1 00:00:00,000 --> 00:00:03,000 Bien, vamos a continuar con el tema 6. 2 00:00:03,000 --> 00:00:07,000 Hoy vamos a ver lo que llamamos la PCR estándar o convencional, 3 00:00:07,000 --> 00:00:10,000 también se le llama PCR básica. 4 00:00:10,000 --> 00:00:16,000 Es el modelo de PCR diseñado por Mewlis en 1983 5 00:00:16,000 --> 00:00:20,000 y se le llama PCR estándar porque es la forma más sencilla, 6 00:00:20,000 --> 00:00:23,000 más simple de PCR. 7 00:00:23,000 --> 00:00:26,000 A partir de ella vamos a ver después una serie de modalidades 8 00:00:26,000 --> 00:00:31,000 que se han ido desarrollando pero teniendo siempre como base 9 00:00:31,000 --> 00:00:35,000 esta PCR estándar o convencional, como también se le suele llamar. 10 00:00:35,000 --> 00:00:39,000 Esta PCR convencional es la que se utiliza de forma rutinaria 11 00:00:39,000 --> 00:00:43,000 cuando queremos hacer un análisis, un primer análisis por PCR. 12 00:00:43,000 --> 00:00:48,000 Ya veréis que es la más sencilla y no permite la cuantificación 13 00:00:48,000 --> 00:00:52,000 sino sencillamente la amplificación de un fragmento de DNA 14 00:00:52,000 --> 00:00:55,000 y su detección en un DNA molde. 15 00:00:55,000 --> 00:00:56,000 ¿De acuerdo? 16 00:00:56,000 --> 00:01:00,000 Entonces, en esta PCR estándar o convencional 17 00:01:00,000 --> 00:01:03,000 vamos a amplificar un solo fragmento de DNA, 18 00:01:03,000 --> 00:01:08,000 por tanto vamos a necesitar una pareja de primers nada más, 19 00:01:08,000 --> 00:01:11,000 un único par de cebadores o de primers 20 00:01:11,000 --> 00:01:16,000 y vamos a hacer un único proceso de amplificación a tiempo final. 21 00:01:16,000 --> 00:01:20,000 Es decir, que vamos a analizar los resultados 22 00:01:20,000 --> 00:01:24,000 una vez hayan acabado todos los ciclos de la PCR. 23 00:01:24,000 --> 00:01:28,000 Veremos más adelante que la PCR a tiempo real 24 00:01:28,000 --> 00:01:33,000 en la cual vamos a ir analizando cómo se amplifican los fragmentos, 25 00:01:33,000 --> 00:01:39,000 cómo van apareciendo en la reacción a tiempo real, ciclo a ciclo. 26 00:01:39,000 --> 00:01:41,000 Después de cada ciclo vamos a ir viendo 27 00:01:41,000 --> 00:01:44,000 cómo se van amplificando los fragmentos, 28 00:01:44,000 --> 00:01:46,000 pero esto lo veremos más adelante. 29 00:01:47,000 --> 00:01:50,000 Para entender bien el funcionamiento de la PCR convencional 30 00:01:50,000 --> 00:01:55,000 vamos a profundizar como cuatro apartados fundamentales. 31 00:01:55,000 --> 00:01:59,000 Primero, lo primero que vamos a ver es la mezcla de reacción, 32 00:01:59,000 --> 00:02:01,000 es decir, yo quiero hacer una PCR, 33 00:02:01,000 --> 00:02:04,000 sabemos que necesitamos una serie de componentes 34 00:02:04,000 --> 00:02:09,000 que ya vimos algunos en la explicación del otro día, 35 00:02:09,000 --> 00:02:11,000 faltan muchos más componentes 36 00:02:11,000 --> 00:02:13,000 porque necesitamos una mezcla de reacción 37 00:02:13,000 --> 00:02:16,000 para que en el tubo de PCR se pueda llevar a cabo 38 00:02:16,000 --> 00:02:20,000 la reacción en cadena, en cadena de la polimerasa. 39 00:02:20,000 --> 00:02:21,000 ¿De acuerdo? 40 00:02:21,000 --> 00:02:25,000 En segundo lugar, vamos a ver cómo se prepara esa mezcla de reacción. 41 00:02:25,000 --> 00:02:29,000 Es tremendamente importante preparar bien la mezcla 42 00:02:29,000 --> 00:02:32,000 para que nuestros resultados sean fiables 43 00:02:32,000 --> 00:02:34,000 y luego sean reproducibles, 44 00:02:34,000 --> 00:02:39,000 es decir, que la PCR que hago con la muestra de un paciente hoy 45 00:02:39,000 --> 00:02:43,000 me sirva y sea extrapolable 46 00:02:43,000 --> 00:02:48,000 y la pueda comparar con las PCR que hago con las muestras de otros pacientes 47 00:02:48,000 --> 00:02:50,000 mañana, pasado, la semana que viene 48 00:02:50,000 --> 00:02:52,000 o que puedan hacer en otro laboratorio. 49 00:02:52,000 --> 00:02:56,000 Por tanto, la mezcla de reacción que está bien hecha 50 00:02:56,000 --> 00:03:00,000 hace que la PCR sea fiable y sea reproducible. 51 00:03:01,000 --> 00:03:04,000 Luego veremos cómo programamos el termociclador, 52 00:03:04,000 --> 00:03:07,000 cómo es el programa de una PCR convencional, 53 00:03:07,000 --> 00:03:09,000 qué fases tiene, qué etapas tiene 54 00:03:09,000 --> 00:03:12,000 y por último veremos un pequeño apartado de análisis 55 00:03:12,000 --> 00:03:18,000 cómo analizamos el resultado una vez ya ha finalizado la PCR. 56 00:03:19,000 --> 00:03:20,000 ¿De acuerdo? 57 00:03:20,000 --> 00:03:24,000 Vamos a entrar a ver la composición de la mezcla de reacción. 58 00:03:25,000 --> 00:03:30,000 La mezcla de reacción no es ni más ni menos que una mezcla de reactivos. 59 00:03:31,000 --> 00:03:35,000 Va a contener todos los reactivos necesarios 60 00:03:35,000 --> 00:03:40,000 para que pueda llevarse a cabo in vitro una reacción de PCR 61 00:03:40,000 --> 00:03:43,000 o una reacción in vitro de replicación del DNA, 62 00:03:43,000 --> 00:03:45,000 de amplificación del DNA. 63 00:03:45,000 --> 00:03:49,000 Es decir, en la mezcla de reacción tengo que tener todos los componentes 64 00:03:49,000 --> 00:03:54,000 para que la DNA polimerasa pueda leer el DNA a molde 65 00:03:54,000 --> 00:03:57,000 y realizar las copias de amplificación. 