1
00:00:00,000 --> 00:00:08,000
Vamos a corregir el ejercicio que os comentaba en la primera parte del tema.

2
00:00:08,000 --> 00:00:12,000
Ya sabemos que en vivo necesitamos helicasas.

3
00:00:12,000 --> 00:00:17,000
Si os acordáis, las helicasas son las que van abriendo y van rompiendo los puentes de hidrógeno

4
00:00:17,000 --> 00:00:20,000
entre las dos heblas de la doble hélice,

5
00:00:20,000 --> 00:00:26,000
de tal manera que tienen que entrar enseguida las proteínas SSBP,

6
00:00:26,000 --> 00:00:29,000
acordaos, son las proteínas de unión a cadena sencilla,

7
00:00:29,000 --> 00:00:35,000
para que no vuelvan a formar los puentes de hidrógeno, que ocurre de forma espontánea.

8
00:00:35,000 --> 00:00:40,000
Al mismo tiempo tenemos girasas e topoisomerasas,

9
00:00:40,000 --> 00:00:47,000
que si os acordáis, dan una vuelta al DNA, cortan y vuelven a empalmar,

10
00:00:47,000 --> 00:00:54,000
de tal manera que este complejo de helicasas, proteínas SSBP, girasas topoisomerasas,

11
00:00:54,000 --> 00:00:58,000
son las que nos permiten la desnaturalización del DNA,

12
00:00:58,000 --> 00:01:05,000
que las dos hebras se puedan separar, que no hayan superestructuras superenrolladas,

13
00:01:05,000 --> 00:01:14,000
por tanto que la estructura del DNA esté relajada y no vuelvan a formarse los puentes de hidrógeno.

14
00:01:14,000 --> 00:01:19,000
Además tenemos la primasa, que si os acordáis,

15
00:01:19,000 --> 00:01:25,000
es el enzima encargado de sintetizar el primer, un primer de RNA,

16
00:01:25,000 --> 00:01:30,000
que se va a unir a la cadena molde y a partir de ese primer de RNA,

17
00:01:30,000 --> 00:01:36,000
la DNA polimerasa va a sintetizar, va a replicar la nueva cadena,

18
00:01:36,000 --> 00:01:39,000
la cadena de nueva síntesis del DNA.

19
00:01:39,000 --> 00:01:44,000
Una vez se ha producido esa síntesis por la DNA polimerasa,

20
00:01:44,000 --> 00:01:50,000
acordaos que la DNA polimerasa es capaz de destruir, romper los primers

21
00:01:50,000 --> 00:01:57,000
y volver a sintetizar una hebra nueva, pero de DNA complementaria al DNA molde.

22
00:01:57,000 --> 00:02:02,000
Y por último tenemos también la ligasa, que va uniendo un fragmento de Okazaki

23
00:02:02,000 --> 00:02:07,000
con otro fragmento de Okazaki, para que sea una secuencia continua.

24
00:02:07,000 --> 00:02:11,000
Todos estos son los enzimas que la célula tiene,

25
00:02:11,000 --> 00:02:17,000
la maquinaria celular encargada de la replicación del DNA.

26
00:02:17,000 --> 00:02:18,000
¿De acuerdo?

27
00:02:18,000 --> 00:02:26,000
Entonces, in vitro, Karim Iulis se dio cuenta que, claro,

28
00:02:26,000 --> 00:02:31,000
el complejo helicasa, proteínas SSBP, girasas y topoisomerasas

29
00:02:31,000 --> 00:02:37,000
lo podía sustituir fácilmente jugando con la temperatura,

30
00:02:37,000 --> 00:02:40,000
ya que nosotros sabemos que, al aumentar la temperatura,

31
00:02:40,000 --> 00:02:47,000
normalmente a temperaturas en el DNA de un cromosoma eucariota,

32
00:02:47,000 --> 00:02:51,000
al elevar la temperatura a 94 o 95 grados,

33
00:02:51,000 --> 00:02:56,000
el DNA desnaturaliza de forma espontánea, se rompen los puentes de hidrógeno.

34
00:02:56,000 --> 00:03:02,000
Esto ya lo sabemos del tema 2 y lo repasamos en el tema 4 de hibridación.

35
00:03:02,000 --> 00:03:03,000
¿De acuerdo?

36
00:03:03,000 --> 00:03:06,000
Por lo tanto, se dio cuenta que, jugando con la temperatura,

37
00:03:06,000 --> 00:03:12,000
no era necesario poner en el tubo de ensayo helicasas, proteínas SSBP,

38
00:03:12,000 --> 00:03:16,000
girasas y topoisomerasas, sino que, jugando con la temperatura,

39
00:03:16,000 --> 00:03:20,000
subiendo la temperatura y bajándola, podía hacer que el DNA

40
00:03:20,000 --> 00:03:24,000
desnaturalizase y renaturalizase.

41
00:03:27,000 --> 00:03:28,000
¿Qué más?

42
00:03:28,000 --> 00:03:33,000
En lugar de primers, es decir, en lugar de poner primasa

43
00:03:33,000 --> 00:03:38,000
para que sintetice los primers, los cebadores, se le ocurrió una idea.

44
00:03:38,000 --> 00:03:45,000
La idea fue sintetizar de forma artificial en el laboratorio los cebadores

45
00:03:45,000 --> 00:03:52,000
y añadir al tubo de ensayo ya directamente los cebadores, los primers,

46
00:03:52,000 --> 00:03:59,000
sin necesidad de que la primasa tuviese que realizar su actividad enzimática.

47
00:03:59,000 --> 00:04:05,000
La polimerasa, la DNA polimerasa, tuvo que elegir una DNA polimerasa

48
00:04:05,000 --> 00:04:10,000
que fuese termoestable, puesto que uno de los problemas es que,

49
00:04:10,000 --> 00:04:16,000
si tenemos que desnaturalizar a 95 grados, la DNA polimerasa

50
00:04:16,000 --> 00:04:21,000
y cualquier enzima que es una proteína también desnaturaliza.

51
00:04:21,000 --> 00:04:26,000
De tal manera que si pongo el DNA a 95 grados y tengo la DNA polimerasa,

52
00:04:26,000 --> 00:04:33,000
la DNA polimerasa me la cargo, desnaturaliza, se desnaturaliza y se inactiva.

53
00:04:33,000 --> 00:04:38,000
De tal manera que tuvo que buscar unas DNA polimerasas que fuesen termoestables

54
00:04:38,000 --> 00:04:41,000
y pudiesen aguantar temperaturas elevadas.

55
00:04:41,000 --> 00:04:46,000
Y en cuanto a la ligasa, en este caso no tenemos que ligar nada,

56
00:04:46,000 --> 00:04:51,000
no tenemos fragmentos de Okazaki y por tanto no es necesario poner ligasa.

57
00:04:51,000 --> 00:04:55,000
De tal manera que de todos estos enzimas, si os dais cuenta,

58
00:04:55,000 --> 00:05:01,000
jugando con la temperatura y añadiendo directamente los cebadores, los primers específicos,

59
00:05:01,000 --> 00:05:06,000
solamente se dio cuenta que solamente era necesario poner una enzima,

60
00:05:06,000 --> 00:05:09,000
que era la DNA polimerasa termoestable.

61
00:05:09,000 --> 00:05:19,000
Por tanto, y en resumen, la PCR diseñada por Mulis en el año 83 tiene un punto clave.

62
00:05:19,000 --> 00:05:23,000
Su punto clave es que es un diseño repetitivo.

63
00:05:23,000 --> 00:05:30,000
Es decir, se trata de repetir secuencialmente ciclos de replicación del DNA.

64
00:05:30,000 --> 00:05:35,000
¿Cuáles son los grandes problemas con los que se encontró Mulis?

65
00:05:35,000 --> 00:05:37,000
El primero es la especificidad de copia.

66
00:05:37,000 --> 00:05:44,000
Es decir, de esa cadena gigantesca, imaginaos que es un cromosoma eucariota,

67
00:05:44,000 --> 00:05:50,000
el cromosoma 5, que es enorme, que tiene miles y miles de pares de bases.

68
00:05:50,000 --> 00:05:55,000
¿Cómo selecciono yo específicamente?

69
00:05:55,000 --> 00:06:02,000
¿Cómo aseguro yo que se amplifica un fragmento concreto de forma específica?

70
00:06:02,000 --> 00:06:08,000
Solamente ese y ningún otro fragmento de toda la longitud del cromosoma.

71
00:06:08,000 --> 00:06:14,000
Y el segundo problema es el que ya os comentaba antes de la termoresistencia de la polimerasa.

72
00:06:14,000 --> 00:06:20,000
Es decir, si yo voy a utilizar la temperatura para desnaturalizar el DNA

73
00:06:20,000 --> 00:06:27,000
y tengo la DNA polimerasa, la DNA polimerasa también se va a desnaturalizar,

74
00:06:27,000 --> 00:06:30,000
se va a inactivar a cada ciclo.

75
00:06:31,000 --> 00:06:33,000
¿Cómo lo solucionó?

76
00:06:33,000 --> 00:06:39,000
Pues la solución para el primer problema de la especificidad de copia

77
00:06:39,000 --> 00:06:43,000
fue diseñar cebadores primers específicos.

78
00:06:43,000 --> 00:06:46,000
Los primers, que los vamos a ver ahora más adelante,

79
00:06:46,000 --> 00:06:51,000
estos cebadores específicos son los que le dicen a la polimerasa el comienzo y el final,

80
00:06:51,000 --> 00:06:56,000
los límites del fragmento concreto que queremos amplificar.

81
00:06:57,000 --> 00:06:58,000
¿De acuerdo?

82
00:06:58,000 --> 00:07:02,000
Por tanto, diseñando unos cebadores específicos,

83
00:07:02,000 --> 00:07:06,000
me aseguro que de toda la longitud de ese cromosoma

84
00:07:06,000 --> 00:07:11,000
solamente se va a amplificar específicamente un fragmento concreto.

85
00:07:12,000 --> 00:07:15,000
Y en cuanto a la termoresistencia,

86
00:07:15,000 --> 00:07:23,000
lo que hizo Mulis fue buscar animales que viviesen en ambientes que llamamos extremófilos

87
00:07:23,000 --> 00:07:26,000
y encontró una serie de bacterias,

88
00:07:26,000 --> 00:07:29,000
que son arqueobacterias muy antiguas, muy primitivas,

89
00:07:29,000 --> 00:07:32,000
que son extremófilas y hay de muchos tipos.

90
00:07:32,000 --> 00:07:37,000
Pues unas viven en ambientes ácidos, otras en ambientes alcalinos,

91
00:07:37,000 --> 00:07:39,000
otras viven en ambientes alófitos,

92
00:07:39,000 --> 00:07:43,000
es decir, con concentraciones de sales tremendamente elevadas

93
00:07:43,000 --> 00:07:46,000
y hay otras que son termófilas,

94
00:07:46,000 --> 00:07:53,000
es decir, viven en ecosistemas de temperatura muy elevada.

95
00:07:53,000 --> 00:07:57,000
Por ejemplo, son bacterias que viven en los reefs,

96
00:07:57,000 --> 00:08:00,000
o sea, en las dorsales oceánicas, ¿de acuerdo?,

97
00:08:00,000 --> 00:08:04,000
donde está continuamente fluyendo magma

98
00:08:04,000 --> 00:08:10,000
y donde las temperaturas rondan una media de 80 grados centígrados.

99
00:08:10,000 --> 00:08:11,000
¿De acuerdo?

100
00:08:11,000 --> 00:08:13,000
De tal manera que él se dio cuenta que si esos animales

101
00:08:13,000 --> 00:08:16,000
eran capaces de vivir a esas temperaturas,

102
00:08:16,000 --> 00:08:20,000
debían tener unas DNA polimerasas que fuesen termoestables

103
00:08:20,000 --> 00:08:23,000
y no desnaturalizasen a esas temperaturas.

104
00:08:23,000 --> 00:08:28,000
Y efectivamente, la DNA polimerasa que más se utiliza

105
00:08:28,000 --> 00:08:32,000
es la TAC polimerasa, ¿de acuerdo?,

106
00:08:32,000 --> 00:08:37,000
que es la primera polimerasa que se utiliza en las PCRs,

107
00:08:37,000 --> 00:08:41,000
que procede de una arqueobacteria termófila

108
00:08:41,000 --> 00:08:44,000
que se llama Termus aquaticus, de ahí su nombre,

109
00:08:44,000 --> 00:08:46,000
TAC polimerasa,

110
00:08:46,000 --> 00:08:50,000
y es la que más se utiliza y se utiliza de forma rutinaria.

