1
00:00:00,000 --> 00:00:06,000
Aquí tenemos ya el PowerPoint que vimos el otro día de electroforesis.

2
00:00:06,000 --> 00:00:15,600
Si os acordáis, la electroforesis era una de las técnicas que se utilizan para analizar

3
00:00:15,600 --> 00:00:16,600
proteínas.

4
00:00:16,600 --> 00:00:23,000
Teníamos la diálisis, la cromatografía y la electroforesis.

5
00:00:23,000 --> 00:00:28,880
Entonces, ¿con la electroforesis qué es lo que conseguimos?

6
00:00:28,880 --> 00:00:36,160
Pues vamos a separar la proteína pura, vamos a identificar también las proteínas, vamos

7
00:00:36,160 --> 00:00:41,360
a conocer también su masa molecular, la masa molecular de las proteínas que tenemos en

8
00:00:41,360 --> 00:00:42,360
una muestra.

9
00:00:42,360 --> 00:00:46,960
¿En qué se basa la electroforesis?

10
00:00:46,960 --> 00:00:53,440
Pues se basa en aplicar un campo eléctrico a nuestra muestra y dependiendo de la carga

11
00:00:53,440 --> 00:00:59,880
que tenga nuestra muestra, los componentes de esa muestra se van a desplazar hacia un

12
00:00:59,880 --> 00:01:02,160
lado o hacia otro.

13
00:01:02,160 --> 00:01:07,120
Hay distintos tipos de electroforesis, en un caso sería, por ejemplo, cuando tenemos

14
00:01:07,120 --> 00:01:12,080
distintas cargas en nuestra muestra, pues las cargas positivas irían hacia el ánodo

15
00:01:12,080 --> 00:01:18,200
y las cargas negativas se desplazan hacia el cátodo y así podemos separar los componentes

16
00:01:18,200 --> 00:01:19,200
de nuestra muestra.

17
00:01:20,200 --> 00:01:25,120
Y el otro día lo que vimos fue la electroforesis en gel de poliacrilamida.

18
00:01:25,120 --> 00:01:36,000
En la electroforesis en gel de poliacrilamida lo que tenemos es un gel que tiene distintos

19
00:01:36,000 --> 00:01:44,120
tamaños de poro por el que vamos a hacer atravesar nuestra muestra y los componentes

20
00:01:44,120 --> 00:01:48,360
de nuestra muestra se van a separar según su masa molecular.

21
00:01:48,360 --> 00:01:52,000
Como veis aquí estas amarillas son más grandes, luego estarían estas negras y luego

22
00:01:52,000 --> 00:01:53,400
estas rojas.

23
00:01:53,400 --> 00:02:03,680
Entonces, vimos que había que preparar, por una parte, el gel de poliacrilamida, es lo

24
00:02:03,680 --> 00:02:06,400
primero que tenemos que preparar.

25
00:02:06,400 --> 00:02:14,040
Para preparar este gel necesitamos primero acrilamida, a partir de la acrilamida, que

26
00:02:14,040 --> 00:02:20,640
es este compuesto de aquí que tiene un doble enlace, a partir de la acrilamida se forma

27
00:02:20,640 --> 00:02:23,240
la poliacrilamida.

28
00:02:23,240 --> 00:02:30,360
La poliacrilamida son uniones de acrilamida, uniones del monómero acrilamida, estas cadenas

29
00:02:30,360 --> 00:02:33,360
aquí en azul.

30
00:02:33,360 --> 00:02:37,240
¿Cómo logramos que se una una acrilamida con otra, con otra, con otra?

31
00:02:37,240 --> 00:02:43,520
Pues lo que hacemos es añadir persulfato amónico que es el iniciador de la reacción.

32
00:02:43,520 --> 00:02:48,760
El iniciador de la reacción lo que va a hacer va a ser, va a romper este doble enlace de

33
00:02:48,760 --> 00:02:49,760
aquí.

34
00:02:49,760 --> 00:02:57,040
Se van a formar dos radicales y así se van a unir una acrilamida con otra.

35
00:02:57,040 --> 00:03:01,840
Pero esta reacción es lenta, por lo que necesitamos un catalizador.

36
00:03:01,840 --> 00:03:06,280
Y el catalizador es este compuesto de aquí que se llama TEMED.

37
00:03:07,040 --> 00:03:13,800
Entonces, una vez que tenemos la poliacrilamida, o sea, polimuchas acrilamidas, lo que tenemos

38
00:03:13,800 --> 00:03:18,120
que hacer es unir una cadena con otra cadena.

39
00:03:18,120 --> 00:03:24,280
Y para eso añadimos bisacrilamida, este otro compuesto, bisacrilamida.

40
00:03:24,280 --> 00:03:30,280
Y esta bisacrilamida se va a unir a una cadena y se va a unir a otra cadena.

41
00:03:30,280 --> 00:03:36,200
Y entonces se nos va a quedar una poliacrilamida entrecruzada se dice, o sea, una poliacrilamida

42
00:03:36,200 --> 00:03:40,120
que va a tener poros.

43
00:03:40,120 --> 00:03:47,040
Teníamos aquí este dibujo, ya de aquí, esta sería la cadena de acrilamida, de poliacrilamida,

44
00:03:47,040 --> 00:03:52,360
otra cadena de poliacrilamida, otra cadena de poliacrilamida y la bisacrilamida estaría

45
00:03:52,360 --> 00:03:55,000
aquí uniendo las cadenas.

46
00:03:55,000 --> 00:03:59,440
Aquí otra bisacrilamida, otra bisacrilamida y se generan poros.

47
00:03:59,440 --> 00:04:05,960
Bueno, pues dependiendo de la cantidad de acrilamida y bisacrilamida que pongamos, vamos

48
00:04:05,960 --> 00:04:09,240
a tener unos poros más pequeños o más grandes.