66 00:03:58,000 --> 00:04:02,000 Esta mezcla de reacción no es ni más ni menos que un tampón. 67 00:04:03,000 --> 00:04:04,000 ¿De acuerdo? 68 00:04:04,000 --> 00:04:05,000 Un tampón adecuado. 69 00:04:05,000 --> 00:04:09,000 En este tampón van a ir disueltos todos los reactivos 70 00:04:09,000 --> 00:04:11,000 que vamos a ir viendo ahora después. 71 00:04:11,000 --> 00:04:14,000 Y este tampón lo que aporta es un pH idóneo 72 00:04:14,000 --> 00:04:17,000 y una concentración salina idónea 73 00:04:17,000 --> 00:04:23,000 para que la DNA polimerasa actúe con un máximo de fidelidad. 74 00:04:24,000 --> 00:04:26,000 ¿Qué es esto de la fidelidad? 75 00:04:26,000 --> 00:04:29,000 La fidelidad, el máximo de fidelidad, 76 00:04:29,000 --> 00:04:34,000 se entiende como que la PCR, 77 00:04:34,000 --> 00:04:37,000 decimos que la PCR tiene una alta fidelidad 78 00:04:37,000 --> 00:04:40,000 y la DNA polimerasa ha hecho una reacción de alta fidelidad 79 00:04:40,000 --> 00:04:45,000 cuando no se ha equivocado al introducir un nucleótido. 80 00:04:46,000 --> 00:04:47,000 ¿De acuerdo? 81 00:04:47,000 --> 00:04:51,000 Por tanto, el tampón de la mezcla de reacción 82 00:04:51,000 --> 00:04:55,000 nos aporta un pH y una concentración de sales 83 00:04:55,000 --> 00:05:00,000 que permiten que la DNA polimerasa realice una reacción de PCR 84 00:05:00,000 --> 00:05:02,000 con el máximo de fidelidad. 85 00:05:03,000 --> 00:05:04,000 Un ejemplo. 86 00:05:04,000 --> 00:05:10,000 Normalmente estos tampones suelen ser una mezcla de una base, 87 00:05:10,000 --> 00:05:11,000 que es tris, 88 00:05:11,000 --> 00:05:15,000 o sea, una sustancia básica con cloro de potasio. 89 00:05:15,000 --> 00:05:17,000 Tris, cloro de potasio. 90 00:05:17,000 --> 00:05:21,000 Y el pH suele ser alto, entre 8 y 3, 9, 91 00:05:21,000 --> 00:05:24,000 que es el pH idóneo para que la DNA polimerasa 92 00:05:24,000 --> 00:05:27,000 pueda funcionar de forma óptima. 93 00:05:27,000 --> 00:05:28,000 ¿De acuerdo? 94 00:05:29,000 --> 00:05:33,000 Comercialmente, estos tampones para la mezcla de PCR 95 00:05:33,000 --> 00:05:37,000 no los hacemos en el laboratorio. 96 00:05:37,000 --> 00:05:39,000 Podríamos hacerlo comprando tris, 97 00:05:39,000 --> 00:05:41,000 comprando cloro de potasio 98 00:05:41,000 --> 00:05:44,000 y ajustando el pH a 8, 3, 9, 99 00:05:44,000 --> 00:05:46,000 a este rango de pH, 100 00:05:46,000 --> 00:05:49,000 pero lo normal es comprarlo comercialmente 101 00:05:49,000 --> 00:05:52,000 y normalmente vienen concentrados. 102 00:05:52,000 --> 00:05:54,000 Dos veces concentrado, dos por, 103 00:05:54,000 --> 00:05:56,000 cinco veces concentrado, cinco por 104 00:05:56,000 --> 00:05:58,000 o diez veces concentrado. 105 00:05:58,000 --> 00:06:01,000 Eso significa, esto significa que 106 00:06:01,000 --> 00:06:06,000 si yo utilizo un tampón de PCR cinco por, 107 00:06:06,000 --> 00:06:09,000 cinco por, por tanto cinco veces concentrado, 108 00:06:09,000 --> 00:06:12,000 al tubo de reacción tendré que poner 109 00:06:12,000 --> 00:06:16,000 un volumen cinco veces diluido. 110 00:06:16,000 --> 00:06:17,000 ¿De acuerdo? 111 00:06:17,000 --> 00:06:18,000 Todo esto lo vamos a ver, 112 00:06:18,000 --> 00:06:23,000 haremos ejercicios, haremos cálculos y problemas. 113 00:06:23,000 --> 00:06:24,000 ¿De acuerdo? 114 00:06:24,000 --> 00:06:27,000 Esto se entenderá mucho mejor con los problemas. 115 00:06:27,000 --> 00:06:29,000 Pero vamos, fundamentalmente, 116 00:06:29,000 --> 00:06:32,000 la mezcla de reacción tiene un componente fundamental 117 00:06:32,000 --> 00:06:35,000 que es el tampón, aporta el pH y las sales 118 00:06:35,000 --> 00:06:39,000 para que el ADN a polimerasa actúe de forma fiel. 119 00:06:39,000 --> 00:06:43,000 Suelen ser tampones de tris y cloro de potasio 120 00:06:43,000 --> 00:06:45,000 y vienen concentrados. 121 00:06:45,000 --> 00:06:46,000 ¿De acuerdo? 122 00:06:46,000 --> 00:06:48,000 En este tampón es donde yo voy a disolver, 123 00:06:48,000 --> 00:06:50,000 voy a ir añadiendo el resto de componentes 124 00:06:50,000 --> 00:06:52,000 que vamos a ver ahora. 125 00:06:52,000 --> 00:06:55,000 El cloruro de magnesio, los DNTPs, 126 00:06:55,000 --> 00:06:58,000 es decir, los nucleótidos de oxinucleótidos, 127 00:06:58,000 --> 00:07:01,000 pero en este caso son trifosfato, 128 00:07:01,000 --> 00:07:03,000 son nucleótidos que no llevan un fosfato, 129 00:07:03,000 --> 00:07:05,000 sino que llevan tres, 130 00:07:05,000 --> 00:07:07,000 los primers, por supuesto, 131 00:07:07,000 --> 00:07:10,000 la polimerasa, que se suele utilizar 132 00:07:10,000 --> 00:07:11,000 para la PCR convencional, 133 00:07:11,000 --> 00:07:15,000 la tac-polimerasa y el DNA molde. 