111
00:08:50,000 --> 00:08:53,000
¿De acuerdo?

112
00:08:53,000 --> 00:08:54,000
Muy bien.

113
00:08:54,000 --> 00:08:55,000
El primer elemento,

114
00:08:55,000 --> 00:08:58,000
vamos a ir viendo ahora los elementos que se necesitan.

115
00:08:58,000 --> 00:09:00,000
Hemos dicho que son los primers,

116
00:09:00,000 --> 00:09:05,000
luego veremos las características de las DNA polimerasas,

117
00:09:05,000 --> 00:09:08,000
sobre todo la TAC polimerasa termoestable.

118
00:09:08,000 --> 00:09:11,000
Los cebadores, los primers que se utilizan en la PCR,

119
00:09:11,000 --> 00:09:15,000
a diferencia de los primers de la replicación,

120
00:09:15,000 --> 00:09:18,000
que son sintetizados por la primasa,

121
00:09:22,000 --> 00:09:28,000
no son primers de RNA, sino que son primers de DNA.

122
00:09:28,000 --> 00:09:30,000
Son oligonucleótidos,

123
00:09:30,000 --> 00:09:36,000
es decir, cadenas cortas de nucleótidos monocatenarios de DNA.

124
00:09:36,000 --> 00:09:37,000
¿De acuerdo?

125
00:09:37,000 --> 00:09:39,000
De tal manera que para cada PCR,

126
00:09:39,000 --> 00:09:41,000
para cada reacción de PCR,

127
00:09:41,000 --> 00:09:43,000
necesitamos dos cebadores,

128
00:09:43,000 --> 00:09:45,000
una pareja de cebadores,

129
00:09:45,000 --> 00:09:47,000
un cebador que lo llamamos forward,

130
00:09:47,000 --> 00:09:49,000
que es el que va a ir delante,

131
00:09:49,000 --> 00:09:52,000
y el otro cebador que lo llamamos reverse.

132
00:09:52,000 --> 00:09:55,000
Imaginaos que este es el DNA molde,

133
00:09:55,000 --> 00:10:00,000
imaginaos que este es el cromosoma 2 esquematizado,

134
00:10:00,000 --> 00:10:02,000
la hebra 5'3',

135
00:10:02,000 --> 00:10:04,000
la 3'5',

136
00:10:05,000 --> 00:10:08,000
y este es el fragmento en esta zona sombreada,

137
00:10:08,000 --> 00:10:10,000
el fragmento que yo quiero amplificar.

138
00:10:10,000 --> 00:10:12,000
El gen que yo quiero amplificar

139
00:10:12,000 --> 00:10:15,000
puede tener una longitud de 500 pares de bases,

140
00:10:15,000 --> 00:10:17,000
1.000, las que sean.

141
00:10:17,000 --> 00:10:20,000
200, 300 pares de bases.

142
00:10:20,000 --> 00:10:24,000
Los cebadores, el forward y el reverse,

143
00:10:24,000 --> 00:10:27,000
deben diseñarse de forma específica,

144
00:10:27,000 --> 00:10:31,000
de manera que vayan uno al principio del fragmento

145
00:10:31,000 --> 00:10:34,000
y otro al final del fragmento.

146
00:10:35,000 --> 00:10:38,000
Daos cuenta, y esto es muy importante,

147
00:10:38,000 --> 00:10:40,000
que la tag polimerasa,

148
00:10:40,000 --> 00:10:43,000
las DNA polimerasas que utilizamos en la PCR,

149
00:10:43,000 --> 00:10:45,000
como son polimerasas,

150
00:10:45,000 --> 00:10:48,000
acordaos que solamente saben leer

151
00:10:48,000 --> 00:10:51,000
en dirección 3', 5',

152
00:10:51,000 --> 00:10:55,000
y por tanto la cadena que sintetizan es 5', 3'.

153
00:10:56,000 --> 00:10:59,000
De tal manera que los dos cebadores

154
00:10:59,000 --> 00:11:05,000
se van a unir en el extremo 3' del fragmento.

155
00:11:06,000 --> 00:11:11,000
El forward se unirá a la cadena molde 3', 5',

156
00:11:11,000 --> 00:11:14,000
en el extremo 3' del fragmento,

157
00:11:14,000 --> 00:11:16,000
si os dais cuenta.

158
00:11:17,000 --> 00:11:18,000
¿De acuerdo?

159
00:11:18,000 --> 00:11:21,000
Y el reverse se va a unir en el extremo 3',

160
00:11:21,000 --> 00:11:25,000
pero en este caso de la cadena que es 5', 3'.

161
00:11:25,000 --> 00:11:29,000
De tal manera que cuando una vez tengamos unidos

162
00:11:29,000 --> 00:11:34,000
los cebadores a las dos cadenas molde

163
00:11:34,000 --> 00:11:37,000
y se una la DNA polimerasa,

164
00:11:37,000 --> 00:11:42,000
va a sintetizar siempre en dirección 5', 3'.

165
00:11:44,000 --> 00:11:49,000
Es decir, que en cada una de las hebras del DNA molde

166
00:11:49,000 --> 00:11:52,000
la DNA polimerasa avanza en sentido opuesto.

167
00:11:52,000 --> 00:11:56,000
Una iría hacia la derecha y la otra hacia la izquierda.

168
00:11:57,000 --> 00:11:58,000
¿De acuerdo?

169
00:12:00,000 --> 00:12:01,000
Muy bien.

170
00:12:01,000 --> 00:12:03,000
Esto es muy importante.

171
00:12:03,000 --> 00:12:04,000
¿De acuerdo?

172
00:12:04,000 --> 00:12:08,000
Por tanto, los cebadores, si os acordáis,

173
00:12:08,000 --> 00:12:13,000
son los que marcan la especificidad de la reacción de PCR.

174
00:12:13,000 --> 00:12:15,000
Es decir, si en el examen os pregunto

175
00:12:15,000 --> 00:12:19,000
qué elemento de la PCR es el que determina

176
00:12:19,000 --> 00:12:23,000
la especificidad de la reacción?

177
00:12:23,000 --> 00:12:24,000
Los primers.

178
00:12:24,000 --> 00:12:25,000
¿Por qué?

179
00:12:25,000 --> 00:12:28,000
Porque son los que van a delimitar

180
00:12:28,000 --> 00:12:32,000
qué fragmento se tiene que amplificar.

181
00:12:32,000 --> 00:12:35,000
Por tanto, de esto que acabo de decir,

182
00:12:35,000 --> 00:12:41,000
se deduce que los primers, una vez diseñe los primers,

183
00:12:41,000 --> 00:12:47,000
deben ser secuencias que sean únicas en toda la longitud.

184
00:12:47,000 --> 00:12:52,000
De tal manera que este cebador se una única y exclusivamente aquí

185
00:12:52,000 --> 00:12:55,000
y no se pegue de forma inespecífica a lo largo de la cadena.

186
00:12:55,000 --> 00:13:00,000
Y este cebador, el reverse, se una específicamente aquí

187
00:13:00,000 --> 00:13:03,000
y no se une inespecíficamente a lo largo de la secuencia.

188
00:13:03,000 --> 00:13:08,000
Donde se una un cebador, se pegará la polimerasa y amplificará.

189
00:13:08,000 --> 00:13:11,000
Por tanto, los cebadores, los primers,

190
00:13:11,000 --> 00:13:14,000
tienen que ser tremendamente específicos

191
00:13:14,000 --> 00:13:18,000
y unirse solamente en estas secuencias diana.

192
00:13:18,000 --> 00:13:23,000
Porque si no, la DNA polimerasa puede amplificar de forma inespecífica

193
00:13:23,000 --> 00:13:28,000
fragmentos que no son el fragmento que queremos amplificar.

194
00:13:28,000 --> 00:13:29,000
¿De acuerdo?

195
00:13:29,000 --> 00:13:35,000
¿Qué características a grandes rasgos tienen estos cebadores, los primers?

196
00:13:35,000 --> 00:13:38,000
La primera característica es la longitud.

197
00:13:38,000 --> 00:13:40,000
No puedo hacer un cebador muy pequeño

198
00:13:40,000 --> 00:13:43,000
porque si el cebador es muy pequeño,

199
00:13:43,000 --> 00:13:45,000
es decir, muy cortito,

200
00:13:45,000 --> 00:13:50,000
la probabilidad de que se pegue en sitios de forma inespecífica es muy grande.

201
00:13:50,000 --> 00:13:53,000
Por tanto, se estima que la longitud

202
00:13:53,000 --> 00:13:57,000
debe ir siempre entre 18 y 30 pares de bases.

203
00:13:57,000 --> 00:13:59,000
Nunca más de 30 pares de bases

204
00:13:59,000 --> 00:14:02,000
porque entonces es muy difícil que hibride,

205
00:14:02,000 --> 00:14:04,000
que se una el DNA molde.

206
00:14:04,000 --> 00:14:06,000
Y nunca menos de 18,

207
00:14:06,000 --> 00:14:09,000
a ver, la longitud mínima son 16,

208
00:14:09,000 --> 00:14:12,000
menos de 16, 18,

209
00:14:12,000 --> 00:14:14,000
y eso nunca porque es muy fácil entonces

210
00:14:14,000 --> 00:14:17,000
que se ponga, se pegue de forma inespecífica

211
00:14:17,000 --> 00:14:22,000
en otras zonas, en otras secuencias del DNA molde.

212
00:14:22,000 --> 00:14:25,000
Segunda característica, la composición de bases.

213
00:14:25,000 --> 00:14:26,000
Es muy importante.

214
00:14:26,000 --> 00:14:29,000
Para que la unión del primer,

215
00:14:29,000 --> 00:14:34,000
para que la unión del primer a la secuencia diana,

216
00:14:34,000 --> 00:14:38,000
de cada uno de los primers a su secuencia diana,

217
00:14:38,000 --> 00:14:40,000
para que esa unión sea fuerte,

218
00:14:40,000 --> 00:14:43,000
la composición de guaninas y citosinas

219
00:14:43,000 --> 00:14:46,000
debe estar en torno al 60%,

220
00:14:46,000 --> 00:14:48,000
del 40 al 60%,

221
00:14:48,000 --> 00:14:50,000
para que la unión sea fuerte.

222
00:14:50,000 --> 00:14:52,000
Si tengo muchas adeninas y timinas,

223
00:14:52,000 --> 00:14:55,000
si las adeninas y timinas superan el 60%,

224
00:14:55,000 --> 00:14:57,000
la unión va a ser débil

225
00:14:57,000 --> 00:15:00,000
y es muy fácil que se desenganchen.

226
00:15:00,000 --> 00:15:01,000
¿De acuerdo?

227
00:15:01,000 --> 00:15:05,000
Por tanto, la composición en la secuencia de los primers,

228
00:15:05,000 --> 00:15:09,000
la composición de guaninas y citosinas

229
00:15:09,000 --> 00:15:11,000
debe estar en torno al 50%,

230
00:15:11,000 --> 00:15:13,000
tirando al 60%.

231
00:15:13,000 --> 00:15:14,000
¿De acuerdo?

232
00:15:14,000 --> 00:15:17,000
Una vez ya tenemos diseñado el primer,

233
00:15:17,000 --> 00:15:19,000
el forward y el reverse,

234
00:15:19,000 --> 00:15:20,000
¿de acuerdo?

235
00:15:20,000 --> 00:15:22,000
El forward y el reverse,

236
00:15:22,000 --> 00:15:25,000
o el 5' y 3' también se les llaman,

237
00:15:25,000 --> 00:15:28,000
hemos de estudiar la secuencia.

238
00:15:28,000 --> 00:15:31,000
De tal manera que en la secuencia de los primers

239
00:15:31,000 --> 00:15:34,000
no tengamos secuencias complementarias

240
00:15:34,000 --> 00:15:37,000
intramoleculares o intermoleculares.

241
00:15:37,000 --> 00:15:38,000
Es decir,

242
00:15:38,000 --> 00:15:42,000
las secuencias complementarias intramoleculares

243
00:15:42,000 --> 00:15:47,000
lo que provocan es que el propio cebador

244
00:15:47,000 --> 00:15:49,000
forme una horquilla

245
00:15:49,000 --> 00:15:52,000
y tenga secuencias complementarias,

246
00:15:52,000 --> 00:15:54,000
forme una horquilla,

247
00:15:54,000 --> 00:15:58,000
de tal manera que este primer que forma una horquilla

248
00:15:58,000 --> 00:16:01,000
no está disponible para poder unirse a su secuencia diana.