49
00:04:09,240 --> 00:04:17,040
Vale, pues el gel de poliacrilamida puede ser de dos tipos.

50
00:04:17,040 --> 00:04:23,840
A ver dónde lo teníamos.

51
00:04:23,840 --> 00:04:31,480
Puede ser de dos tipos, uno que es todo el gel es igual, todo el gel, no hay variación

52
00:04:31,480 --> 00:04:38,520
en el gel y luego el que se utiliza es un gel que se divide en dos partes.

53
00:04:38,520 --> 00:04:45,760
Por una parte vamos a tener, en la parte de arriba del gel vamos a tener el gel que se

54
00:04:45,760 --> 00:04:54,920
llama gel concentrador, que también se puede llamar gel de carga o acumulador o de compactación.

55
00:04:54,920 --> 00:05:00,600
Esto va a ser en la parte de arriba del gel y la parte de abajo del gel va a ser el gel

56
00:05:00,720 --> 00:05:02,240
separador.

57
00:05:02,240 --> 00:05:04,280
Aquí lo tenemos mejor.

58
00:05:04,280 --> 00:05:10,040
La parte de arriba gel concentrador o acumulador y abajo gel separador.

59
00:05:10,040 --> 00:05:11,800
¿Y por qué se llama gel separador?

60
00:05:11,800 --> 00:05:17,480
Pues porque a partir de aquí es donde van a empezar a separarse nuestras proteínas

61
00:05:17,480 --> 00:05:19,800
según su tamaño.

62
00:05:19,800 --> 00:05:25,440
Veis aquí, estos se llaman los pocillos, aquí es donde vamos a introducir nuestra

63
00:05:25,440 --> 00:05:26,440
muestra.

64
00:05:27,160 --> 00:05:33,520
Nuestras proteínas van a atravesar el gel concentrador y lo que hace el gel concentrador

65
00:05:33,520 --> 00:05:39,480
es que todas las proteínas comiencen a separarse desde la misma posición.

66
00:05:39,480 --> 00:05:46,000
Y a partir de aquí ya van a atravesar el gel separador y se van a ir separando.

67
00:05:46,000 --> 00:05:52,640
Y el resultado es este que veis aquí, así, son rayas lo que vamos a ver, luego vamos

68
00:05:52,640 --> 00:05:56,280
a ver cómo se analizan estas rayas.

69
00:05:56,280 --> 00:06:04,160
Entonces, lo que diferencia a un gel de otro es la cantidad de acrilamida, también el

70
00:06:04,160 --> 00:06:13,560
pH y esto lo que va a hacer es que el gel separador va a tener menor tamaño de poro

71
00:06:13,560 --> 00:06:19,640
y entonces por eso aquí se van a separar las proteínas.

72
00:06:19,640 --> 00:06:23,640
Sin embargo aquí el gel concentrador tiene más tamaño de poro, un poro más grande

73
00:06:23,640 --> 00:06:29,920
y por aquí pasan todas las proteínas prácticamente del mismo, por igual, a la misma velocidad.

74
00:06:29,920 --> 00:06:35,600
Sin embargo aquí, por la diferencia de poro, pues se van a separar unas proteínas de otras,

75
00:06:35,600 --> 00:06:40,720
las de mayor peso molecular quedan arriba y las de menor peso molecular quedan abajo.

76
00:06:40,720 --> 00:06:45,960
Vale, pues esto sería el gel.

77
00:06:45,960 --> 00:06:51,960
Bueno, acordaros que dijimos que la acrilamida es tóxica, es neurotóxica y por lo tanto

78
00:06:51,960 --> 00:06:54,400
hay que trabajar con mucho cuidado.

79
00:06:54,400 --> 00:07:00,440
Una vez que ya tenemos al gel de poliacrilamida ya no es tóxica, lo único que, bueno, pues

80
00:07:00,440 --> 00:07:07,320
puede quedar por ahí alguna acrilamida y entonces, bueno, tenemos que seguir trabajando con guantes.

81
00:07:07,320 --> 00:07:13,760
Vale, eso era la parte del gel, cómo se prepara el gel.

82
00:07:13,760 --> 00:07:20,120
Y ahora sobre ese gel, que tenemos unos pocillos como habéis visto, pues sobre ese gel vamos

83
00:07:20,120 --> 00:07:23,640
a ir introduciendo nuestras muestras.

84
00:07:23,640 --> 00:07:31,200
Suele haber como ocho pocillos o así y entonces vamos a ir introduciendo las diferentes muestras.

85
00:07:31,200 --> 00:07:34,520
¿Cómo se introducen estas muestras?

86
00:07:34,520 --> 00:07:41,840
Pues lo normal es que las muestras se introduzcan en condiciones desnaturalizantes, es decir,

87
00:07:41,840 --> 00:07:47,920
condiciones desnaturalizantes significa que nuestra proteína ha perdido la estructura,

88
00:07:47,920 --> 00:07:52,560
si tenía estructura cuaternaria la ha perdido, pierde la estructura terciaria y pierde la

89
00:07:52,560 --> 00:08:01,240
estructura secundaria y se queda solo con la estructura primaria, es decir, la cadena

90
00:08:01,240 --> 00:08:02,240
lineal.

91
00:08:02,240 --> 00:08:08,520
¿Y qué quiere decir que pierda estas estructuras?

92
00:08:08,520 --> 00:08:14,240
Lo que quiere decir es que hemos añadido algún compuesto o hemos calentado la muestra

93
00:08:14,240 --> 00:08:18,800
y se han roto los enlaces que había por los puentes de hidrógeno, los puentes de

94
00:08:18,800 --> 00:08:26,120
sulfuro, las atracciones electrostáticas, las interacciones hidrofóbicas, pues esas

95
00:08:26,120 --> 00:08:32,760
interacciones que había se han roto y entonces nos queda la cadena de forma lineal.