134 00:07:15,000 --> 00:07:17,000 ¿De acuerdo? 135 00:07:17,000 --> 00:07:19,000 Vale, pues vamos a ir viendo ahora 136 00:07:19,000 --> 00:07:20,000 en esta mezcla de reacción 137 00:07:20,000 --> 00:07:23,000 cada uno de estos componentes. 138 00:07:26,000 --> 00:07:29,000 El primero de ellos es el cloruro de magnesio. 139 00:07:29,000 --> 00:07:32,000 El cloruro de magnesio es muy importante, 140 00:07:32,000 --> 00:07:34,000 no tanto por el cloruro, 141 00:07:34,000 --> 00:07:35,000 ya sabéis que es una sal, 142 00:07:35,000 --> 00:07:38,000 el cloruro de magnesio es una sal binaria, 143 00:07:38,000 --> 00:07:40,000 no tanto por el cloruro, sino por el magnesio, 144 00:07:40,000 --> 00:07:42,000 porque es importante añadir magnesio, 145 00:07:42,000 --> 00:07:43,000 porque la DNA polimerasa 146 00:07:43,000 --> 00:07:46,000 utiliza el magnesio como cofactor. 147 00:07:46,000 --> 00:07:47,000 Si no hay magnesio, 148 00:07:47,000 --> 00:07:49,000 la DNA polimerasa no puede actuar 149 00:07:49,000 --> 00:07:52,000 y por tanto podremos poner kilos y kilos 150 00:07:52,000 --> 00:07:56,000 de DNA polimerasa que estará inactiva. 151 00:07:56,000 --> 00:07:58,000 ¿De acuerdo? 152 00:07:58,000 --> 00:08:00,000 Por tanto, la ausencia de cloruro de magnesio 153 00:08:00,000 --> 00:08:03,000 y también el exceso 154 00:08:05,000 --> 00:08:08,000 inactivan la DNA polimerasa. 155 00:08:08,000 --> 00:08:10,000 Esto es muy importante. 156 00:08:10,000 --> 00:08:11,000 Es decir, la ausencia, 157 00:08:11,000 --> 00:08:13,000 una concentración muy baja, 158 00:08:13,000 --> 00:08:14,000 es como si no hubiera puesto, 159 00:08:14,000 --> 00:08:15,000 si la concentración es muy baja, 160 00:08:15,000 --> 00:08:19,000 si no tiene una cantidad de magnesio mínima, 161 00:08:19,000 --> 00:08:21,000 la DNA polimerasa no va a actuar. 162 00:08:21,000 --> 00:08:23,000 Pero si pongo en exceso, 163 00:08:23,000 --> 00:08:26,000 también se va a inhibir la reacción de PCR 164 00:08:26,000 --> 00:08:30,000 y sobre todo va a disminuir la fidelidad. 165 00:08:30,000 --> 00:08:33,000 Por tanto, es muy importante el cloruro de magnesio. 166 00:08:33,000 --> 00:08:35,000 Podemos jugar con su concentración. 167 00:08:35,000 --> 00:08:39,000 Normalmente, a nivel comercial, 168 00:08:39,000 --> 00:08:41,000 la concentración inicial, 169 00:08:41,000 --> 00:08:43,000 que es lo que va a ir apareciendo aquí, 170 00:08:43,000 --> 00:08:46,000 es la concentración del tubito 171 00:08:46,000 --> 00:08:48,000 que yo compro en la casa comercial. 172 00:08:48,000 --> 00:08:52,000 El cloruro de magnesio viene siempre a 25 milimolar. 173 00:08:52,000 --> 00:08:55,000 Y la concentración final se refiere a la concentración 174 00:08:55,000 --> 00:08:58,000 que tiene que haber en el tubo de PCR 175 00:08:58,000 --> 00:09:00,000 antes de que empiece la reacción. 176 00:09:00,000 --> 00:09:02,000 Entonces, la concentración final 177 00:09:02,000 --> 00:09:05,000 suele estar en torno a 1,5 milimolar. 178 00:09:05,000 --> 00:09:06,000 ¿De acuerdo? 179 00:09:06,000 --> 00:09:09,000 Esto es una concentración media 180 00:09:09,000 --> 00:09:12,000 y con el cloruro de magnesio podemos jugar. 181 00:09:12,000 --> 00:09:13,000 ¿De acuerdo? 182 00:09:13,000 --> 00:09:14,000 Podemos jugar, 183 00:09:14,000 --> 00:09:17,000 podemos subir hasta 2 milimolar, 184 00:09:17,000 --> 00:09:20,000 2,25, incluso 2,5 milimolar, 185 00:09:20,000 --> 00:09:21,000 no mucho más, 186 00:09:21,000 --> 00:09:25,000 y podemos disminuir a 1 o incluso 0,75 milimolar. 187 00:09:25,000 --> 00:09:26,000 ¿De acuerdo? 188 00:09:26,000 --> 00:09:27,000 Por tanto, 189 00:09:27,000 --> 00:09:30,000 el primer componente que voy a poner en el tampón, 190 00:09:30,000 --> 00:09:31,000 en la mezcla de reacción, 191 00:09:31,000 --> 00:09:33,000 es el cloruro de magnesio. 192 00:09:33,000 --> 00:09:36,000 Muy importante porque el magnesio es cofactor 193 00:09:36,000 --> 00:09:37,000 de la DNA polimerasa. 194 00:09:37,000 --> 00:09:41,000 Si no hay suficiente magnesio ahí en exceso, 195 00:09:41,000 --> 00:09:44,000 la DNA polimerasa no funciona bien 196 00:09:44,000 --> 00:09:45,000 y, por tanto, 197 00:09:45,000 --> 00:09:48,000 la eficiencia de la reacción es bajita. 198 00:09:48,000 --> 00:09:51,000 El segundo componente son los DNTPs. 199 00:09:51,000 --> 00:09:55,000 Los DNTPs son los deoxinucleótidos trifosfato. 200 00:09:55,000 --> 00:09:56,000 Ya hemos dicho antes 201 00:09:56,000 --> 00:09:58,000 que son los nucleótidos normales. 202 00:09:58,000 --> 00:10:01,000 Los 4 deoxinucleótidos 203 00:10:01,000 --> 00:10:04,000 es una mezcla de los 4 deoxinucleótidos, 204 00:10:04,000 --> 00:10:05,000 esto es importante, 205 00:10:05,000 --> 00:10:09,000 adenina, timina, guanina y ciptosina, 206 00:10:09,000 --> 00:10:10,000 los 4, 207 00:10:10,000 --> 00:10:14,000 su concentración inicial es 10 milimolar. 208 00:10:14,000 --> 00:10:16,000 Muy importante, 209 00:10:16,000 --> 00:10:18,000 los 4 deoxinucleótidos, 210 00:10:18,000 --> 00:10:20,000 los 4 DNTPs, 211 00:10:20,000 --> 00:10:22,000 yo los compro comerciales, 212 00:10:22,000 --> 00:10:24,000 ya mezclados. 