249
00:16:01,000 --> 00:16:04,000
Y por tanto, pierdo primers.

250
00:16:04,000 --> 00:16:09,000
O que este primer con otro primer forward

251
00:16:09,000 --> 00:16:12,000
tengan secuencias complementarias.

252
00:16:12,000 --> 00:16:13,000
¿De acuerdo?

253
00:16:13,000 --> 00:16:17,000
Esto sería una horquilla

254
00:16:17,000 --> 00:16:20,000
que sería una secuencia complementaria intramolecular

255
00:16:20,000 --> 00:16:22,000
dentro de la misma molécula

256
00:16:22,000 --> 00:16:25,000
y estas de aquí son lo que llamamos los dímeros,

257
00:16:25,000 --> 00:16:27,000
dímeros de primers

258
00:16:27,000 --> 00:16:31,000
que pueden ser dímeros de un cebador consigo mismo

259
00:16:31,000 --> 00:16:33,000
o con el otro cebador.

260
00:16:33,000 --> 00:16:34,000
¿De acuerdo?

261
00:16:34,000 --> 00:16:36,000
Forward y reverse

262
00:16:36,000 --> 00:16:37,000
o forward y forward

263
00:16:37,000 --> 00:16:39,000
o reverse y reverse.

264
00:16:39,000 --> 00:16:41,000
En todas ellas,

265
00:16:41,000 --> 00:16:44,000
si tengo secuencias complementarias intramoleculares

266
00:16:44,000 --> 00:16:48,000
todo esto va a hacer que la PCR sea menos eficiente.

267
00:16:48,000 --> 00:16:50,000
¿De acuerdo?

268
00:16:50,000 --> 00:16:53,000
Y la última característica de los cebadores

269
00:16:53,000 --> 00:16:54,000
es su temperatura de fusión.

270
00:16:54,000 --> 00:16:57,000
Acordaos que ya vimos en el tema 4

271
00:16:57,000 --> 00:16:59,000
que la temperatura de melting

272
00:16:59,000 --> 00:17:00,000
o la temperatura de fusión

273
00:17:00,000 --> 00:17:04,000
es específica, única,

274
00:17:04,000 --> 00:17:06,000
muy específica, única

275
00:17:06,000 --> 00:17:08,000
para cada híbrido que se forma.

276
00:17:08,000 --> 00:17:10,000
Aquí se tiene que formar un híbrido,

277
00:17:10,000 --> 00:17:14,000
un híbrido entre DNA molde y primer

278
00:17:14,000 --> 00:17:16,000
de tal manera que

279
00:17:16,000 --> 00:17:19,000
este híbrido y este otro híbrido,

280
00:17:19,000 --> 00:17:20,000
cada uno de ellos

281
00:17:20,000 --> 00:17:23,000
tiene una temperatura de melting diferente.

282
00:17:23,000 --> 00:17:24,000
¿De acuerdo?

283
00:17:24,000 --> 00:17:27,000
Ya veremos cómo se calcula la temperatura de melting

284
00:17:27,000 --> 00:17:29,000
pero esa temperatura de melting

285
00:17:29,000 --> 00:17:31,000
para que la reacción vaya bien

286
00:17:31,000 --> 00:17:34,000
tiene que estar en torno a 52-65ºC

287
00:17:34,000 --> 00:17:36,000
nunca por debajo de 50ºC

288
00:17:36,000 --> 00:17:38,000
nunca por encima de 65ºC

289
00:17:38,000 --> 00:17:39,000
¿De acuerdo?

290
00:17:39,000 --> 00:17:42,000
Estando ahí en torno a 55-60ºC

291
00:17:42,000 --> 00:17:44,000
más o menos la temperatura de melting

292
00:17:44,000 --> 00:17:46,000
la reacción va a funcionar muy bien

293
00:17:46,000 --> 00:17:49,000
y los dímeros, o sea los híbridos

294
00:17:49,000 --> 00:17:51,000
primer, ADN, molde

295
00:17:51,000 --> 00:17:53,000
se van a formar muy bien.

296
00:17:53,000 --> 00:17:54,000
¿De acuerdo?

297
00:17:54,000 --> 00:17:56,000
De esto de los diseños de cebadores

298
00:17:56,000 --> 00:17:58,000
vamos a hacer una actividad

299
00:17:58,000 --> 00:18:00,000
que os la subiré también a la plataforma

300
00:18:00,000 --> 00:18:03,000
para que podáis hacerla durante estos días

301
00:18:03,000 --> 00:18:05,000
que no tendremos clase presencial.

302
00:18:05,000 --> 00:18:07,000
¿De acuerdo?

303
00:18:07,000 --> 00:18:09,000
Muy bien.

304
00:18:09,000 --> 00:18:12,000
En cuanto a las DNA polimerasas termoestables

305
00:18:12,000 --> 00:18:15,000
ya hemos dicho que proceden todas ellas

306
00:18:15,000 --> 00:18:20,000
de organismos que son extremófilos

307
00:18:20,000 --> 00:18:23,000
viven en ambientes extremos

308
00:18:23,000 --> 00:18:26,000
y en concreto las DNA polimerasas termoestables

309
00:18:26,000 --> 00:18:31,000
proceden de arqueobacterias termófilas

310
00:18:31,000 --> 00:18:33,000
es decir, que viven a temperaturas

311
00:18:33,000 --> 00:18:37,000
que pueden rondar de los 50ºC a los 80ºC

312
00:18:37,000 --> 00:18:39,000
¿De acuerdo?

313
00:18:39,000 --> 00:18:41,000
¿Qué características tienen

314
00:18:41,000 --> 00:18:43,000
estas polimerasas termoestables

315
00:18:43,000 --> 00:18:45,000
respecto a las DNA polimerasas

316
00:18:45,000 --> 00:18:47,000
por ejemplo de nuestras células eucariotas?

317
00:18:48,000 --> 00:18:50,000
Pues la primera de ellas es que

318
00:18:50,000 --> 00:18:52,000
realizan su actividad polimerasa

319
00:18:52,000 --> 00:18:54,000
a una temperatura óptima

320
00:18:54,000 --> 00:18:56,000
y la temperatura óptima

321
00:18:56,000 --> 00:19:01,000
aproximadamente ronda los 70ºC

322
00:19:01,000 --> 00:19:02,000
¿De acuerdo?

323
00:19:02,000 --> 00:19:06,000
Es decir, para que esta DNA polimerasa termoestable

324
00:19:06,000 --> 00:19:10,000
pueda amplificar un fragmento de DNA

325
00:19:10,000 --> 00:19:12,000
y sintetizar una cadena de DNA

326
00:19:12,000 --> 00:19:14,000
debe encontrarse a temperaturas

327
00:19:14,000 --> 00:19:18,000
en torno a 70-75ºC

328
00:19:18,000 --> 00:19:21,000
Normalmente suelen ser en una temperatura de 72ºC

329
00:19:21,000 --> 00:19:24,000
Ya os podéis grabar esta temperatura

330
00:19:24,000 --> 00:19:26,000
72ºC

331
00:19:26,000 --> 00:19:28,000
Y en segundo lugar, la segunda diferencia

332
00:19:28,000 --> 00:19:31,000
es que pueden mantener su actividad polimerasa

333
00:19:31,000 --> 00:19:35,000
tras tiempos prolongados de incubación

334
00:19:35,000 --> 00:19:37,000
a altas temperaturas

335
00:19:37,000 --> 00:19:41,000
Es decir, mantienen su actividad polimerasa

336
00:19:41,000 --> 00:19:47,000
hasta 40-45 minutos seguidos a 95ºC

337
00:19:47,000 --> 00:19:49,000
Que es una burrada

338
00:19:49,000 --> 00:19:50,000
95ºC

339
00:19:50,000 --> 00:19:52,000
Daos cuenta que estamos rozando

340
00:19:52,000 --> 00:19:54,000
la temperatura de ebullición del agua

341
00:19:54,000 --> 00:19:56,000
Metemos un dedo y sacamos el hueso

342
00:19:56,000 --> 00:19:58,000
¿Vale? Para que os hagáis una idea

343
00:19:58,000 --> 00:20:01,000
Pues esta, cogemos una DNA polimerasa termoestable

344
00:20:01,000 --> 00:20:03,000
la metemos a 95ºC

345
00:20:03,000 --> 00:20:05,000
y aguanta sin desnaturalizarse

346
00:20:05,000 --> 00:20:07,000
tres cuartos de hora

347
00:20:07,000 --> 00:20:09,000
En torno a 40-45 minutos

348
00:20:09,000 --> 00:20:11,000
¿De acuerdo?

349
00:20:11,000 --> 00:20:12,000
Esto es muy importante

350
00:20:12,000 --> 00:20:14,000
porque ninguna otra DNA polimerasa

351
00:20:14,000 --> 00:20:16,000
de células eucariotas por ejemplo

352
00:20:16,000 --> 00:20:18,000
tiene ninguna de estas dos características

353
00:20:18,000 --> 00:20:21,000
ni su temperatura óptima 72ºC

354
00:20:21,000 --> 00:20:24,000
ni aguanta temperaturas de 95ºC

355
00:20:24,000 --> 00:20:26,000
sin desnaturalizarse

356
00:20:26,000 --> 00:20:27,000
¿De acuerdo?

357
00:20:27,000 --> 00:20:30,000
Tenemos muchos tipos de DNA polimerasas termoestables

358
00:20:30,000 --> 00:20:31,000
muchas

359
00:20:31,000 --> 00:20:33,000
La clásica es la TAC polimerasa

360
00:20:33,000 --> 00:20:34,000
que es la primera

361
00:20:34,000 --> 00:20:35,000
¿De acuerdo?

362
00:20:35,000 --> 00:20:37,000
Tiene actividad polimerasa, por supuesto

363
00:20:37,000 --> 00:20:40,000
pero además tiene actividad exonucleasa

364
00:20:40,000 --> 00:20:42,000
5'-3'

365
00:20:42,000 --> 00:20:44,000
pero no tiene actividad correctora

366
00:20:44,000 --> 00:20:46,000
¿Os acordáis de la actividad correctora?

367
00:20:46,000 --> 00:20:49,000
Era la actividad exonucleasa 3'-5'

368
00:20:49,000 --> 00:20:50,000
Sin embargo

369
00:20:50,000 --> 00:20:53,000
después de descubrirse

370
00:20:53,000 --> 00:20:56,000
y utilizarse la TAC polimerasa

371
00:20:56,000 --> 00:20:58,000
se han ido descubriendo otras polimerasas

372
00:20:58,000 --> 00:21:00,000
que además de la actividad polimerasa

373
00:21:00,000 --> 00:21:03,000
y 5'-3' exonucleasa

374
00:21:03,000 --> 00:21:05,000
tienen también actividad correctora

375
00:21:05,000 --> 00:21:08,000
actividad exonucleasa 3'-5'

376
00:21:08,000 --> 00:21:11,000
A estas muchas de las empresas

377
00:21:11,000 --> 00:21:13,000
que comercializan estas polimerasas

378
00:21:13,000 --> 00:21:15,000
las llaman gold

379
00:21:15,000 --> 00:21:16,000
doradas

380
00:21:16,000 --> 00:21:17,000
¿De acuerdo?

381
00:21:17,000 --> 00:21:19,000
TAC polimerasa dorada

382
00:21:19,000 --> 00:21:20,000
la TAC gold

383
00:21:20,000 --> 00:21:21,000
¿De acuerdo?

384
00:21:21,000 --> 00:21:22,000
¿Por qué?

385
00:21:22,000 --> 00:21:23,000
Porque hacen que

386
00:21:23,000 --> 00:21:25,000
no se cometan tantos errores

387
00:21:25,000 --> 00:21:27,000
Es decir, acordaos que la polimerasa

388
00:21:27,000 --> 00:21:28,000
puede equivocarse

389
00:21:28,000 --> 00:21:31,000
y meter un nucleótido incorrecto

390
00:21:31,000 --> 00:21:33,000
Si tiene esta actividad exonucleasa

391
00:21:33,000 --> 00:21:35,000
ella misma es capaz de corregirla

392
00:21:35,000 --> 00:21:36,000
¿De acuerdo?