96
00:08:32,760 --> 00:08:37,480
Pues son en estas condiciones, en condiciones desnaturalizantes, es como se suele trabajar

97
00:08:37,480 --> 00:08:40,320
con gels de poliacrilamida.

98
00:08:40,320 --> 00:08:49,280
Y para desnaturalizar la poliacrilamida, perdón, la proteína, se utiliza este compuesto que

99
00:08:49,280 --> 00:08:57,280
es el SDS, es el dodecyl sulfonato de sodio, que es esta molécula de aquí que tenéis,

100
00:08:57,280 --> 00:09:06,680
o sea, son 12 carbonos y al final un azufre aquí unido a dos oxígenos y otros y el sodio.

101
00:09:07,000 --> 00:09:16,240
Vale, pues entonces, eso, el SDS rompe estos enlaces que tenemos aquí, estos enlaces,

102
00:09:16,240 --> 00:09:19,480
y se queda la cadena tal cual.

103
00:09:19,480 --> 00:09:26,480
Pero una cosa importante también que hace el SDS es que carga con carga negativa, veis

104
00:09:26,480 --> 00:09:34,200
aquí todas las cargas negativas, a la proteína, carga con carga negativa a la proteína.

105
00:09:34,200 --> 00:09:41,760
Por lo tanto, todas las proteínas de nuestra muestra van a tener carga negativa y, por

106
00:09:41,760 --> 00:09:49,160
lo tanto, cuando apliquemos un campo eléctrico, las proteínas, que como tienen todas carga

107
00:09:49,160 --> 00:09:55,840
negativa, se van a dirigir hacia el cátodo, o sea, hacia abajo, se van a ir dirigiendo

108
00:09:55,840 --> 00:09:59,960
hacia el cátodo, que estará aquí el cátodo.

109
00:09:59,960 --> 00:10:06,480
Y las proteínas, entonces, se van a separar solo por su masa molecular, esto es importante,

110
00:10:06,480 --> 00:10:07,480
¿vale?

111
00:10:07,480 --> 00:10:12,480
Proteínas se separan por su masa molecular, las de mayor tamaño quedan aquí arriba,

112
00:10:12,480 --> 00:10:16,640
después estas en color verde que son de menor tamaño y después estas que son más pequeñas.

113
00:10:16,640 --> 00:10:27,920
Bueno, pues ya sabemos cómo preparamos el gel, cómo se introduce la muestra, bueno,

114
00:10:27,920 --> 00:10:36,240
la muestra se introduce con unas, con pipetas, se introduce en estos pocillos de aquí, ¿vale?

115
00:10:36,240 --> 00:10:44,720
Ahora vamos a ver un vídeo que yo creo que lo vais a entender mejor, vale, bien, pues

116
00:10:44,720 --> 00:10:48,880
esto ya es lo que os he explicado, por aquí se introduce la muestra y las proteínas con

117
00:10:48,880 --> 00:10:51,760
carga negativa se dirigen hacia el cátodo.

118
00:10:52,360 --> 00:11:00,160
Bueno, pues una vez que ya, bueno, a partir de que introducimos las muestras, se aplica

119
00:11:00,160 --> 00:11:05,640
el campo eléctrico, las proteínas se dirigen al cátodo y cuando termina la electroforesis

120
00:11:05,640 --> 00:11:12,520
tenemos que analizar ese gel que nos ha quedado.

121
00:11:12,520 --> 00:11:18,080
Pues para analizar ese gel lo que vamos a hacer es, lo que tenemos que hacer es teñir

122
00:11:18,080 --> 00:11:24,080
el gel para poder ver esas rayitas que veíamos antes, para poder ver nuestras proteínas

123
00:11:24,080 --> 00:11:30,640
y ese gel lo vamos a teñir con este producto que es el azul de coma, así, ¿vale?

124
00:11:30,640 --> 00:11:38,440
Y se nos va a quedar una cosa así, el gel y todo con rayitas azules, ¿vale?

125
00:11:38,440 --> 00:11:47,000
Entonces, lo que tenemos que hacer es, aparte de introducir nuestras muestras en los pocillos,

126
00:11:47,000 --> 00:11:54,400
en uno de los pocillos tenemos que introducir una muestra que se llama muestra de referencia

127
00:11:54,400 --> 00:12:01,320
y esa muestra de referencia nosotros conocemos, de esa muestra de referencia conocemos las

128
00:12:01,320 --> 00:12:08,720
proteínas que tiene y conocemos sus masas moleculares y entonces, esta por ejemplo aquí

129
00:12:08,720 --> 00:12:14,480
sería la muestra de referencia, nos salen todas estas líneas, lo que vamos a hacer

130
00:12:14,480 --> 00:12:22,680
es medir qué distancia ha recorrido cada una de nuestras proteínas, de las de referencia,

131
00:12:22,680 --> 00:12:29,400
medimos la distancia y la vamos a dividir entre la distancia que recorre el disolvente,

132
00:12:29,400 --> 00:12:36,720
que el disolvente será el que aparece el último aquí, la última línea, entonces

133
00:12:36,720 --> 00:12:42,800
medimos la distancia desde el gel separador, desde el principio del gel separador hasta

134
00:12:42,800 --> 00:12:47,960
lo que ha recorrido la primera proteína y ese valor lo dividimos entre el valor que

135
00:12:47,960 --> 00:12:51,080
ha recorrido el disolvente, ¿vale?