213 00:10:24,000 --> 00:10:26,000 También podría hacer yo la mezcla 214 00:10:26,000 --> 00:10:29,000 y comprar los 4 DNTPs por separado, 215 00:10:29,000 --> 00:10:31,000 pero muy importante, 216 00:10:31,000 --> 00:10:34,000 la concentración final de esa mezcla 217 00:10:34,000 --> 00:10:36,000 es 10 milimolar 218 00:10:36,000 --> 00:10:39,000 y la concentración de cada uno de los DNTPs 219 00:10:39,000 --> 00:10:41,000 tiene que ser idéntica. 220 00:10:41,000 --> 00:10:42,000 Por tanto, 221 00:10:42,000 --> 00:10:45,000 adenina, timina, guanina y ciptosina 222 00:10:45,000 --> 00:10:47,000 deben estar a una concentración 223 00:10:47,000 --> 00:10:50,000 de 2,5 milimolar. 224 00:10:50,000 --> 00:10:53,000 Me imagino que se entiende, ¿de acuerdo? 225 00:10:53,000 --> 00:10:56,000 2,5 milimolar por 4 nucleótidos 226 00:10:56,000 --> 00:11:00,000 me da una concentración de 10 milimolar. 227 00:11:00,000 --> 00:11:01,000 Y yo en el tubo, 228 00:11:01,000 --> 00:11:04,000 normalmente se suele utilizar en el tubo de PCR, 229 00:11:04,000 --> 00:11:07,000 una concentración final de DNTPs 230 00:11:07,000 --> 00:11:11,000 de 200 micromolar aproximadamente. 231 00:11:11,000 --> 00:11:12,000 ¿De acuerdo? 232 00:11:12,000 --> 00:11:15,000 Es una burrada. 233 00:11:15,000 --> 00:11:16,000 ¿Vale? 234 00:11:16,000 --> 00:11:18,000 Pongo DNTPs en exceso. 235 00:11:18,000 --> 00:11:21,000 Poner muchísimos DNTPs 236 00:11:21,000 --> 00:11:23,000 no inhibe la reacción. 237 00:11:23,000 --> 00:11:26,000 Lo que hace es que la reacción sea más cara 238 00:11:26,000 --> 00:11:28,000 porque los DNTPs no son baratos. 239 00:11:28,000 --> 00:11:29,000 De todas maneras, 240 00:11:29,000 --> 00:11:30,000 el componente más caro de aquí, 241 00:11:30,000 --> 00:11:31,000 como veremos ahora, 242 00:11:31,000 --> 00:11:32,000 es la DNA polimerasa, 243 00:11:32,000 --> 00:11:34,000 la TAC polimerasa. 244 00:11:34,000 --> 00:11:35,000 ¿De acuerdo? 245 00:11:35,000 --> 00:11:37,000 Por tanto, muy importante. 246 00:11:37,000 --> 00:11:39,000 Suele venir comercialmente ya la mezcla 247 00:11:39,000 --> 00:11:42,000 de los 4 DNTPs a 10 milimolar. 248 00:11:42,000 --> 00:11:44,000 La concentración de cada uno de ellos 249 00:11:44,000 --> 00:11:46,000 debe ser idéntica. 250 00:11:46,000 --> 00:11:48,000 Por tanto, 2,5 milimolar. 251 00:11:48,000 --> 00:11:52,000 Y la concentración final en el tubo de reacción 252 00:11:52,000 --> 00:11:55,000 suele estar en torno a 200 micromolar. 253 00:11:57,000 --> 00:11:58,000 Los cebadores. 254 00:11:58,000 --> 00:12:00,000 El forward y el reverse. 255 00:12:00,000 --> 00:12:01,000 ¿De acuerdo? 256 00:12:01,000 --> 00:12:02,000 Los cebadores. 257 00:12:02,000 --> 00:12:06,000 Normalmente, los cebadores los diseñamos 258 00:12:06,000 --> 00:12:08,000 en el ejercicio que habéis hecho 259 00:12:08,000 --> 00:12:11,000 con el gen de GPX. 260 00:12:14,000 --> 00:12:16,000 Habéis diseñado unos cebadores específicos, 261 00:12:16,000 --> 00:12:18,000 un forward, un reverse. 262 00:12:18,000 --> 00:12:19,000 ¿De acuerdo? 263 00:12:19,000 --> 00:12:21,000 Cada uno de ellos tiene que estar 264 00:12:23,000 --> 00:12:24,000 a la misma concentración, 265 00:12:24,000 --> 00:12:26,000 a 10 micromolar, 266 00:12:26,000 --> 00:12:30,000 que suele venir a esta concentración inicial 267 00:12:30,000 --> 00:12:32,000 en el tubo comercial. 268 00:12:32,000 --> 00:12:34,000 Normalmente, el tubo comercial 269 00:12:34,000 --> 00:12:36,000 viene mucho más concentrado 270 00:12:36,000 --> 00:12:38,000 y nosotros hacemos alícuotas. 271 00:12:38,000 --> 00:12:40,000 Es decir, lo diluimos en tubitos 272 00:12:40,000 --> 00:12:42,000 que los llamamos alícuotas. 273 00:12:42,000 --> 00:12:44,000 Terminología nueva 274 00:12:44,000 --> 00:12:46,000 que creo que hasta ahora no la hemos utilizado. 275 00:12:46,000 --> 00:12:49,000 Por tanto, del tubo comercial que me llega 276 00:12:49,000 --> 00:12:52,000 yo hago diluciones que son alícuotas 277 00:12:52,000 --> 00:12:54,000 que las voy a dejar a 10 micromolar. 278 00:12:54,000 --> 00:12:55,000 ¿De acuerdo? 279 00:12:55,000 --> 00:12:57,000 Por tanto, mi concentración inicial 280 00:12:57,000 --> 00:12:58,000 de cebadores, 281 00:12:58,000 --> 00:13:00,000 tanto del forward como del reverse, 282 00:13:00,000 --> 00:13:02,000 de los dos, cada uno de ellos, 283 00:13:02,000 --> 00:13:04,000 tiene que estar a 10 micromolar. 284 00:13:04,000 --> 00:13:06,000 Y la concentración final 285 00:13:06,000 --> 00:13:11,000 suele estar en torno a 200-400 nanomolar. 286 00:13:11,000 --> 00:13:13,000 Fijaos que vamos bajando de escala. 287 00:13:13,000 --> 00:13:16,000 Milimolar, micromolar, mil veces menos, 288 00:13:16,000 --> 00:13:18,000 nanomolar, mil veces menos. 289 00:13:18,000 --> 00:13:19,000 ¿De acuerdo? 