393
00:21:36,000 --> 00:21:37,000
Saca ese nucleótido erróneo

394
00:21:37,000 --> 00:21:39,000
y mete el correcto

395
00:21:39,000 --> 00:21:41,000
Y luego tenemos otras polimerasas

396
00:21:41,000 --> 00:21:42,000
que son las que llamamos

397
00:21:42,000 --> 00:21:44,000
transcriptasas inversas

398
00:21:44,000 --> 00:21:46,000
Es decir, esas transcriptasas inversas

399
00:21:46,000 --> 00:21:48,000
son DNA polimerasas

400
00:21:48,000 --> 00:21:50,000
que tienen una característica

401
00:21:50,000 --> 00:21:53,000
y es que no utilizan DNA molde

402
00:21:53,000 --> 00:21:56,000
sino que utilizan RNA molde

403
00:21:56,000 --> 00:21:59,000
Leen RNA y sintetizan DNA

404
00:21:59,000 --> 00:22:00,000
¿De acuerdo?

405
00:22:00,000 --> 00:22:02,000
Ya veremos para qué las utilizamos

406
00:22:02,000 --> 00:22:05,000
Pero también se utilizan muchísimo

407
00:22:05,000 --> 00:22:07,000
¿De acuerdo?

408
00:22:08,000 --> 00:22:11,000
¿Cuál es el ciclo básico de una PCR?

409
00:22:11,000 --> 00:22:14,000
Hemos dicho que la reacción de PCR

410
00:22:14,000 --> 00:22:17,000
son una repetición secuencial

411
00:22:17,000 --> 00:22:19,000
de ciclos de PCR

412
00:22:19,000 --> 00:22:22,000
Se pueden hacer 25, 30, 35

413
00:22:22,000 --> 00:22:25,000
e incluso 40 ciclos de PCR

414
00:22:25,000 --> 00:22:26,000
¿De acuerdo?

415
00:22:26,000 --> 00:22:28,000
En una reacción de PCR

416
00:22:28,000 --> 00:22:31,000
¿En qué consiste uno de esos ciclos?

417
00:22:31,000 --> 00:22:33,000
Uno de esos ciclos tiene tres fases

418
00:22:33,000 --> 00:22:35,000
y esto es muy importante

419
00:22:35,000 --> 00:22:37,000
Esto os lo voy a preguntar sí o sí

420
00:22:37,000 --> 00:22:38,000
¿De acuerdo?

421
00:22:38,000 --> 00:22:42,000
Así que apuntadlo

422
00:22:42,000 --> 00:22:44,000
Un ciclo básico de la PCR

423
00:22:44,000 --> 00:22:45,000
tiene tres fases

424
00:22:45,000 --> 00:22:47,000
Partimos de un DNA molde

425
00:22:47,000 --> 00:22:48,000
¿Os acordáis?

426
00:22:48,000 --> 00:22:49,000
Además del DNA molde

427
00:22:49,000 --> 00:22:52,000
ya veremos que tenemos que poner los primers

428
00:22:52,000 --> 00:22:53,000
y además de los primers

429
00:22:53,000 --> 00:22:56,000
tenemos que poner la DNA polimerasa

430
00:22:56,000 --> 00:22:59,000
Cuando va a comenzar la PCR

431
00:22:59,000 --> 00:23:01,000
la reacción de PCR

432
00:23:01,000 --> 00:23:03,000
y va a empezar el primer ciclo

433
00:23:03,000 --> 00:23:04,000
Este ciclo

434
00:23:04,000 --> 00:23:06,000
igual que todos los ciclos sucesivos

435
00:23:06,000 --> 00:23:07,000
pasa por tres fases

436
00:23:07,000 --> 00:23:10,000
La primera fase es una fase de desnaturalización

437
00:23:10,000 --> 00:23:12,000
Esta fase de desnaturalización

438
00:23:12,000 --> 00:23:14,000
el único objetivo que tiene

439
00:23:14,000 --> 00:23:16,000
es que del DNA molde

440
00:23:16,000 --> 00:23:18,000
que es bicatenario

441
00:23:18,000 --> 00:23:20,000
se rompan todos los puentes de hidrógeno

442
00:23:20,000 --> 00:23:23,000
y obtener dos hebras monocatenarias

443
00:23:23,000 --> 00:23:24,000
desnaturalización

444
00:23:24,000 --> 00:23:27,000
Esta fase de desnaturalización

445
00:23:27,000 --> 00:23:29,000
es siempre a la misma temperatura

446
00:23:29,000 --> 00:23:30,000
que es a 95º

447
00:23:30,000 --> 00:23:33,000
94º o 95ºC

448
00:23:33,000 --> 00:23:34,000
Siempre

449
00:23:34,000 --> 00:23:38,000
¿Cuánto tiempo la ponemos a 95º?

450
00:23:38,000 --> 00:23:40,000
Depende

451
00:23:40,000 --> 00:23:41,000
Depende

452
00:23:41,000 --> 00:23:43,000
Si el DNA molde

453
00:23:43,000 --> 00:23:45,000
es un DNA mitocondrial

454
00:23:45,000 --> 00:23:47,000
que es circular y es pequeñito

455
00:23:47,000 --> 00:23:49,000
tiene pocas pares de bases

456
00:23:49,000 --> 00:23:51,000
la desnaturalización puede ser rápida

457
00:23:51,000 --> 00:23:53,000
en unos cuantos segundos

458
00:23:53,000 --> 00:23:54,000
Pero si estamos hablando

459
00:23:54,000 --> 00:23:55,000
que el DNA molde

460
00:23:55,000 --> 00:23:57,000
es un cromosoma entero

461
00:23:57,000 --> 00:23:58,000
eucariota

462
00:23:58,000 --> 00:24:01,000
que tiene miles y miles de pares de bases

463
00:24:01,000 --> 00:24:02,000
el tiempo de desnaturalización

464
00:24:02,000 --> 00:24:03,000
tiene que ser mayor

465
00:24:03,000 --> 00:24:06,000
y puede llegar incluso a un minuto

466
00:24:06,000 --> 00:24:08,000
Acordaos

467
00:24:08,000 --> 00:24:09,000
Acordaos

468
00:24:09,000 --> 00:24:10,000
que si utilizo

469
00:24:10,000 --> 00:24:12,000
de tiempo de desnaturalización

470
00:24:12,000 --> 00:24:13,000
un minuto

471
00:24:13,000 --> 00:24:16,000
y hago 40 ciclos

472
00:24:16,000 --> 00:24:18,000
la tag polimerasa

473
00:24:18,000 --> 00:24:20,000
va a estar 40 minutos

474
00:24:20,000 --> 00:24:22,000
a 95º

475
00:24:22,000 --> 00:24:24,000
Acordaos que esto es muy importante

476
00:24:24,000 --> 00:24:26,000
porque

477
00:24:26,000 --> 00:24:28,000
40 o 45 minutos

478
00:24:28,000 --> 00:24:31,000
es el máximo que aguanta a 95º

479
00:24:31,000 --> 00:24:32,000
la tag polimerasa

480
00:24:32,000 --> 00:24:35,000
la polimerasa termoestable

481
00:24:35,000 --> 00:24:36,000
¿De acuerdo?

482
00:24:36,000 --> 00:24:37,000
Por tanto, primera fase

483
00:24:37,000 --> 00:24:39,000
fase de desnaturalización

484
00:24:39,000 --> 00:24:41,000
a 95º

485
00:24:41,000 --> 00:24:42,000
¿Cuánto tiempo?

486
00:24:42,000 --> 00:24:44,000
Depende de la longitud

487
00:24:44,000 --> 00:24:46,000
del DNA molde

488
00:24:46,000 --> 00:24:47,000
A mayor longitud

489
00:24:47,000 --> 00:24:49,000
mayor tiempo de desnaturalización

490
00:24:49,000 --> 00:24:51,000
como es lógico

491
00:24:51,000 --> 00:24:52,000
Segunda frase

492
00:24:52,000 --> 00:24:53,000
La segunda fase

493
00:24:53,000 --> 00:24:55,000
es la fase de hibridación de los cebadores

494
00:24:56,000 --> 00:24:58,000
¿Hibridación de los cebadores?

495
00:24:58,000 --> 00:25:00,000
Cada uno de los cebadores

496
00:25:00,000 --> 00:25:01,000
hemos dicho que tiene

497
00:25:01,000 --> 00:25:03,000
una temperatura de melting

498
00:25:03,000 --> 00:25:05,000
el forward tiene una temperatura

499
00:25:05,000 --> 00:25:06,000
de melting propia

500
00:25:06,000 --> 00:25:07,000
el reverse tiene una temperatura

501
00:25:07,000 --> 00:25:09,000
de melting propia

502
00:25:09,000 --> 00:25:11,000
La temperatura de hibridación

503
00:25:11,000 --> 00:25:13,000
hago un inciso

504
00:25:13,000 --> 00:25:15,000
nadie dice hibridación de cebadores

505
00:25:15,000 --> 00:25:17,000
sino que todo el mundo habla de

506
00:25:17,000 --> 00:25:19,000
anilin de los primers

507
00:25:19,000 --> 00:25:20,000
anilin

508
00:25:20,000 --> 00:25:21,000
tenéis en la página

509
00:25:21,000 --> 00:25:23,000
no sé cuántos del libro

510
00:25:23,000 --> 00:25:25,000
cómo se escribe lo de anilin

511
00:25:25,000 --> 00:25:27,000
¿De acuerdo?

512
00:25:27,000 --> 00:25:29,000
Sí, me parece que está en la página 139

513
00:25:29,000 --> 00:25:30,000
que la tengo aquí delante

514
00:25:30,000 --> 00:25:31,000
¿De acuerdo?

515
00:25:31,000 --> 00:25:33,000
El anilin de los primers

516
00:25:33,000 --> 00:25:34,000
¿De acuerdo?

517
00:25:34,000 --> 00:25:36,000
La temperatura de anilin

518
00:25:36,000 --> 00:25:37,000
de los primers

519
00:25:37,000 --> 00:25:39,000
es exclusiva

520
00:25:39,000 --> 00:25:41,000
única e irrepetible

521
00:25:41,000 --> 00:25:43,000
para esa pareja de primers

522
00:25:43,000 --> 00:25:45,000
¿De acuerdo?

523
00:25:45,000 --> 00:25:46,000
Imaginaos

524
00:25:46,000 --> 00:25:48,000
que yo quiero hacer

525
00:25:48,000 --> 00:25:50,000
dos reacciones de PCR diferentes

526
00:25:50,000 --> 00:25:52,000
en dos tubos diferentes

527
00:25:52,000 --> 00:25:54,000
en el primer tubo

528
00:25:54,000 --> 00:25:56,000
meto el forward 1

529
00:25:56,000 --> 00:25:58,000
y el reverse 1

530
00:25:58,000 --> 00:26:00,000
y en el segundo tubo

531
00:26:00,000 --> 00:26:02,000
meto el forward 1

532
00:26:02,000 --> 00:26:04,000
y un reverse 2

533
00:26:04,000 --> 00:26:06,000
diferente

534
00:26:06,000 --> 00:26:08,000
¿De acuerdo?

535
00:26:08,000 --> 00:26:10,000
Son dos parejas diferentes

536
00:26:10,000 --> 00:26:12,000
reverse 1

537
00:26:12,000 --> 00:26:13,000
forward 1

538
00:26:13,000 --> 00:26:14,000
reverse 2

539
00:26:14,000 --> 00:26:15,000
forward 1

540
00:26:15,000 --> 00:26:17,000
La temperatura de anilin

541
00:26:17,000 --> 00:26:19,000
o temperatura de hibridación

542
00:26:19,000 --> 00:26:21,000
en cada uno

543
00:26:21,000 --> 00:26:23,000
de los tubos es diferente

544
00:26:23,000 --> 00:26:25,000
¿De acuerdo?