136
00:12:51,080 --> 00:13:01,120
Pues ahora lo que hacemos es representar, representamos el RF, o sea, lo que ha recorrido

137
00:13:01,120 --> 00:13:07,400
cada una de nuestras proteínas frente al logaritmo de la masa molecular que nosotros

138
00:13:07,400 --> 00:13:14,280
conocemos de nuestra muestra de referencia, como conocemos la masa molecular, medimos

139
00:13:14,280 --> 00:13:23,080
en nuestro gel que hemos analizado, medimos en nuestro gel los RF y hacemos una representación,

140
00:13:23,080 --> 00:13:31,080
representamos esos puntos, ajustamos a mínimos cuadrados y vamos a obtener una recta, esa

141
00:13:31,080 --> 00:13:36,320
recta como veis tiene la pendiente negativa, ¿vale?

142
00:13:36,320 --> 00:13:40,040
Y bueno, esta sería la ordenada en el origen.

143
00:13:40,040 --> 00:13:49,800
Y ahora a partir de esta recta, de estos valores, lo que hacemos es en nuestra muestra medimos

144
00:13:49,800 --> 00:13:57,760
el RF de nuestras proteínas, medimos el RF, o sea, la distancia que recorre nuestra proteína

145
00:13:57,760 --> 00:14:04,680
dividido entre la distancia que recorre el disolvente, medimos ese RF que sería esto

146
00:14:04,680 --> 00:14:06,160
aquí en rojo, ¿vale?

147
00:14:06,160 --> 00:14:14,960
La sustancia, la muestra desconocida y lo que hacemos es interpolar en la recta, ¿vale?

148
00:14:14,960 --> 00:14:22,760
Metemos ese dato, el dato del RF lo metemos aquí en la ecuación de la recta, en la X

149
00:14:22,760 --> 00:14:30,440
y de ahí deduciremos la masa molecular de nuestra proteína, de nuestra proteína desconocida.

150
00:14:30,440 --> 00:14:31,440
¿Vale?

151
00:14:31,440 --> 00:14:39,320
Pues entonces, importante eso, en electroforesis se aplica un campo eléctrico a la muestra.

152
00:14:39,320 --> 00:14:47,240
En electroforesis en gel de agarosa las proteínas que estamos analizando tienen carga negativa

153
00:14:47,480 --> 00:14:53,760
porque le hemos añadido el SDS, el dodecyl sulfato de sodio, las hemos aplicado carga

154
00:14:53,760 --> 00:14:58,880
negativa y las hemos desnaturalizado, por lo tanto nuestras proteínas se van a desplazar

155
00:14:58,880 --> 00:15:04,920
hacia el cátodo y el desplazamiento, el mayor o menor desplazamiento va a ser en función

156
00:15:04,920 --> 00:15:11,920
de la masa molecular y por lo tanto vamos a poder determinar la masa molecular de una

157
00:15:11,920 --> 00:15:14,160
muestra de una proteína desconocida.

158
00:15:14,160 --> 00:15:25,240
Vale, pues vamos a ver un vídeo, bueno aquí os he puesto varios vídeos que están bien

159
00:15:25,240 --> 00:15:33,320
de la Universidad de Sevilla de Valencia y también uno del CSIC, los tres están bien,

160
00:15:33,320 --> 00:15:38,920
vamos a ver este del CSIC y los otros si queréis también los podéis echar un vistazo en casa

161
00:15:38,920 --> 00:15:44,000
y vamos a ver cómo se trabaja en el laboratorio para que os hagáis una idea de lo que es

162
00:15:44,000 --> 00:15:46,000
la práctica de electroforesis.

163
00:15:59,000 --> 00:16:04,000
Vale, como no lo soléis escuchar, pues yo os lo voy contando.

164
00:16:04,000 --> 00:16:19,000
Esto sería electroforesis en gel de poliacrilamida, entonces lo primero que hay que hacer es,

165
00:16:19,000 --> 00:16:28,240
ahora un momento que quito los subtítulos, lo primero que tenemos que hacer es preparar

166
00:16:28,240 --> 00:16:35,920
el gel y para preparar el gel tenemos este dispositivo de aquí, aquí podríamos preparar

167
00:16:35,920 --> 00:16:43,320
dos geles, aquí uno y aquí otro y para ello necesitamos dos cristales, estos dos cristales

168
00:16:43,320 --> 00:16:49,520
uno es más grande que el otro, entonces se pone uno encima del otro y el grande tiene

169
00:16:49,520 --> 00:16:55,760
aquí en los dos laterales tiene como un reborde para que cuando introduzcamos la disolución

170
00:16:55,760 --> 00:17:10,120
se entre los dos cristales pues pueda entrar, entonces, veis, ponemos un cristal sobre el

171
00:17:10,120 --> 00:17:18,200
otro y lo colocamos en el dispositivo, cerramos el dispositivo para que se queden bien fijos

172
00:17:18,200 --> 00:17:28,120
los cristales y lo ponemos en este otro dispositivo, vale y ahora ya lo que vamos a hacer es, vamos

173
00:17:28,120 --> 00:17:35,440
a ir preparando la disolución para que se forme el gel de poliacrilamida, entonces para

174
00:17:35,440 --> 00:17:42,720
preparar esta disolución necesitamos una disolución de acrilamida y bisacrilamida,

175
00:17:42,720 --> 00:17:51,560
se necesita agua, se necesita SDS y luego se va a necesitar también el persulfato,

176
00:17:51,560 --> 00:17:57,840
acordaros, el persulfato es el iniciador y se va a necesitar también el TEMED que

177
00:17:57,840 --> 00:18:05,800
es el catalizador, entonces ahora va a ir mezclando todos los componentes de la disolución

178
00:18:13,720 --> 00:18:15,240
vale, el agua

179
00:18:26,160 --> 00:18:33,240
a la disolución tampón también se necesita una disolución tampón que es un tampón de tris y