290 00:13:19,000 --> 00:13:22,000 Si pongo un exceso de cebadores, 291 00:13:22,000 --> 00:13:25,000 si no se inhibe la reacción, 292 00:13:25,000 --> 00:13:26,000 lo único que puede pasar 293 00:13:26,000 --> 00:13:28,000 es que haya tantos cebadores 294 00:13:28,000 --> 00:13:29,000 que se empiecen a pegar 295 00:13:29,000 --> 00:13:32,000 por cualquier sitio del DNA molde 296 00:13:32,000 --> 00:13:34,000 y amplifique la polimerasa, 297 00:13:34,000 --> 00:13:37,000 fragmentos, de forma inespecífica. 298 00:13:37,000 --> 00:13:40,000 Entonces, la concentración de los cebadores 299 00:13:40,000 --> 00:13:43,000 sí es crítica en la mezcla de reacción. 300 00:13:43,000 --> 00:13:45,000 ¿De acuerdo? 301 00:13:45,000 --> 00:13:46,000 Va. 302 00:13:46,000 --> 00:13:48,000 La DNA polimerasa. 303 00:13:48,000 --> 00:13:49,000 Para la PCR convencional 304 00:13:49,000 --> 00:13:50,000 ya hemos dicho que normalmente 305 00:13:50,000 --> 00:13:52,000 se suele utilizar la TAC polimerasa. 306 00:13:52,000 --> 00:13:54,000 Ya la conocemos. 307 00:13:54,000 --> 00:13:57,000 La TAC polimerasa, igual que todos los enzimas, 308 00:14:01,000 --> 00:14:04,000 no viene expresada en unidades de concentración, 309 00:14:04,000 --> 00:14:08,000 sino en lo que llamamos unidades internacionales. 310 00:14:08,000 --> 00:14:12,000 Esta es una unidad de actividad enzimática. 311 00:14:12,000 --> 00:14:15,000 Es decir, lo que viene a decir esto 312 00:14:15,000 --> 00:14:17,000 es que cuando me llega el tubito 313 00:14:17,000 --> 00:14:20,000 que acabo de comprar con la TAC polimerasa 314 00:14:20,000 --> 00:14:24,000 y me pone 2,5 unidades por microlitro, 315 00:14:24,000 --> 00:14:27,000 significa que si yo cojo un microlitro 316 00:14:27,000 --> 00:14:30,000 de ese tubo comercial, 317 00:14:30,000 --> 00:14:34,000 en ese tubo hay 2,5 unidades 318 00:14:34,000 --> 00:14:36,000 de actividad enzimática. 319 00:14:36,000 --> 00:14:38,000 ¿De acuerdo? 320 00:14:38,000 --> 00:14:41,000 Bueno, el uso de unidades internacionales 321 00:14:41,000 --> 00:14:45,000 para los enzimas se utiliza muchísimo. 322 00:14:45,000 --> 00:14:47,000 Entonces, normalmente la DNA polimerasa 323 00:14:47,000 --> 00:14:51,000 suele estar en torno a 2,5 a 5 unidades por microlitro 324 00:14:51,000 --> 00:14:56,000 y dependiendo del tipo de DNA polimerasa que tenga, 325 00:14:56,000 --> 00:15:00,000 suele variar en el tubo de reacción. 326 00:15:00,000 --> 00:15:05,000 Se suele poner de 1 a 2,5 unidades de actividad. 327 00:15:05,000 --> 00:15:10,000 Por tanto, si voy a poner 2,5 unidades de actividad 328 00:15:10,000 --> 00:15:14,000 en mi tubo, tendría que pipetear un microlitro 329 00:15:14,000 --> 00:15:18,000 si está a 2,5 unidades microlitro, 330 00:15:18,000 --> 00:15:22,000 pero si el tubo me ha llegado a 5 unidades microlitro, 331 00:15:22,000 --> 00:15:25,000 para tener en mi tubo 2,5 unidades, 332 00:15:25,000 --> 00:15:28,000 tendría que añadir 0,5 microlitros. 333 00:15:28,000 --> 00:15:31,000 Bueno, esto quizás es un poquito lioso, 334 00:15:31,000 --> 00:15:35,000 pero no tiene ninguna complicación. 335 00:15:35,000 --> 00:15:37,000 Haremos problemas, haremos problemas 336 00:15:37,000 --> 00:15:40,000 y veréis que no es nada difícil. 337 00:15:41,000 --> 00:15:45,000 ¿Qué polimerasa utilizo para mi PCR convencional? 338 00:15:45,000 --> 00:15:47,000 ¿Cuál elijo? ¿La tag polimerasa? 339 00:15:47,000 --> 00:15:50,000 ¿La tag polimerasa gold, que es de máxima fidelidad? 340 00:15:50,000 --> 00:15:52,000 Pues depende de tres parámetros 341 00:15:52,000 --> 00:15:54,000 y esto es muy importante y lo tenéis en el libro. 342 00:15:54,000 --> 00:15:58,000 El primer parámetro depende de la fidelidad. 343 00:15:58,000 --> 00:16:03,000 Es decir, si yo, imaginaos que la PCR que quiero hacer 344 00:16:03,000 --> 00:16:08,000 es solamente detectar, por ejemplo, la PCR de la COVID, 345 00:16:08,000 --> 00:16:10,000 es sencillamente quiero detectar 346 00:16:10,000 --> 00:16:14,000 si el paciente tiene o no tiene RNA del virus. 347 00:16:14,000 --> 00:16:16,000 Por tanto, lo único que me interesa, 348 00:16:16,000 --> 00:16:18,000 como vamos a ver más adelante, 349 00:16:18,000 --> 00:16:21,000 es si es positivo o es negativo. 350 00:16:21,000 --> 00:16:24,000 Que la DNA polimerasa haya cometido más o menos errores, 351 00:16:24,000 --> 00:16:26,000 me da igual. 352 00:16:26,000 --> 00:16:29,000 Por tanto, puedo utilizar una tag polimerasa baratita, 353 00:16:29,000 --> 00:16:32,000 porque lo único que quiero es que amplifique. 354 00:16:32,000 --> 00:16:34,000 Si amplifica, significa que el paciente es positivo. 355 00:16:34,000 --> 00:16:37,000 Si no amplifica, significa que el paciente es negativo. 356 00:16:37,000 --> 00:16:41,000 Pero si yo lo que quiero es amplificar un gen 357 00:16:41,000 --> 00:16:43,000 para luego clonarlo en un vector 358 00:16:43,000 --> 00:16:46,000 y hacer estudios funcionales en células, 359 00:16:46,000 --> 00:16:48,000 es decir, si yo ese gen que he amplificado 360 00:16:48,000 --> 00:16:51,000 luego lo voy a usar para otros experimentos, 361 00:16:51,000 --> 00:16:53,000 necesito que lo haya copiado bien 362 00:16:53,000 --> 00:16:56,000 y que la tag polimerasa no haya cometido errores. 