545
00:26:25,000 --> 00:26:27,000
Por tanto

546
00:26:27,000 --> 00:26:29,000
la desnaturalización

547
00:26:29,000 --> 00:26:31,000
a 95 grados

548
00:26:31,000 --> 00:26:33,000
la hibridación

549
00:26:33,000 --> 00:26:35,000
el anilin de los primers

550
00:26:35,000 --> 00:26:37,000
depende de

551
00:26:37,000 --> 00:26:38,000
cada pareja de primers

552
00:26:38,000 --> 00:26:40,000
y de la temperatura de melting

553
00:26:40,000 --> 00:26:41,000
suele estar

554
00:26:41,000 --> 00:26:43,000
y esto sí que es importante

555
00:26:43,000 --> 00:26:45,000
suele estar en torno a

556
00:26:45,000 --> 00:26:47,000
50-65 grados

557
00:26:47,000 --> 00:26:49,000
la temperatura de anilin

558
00:26:49,000 --> 00:26:51,000
nunca a los 65 grados

559
00:26:51,000 --> 00:26:53,000
porque sería

560
00:26:53,000 --> 00:26:55,000
muy difícil que hiciese la hibridación

561
00:26:55,000 --> 00:26:57,000
y tampoco por debajo de

562
00:26:57,000 --> 00:26:59,000
50 grados

563
00:26:59,000 --> 00:27:01,000
y esto es muy importante

564
00:27:01,000 --> 00:27:03,000
cuanto mayor sea

565
00:27:03,000 --> 00:27:05,000
la temperatura de anilin

566
00:27:05,000 --> 00:27:07,000
es decir, cuanto más se aproxime

567
00:27:07,000 --> 00:27:09,000
a 60-62-65 grados

568
00:27:11,000 --> 00:27:13,000
hacemos que la reacción

569
00:27:13,000 --> 00:27:15,000
de PCR sea más específica

570
00:27:15,000 --> 00:27:17,000
cuanto menos sea

571
00:27:17,000 --> 00:27:19,000
la temperatura de anilin

572
00:27:19,000 --> 00:27:21,000
cuanto más se acerque

573
00:27:21,000 --> 00:27:23,000
a 55 grados

574
00:27:23,000 --> 00:27:25,000
52, 50 grados

575
00:27:25,000 --> 00:27:27,000
permitimos

576
00:27:27,000 --> 00:27:29,000
que la reacción sea menos específica

577
00:27:29,000 --> 00:27:31,000
¿Por qué?

578
00:27:31,000 --> 00:27:33,000
Porque permitimos que estos primers

579
00:27:33,000 --> 00:27:35,000
se puedan pegar

580
00:27:35,000 --> 00:27:37,000
a lo largo de todo el DNA molde

581
00:27:37,000 --> 00:27:39,000
en sitios de forma inespecífica

582
00:27:39,000 --> 00:27:41,000
por tanto

583
00:27:41,000 --> 00:27:43,000
la temperatura de anilin

584
00:27:43,000 --> 00:27:45,000
la temperatura de anilin

585
00:27:45,000 --> 00:27:47,000
es muy importante

586
00:27:47,000 --> 00:27:49,000
y cuanto más cercana

587
00:27:49,000 --> 00:27:51,000
cuanto más alta sea

588
00:27:51,000 --> 00:27:53,000
mejor, cuanto más cercana

589
00:27:53,000 --> 00:27:55,000
a 60-62-65 grados

590
00:27:55,000 --> 00:27:57,000
mejor

591
00:27:57,000 --> 00:27:59,000
porque hacemos que la reacción

592
00:27:59,000 --> 00:28:01,000
sea más específica

593
00:28:01,000 --> 00:28:03,000
y hacemos que a estos primers

594
00:28:03,000 --> 00:28:05,000
les sea muy difícil

595
00:28:05,000 --> 00:28:07,000
unirse a sitios de forma inespecífica

596
00:28:07,000 --> 00:28:09,000
y solamente se unirán

597
00:28:09,000 --> 00:28:11,000
donde se puedan unir de forma

598
00:28:11,000 --> 00:28:13,000
fuerte

599
00:28:13,000 --> 00:28:15,000
Muy bien, primer paso

600
00:28:15,000 --> 00:28:17,000
de naturalización, segundo paso

601
00:28:17,000 --> 00:28:19,000
el anilin, tercer paso

602
00:28:19,000 --> 00:28:21,000
es lo que llamamos la fase de extensión

603
00:28:21,000 --> 00:28:23,000
es decir

604
00:28:23,000 --> 00:28:25,000
en esta fase de extensión vamos a

605
00:28:25,000 --> 00:28:27,000
poner el tubo a la temperatura

606
00:28:27,000 --> 00:28:29,000
óptima

607
00:28:29,000 --> 00:28:31,000
de la DNA polimerasa

608
00:28:31,000 --> 00:28:33,000
para que polimerice, si os acordáis

609
00:28:33,000 --> 00:28:35,000
a 72 grados, entre 70 y 75

610
00:28:35,000 --> 00:28:37,000
suele ser 72 grados

611
00:28:37,000 --> 00:28:39,000
a esta temperatura

612
00:28:39,000 --> 00:28:41,000
de 72 grados

613
00:28:41,000 --> 00:28:43,000
la DNA polimerasa

614
00:28:43,000 --> 00:28:45,000
va a extender

615
00:28:45,000 --> 00:28:47,000
de ahí su nombre de extensión

616
00:28:47,000 --> 00:28:49,000
va a ir añadiendo nucleótidos

617
00:28:49,000 --> 00:28:51,000
de forma complementaria

618
00:28:51,000 --> 00:28:53,000
¿hasta dónde?

619
00:28:53,000 --> 00:28:55,000
hasta que se acabe la molécula

620
00:28:55,000 --> 00:28:57,000
¿cuánto tiempo ponemos de extensión?

621
00:28:57,000 --> 00:28:59,000
esto es muy importante

622
00:28:59,000 --> 00:29:01,000
también

623
00:29:01,000 --> 00:29:03,000
no viene en el libro, así es que

624
00:29:03,000 --> 00:29:05,000
apuntadlo, hay una regla

625
00:29:05,000 --> 00:29:07,000
clásica que dice que

626
00:29:07,000 --> 00:29:09,000
tenemos que poner

627
00:29:09,000 --> 00:29:11,000
de tiempo de extensión

628
00:29:11,000 --> 00:29:13,000
10 segundos

629
00:29:13,000 --> 00:29:15,000
10 segundos de extensión

630
00:29:15,000 --> 00:29:17,000
por cada 100 pares de bases

631
00:29:17,000 --> 00:29:19,000
que tenga que amplificar

632
00:29:19,000 --> 00:29:21,000
la polimerasa

633
00:29:21,000 --> 00:29:23,000
es decir, si quiero

634
00:29:23,000 --> 00:29:25,000
amplificar un fragmento que tiene

635
00:29:25,000 --> 00:29:27,000
200 pares de bases

636
00:29:27,000 --> 00:29:29,000
tendré que poner

637
00:29:29,000 --> 00:29:31,000
20 segundos

638
00:29:33,000 --> 00:29:35,000
20 segundos de extensión

639
00:29:35,000 --> 00:29:37,000
si quiero amplificar

640
00:29:37,000 --> 00:29:39,000
un fragmento que tiene

641
00:29:39,000 --> 00:29:41,000
850 pares

642
00:29:41,000 --> 00:29:43,000
de bases

643
00:29:43,000 --> 00:29:45,000
tendré que poner 85 segundos

644
00:29:45,000 --> 00:29:47,000
de extensión, es decir

645
00:29:47,000 --> 00:29:49,000
1 minuto y 25 segundos

646
00:29:49,000 --> 00:29:51,000
¿se entiende?

647
00:29:51,000 --> 00:29:53,000
por tanto, 10 segundos

648
00:29:53,000 --> 00:29:55,000
de extensión

649
00:29:55,000 --> 00:29:57,000
cada 100 pares de bases que tenga que amplificar

650
00:29:57,000 --> 00:29:59,000
la polimerasa

651
00:29:59,000 --> 00:30:01,000
por tanto, el ciclo básico

652
00:30:01,000 --> 00:30:03,000
de una PCR consta

653
00:30:03,000 --> 00:30:05,000
de tres fases

654
00:30:05,000 --> 00:30:07,000
desnaturalización

655
00:30:07,000 --> 00:30:09,000
anilin y extensión

656
00:30:09,000 --> 00:30:11,000
cada una de estas fases

657
00:30:11,000 --> 00:30:13,000
es a una temperatura diferente

658
00:30:13,000 --> 00:30:15,000
95

659
00:30:15,000 --> 00:30:17,000
la temperatura de anilin

660
00:30:17,000 --> 00:30:19,000
correspondiente y 72 grados

661
00:30:19,000 --> 00:30:21,000
si os dais cuenta

662
00:30:21,000 --> 00:30:23,000
desnaturalización y extensión siempre son

663
00:30:23,000 --> 00:30:25,000
a la misma temperatura

664
00:30:25,000 --> 00:30:27,000
siempre son

665
00:30:27,000 --> 00:30:29,000
a la misma temperatura

666
00:30:29,000 --> 00:30:31,000
independientemente de si el fragmento es muy largo

667
00:30:31,000 --> 00:30:33,000
el fragmento que queremos amplificar

668
00:30:33,000 --> 00:30:35,000
es muy largo, es muy corto

669
00:30:35,000 --> 00:30:37,000
95 grados, 72 grados

670
00:30:39,000 --> 00:30:41,000
la temperatura de anilin es la que siempre varía

671
00:30:41,000 --> 00:30:43,000
y ya hemos dicho que depende de que

672
00:30:43,000 --> 00:30:45,000
pareja de primers

673
00:30:45,000 --> 00:30:47,000
tenemos aquí

674
00:30:47,000 --> 00:30:49,000
¿cuánto tiempo

675
00:30:49,000 --> 00:30:51,000
tiene que estar

676
00:30:51,000 --> 00:30:53,000
en la desnaturalización?

677
00:30:53,000 --> 00:30:55,000
¿de qué depende? de la longitud del DNA molde

678
00:30:55,000 --> 00:30:57,000
¿cuánto tiempo ponemos

679
00:30:57,000 --> 00:30:59,000
de hibridación?

680
00:30:59,000 --> 00:31:01,000
ya sabemos

681
00:31:01,000 --> 00:31:03,000
se pone poquito tiempo

682
00:31:03,000 --> 00:31:05,000
¿vale? de hibridación

683
00:31:05,000 --> 00:31:07,000
suele estar en torno a 30-60 segundos

684
00:31:07,000 --> 00:31:09,000
¿de acuerdo?

685
00:31:09,000 --> 00:31:11,000
no mucho más, con 30 segundos

686
00:31:11,000 --> 00:31:13,000
es suficiente, incluso con menos

687
00:31:13,000 --> 00:31:15,000
y de extensión ya hemos dicho

688
00:31:15,000 --> 00:31:17,000
que pondremos 10 segundos

689
00:31:17,000 --> 00:31:19,000
de extensión por cada 100 pares

690
00:31:19,000 --> 00:31:21,000
de bases ¿de acuerdo?

691
00:31:21,000 --> 00:31:23,000
por tanto, queremos

692
00:31:23,000 --> 00:31:25,000
hacer una PCR que tiene que tener

693
00:31:25,000 --> 00:31:27,000
30 ciclos

694
00:31:27,000 --> 00:31:29,000
¿de acuerdo? pues hará 30 ciclos

695
00:31:29,000 --> 00:31:31,000
de desnaturaliza

696
00:31:31,000 --> 00:31:33,000
hibrida, extiende

697
00:31:33,000 --> 00:31:35,000
y de nuevo, desnaturaliza

698
00:31:35,000 --> 00:31:37,000
hibrida, extiende

699
00:31:37,000 --> 00:31:39,000
tercer ciclo, desnaturaliza, hibrida

700
00:31:39,000 --> 00:31:41,000
extiende, cuarto ciclo

701
00:31:41,000 --> 00:31:43,000
desnaturaliza, hibrida, extiende

702
00:31:43,000 --> 00:31:45,000
¿se entiende como funciona?

703
00:31:45,000 --> 00:31:47,000
así hasta los

704
00:31:47,000 --> 00:31:49,000
25, 30, 35 ciclos

705
00:31:49,000 --> 00:31:51,000
que dure la PCR

706
00:31:51,000 --> 00:31:53,000
¿de acuerdo?

707
00:31:53,000 --> 00:31:55,000
esto es muy importante

708
00:31:55,000 --> 00:31:57,000
para realizar esta PCR

709
00:31:57,000 --> 00:31:59,000
utilizamos un termociclador

710
00:31:59,000 --> 00:32:01,000
si os acordáis, el termociclador

711
00:32:01,000 --> 00:32:03,000
tiene un termobloque que está

712
00:32:03,000 --> 00:32:05,000
hecho de un material

713
00:32:05,000 --> 00:32:07,000
que por un proceso de impedancias

714
00:32:07,000 --> 00:32:09,000
es capaz de cambiar

715
00:32:09,000 --> 00:32:11,000
de 95 a 60 grados

716
00:32:11,000 --> 00:32:13,000
a 72 grados

717
00:32:13,000 --> 00:32:15,000
y vuelta 95, 60, 62

718
00:32:15,000 --> 00:32:17,000
a 72

719
00:32:17,000 --> 00:32:19,000
de forma tremendamente rápida

720
00:32:19,000 --> 00:32:21,000
¿de acuerdo?