180
00:18:33,240 --> 00:18:40,040
clorhídrico, ahora la disolución de acrilamida y bisacrilamida y el SDS

181
00:18:42,720 --> 00:18:51,440
vale, ahora se añade el persulfato de amonio que es el iniciador de la reacción

182
00:18:53,080 --> 00:19:01,200
y ahora se añade el TEMED que es el catalizador, una vez que se añada el TEMED enseguida ya hay

183
00:19:01,200 --> 00:19:08,040
que introducir la disolución entre los dos cristales que tenemos aquí porque el TEMED

184
00:19:08,040 --> 00:19:12,200
lo que hace es catalizar la reacción, entonces si no lo introducimos rápido

185
00:19:12,200 --> 00:19:18,280
pues se nos va a polimerizar aquí en el vasito

186
00:19:23,800 --> 00:19:27,120
vale, lo mezcla un poco y ya con una pipeta PASTER

187
00:19:29,280 --> 00:19:35,880
lo mezcla un poco con la pipeta y ya va a ir introduciendo entre los dos cristales,

188
00:19:35,880 --> 00:19:43,280
veis que se va llenando, se va llenando los dos cristales, este sería el gel separador

189
00:19:44,600 --> 00:19:53,880
donde se van a separar las proteínas, ahora tenemos que añadir por arriba, vamos a añadir

190
00:19:53,880 --> 00:20:03,000
una capa de agua y esta capa de agua lo que hace es aislar a la poliacrilamida porque es que,

191
00:20:03,000 --> 00:20:09,680
porque si no con el oxígeno del aire no gelifica, no polimeriza, por lo tanto añadimos una capa

192
00:20:09,680 --> 00:20:16,840
de agua en el borde superior para que polimerice, veis si os fijáis aquí el vial ya en el vial ya

193
00:20:16,840 --> 00:20:23,880
había empezado a polimerizar por eso hay que hacerlo un poco rápido, bien pues ya aquí habría

194
00:20:23,880 --> 00:20:30,880
que esperar 45 minutos a que gelifique y el siguiente paso sería quitar el agua que hemos

195
00:20:30,880 --> 00:20:49,480
puesto aquí arriba, vale ya quitamos el agua, tendríamos ya ahí el gel separador y ahora va

196
00:20:49,480 --> 00:20:56,120
a preparar el gel concentrador que es el gel, la parte de arriba del gel, se mezclan los mismos

197
00:20:56,120 --> 00:21:04,720
reactivos lo que pasa que en concentraciones diferentes y a un pH diferente, ese sería,

198
00:21:04,720 --> 00:21:13,720
aquí ya tendríamos el témed, se mezcla y ya se introduce con la pipeta entre los cristales,

199
00:21:15,880 --> 00:21:21,360
ahora se introduce el peine, esto de aquí es el peine y esto lo que va a hacer va a

200
00:21:21,360 --> 00:21:32,200
generar pocillos, va a generar unos huecos cuando gelifique el gel se van a generar unos huecos aquí

201
00:21:32,200 --> 00:21:41,040
y por aquí en estos huecos pues va a ser donde introduzcamos después nuestras muestras, ahora

202
00:21:41,040 --> 00:21:50,400
ya lo está introduciendo en la cubeta de electroforesis, ya aquí ya una vez introducido

203
00:21:50,400 --> 00:21:55,800
en la cubeta ya va a aplicar el campo eléctrico, aquí ya vamos a empezar ya la electroforesis como

204
00:21:55,800 --> 00:22:03,480
tal, entonces aquí tendría, esta cubeta tiene dos electrodos, hay que colocar el negro, hay que

205
00:22:03,480 --> 00:22:10,800
enchufarlo al negro y el rojo al rojo, esta es la cubeta de electroforesis

206
00:22:20,400 --> 00:22:27,400
y ahora lo que se hace es añadir aquí a esta cubeta una disolución tampón,

207
00:22:51,400 --> 00:22:54,400
se añade una disolución tampón,

208
00:22:58,400 --> 00:23:01,400
se añade por dentro y luego se va a añadir también por fuera

209
00:23:05,400 --> 00:23:15,400
y se quita el peine, ya nos habrán quedado ahí los pocillos, ahora tenemos este sistema

210
00:23:15,400 --> 00:23:22,400
en amarillo que nos va a ayudar a introducir las muestras porque si no es difícil ver los

211
00:23:22,400 --> 00:23:29,400
pocillos, entonces se pone este sistema y así es más fácil introducir las muestras.

212
00:23:33,400 --> 00:23:41,400
Vale, veis que tenemos varios pocillos, 8, entonces en uno de ellos ya está introduciendo

213
00:23:41,400 --> 00:23:47,400
una muestra, esta pues podría ser la de referencia, veis se van llenando los pocillos

214
00:23:53,400 --> 00:23:59,400
y entonces aquí vamos a ir poniendo distintas muestras, pueden ser por ejemplo muestras de

215
00:23:59,400 --> 00:24:06,400
distintos pescados, pues de atún, de lubina, de salmón y luego vamos a poder ver qué proteínas

216
00:24:06,400 --> 00:24:11,400
tienen esos pescados, nos van a salir aquí diferentes proteínas y vamos a poder comparar

217
00:24:11,400 --> 00:24:17,400
pues si igual hay dos pescados que son parecidos y nos aparecen proteínas también parecidas.

218
00:24:26,400 --> 00:24:27,400
Y ya la última.

219
00:24:27,400 --> 00:24:53,400
Y ahora ya, bueno esta sería ya la última y ya conectaríamos la cubeta al campo, o sea

220
00:24:53,400 --> 00:24:56,400
aplicaríamos ya el campo eléctrico.