363 00:16:56,000 --> 00:16:58,000 Por eso necesito lo que llamamos 364 00:16:58,000 --> 00:17:01,000 las DNA polimerasas de alta fidelidad. 365 00:17:01,000 --> 00:17:04,000 Por tanto, primer parámetro 366 00:17:04,000 --> 00:17:08,000 que miro para elegir la polimerasa, la fidelidad. 367 00:17:08,000 --> 00:17:11,000 El segundo, la longitud del fragmento. 368 00:17:11,000 --> 00:17:14,000 Es decir, no es lo mismo amplificar 200 pares de bases, 369 00:17:14,000 --> 00:17:16,000 500 pares de bases, 370 00:17:16,000 --> 00:17:19,000 que tener que amplificar 3,5 kilobases, 371 00:17:19,000 --> 00:17:22,000 es decir, 3500 pares de bases. 372 00:17:22,000 --> 00:17:25,000 Hay polimerasas que funcionan mucho mejor 373 00:17:25,000 --> 00:17:29,000 cuando lo que queremos es amplificar fragmentos grandes. 374 00:17:29,000 --> 00:17:32,000 Segundo parámetro, longitud del amplicón. 375 00:17:33,000 --> 00:17:37,000 Y tercer parámetro, la secuencia que tenemos que amplificar. 376 00:17:37,000 --> 00:17:41,000 No es lo mismo una secuencia muy rica en adeninas y timinas 377 00:17:41,000 --> 00:17:44,000 que una secuencia muy rica en citosinas y guaninas. 378 00:17:44,000 --> 00:17:45,000 ¿De acuerdo? 379 00:17:45,000 --> 00:17:49,000 Por tanto, tres parámetros para poder elegir la polimerasa. 380 00:17:49,000 --> 00:17:52,000 La fidelidad, la longitud del amplicón 381 00:17:52,000 --> 00:17:55,000 y la secuencia concreta. 382 00:17:55,000 --> 00:17:56,000 ¿De acuerdo? 383 00:17:56,000 --> 00:17:59,000 Muy bien, pues ya hemos visto cuatro componentes 384 00:17:59,000 --> 00:18:02,000 que vamos a ir poniendo en la mezcla de reacción 385 00:18:02,000 --> 00:18:05,000 en cada tubo a estas concentraciones. 386 00:18:05,000 --> 00:18:07,000 El magnesio, que es el cofactor, 387 00:18:07,000 --> 00:18:12,000 los DNTPs, los elevadores forward y reverse. 388 00:18:12,000 --> 00:18:17,000 Por tanto, pondré 200 o 400 nanomolar del forward 389 00:18:17,000 --> 00:18:19,000 y 200-400 nanomolar del reverse 390 00:18:19,000 --> 00:18:21,000 y la DNA polimerasa. 391 00:18:21,000 --> 00:18:24,000 ¿Qué más necesito añadir? 392 00:18:24,000 --> 00:18:26,000 El DNA molde, por supuesto. 393 00:18:26,000 --> 00:18:29,000 Si no pongo DNA molde, la polimerasa... 394 00:18:29,000 --> 00:18:32,000 Los elevadores no pueden hibridar con nada 395 00:18:32,000 --> 00:18:34,000 y la polimerasa no tiene nada que copiar 396 00:18:34,000 --> 00:18:36,000 porque no tiene nada que leer. 397 00:18:36,000 --> 00:18:40,000 Por tanto, el DNA molde es tremendamente importante. 398 00:18:40,000 --> 00:18:41,000 ¿De acuerdo? 399 00:18:41,000 --> 00:18:45,000 Entonces, ¿cuál es la concentración inicial? 400 00:18:45,000 --> 00:18:46,000 Pues no la sé. 401 00:18:46,000 --> 00:18:48,000 A priori, no la conozco. 402 00:18:48,000 --> 00:18:52,000 Estas sí que las conozco porque son las comerciales. 403 00:18:52,000 --> 00:18:56,000 Pero si yo es un DNA que he extraído de un paciente, 404 00:18:56,000 --> 00:19:00,000 de unas células que me han llegado de un paciente, por ejemplo, 405 00:19:00,000 --> 00:19:04,000 o un DNA que hemos extraído como el que purificasteis, 406 00:19:04,000 --> 00:19:06,000 hicimos en la práctica, 407 00:19:06,000 --> 00:19:09,000 es decir, la extracción y purificación que hicisteis en la práctica, 408 00:19:09,000 --> 00:19:11,000 midiendo la absorbancia 260, 409 00:19:11,000 --> 00:19:14,000 yo calcularía, como hicisteis en la práctica, 410 00:19:14,000 --> 00:19:17,000 la concentración inicial de mi DNA molde. 411 00:19:17,000 --> 00:19:21,000 Por tanto, a priori, no sé cuál es la concentración. 412 00:19:21,000 --> 00:19:26,000 Lo que sí sé es el rango de concentraciones que se necesitan 413 00:19:26,000 --> 00:19:28,000 en el tubo de PCR, 414 00:19:28,000 --> 00:19:31,000 la concentración final que deben tener, 415 00:19:31,000 --> 00:19:34,000 dependiendo de qué tipo de DNA es. 416 00:19:34,000 --> 00:19:38,000 Si es un DNA plasmídico, un plásmido bacteriano, 417 00:19:38,000 --> 00:19:41,000 está con poquita cantidad suficiente. 418 00:19:41,000 --> 00:19:44,000 0,1 a un nanogramos. 419 00:19:44,000 --> 00:19:48,000 Esto sería 1 por 10 elevado a la menos 9. 420 00:19:48,000 --> 00:19:50,000 O sea, prácticamente nada. 421 00:19:50,000 --> 00:19:53,000 Con muy poquito que ponga. 422 00:19:53,000 --> 00:19:57,000 Si es un DNA plasmídico, es suficiente para que amplifique bien. 423 00:19:57,000 --> 00:20:02,000 De 1 a 10 nanogramos si es el DNA cromosómico bacteriano. 424 00:20:02,000 --> 00:20:04,000 ¿Vale? El DNA... 425 00:20:04,000 --> 00:20:07,000 Pero si es un DNA eucariota, por ejemplo, de levaduras, 426 00:20:07,000 --> 00:20:13,000 o DNA nuclear, nuclear de células humanas, por ejemplo, 427 00:20:13,000 --> 00:20:15,000 necesito mucha mayor cantidad. 