721
00:32:21,000 --> 00:32:23,000
de tal manera que la PCR, los 30 ciclos

722
00:32:23,000 --> 00:32:25,000
de PCR puede hacerlos fácilmente

723
00:32:25,000 --> 00:32:27,000
en una hora y media, dos horas

724
00:32:27,000 --> 00:32:29,000
¿de acuerdo?

725
00:32:31,000 --> 00:32:33,000
vale, en cuanto a los productos

726
00:32:33,000 --> 00:32:35,000
de amplificación

727
00:32:35,000 --> 00:32:37,000
es lógico pensar

728
00:32:37,000 --> 00:32:39,000
que después de cada uno de los ciclos

729
00:32:39,000 --> 00:32:41,000
vamos a ir obteniendo

730
00:32:41,000 --> 00:32:43,000
una serie de productos amplificados

731
00:32:43,000 --> 00:32:45,000
es decir

732
00:32:45,000 --> 00:32:47,000
teníamos este DNA molde

733
00:32:47,000 --> 00:32:49,000
hemos hecho el primer ciclo

734
00:32:49,000 --> 00:32:51,000
de PCR, hemos desnaturalizado

735
00:32:51,000 --> 00:32:53,000
hemos hecho

736
00:32:53,000 --> 00:32:55,000
el annealing de los primers

737
00:32:55,000 --> 00:32:57,000
y ha extendido la polimerasa

738
00:32:57,000 --> 00:32:59,000
cuando acabe

739
00:32:59,000 --> 00:33:01,000
este primer ciclo

740
00:33:01,000 --> 00:33:03,000
ya no tenemos solamente DNA molde

741
00:33:03,000 --> 00:33:05,000
en el tubo, tenemos

742
00:33:05,000 --> 00:33:07,000
estas nuevas cadenas también

743
00:33:07,000 --> 00:33:09,000
que están formadas por una parte de primer

744
00:33:09,000 --> 00:33:11,000
y la parte

745
00:33:11,000 --> 00:33:13,000
extendida que ha hecho

746
00:33:13,000 --> 00:33:15,000
la polimerasa

747
00:33:15,000 --> 00:33:17,000
y la otra

748
00:33:17,000 --> 00:33:19,000
¿de acuerdo? por tanto, a cada ciclo

749
00:33:19,000 --> 00:33:21,000
vamos a ir obteniendo una serie

750
00:33:21,000 --> 00:33:23,000
de productos de amplificación

751
00:33:23,000 --> 00:33:25,000
de PCR

752
00:33:25,000 --> 00:33:27,000
¿qué es lo más importante?

753
00:33:27,000 --> 00:33:29,000
de esta parte del tema

754
00:33:29,000 --> 00:33:31,000
de este apartado del libro

755
00:33:31,000 --> 00:33:33,000
lo más importante es tener en cuenta

756
00:33:33,000 --> 00:33:35,000
que hasta que no lleguemos al tercer ciclo

757
00:33:37,000 --> 00:33:39,000
hasta que no lleguemos al tercer ciclo

758
00:33:39,000 --> 00:33:41,000
no vamos a obtener

759
00:33:41,000 --> 00:33:43,000
el fragmento que queremos amplificar

760
00:33:43,000 --> 00:33:45,000
daos cuenta que

761
00:33:45,000 --> 00:33:47,000
el fragmento que queremos amplificar

762
00:33:47,000 --> 00:33:49,000
decimos que lo hemos conseguido

763
00:33:49,000 --> 00:33:51,000
cuando tenemos

764
00:33:51,000 --> 00:33:53,000
y vuelvo

765
00:33:53,000 --> 00:33:55,000
a esta diapositiva

766
00:33:55,000 --> 00:33:57,000
este fragmento que ha amplificado

767
00:33:57,000 --> 00:33:59,000
esta cadena que ha amplificado

768
00:33:59,000 --> 00:34:01,000
¿es la que nosotros

769
00:34:01,000 --> 00:34:03,000
queremos?

770
00:34:03,000 --> 00:34:05,000
no, ¿por qué no es la que nosotros

771
00:34:05,000 --> 00:34:07,000
queremos? porque nosotros queremos

772
00:34:07,000 --> 00:34:09,000
que esta cadena vaya desde aquí

773
00:34:09,000 --> 00:34:11,000
hasta aquí

774
00:34:11,000 --> 00:34:13,000
por tanto

775
00:34:13,000 --> 00:34:15,000
toda esta parte de aquí, de esta primera

776
00:34:15,000 --> 00:34:17,000
cadena, le sobra

777
00:34:17,000 --> 00:34:19,000
igual toda esta parte de aquí, de esta cadena

778
00:34:19,000 --> 00:34:21,000
le sobra, de tal manera que

779
00:34:21,000 --> 00:34:23,000
no hemos obtenido

780
00:34:23,000 --> 00:34:25,000
hemos amplificado dos cadenas

781
00:34:25,000 --> 00:34:27,000
pero ninguna de ellas

782
00:34:27,000 --> 00:34:29,000
es

783
00:34:29,000 --> 00:34:31,000
desde el principio hasta el final

784
00:34:31,000 --> 00:34:33,000
el fragmento que queremos amplificar

785
00:34:33,000 --> 00:34:35,000
y además, segunda

786
00:34:35,000 --> 00:34:37,000
característica

787
00:34:37,000 --> 00:34:39,000
debe ser de doble cadena

788
00:34:39,000 --> 00:34:41,000
por tanto, no vamos a obtener

789
00:34:41,000 --> 00:34:43,000
el fragmento que queremos amplificar

790
00:34:43,000 --> 00:34:45,000
desde el principio hasta el final

791
00:34:45,000 --> 00:34:47,000
y siendo de doble cadena

792
00:34:47,000 --> 00:34:49,000
hasta que nos lleguemos al tercer ciclo

793
00:34:49,000 --> 00:34:51,000
esto, para los que no lo habéis

794
00:34:51,000 --> 00:34:53,000
visto nunca, es un pelín complejo

795
00:34:53,000 --> 00:34:55,000
tenéis un

796
00:34:55,000 --> 00:34:57,000
dibujo, sí, esquemático

797
00:34:57,000 --> 00:34:59,000
en la página 141

798
00:34:59,000 --> 00:35:01,000
del libro, lo podéis mirar

799
00:35:01,000 --> 00:35:03,000
yo os recomiendo que lo dibujéis

800
00:35:03,000 --> 00:35:05,000
entonces

801
00:35:05,000 --> 00:35:07,000
os dibujáis un DNA molde

802
00:35:07,000 --> 00:35:09,000
y os dibujáis primer ciclo

803
00:35:09,000 --> 00:35:11,000
una vez haya acabado el primer

804
00:35:11,000 --> 00:35:13,000
ciclo, qué productos

805
00:35:13,000 --> 00:35:15,000
de amplificación obtengo

806
00:35:17,000 --> 00:35:19,000
segundo ciclo, partiendo de

807
00:35:19,000 --> 00:35:21,000
los productos

808
00:35:21,000 --> 00:35:23,000
amplificados que he obtenido

809
00:35:23,000 --> 00:35:25,000
en el primer ciclo, a partir de ellos

810
00:35:25,000 --> 00:35:27,000
qué otros productos

811
00:35:27,000 --> 00:35:29,000
de amplificación obtengo

812
00:35:29,000 --> 00:35:31,000
y en el tercer ciclo

813
00:35:31,000 --> 00:35:33,000
y así en el cuarto, en el quinto, etc

814
00:35:33,000 --> 00:35:35,000
con que lleguéis al tercero es más que

815
00:35:35,000 --> 00:35:37,000
suficiente, yo no lo voy a

816
00:35:37,000 --> 00:35:39,000
hacer y lo voy a intentar explicar para que

817
00:35:39,000 --> 00:35:41,000
se vea bien, con un vídeo muy sencillito

818
00:35:41,000 --> 00:35:43,000
este es el esquema que os

819
00:35:43,000 --> 00:35:45,000
estoy diciendo, de acuerdo

820
00:35:45,000 --> 00:35:47,000
os pintáis un DNA molde en

821
00:35:47,000 --> 00:35:49,000
negro y luego utilizáis

822
00:35:49,000 --> 00:35:51,000
rotuladores de colorcito, como lo tienen

823
00:35:51,000 --> 00:35:53,000
aquí, si queréis

824
00:35:53,000 --> 00:35:55,000
y una vez hayáis obtenido estos

825
00:35:55,000 --> 00:35:57,000
productos después de acabar el primer

826
00:35:57,000 --> 00:35:59,000
ciclo, podéis hacer

827
00:35:59,000 --> 00:36:01,000
cuáles serían los productos después

828
00:36:01,000 --> 00:36:03,000
de acabar el segundo ciclo

829
00:36:03,000 --> 00:36:05,000
después de acabar el tercer ciclo

830
00:36:05,000 --> 00:36:07,000
y ahí con eso es suficiente

831
00:36:07,000 --> 00:36:09,000
si os dais cuenta

832
00:36:09,000 --> 00:36:11,000
este es el fragmento, estos de aquí

833
00:36:11,000 --> 00:36:13,000
abajo

834
00:36:13,000 --> 00:36:15,000
son los que nosotros queremos

835
00:36:15,000 --> 00:36:17,000
obtener desde el principio

836
00:36:17,000 --> 00:36:19,000
desde el primer primer hasta el

837
00:36:19,000 --> 00:36:21,000
final, desde el forward al reverse

838
00:36:21,000 --> 00:36:23,000
y además de doble cadena

839
00:36:23,000 --> 00:36:25,000
con este

840
00:36:25,000 --> 00:36:27,000
vídeo yo creo que se va a entender

841
00:36:27,000 --> 00:36:29,000
mucho mejor

842
00:36:29,000 --> 00:36:31,000
os lo voy a ir explicando

843
00:36:31,000 --> 00:36:33,000
nosotros tenemos

844
00:36:33,000 --> 00:36:35,000
nuestro tubo, aquí lo han

845
00:36:35,000 --> 00:36:37,000
puesto a 35 grados, estaría a temperatura

846
00:36:37,000 --> 00:36:39,000
ambiente, dentro de nuestro tubo

847
00:36:39,000 --> 00:36:41,000
hemos puesto los primers

848
00:36:41,000 --> 00:36:43,000
hemos puesto

849
00:36:43,000 --> 00:36:45,000
perdón

850
00:36:45,000 --> 00:36:47,000
a ver

851
00:36:51,000 --> 00:36:53,000
un segundito

852
00:36:59,000 --> 00:37:01,000
a ver que tengo

853
00:37:01,000 --> 00:37:03,000
un problema

854
00:37:05,000 --> 00:37:07,000
automático

855
00:37:07,000 --> 00:37:09,000
automático

856
00:37:09,000 --> 00:37:11,000
automático

857
00:37:11,000 --> 00:37:13,000
vamos a ver en el anterior

858
00:37:13,000 --> 00:37:15,000
lo vamos a ir viendo

859
00:37:15,000 --> 00:37:17,000
fijaros, tenemos en nuestro tubo

860
00:37:17,000 --> 00:37:19,000
a 35 grados

861
00:37:19,000 --> 00:37:21,000
podría estar a temperatura ambiente

862
00:37:21,000 --> 00:37:23,000
tenemos todas las moléculas de DNA

863
00:37:23,000 --> 00:37:25,000
molde

864
00:37:25,000 --> 00:37:27,000
imaginaos que son

865
00:37:27,000 --> 00:37:29,000
el cromosoma 1

866
00:37:29,000 --> 00:37:31,000
o un DNA mitocondrial

867
00:37:31,000 --> 00:37:33,000
da igual, son de doble cadena

868
00:37:33,000 --> 00:37:35,000
de tal manera que

869
00:37:35,000 --> 00:37:37,000
nos vamos a quedar con este ejemplo

870
00:37:37,000 --> 00:37:39,000
con esta cadena, ejemplo

871
00:37:39,000 --> 00:37:41,000
todas son iguales, ya veis que tienen

872
00:37:41,000 --> 00:37:43,000
dos

873
00:37:43,000 --> 00:37:45,000
son bicatenarias

874
00:37:45,000 --> 00:37:47,000
una cadena la han pintado en azul

875
00:37:47,000 --> 00:37:49,000
que sería esta de aquí, imaginaos

876
00:37:49,000 --> 00:37:51,000
que es la 5'3'

877
00:37:51,000 --> 00:37:53,000
y la otra es la fucsia

878
00:37:53,000 --> 00:37:55,000
que sería 3'5'

879
00:37:55,000 --> 00:37:57,000
y dentro de toda esta longitud

880
00:37:57,000 --> 00:37:59,000
de esta

881
00:37:59,000 --> 00:38:01,000
molécula de ácido nucleico

882
00:38:01,000 --> 00:38:03,000
de DNA bicatenario tenemos

883
00:38:03,000 --> 00:38:05,000
la secuencia target

884
00:38:05,000 --> 00:38:07,000
el fragmento que queremos amplificar

885
00:38:07,000 --> 00:38:09,000
aquí lo han representado en verde

886
00:38:09,000 --> 00:38:11,000
¿de acuerdo?