221
00:25:00,400 --> 00:25:05,400
Cerramos la cubeta, el cable negro con el cable negro y el rojo con el rojo, le vamos

222
00:25:05,400 --> 00:25:13,400
a aplicar aquí un voltaje y ahí hay que esperar a que las proteínas se vayan desplazando

223
00:25:13,400 --> 00:25:16,400
a través del gel separador.

224
00:25:23,400 --> 00:25:36,400
Vale, veis, ahora las proteínas se van a dirigir hacia el cátodo y se van a ir empezando

225
00:25:36,400 --> 00:25:37,400
a separar.

226
00:25:44,400 --> 00:25:51,400
Ahora ya termina la electroforesis y ya vamos a obtener nuestro gel, lo que pasa es que

227
00:25:51,400 --> 00:25:56,400
el gel, lo que os comentaba antes, ahora mismo no se van a ver bien, no se van a ver

228
00:25:56,400 --> 00:26:03,400
las proteínas y lo tenemos que teñir y se teñe con una disolución de azul de como así.

229
00:26:15,400 --> 00:26:20,400
Vale, ahí tendríamos los dos cristales que los tenemos que separar.

230
00:26:20,400 --> 00:26:26,400
Bueno, primero se le añade agua para limpiar de la disolución tampón y ahora vamos a

231
00:26:26,400 --> 00:26:29,400
separar los dos cristales.

232
00:26:29,400 --> 00:26:34,400
Separamos los dos cristales con esta cuña verde y en uno de los dos cristales se nos

233
00:26:34,400 --> 00:26:36,400
quedará el gel.

234
00:26:38,400 --> 00:26:45,400
Veis, ahí tenemos el gel, este sería el gel y ahora tenemos que teñirlo.

235
00:26:46,400 --> 00:26:50,400
Lo se lava primero con agua.

236
00:26:53,400 --> 00:26:55,400
¿Veis cómo es el gel?

237
00:26:59,400 --> 00:27:04,400
Vale, y entonces ahora lo ponemos en una disolución de azul de coma así.

238
00:27:05,400 --> 00:27:08,400
Y se deja ahí un tiempo agitando.

239
00:27:10,400 --> 00:27:18,400
Se pone en un balancín en este aparato y ahí se deja agitando.

240
00:27:20,400 --> 00:27:25,400
Y lo siguiente que tendremos que hacer es desteñir el gel para que solamente veamos

241
00:27:25,400 --> 00:27:29,400
las proteínas porque si no ahora no veríamos nada.

242
00:27:29,400 --> 00:27:32,400
Guardamos la disolución de tinción.

243
00:27:34,400 --> 00:27:39,400
¿Veis? Ahora se nos ha quedado todo el gel azul y ahora tenemos que lavarlo.

244
00:27:41,400 --> 00:27:45,400
Y ya nos aparecerán las bandas de las proteínas.

245
00:27:45,400 --> 00:27:47,400
Dejamos hologramalando.

246
00:27:51,400 --> 00:27:59,400
Están quizás aquí un poco más blanquitas, pero claro, muchas veces hay que guardarlas

247
00:27:59,400 --> 00:28:02,400
las vamos a solvir y luego nos las voy a meter automaticamente.

248
00:28:04,400 --> 00:28:05,400
Permiso puna.

249
00:28:06,400 --> 00:28:11,400
Y con el tipes de vitex, es que me estoy siendo 조금 seguido.

250
00:28:11,400 --> 00:28:24,400
Tendríamos que quitar la parte del gel concentrador para contar a partir del gel separador.

251
00:28:27,400 --> 00:28:32,400
Ahora está añadiendo la disolución que va a desteñir.

252
00:28:32,400 --> 00:28:42,400
Lo vuelvo a poner ahí en el balencín.

253
00:28:42,400 --> 00:29:01,400
¿Veis? Ya empiezan a aparecer las bandas de proteínas.

254
00:29:01,400 --> 00:29:09,400
Hay que sacar el gel con cuidado que no se rompa.

255
00:29:09,400 --> 00:29:12,400
Y ahí ya tendríamos las bandas.

256
00:29:12,400 --> 00:29:15,400
Y entonces ahí ya mediríamos los RFs.

257
00:29:15,400 --> 00:29:23,400
Compararíamos con nuestra muestra de referencia y mediríamos los RFs de nuestras muestras.

258
00:29:23,400 --> 00:29:26,400
Vale, pues este es el vídeo.

259
00:29:26,400 --> 00:29:31,400
Ya os digo que hay otros dos vídeos de la Universidad de Valencia y de Sevilla que también están muy bien.

260
00:29:31,400 --> 00:29:41,400
Y ahora vamos a ver de la página de Biomodel una simulación de electroforesis.

261
00:29:43,400 --> 00:29:51,400
Entonces en esta página entráis en Biomodel, en la página de la Universidad de Alcalá de Henares.

262
00:29:51,400 --> 00:29:55,400
Y aquí tendríamos esto en gris. Sería el gel.

263
00:29:55,400 --> 00:29:58,400
Lo que pasa es que aquí solamente tenemos dos pocillos.

264
00:29:58,400 --> 00:30:01,400
Y lo que tenemos que hacer es...

265
00:30:01,400 --> 00:30:06,400
Bueno, aquí hay unos ejercicios. Vamos a entrar aquí.

266
00:30:06,400 --> 00:30:12,400
Entonces aquí lo que nos pregunta es la influencia de la diferencia de potencial aplicada.

267
00:30:12,400 --> 00:30:18,400
O sea, si ponemos más voltaje o menos, ¿qué es lo que ocurre?

268
00:30:18,400 --> 00:30:23,400
¿Se separan más los patrones o se separan menos? ¿Avanzan más rápido o avanzan más lento?

269
00:30:23,400 --> 00:30:25,400
Pues entonces lo vamos a comprobar.

270
00:30:25,400 --> 00:30:31,400
Esto de aquí serían los patrones de nuestra muestra de referencia.