428 00:20:15,000 --> 00:20:19,000 ¿Por qué? Porque hay tanta cantidad de DNA. 429 00:20:19,000 --> 00:20:24,000 Imaginaos que es el DNA genómico de una célula eucariota humana. 430 00:20:24,000 --> 00:20:27,000 46 cromosomas gigantescos. 431 00:20:27,000 --> 00:20:31,000 Muy largos, muy grandes, muy complejos, con histonas. 432 00:20:31,000 --> 00:20:32,000 ¿Se entiende? 433 00:20:32,000 --> 00:20:35,000 Para que los cebadores, para que los primers, 434 00:20:35,000 --> 00:20:38,000 encuentren la secuencia diana, 435 00:20:38,000 --> 00:20:42,000 necesito poner mucha mayor cantidad de DNA. 436 00:20:42,000 --> 00:20:44,000 ¿Ya os dais cuenta? 437 00:20:44,000 --> 00:20:47,000 Que es prácticamente un orden de magnitud. 438 00:20:47,000 --> 00:20:50,000 10 veces más, 100 veces más. 439 00:20:50,000 --> 00:20:52,000 ¿De acuerdo? 440 00:20:52,000 --> 00:20:55,000 A grandes rasgos, como regla general, 441 00:20:55,000 --> 00:20:59,000 se suelen poner, si no tenemos mucha idea, 442 00:20:59,000 --> 00:21:02,000 se suelen poner 10 nanogramos de DNA 443 00:21:02,000 --> 00:21:06,000 por cada microlitro de mezcla de reacción. 444 00:21:06,000 --> 00:21:10,000 Es decir, yo he puesto aquí de 100 a 500 ya, 445 00:21:10,000 --> 00:21:16,000 pero de 100 a 500 están 200, 250, 300, 429, 446 00:21:16,000 --> 00:21:18,000 ¿se entiende? 447 00:21:18,000 --> 00:21:20,000 ¿Qué cantidad pongo? 448 00:21:20,000 --> 00:21:23,000 Pues esta regla de oro es muy importante. 449 00:21:23,000 --> 00:21:26,000 Se estima unos 10 nanogramos de DNA 450 00:21:26,000 --> 00:21:30,000 por cada microlitro de la mezcla de reacción. 451 00:21:30,000 --> 00:21:35,000 Imaginaos que la PCR la voy a hacer en 50 microlitros. 452 00:21:35,000 --> 00:21:42,000 La reaction mix son 50 microlitros por 10. 453 00:21:42,000 --> 00:21:45,000 En ese tubo tendría que añadir 500 nanogramos. 454 00:21:45,000 --> 00:21:47,000 ¿Se entiende? 455 00:21:47,000 --> 00:21:50,000 Espero que sí. 456 00:21:50,000 --> 00:21:54,000 Del DNA molde, el libro nos recuerda, 457 00:21:54,000 --> 00:21:56,000 yo no voy a entrar porque ya lo hemos dado, 458 00:21:56,000 --> 00:21:59,000 lo hemos estudiado y lo hemos examinado, 459 00:21:59,000 --> 00:22:03,000 nos recuerda que el DNA tiene que tener suficiente calidad 460 00:22:03,000 --> 00:22:06,000 y debe haber suficiente cantidad. 461 00:22:06,000 --> 00:22:08,000 En cuanto a la cantidad, lo acabamos de ver. 462 00:22:08,000 --> 00:22:11,000 En cuanto a la calidad, 463 00:22:11,000 --> 00:22:13,000 pues ya sabemos qué significa calidad. 464 00:22:14,000 --> 00:22:17,000 Primer parámetro de calidad de un DNA molde, la integridad. 465 00:22:17,000 --> 00:22:19,000 ¿Cómo vemos la integridad? 466 00:22:19,000 --> 00:22:22,000 Si os acordáis, corriendo el DNA en un gel de agarosa. 467 00:22:22,000 --> 00:22:26,000 Si es un plásmido, un cromosoma bacteriano 468 00:22:26,000 --> 00:22:29,000 o es DNA eucariota, ya sabemos, DNA genómico, 469 00:22:29,000 --> 00:22:32,000 ya sabemos que en el gel de agarosa se ve diferente. 470 00:22:32,000 --> 00:22:34,000 Primer parámetro, integridad. 471 00:22:34,000 --> 00:22:39,000 Segundo parámetro, los contaminantes, la pureza. 472 00:22:39,000 --> 00:22:42,000 Y esto acordaos que ya lo hemos medido 473 00:22:42,000 --> 00:22:46,000 con las absorbancias 260, 230 y 280, 474 00:22:46,000 --> 00:22:48,000 haciendo los cocientes, ¿os acordáis? 475 00:22:48,000 --> 00:22:52,000 No voy a entrar en detalle porque ya lo sabemos. 476 00:22:52,000 --> 00:22:54,000 Lo nuevo es esto que hemos visto, 477 00:22:54,000 --> 00:22:56,000 de qué cantidad tengo que poner el DNA molde. 478 00:22:56,000 --> 00:22:58,000 Muy importante, muy importante, 479 00:22:58,000 --> 00:23:02,000 y el libro no hace mención, 480 00:23:02,000 --> 00:23:04,000 hay que ceñirse a estas cantidades. 481 00:23:04,000 --> 00:23:07,000 Uno puede decir, bueno, pues, 482 00:23:07,000 --> 00:23:10,000 para asegurarme de que va a amplificar la polimerasa, 483 00:23:10,000 --> 00:23:15,000 en lugar de 500, pues voy a poner 800 nanogramos. 484 00:23:15,000 --> 00:23:17,000 Vale. 485 00:23:17,000 --> 00:23:22,000 Una cantidad excesiva de DNA inhibe la reacción de PCR. 486 00:23:22,000 --> 00:23:24,000 Para que nos aclaremos y nos entendamos, 487 00:23:24,000 --> 00:23:28,000 la DNA polimerasa se aturulla, ¿de acuerdo? 488 00:23:28,000 --> 00:23:31,000 No me pongáis esto en el examen, 489 00:23:31,000 --> 00:23:33,000 pero es para que nos entendamos. 490 00:23:33,000 --> 00:23:37,000 Hay tal cantidad, tal maraña de fibras de DNA 491 00:23:37,000 --> 00:23:40,000 en el tubo de PCR que la DNA polimerasa 492 00:23:40,000 --> 00:23:43,000 es incapaz de encontrar los sitios de hibridación 493 00:23:43,000 --> 00:23:45,000 donde están los primers, ¿de acuerdo? 494 00:23:45,000 --> 00:23:49,000 Y, por tanto, se inhibe la eficiencia 495 00:23:49,000 --> 00:23:51,000 de la reacción de PCR. 496 00:23:51,000 --> 00:23:55,000 Por tanto, no por poner mucho DNA es mejor. 497 00:23:55,000 --> 00:23:58,000 Hay que poner el DNA justo, ¿vale? 498 00:23:58,000 --> 00:24:00,000 Siguiendo esta regla, ¿de acuerdo? 