887
00:38:11,000 --> 00:38:13,000
a ver

888
00:38:13,000 --> 00:38:15,000
un segundito

889
00:38:15,000 --> 00:38:17,000
tenemos la

890
00:38:17,000 --> 00:38:19,000
secuencia

891
00:38:19,000 --> 00:38:21,000
target, ¿de acuerdo?

892
00:38:21,000 --> 00:38:23,000
el fragmento que nosotros queremos amplificar

893
00:38:23,000 --> 00:38:25,000
comienza el primer ciclo

894
00:38:25,000 --> 00:38:27,000
uy, esto

895
00:38:27,000 --> 00:38:29,000
es que

896
00:38:29,000 --> 00:38:31,000
perdonad, pero es que es un poco

897
00:38:31,000 --> 00:38:33,000
ahora

898
00:38:33,000 --> 00:38:35,000
comienza el primer ciclo, ¿de acuerdo?

899
00:38:35,000 --> 00:38:37,000
el primer ciclo ya sabemos, empieza

900
00:38:37,000 --> 00:38:39,000
primera fase, fase de desnaturalización

901
00:38:39,000 --> 00:38:41,000
ponemos el tubo

902
00:38:41,000 --> 00:38:43,000
a 95º, se produce la

903
00:38:43,000 --> 00:38:45,000
desnaturalización completa

904
00:38:45,000 --> 00:38:47,000
¿de acuerdo?

905
00:38:47,000 --> 00:38:49,000
una vez que ha desnaturalizado

906
00:38:49,000 --> 00:38:51,000
temperatura de anilin

907
00:38:51,000 --> 00:38:53,000
imaginaos que para estos primers

908
00:38:53,000 --> 00:38:55,000
este sería el forward

909
00:38:55,000 --> 00:38:57,000
y este sería el reverse, el forward es el

910
00:38:57,000 --> 00:38:59,000
que va al principio de la secuencia

911
00:38:59,000 --> 00:39:01,000
que quiero amplificar, el reverse

912
00:39:01,000 --> 00:39:03,000
como ya hemos dicho es el que va al final

913
00:39:05,000 --> 00:39:07,000
imaginaos que para esta pareja de primers

914
00:39:07,000 --> 00:39:09,000
su temperatura de anilin son 60º

915
00:39:09,000 --> 00:39:11,000
¿de acuerdo? pues

916
00:39:11,000 --> 00:39:13,000
ponemos la reacción a 60º

917
00:39:13,000 --> 00:39:15,000
¿de acuerdo? de tal manera que

918
00:39:15,000 --> 00:39:17,000
favorecemos que se produzca

919
00:39:17,000 --> 00:39:19,000
el anilin, ¿de acuerdo?

920
00:39:19,000 --> 00:39:21,000
cada uno de los primers se une específicamente

921
00:39:21,000 --> 00:39:23,000
al extremo 3'

922
00:39:23,000 --> 00:39:25,000
de su DNA molde, o sea, este de aquí

923
00:39:25,000 --> 00:39:27,000
no se puede unir aquí, sino que se une ahí

924
00:39:27,000 --> 00:39:29,000
y ahora

925
00:39:29,000 --> 00:39:31,000
la pondremos a 72º para

926
00:39:31,000 --> 00:39:33,000
que la TAC polimerasa

927
00:39:33,000 --> 00:39:35,000
en este caso es una TAC polimerasa, pueda

928
00:39:35,000 --> 00:39:37,000
coger los nucleótidos

929
00:39:37,000 --> 00:39:39,000
que se encuentran aquí libres y pueda

930
00:39:39,000 --> 00:39:41,000
amplificar, ¿de acuerdo?

931
00:39:41,000 --> 00:39:43,000
va amplificando, va amplificando

932
00:39:43,000 --> 00:39:45,000
¿hasta dónde amplifica?

933
00:39:45,000 --> 00:39:47,000
hasta que se

934
00:39:47,000 --> 00:39:49,000
acabe el DNA molde, ¿de acuerdo?

935
00:39:49,000 --> 00:39:51,000
o también podría ser

936
00:39:51,000 --> 00:39:53,000
hasta que se acabe el DNA molde

937
00:39:53,000 --> 00:39:55,000
o hasta que acabe el tiempo

938
00:39:55,000 --> 00:39:57,000
acordaos que de extensión

939
00:39:57,000 --> 00:39:59,000
pues imaginaos que le vamos a dar

940
00:39:59,000 --> 00:40:01,000
30 segundos

941
00:40:01,000 --> 00:40:03,000
de extensión

942
00:40:03,000 --> 00:40:05,000
pues si en esos 30 segundos

943
00:40:05,000 --> 00:40:07,000
de extensión ha empezado la polimerasa

944
00:40:07,000 --> 00:40:09,000
acaba el fragmento y se queda aquí

945
00:40:09,000 --> 00:40:11,000
este fragmento

946
00:40:11,000 --> 00:40:13,000
quedaría amplificado hasta aquí, ¿de acuerdo?

947
00:40:15,000 --> 00:40:17,000
muy bien, y acaba

948
00:40:17,000 --> 00:40:19,000
de tal manera que al final

949
00:40:21,000 --> 00:40:23,000
del primer ciclo tenemos

950
00:40:23,000 --> 00:40:25,000
estos productos de

951
00:40:25,000 --> 00:40:27,000
amplificación que aquí

952
00:40:27,000 --> 00:40:29,000
os los ponen esquematizados

953
00:40:29,000 --> 00:40:31,000
¿de acuerdo? tendríamos

954
00:40:31,000 --> 00:40:33,000
perdón, tiro un poquito para atrás

955
00:40:33,000 --> 00:40:35,000
¿de acuerdo?

956
00:40:35,000 --> 00:40:37,000
tenemos

957
00:40:37,000 --> 00:40:39,000
esta hebra y esta hebra

958
00:40:39,000 --> 00:40:41,000
si os acordáis son las originales

959
00:40:41,000 --> 00:40:43,000
y estas dos hebras que son de

960
00:40:43,000 --> 00:40:45,000
nueva síntesis, tenemos

961
00:40:45,000 --> 00:40:47,000
el reverse, a partir del reverse

962
00:40:47,000 --> 00:40:49,000
se ha sintetizado esta cadena

963
00:40:49,000 --> 00:40:51,000
y a partir del forward se ha sintetizado

964
00:40:51,000 --> 00:40:53,000
esta cadena por la polimerasa

965
00:40:53,000 --> 00:40:55,000
¿de acuerdo? estos son los productos

966
00:40:55,000 --> 00:40:57,000
de amplificación y ahora comienza

967
00:40:57,000 --> 00:40:59,000
el segundo ciclo

968
00:40:59,000 --> 00:41:01,000
cuando comienza el segundo ciclo empezamos de nuevo

969
00:41:01,000 --> 00:41:03,000
fase de desnaturalización

970
00:41:03,000 --> 00:41:05,000
a 95 grados

971
00:41:05,000 --> 00:41:07,000
para que se

972
00:41:07,000 --> 00:41:09,000
desnaturalice, ¿de acuerdo?

973
00:41:09,000 --> 00:41:11,000
60 grados, temperatura de anilin

974
00:41:11,000 --> 00:41:13,000
para que los primers nuevamente

975
00:41:13,000 --> 00:41:15,000
se puedan unir, daos cuenta

976
00:41:15,000 --> 00:41:17,000
que ahora los primers

977
00:41:17,000 --> 00:41:19,000
no solamente se van a unir

978
00:41:19,000 --> 00:41:21,000
a las hebras

979
00:41:21,000 --> 00:41:23,000
molde del principio

980
00:41:23,000 --> 00:41:25,000
sino que también se van a unir

981
00:41:25,000 --> 00:41:27,000
a las hebras

982
00:41:27,000 --> 00:41:29,000
de nueva síntesis del primer

983
00:41:29,000 --> 00:41:31,000
ciclo, ¿de acuerdo? entonces los primers

984
00:41:31,000 --> 00:41:33,000
van a hibridar siempre en

985
00:41:33,000 --> 00:41:35,000
aquellas secuencias que sean específicas

986
00:41:35,000 --> 00:41:37,000
independientemente de si son

987
00:41:37,000 --> 00:41:39,000
las de partida o si son las de

988
00:41:39,000 --> 00:41:41,000
nueva síntesis, temperatura

989
00:41:41,000 --> 00:41:43,000
de anilin, 60 grados, se ha producido

990
00:41:43,000 --> 00:41:45,000
el anilin, la hibridación

991
00:41:45,000 --> 00:41:47,000
y empezará a 72 grados

992
00:41:47,000 --> 00:41:49,000
la extensión y se van a extender

993
00:41:49,000 --> 00:41:51,000
todas ellas, en este caso

994
00:41:51,000 --> 00:41:53,000
¿hasta dónde se van a extender?

995
00:41:53,000 --> 00:41:55,000
pues la polimerasa va a ir extendiendo

996
00:41:55,000 --> 00:41:57,000
hasta el final de la cadena

997
00:41:57,000 --> 00:41:59,000
igualmente, si os dais cuenta

998
00:42:01,000 --> 00:42:03,000
tenemos

999
00:42:03,000 --> 00:42:05,000
ahora cuatro cadenas

1000
00:42:05,000 --> 00:42:07,000
que tienen fragmentos bicatenarios

1001
00:42:07,000 --> 00:42:09,000
y fragmentos monocatenarios

1002
00:42:09,000 --> 00:42:11,000
si os dais cuenta

1003
00:42:11,000 --> 00:42:13,000
y cada una respecto de las otras son

1004
00:42:13,000 --> 00:42:15,000
completamente diferentes

1005
00:42:15,000 --> 00:42:17,000
ahora yo os pregunto

1006
00:42:17,000 --> 00:42:19,000
¿alguna de estas moléculas

1007
00:42:19,000 --> 00:42:21,000
es

1008
00:42:21,000 --> 00:42:23,000
ya la secuencia target?

1009
00:42:23,000 --> 00:42:25,000
¿es el fragmento que yo quería amplificar?

1010
00:42:25,000 --> 00:42:27,000
no

1011
00:42:27,000 --> 00:42:29,000
¿por qué? porque a esta

1012
00:42:29,000 --> 00:42:31,000
estas dos, que son las que más se aproximan

1013
00:42:31,000 --> 00:42:33,000
a las que más se parecen

1014
00:42:33,000 --> 00:42:35,000
les cuelga aquí una cola

1015
00:42:35,000 --> 00:42:37,000
todavía una cola

1016
00:42:37,000 --> 00:42:39,000
monocatenaria

1017
00:42:39,000 --> 00:42:41,000
de tal manera que, aunque ya contengo

1018
00:42:41,000 --> 00:42:43,000
desde el principio hasta el final

1019
00:42:43,000 --> 00:42:45,000
el fragmento que yo quiero, esta cola

1020
00:42:45,000 --> 00:42:47,000
me molesta

1021
00:42:47,000 --> 00:42:49,000
por tanto, esta molécula y esta molécula

1022
00:42:49,000 --> 00:42:51,000
no son el fragmento que yo quiero

1023
00:42:51,000 --> 00:42:53,000
amplificar

1024
00:42:53,000 --> 00:42:55,000
¿de acuerdo?

1025
00:42:55,000 --> 00:42:57,000
llegamos

1026
00:42:57,000 --> 00:42:59,000
al final del segundo ciclo

1027
00:42:59,000 --> 00:43:01,000
comienza el tercer

1028
00:43:01,000 --> 00:43:03,000
ciclo, aunque se ve un pelín pixelado

1029
00:43:03,000 --> 00:43:05,000
¿de acuerdo?