271
00:30:31,400 --> 00:30:39,400
Entonces son distintas proteínas que conocemos su masa molecular.

272
00:30:39,400 --> 00:30:47,400
Las marcamos y las introducimos en el pocillo, en el primer pocillo.

273
00:30:47,400 --> 00:30:49,400
Vale.

274
00:30:52,400 --> 00:30:54,400
Aquí.

275
00:30:58,400 --> 00:31:01,400
Ah, añadir patrón, que no lo veía.

276
00:31:01,400 --> 00:31:04,400
Vale, pues añadimos el patrón.

277
00:31:04,400 --> 00:31:07,400
Esta sería nuestra muestra de referencia.

278
00:31:07,400 --> 00:31:10,400
Y ahora vamos a añadir nuestra muestra.

279
00:31:10,400 --> 00:31:14,400
Y de las muestras tenemos 10 problemas.

280
00:31:14,400 --> 00:31:17,400
Pues vamos a hacer el 2, por ejemplo.

281
00:31:19,400 --> 00:31:22,400
Vale, pues le damos a añadir muestra.

282
00:31:22,400 --> 00:31:25,400
Y aquí se nos añade nuestra muestra.

283
00:31:25,400 --> 00:31:30,400
Vamos a ponerle, por ejemplo, un voltaje muy bajo, del 50.

284
00:31:30,400 --> 00:31:32,400
Y le damos a comenzar.

285
00:31:32,400 --> 00:31:37,400
Lo demás lo dejamos igual, la velocidad y el tanto por ciento de acrilamida lo dejamos igual.

286
00:31:37,400 --> 00:31:40,400
Y ahora le vamos a dar a comenzar.

287
00:31:41,400 --> 00:31:48,400
¿Veis? Esta sería nuestra muestra de referencia, cómo se van separando las proteínas.

288
00:31:48,400 --> 00:31:53,400
Lo que hay que hacer es parar cuando justo esté llegando casi al final.

289
00:31:55,400 --> 00:31:57,400
Lo paramos.

290
00:31:57,400 --> 00:32:05,400
Y esto de aquí, la banda esta aquí morada, es el disolvente, que es el bromofenol.

291
00:32:05,400 --> 00:32:11,400
Y este es el que nos va a servir para calcular el RF.

292
00:32:11,400 --> 00:32:15,400
Pues entonces, en este caso, hemos aplicado un voltaje de 50.

293
00:32:15,400 --> 00:32:19,400
Y ahora vamos a aplicar un voltaje de 200.

294
00:32:19,400 --> 00:32:21,400
Y vamos a ver si va más...

295
00:32:21,400 --> 00:32:26,400
Ah, bueno, tendríamos que volver a introducir nuestras muestras.

296
00:32:26,400 --> 00:32:29,400
Añadimos el patrón.

297
00:32:29,400 --> 00:32:32,400
Añadimos la muestra a muestra, que era la muestra 2.

298
00:32:36,400 --> 00:32:40,400
Y le damos a comenzar y vamos a ver qué diferencia hay.

299
00:32:43,400 --> 00:32:49,400
Vale, pues si os fijáis, estaba bastante más rápido que la anterior.

300
00:32:49,400 --> 00:32:51,400
Vamos a ver otra vez la de 50.

301
00:32:53,400 --> 00:32:55,400
Añadimos patrón.

302
00:33:00,400 --> 00:33:02,400
Añadimos muestra.

303
00:33:03,400 --> 00:33:05,400
Y le damos.

304
00:33:07,400 --> 00:33:10,400
Estaba bastante más lenta que a 200.

305
00:33:10,400 --> 00:33:15,400
Entonces, el voltaje influye en la rapidez de separación.

306
00:33:16,400 --> 00:33:21,400
Y después tendríamos la influencia de la concentración de acrilamida.

307
00:33:21,400 --> 00:33:28,400
Entonces, dependiendo de la concentración, puede ser que los patrones se separan más, se separan menos,

308
00:33:28,400 --> 00:33:31,400
tienen mayor movilidad o tienen menor movilidad.

309
00:33:32,400 --> 00:33:34,400
Bueno, pues vamos a verlo.

310
00:33:34,400 --> 00:33:40,400
Tenemos aquí concentraciones de acrilamida que van del 7,5 al 15%.

311
00:33:40,400 --> 00:33:43,400
Pues vamos a empezar por la de 7,5.

312
00:33:44,400 --> 00:33:47,400
Vamos a hacerlo, por ejemplo, con otra muestra.

313
00:33:47,400 --> 00:33:51,400
Vamos a hacerlo con la muestra 4, por ejemplo.

314
00:33:52,400 --> 00:33:55,400
Vale, los patrones los ponemos igual.

315
00:33:55,400 --> 00:33:58,400
El voltaje vamos a ponerlo a 150.

316
00:33:59,400 --> 00:34:01,400
Y le vamos a añadir el patrón.

317
00:34:01,400 --> 00:34:03,400
Añadimos patrón.

318
00:34:05,400 --> 00:34:07,400
Y añadimos muestra.

319
00:34:13,400 --> 00:34:15,400
Y le damos a comenzar.

320
00:34:16,400 --> 00:34:20,400
Vale, pues fijaros, quedaros con esta imagen.

321
00:34:20,400 --> 00:34:26,400
Fijaros, la azul, la amarilla, la banda azul está bastante separada de la amarilla.

322
00:34:26,400 --> 00:34:30,400
Esta es un poquito más juntas y esta es un poquito más separadas.

323
00:34:30,400 --> 00:34:34,400
Pues vamos a quedarnos con esta imagen.

324
00:34:34,400 --> 00:34:36,400
Y le vamos a añadir el patrón.