1030
00:43:05,000 --> 00:43:07,000
hemos puesto a 95 grados

1031
00:43:07,000 --> 00:43:09,000
y todas ellas se han vuelto

1032
00:43:09,000 --> 00:43:11,000
a desnaturalizar

1033
00:43:11,000 --> 00:43:13,000
temperatura de anilin, nuevamente

1034
00:43:13,000 --> 00:43:15,000
los primers se van a unir a todas

1035
00:43:15,000 --> 00:43:17,000
ellas en las secuencias específicas

1036
00:43:17,000 --> 00:43:19,000
y ahora a 72 grados

1037
00:43:19,000 --> 00:43:21,000
¿de acuerdo?

1038
00:43:21,000 --> 00:43:23,000
vuelven a amplificar ¿hasta dónde?

1039
00:43:23,000 --> 00:43:25,000
nuevamente, hasta que acaba la molécula

1040
00:43:25,000 --> 00:43:27,000
pero si os dais cuenta

1041
00:43:27,000 --> 00:43:29,000
de todos estos

1042
00:43:29,000 --> 00:43:31,000
productos

1043
00:43:31,000 --> 00:43:33,000
¿de acuerdo?

1044
00:43:33,000 --> 00:43:35,000
hay dos

1045
00:43:35,000 --> 00:43:37,000
que ahora sí

1046
00:43:37,000 --> 00:43:39,000
estos dos fragmentos, sí que son

1047
00:43:39,000 --> 00:43:41,000
el fragmento que yo quería amplificar

1048
00:43:41,000 --> 00:43:43,000
desde el principio hasta el final

1049
00:43:43,000 --> 00:43:45,000
y de doble cadena

1050
00:43:45,000 --> 00:43:47,000
forward, reverse

1051
00:43:47,000 --> 00:43:49,000
y doble cadena

1052
00:43:49,000 --> 00:43:51,000
¿de acuerdo? entonces, hasta el tercer

1053
00:43:51,000 --> 00:43:53,000
ciclo de la PCR, no obtengo

1054
00:43:53,000 --> 00:43:55,000
los primeros fragmentos

1055
00:43:55,000 --> 00:43:57,000
amplificados

1056
00:43:57,000 --> 00:43:59,000
específicos, porque todos

1057
00:43:59,000 --> 00:44:01,000
estos de aquí, yo no los quiero

1058
00:44:01,000 --> 00:44:03,000
he servido para llegar aquí, pero ahora no los quiero

1059
00:44:03,000 --> 00:44:05,000
¿de acuerdo?

1060
00:44:17,000 --> 00:44:19,000
al final del tercer ciclo, por tanto

1061
00:44:19,000 --> 00:44:21,000
esto es lo que obtenemos, empezaría

1062
00:44:21,000 --> 00:44:23,000
el cuarto ciclo y volvemos

1063
00:44:23,000 --> 00:44:25,000
nuevamente, desnaturalización

1064
00:44:27,000 --> 00:44:29,000
¿de acuerdo?

1065
00:44:29,000 --> 00:44:31,000
aniline

1066
00:44:31,000 --> 00:44:33,000
se han unido los primers

1067
00:44:33,000 --> 00:44:35,000
72 grados, vuelven a amplificar

1068
00:44:35,000 --> 00:44:37,000
de tal manera que ahora

1069
00:44:37,000 --> 00:44:39,000
¿de acuerdo?

1070
00:44:39,000 --> 00:44:41,000
fijaos que poquitas

1071
00:44:41,000 --> 00:44:43,000
8, si os dais cuenta antes eran

1072
00:44:43,000 --> 00:44:45,000
4 y 2

1073
00:44:45,000 --> 00:44:47,000
y ahora ya en el cuarto ciclo tenemos

1074
00:44:47,000 --> 00:44:49,000
8 y 8

1075
00:44:49,000 --> 00:44:51,000
8 moléculas

1076
00:44:51,000 --> 00:44:53,000
largas y 8 moléculas

1077
00:44:53,000 --> 00:44:55,000
que son el fragmento que yo quería amplificar

1078
00:44:55,000 --> 00:44:57,000
acaba el cuarto ciclo

1079
00:44:57,000 --> 00:44:59,000
y comenzará el quinto ciclo

1080
00:44:59,000 --> 00:45:01,000
¿de acuerdo?

1081
00:45:01,000 --> 00:45:03,000
nuevamente 95 grados

1082
00:45:03,000 --> 00:45:05,000
todos ellos desnaturalizan

1083
00:45:05,000 --> 00:45:07,000
60 grados, que es la temperatura

1084
00:45:07,000 --> 00:45:09,000
de aniline específica

1085
00:45:09,000 --> 00:45:11,000
y brindan los primers

1086
00:45:11,000 --> 00:45:13,000
72 grados, amplifican

1087
00:45:13,000 --> 00:45:15,000
¿de acuerdo? amplificación

1088
00:45:15,000 --> 00:45:17,000
extensión, de tal manera

1089
00:45:17,000 --> 00:45:19,000
que al final del quinto ciclo

1090
00:45:19,000 --> 00:45:21,000
si os dais cuenta, ahora voy a tener

1091
00:45:21,000 --> 00:45:23,000
10 y 22

1092
00:45:23,000 --> 00:45:25,000
y así sucesivamente

1093
00:45:25,000 --> 00:45:27,000
a cada ciclo que va pasando

1094
00:45:27,000 --> 00:45:29,000
voy obteniendo

1095
00:45:29,000 --> 00:45:31,000
van creciendo

1096
00:45:31,000 --> 00:45:33,000
de forma exponencial

1097
00:45:33,000 --> 00:45:35,000
daos cuenta

1098
00:45:35,000 --> 00:45:37,000
de forma exponencial

1099
00:45:37,000 --> 00:45:39,000
y esto es así

1100
00:45:39,000 --> 00:45:41,000
obtendré 60 moléculas después de

1101
00:45:41,000 --> 00:45:43,000
30 ciclos, 60 moléculas

1102
00:45:43,000 --> 00:45:45,000
de las largas y

1103
00:45:45,000 --> 00:45:47,000
más de mil millones

1104
00:45:47,000 --> 00:45:49,000
de copias de la

1105
00:45:49,000 --> 00:45:51,000
molécula que yo quería

1106
00:45:51,000 --> 00:45:53,000
obtener

1107
00:45:53,000 --> 00:45:55,000
espero que con este vídeo

1108
00:45:55,000 --> 00:45:57,000
lo podéis repasar, lo podéis poner todas las veces

1109
00:45:57,000 --> 00:45:59,000
que queráis

1110
00:45:59,000 --> 00:46:01,000
y haciendo el ejercicio que os he dicho

1111
00:46:01,000 --> 00:46:03,000
de dibujarlo

1112
00:46:03,000 --> 00:46:05,000
también, por lo menos hasta el

1113
00:46:05,000 --> 00:46:07,000
tercer, cuarto ciclo

1114
00:46:07,000 --> 00:46:09,000
espero que se entienda bien

1115
00:46:09,000 --> 00:46:11,000
todos

1116
00:46:11,000 --> 00:46:13,000
los ciclos de amplificación

1117
00:46:13,000 --> 00:46:15,000
y cuál es la dinámica de amplificación

1118
00:46:15,000 --> 00:46:17,000
en las reacciones de PCR

1119
00:46:17,000 --> 00:46:19,000
¿de acuerdo? aún así

1120
00:46:19,000 --> 00:46:21,000
os he puesto aquí también este segundo

1121
00:46:21,000 --> 00:46:23,000
vídeo que os lo voy a poner también

1122
00:46:23,000 --> 00:46:25,000
en el que se ve

1123
00:46:25,000 --> 00:46:27,000
os lo subiré a la plataforma

1124
00:46:27,000 --> 00:46:29,000
y lo podéis ver también todas las veces que queráis

1125
00:46:29,000 --> 00:46:31,000
¿de acuerdo?

1126
00:46:31,000 --> 00:46:33,000
con esto acabaríamos

1127
00:46:33,000 --> 00:46:35,000
estos dos primeros puntos

1128
00:46:35,000 --> 00:46:37,000
del

1129
00:46:37,000 --> 00:46:39,000
tema 6

1130
00:46:39,000 --> 00:46:41,000
de las técnicas

1131
00:46:41,000 --> 00:46:43,000
de PCR y de las bases teóricas

1132
00:46:43,000 --> 00:46:45,000
de la PCR

1133
00:46:45,000 --> 00:46:47,000
como actividad

1134
00:46:47,000 --> 00:46:49,000
como actividad

1135
00:46:50,000 --> 00:46:52,000
vais a hacer una actividad de diseño de primers

1136
00:46:52,000 --> 00:46:54,000
os la voy a explicar

1137
00:46:54,000 --> 00:46:56,000
más en concreto os la voy a subir

1138
00:46:56,000 --> 00:46:58,000
y os la voy a explicar en la plataforma

1139
00:46:58,000 --> 00:47:00,000
qué es lo que tenéis que hacer pero

1140
00:47:00,000 --> 00:47:02,000
para que os hagáis una idea

1141
00:47:02,000 --> 00:47:04,000
yo os he puesto aquí la secuencia de un gen

1142
00:47:04,000 --> 00:47:06,000
en este caso es del mensajero

1143
00:47:06,000 --> 00:47:08,000
¿de acuerdo?

1144
00:47:08,000 --> 00:47:10,000
no es la secuencia

1145
00:47:10,000 --> 00:47:12,000
es de un gen que es el GPX1

1146
00:47:12,000 --> 00:47:14,000
la glutatón peroxidasa 1

1147
00:47:14,000 --> 00:47:16,000
porque hay varias

1148
00:47:16,000 --> 00:47:18,000
de ellas

1149
00:47:18,000 --> 00:47:20,000
pero en este caso

1150
00:47:20,000 --> 00:47:22,000
no es el gen completo

1151
00:47:22,000 --> 00:47:24,000
sino que es la secuencia del mensajero

1152
00:47:24,000 --> 00:47:26,000
es decir aquí tenemos pegado

1153
00:47:26,000 --> 00:47:28,000
uno detrás de otro la secuencia

1154
00:47:28,000 --> 00:47:30,000
de todos

1155
00:47:30,000 --> 00:47:32,000
los exones del gen

1156
00:47:32,000 --> 00:47:34,000
¿de acuerdo?

1157
00:47:34,000 --> 00:47:36,000
de tal manera que a partir

1158
00:47:36,000 --> 00:47:38,000
de esta secuencia tenemos que diseñar

1159
00:47:38,000 --> 00:47:40,000
unos primers que sean

1160
00:47:40,000 --> 00:47:42,000
específicos por tanto

1161
00:47:42,000 --> 00:47:44,000
únicos

1162
00:47:44,000 --> 00:47:46,000
un forward y un reverse

1163
00:47:46,000 --> 00:47:48,000
con una serie de características

1164
00:47:48,000 --> 00:47:50,000
que yo os voy a dar pues una longitud determinada

1165
00:47:50,000 --> 00:47:52,000
que tengan una temperatura

1166
00:47:52,000 --> 00:47:54,000
de melting determinada

1167
00:47:54,000 --> 00:47:56,000
que tengan una temperatura de annealing

1168
00:47:56,000 --> 00:47:58,000
determinada que la amplicón

1169
00:47:58,000 --> 00:48:00,000
sea de

1170
00:48:00,000 --> 00:48:02,000
es decir la longitud del fragmento

1171
00:48:02,000 --> 00:48:04,000
que queremos amplificar sea de tanto etc.

1172
00:48:04,000 --> 00:48:06,000
Ya os digo

1173
00:48:06,000 --> 00:48:08,000
que no hay una única pareja

1174
00:48:08,000 --> 00:48:10,000
de primers específicos sino que hay

1175
00:48:10,000 --> 00:48:12,000
un montón de parejas

1176
00:48:12,000 --> 00:48:14,000
es decir que cada uno

1177
00:48:14,000 --> 00:48:16,000
puede obtener una pareja de primers

1178
00:48:16,000 --> 00:48:18,000
completamente diferente

1179
00:48:18,000 --> 00:48:20,000
y es posible ¿de acuerdo?

1180
00:48:20,000 --> 00:48:22,000
con las características que yo os voy a pedir

1181
00:48:22,000 --> 00:48:24,000
¿de acuerdo?