325
00:34:36,400 --> 00:34:38,400
Y le vamos a añadir el patrón.

326
00:34:38,400 --> 00:34:40,400
Y le vamos a añadir el patrón.

327
00:34:40,400 --> 00:34:42,400
Y le vamos a añadir el patrón.

328
00:34:44,400 --> 00:34:48,400
Vale, pues aquí se pueden ver las dos imágenes más separadas.

329
00:34:48,400 --> 00:34:52,400
Pues vamos a quedarnos con esta imagen.

330
00:34:52,400 --> 00:34:56,400
Y ahora vamos a cambiar la concentración de acrilamida.

331
00:34:56,400 --> 00:34:59,400
Y vamos a poner el máximo, vamos a poner 15.

332
00:35:02,400 --> 00:35:05,400
Vale, volvemos a introducir el patrón.

333
00:35:06,400 --> 00:35:09,400
Y le damos a comenzar.

334
00:35:14,400 --> 00:35:18,400
Vale, pues entonces, como hemos puesto mucha acrilamida,

335
00:35:18,400 --> 00:35:22,400
aquí estas bandas, si os fijáis, están más pegadas.

336
00:35:22,400 --> 00:35:27,400
Las bandas de mayor masa molecular están aquí más pegadas.

337
00:35:27,400 --> 00:35:29,400
Antes nos salían más separadas.

338
00:35:29,400 --> 00:35:33,400
Pues dependiendo de qué zona queramos ver,

339
00:35:33,400 --> 00:35:39,400
pues vamos a elegir un tanto por ciento de acrilamida mayor o menor.

340
00:35:39,400 --> 00:35:42,400
Y ahora vamos a ver la...

341
00:35:42,400 --> 00:35:45,400
Vamos a dar un poquito...

342
00:35:47,400 --> 00:35:53,400
Vale, y ahora vamos a ver la gráfica, cómo se analiza la gráfica.

343
00:35:53,400 --> 00:35:55,400
Pues en este caso...

344
00:35:55,400 --> 00:35:58,400
Bueno, vamos a volver a hacer la anterior.

345
00:35:59,400 --> 00:36:00,400
A ver...

346
00:36:01,400 --> 00:36:04,400
Sí, vamos a volver a hacer la...

347
00:36:05,400 --> 00:36:09,400
Vamos a volver a hacer a 10, por ejemplo.

348
00:36:09,400 --> 00:36:11,400
Añadimos patrón.

349
00:36:16,400 --> 00:36:18,400
Añadimos muestra.

350
00:36:21,400 --> 00:36:23,400
Le damos a comenzar.

351
00:36:29,400 --> 00:36:32,400
No se separa éste.

352
00:36:32,400 --> 00:36:37,400
Vamos a coger otra, porque aquí no sé por qué no se separa éste.

353
00:36:37,400 --> 00:36:39,400
Se necesitará...

354
00:36:39,400 --> 00:36:41,400
A ver, vamos a hacer la 1.

355
00:36:42,400 --> 00:36:44,400
La 1.

356
00:36:46,400 --> 00:36:49,400
Y vamos a hacer al 12%. Añadimos patrón.

357
00:36:54,400 --> 00:36:56,400
Añadimos muestra.

358
00:36:59,400 --> 00:37:02,400
Y le damos a comenzar.

359
00:37:12,400 --> 00:37:14,400
Vale.

360
00:37:15,400 --> 00:37:18,400
Bien, pues le damos a detener.

361
00:37:18,400 --> 00:37:21,400
Y ahora vamos a ver la gráfica.

362
00:37:21,400 --> 00:37:30,400
Esta sería la gráfica, esta sería la representación de estas bandas, de estas proteínas que tenemos en la muestra de referencia.

363
00:37:30,400 --> 00:37:40,400
La movilidad relativa es el RF que yo os comentaba antes, que es la distancia desde aquí hasta la primera banda,

364
00:37:40,400 --> 00:37:45,400
dividida entre la distancia desde aquí hasta lo que recorre el disolvente.

365
00:37:45,400 --> 00:37:49,400
Y se va representando frente al logaritmo de la masa molecular.

366
00:37:49,400 --> 00:37:58,400
En este caso nos sale una recta cuya pendiente es menos 0,94 y la ordenada en el origen es 4,81.

367
00:37:58,400 --> 00:38:07,400
Pues entonces tendríamos que medir esta distancia de aquí, la distancia de nuestra muestra, que si pinchamos aquí la tenemos,

368
00:38:07,400 --> 00:38:13,400
tenemos aquí la movilidad relativa que es, o sea, éste sería el avance en milímetros, son 3,08,

369
00:38:14,400 --> 00:38:20,400
dividido entre lo que ha recorrido el disolvente, nos va a dar la movilidad relativa, que son 0,05.

370
00:38:20,400 --> 00:38:30,400
Pues este valor de movilidad relativa lo metemos en la recta y de ahí vamos a sacar la masa molecular.

371
00:38:32,400 --> 00:38:35,400
Vale, entonces si pinchamos aquí...

372
00:38:36,400 --> 00:38:40,400
Vale, pues eso ya habría que calcularlo.

373
00:38:41,400 --> 00:38:57,400
Bueno, pues esta es una simulación de la electroforesis, de cómo se lleva a cabo una electroforesis en gel de poliacrilamida.

374
00:38:57,400 --> 00:39:03,400
Si queréis, vosotros en casa podéis también practicar.

375
00:39:04,400 --> 00:39:19,400
Y bueno, en principio terminaríamos hoy esta parte de electroforesis.

376
00:39:19,400 --> 00:39:30,400
No sé si tenéis alguna duda de la electroforesis o de la cromatografía o de alguna de las técnicas que hemos visto.

377
00:39:33,400 --> 00:39:35,400
Muchas gracias.