499 00:24:00,000 --> 00:24:03,000 Es lo mismo que la polimerasa, no lo he comentado antes, 500 00:24:03,000 --> 00:24:04,000 pero uno puede decir, bueno, pues, 501 00:24:04,000 --> 00:24:06,000 para que me funcione muy bien, 502 00:24:06,000 --> 00:24:12,000 en lugar de 2,5, pues, yo le voy a poner 5 unidades, ¿vale? 503 00:24:12,000 --> 00:24:16,000 Para poner más polimerasa de la que tocaría, 504 00:24:16,000 --> 00:24:19,000 no inhibe la reacción. 505 00:24:19,000 --> 00:24:23,000 Lo que ocurre es que si en lugar de poner 2,5 pongo 5, 506 00:24:23,000 --> 00:24:27,000 ese tubito de reacción me va a costar el doble de caro. 507 00:24:27,000 --> 00:24:31,000 Y la DNA polimerasa es muy cara, muy cara. 508 00:24:31,000 --> 00:24:36,000 Un tubito de DNA polimerasa con el buffer, 509 00:24:36,000 --> 00:24:39,000 con el buffer de reacción, reaction buffer, 510 00:24:39,000 --> 00:24:43,000 concentrado con 100 microlitros aproximadamente, 511 00:24:43,000 --> 00:24:44,000 o sea que tendríamos, 512 00:24:44,000 --> 00:24:47,000 si tuviésemos que poner un microlitro de la polimerasa, 513 00:24:47,000 --> 00:24:49,000 tendríamos para 100 reacciones. 514 00:24:49,000 --> 00:24:53,000 Daos cuenta que en el termobloque, 515 00:24:53,000 --> 00:24:59,000 o sea, sí, el bloque térmico de los termocicladores, 516 00:24:59,000 --> 00:25:04,000 los termocicladores están programados para 96 muestras. 517 00:25:04,000 --> 00:25:06,000 O sea que con un tubo de 100 microlitros, 518 00:25:06,000 --> 00:25:08,000 si tengo que poner un microlitro, 519 00:25:08,000 --> 00:25:10,000 básicamente el tubo me lo fundo 520 00:25:10,000 --> 00:25:13,000 poniendo todos los tubos del termociclador. 521 00:25:13,000 --> 00:25:14,000 Vale. 522 00:25:14,000 --> 00:25:17,000 A lo que voy, que me estoy enrollando. 523 00:25:17,000 --> 00:25:21,000 La DNA polimerasa, un tubito de 100 microlitros con su buffer, 524 00:25:21,000 --> 00:25:25,000 que te suelen venir dos tubitos de buffer, 525 00:25:25,000 --> 00:25:28,000 te puede costar en torno a 200 euros. 526 00:25:28,000 --> 00:25:33,000 Entonces, si en lugar de poner 2,5 pongo el doble, 527 00:25:33,000 --> 00:25:36,000 pues me va a salir el doble de caro. 528 00:25:36,000 --> 00:25:39,000 Esto es importante. 529 00:25:39,000 --> 00:25:44,000 Por tanto, cuidaremos la calidad y la cantidad del DNA molde. 530 00:25:44,000 --> 00:25:49,000 Y por último, hay determinadas ocasiones, 531 00:25:49,000 --> 00:25:52,000 imaginaos que yo he diseñado unos primers de nuevo, 532 00:25:52,000 --> 00:25:55,000 no son primers que los conozco porque los acabo de diseñar, 533 00:25:55,000 --> 00:25:56,000 como habéis hecho vosotros. 534 00:25:56,000 --> 00:26:01,000 He puesto cloro de magnésio 1,5, 200 micromolar de DNTP, 535 00:26:01,000 --> 00:26:04,000 he puesto estas cantidades de DNA eucariota. 536 00:26:04,000 --> 00:26:07,000 Es la primera vez que hago esa PCR con esos primers 537 00:26:07,000 --> 00:26:09,000 y no me funciona. 538 00:26:09,000 --> 00:26:11,000 ¿Qué hago? 539 00:26:11,000 --> 00:26:13,000 ¿Dónde ha estado el fallo? 540 00:26:13,000 --> 00:26:15,000 ¿Los cebadores están mal diseñados? 541 00:26:15,000 --> 00:26:17,000 ¿Los puedo coger y tirarlos? 542 00:26:17,000 --> 00:26:20,000 ¿Hay algún componente, algún reactivo que no funciona? 543 00:26:20,000 --> 00:26:22,000 Pues lo normal es, 544 00:26:22,000 --> 00:26:25,000 hay una serie de aditivos y potenciadores 545 00:26:25,000 --> 00:26:27,000 que puedo utilizar, 546 00:26:27,000 --> 00:26:31,000 que me ayudan a que la PCR funcione mejor 547 00:26:31,000 --> 00:26:35,000 y la DNA polimerasa actúe de forma más óptima. 548 00:26:35,000 --> 00:26:38,000 No vamos a entrar en detalle, los tenéis en el libro, 549 00:26:38,000 --> 00:26:40,000 pero utilizar estos aditivos, 550 00:26:40,000 --> 00:26:43,000 normalmente cuando tenga bajo rendimiento, 551 00:26:43,000 --> 00:26:45,000 esto es muy importante, 552 00:26:45,000 --> 00:26:46,000 ¿de acuerdo? 553 00:26:46,000 --> 00:26:47,000 No me ha funcionado la PCR, 554 00:26:47,000 --> 00:26:48,000 no ha amplificado casi nada, 555 00:26:48,000 --> 00:26:50,000 por tanto he tenido un bajo rendimiento 556 00:26:50,000 --> 00:26:52,000 o en segundo lugar, 557 00:26:52,000 --> 00:26:55,000 cuando me habían salido un montón de bandas 558 00:26:55,000 --> 00:26:58,000 y por tanto ha amplificado muchos fragmentos, 559 00:26:58,000 --> 00:27:00,000 los cebadores se han pegado por ahí, 560 00:27:00,000 --> 00:27:01,000 en el DNA molde, 561 00:27:01,000 --> 00:27:03,000 no solamente a su sitio específico, 562 00:27:03,000 --> 00:27:04,000 sino también a otros. 563 00:27:04,000 --> 00:27:06,000 ¿Qué aditivos se suelen utilizar? 564 00:27:06,000 --> 00:27:08,000 Tenéis una tablita en el libro, 565 00:27:08,000 --> 00:27:09,000 se suele utilizar DMSO, 566 00:27:09,000 --> 00:27:10,000 lo vamos a ver ahora después, 567 00:27:10,000 --> 00:27:12,000 y la formamida. 568 00:27:12,000 --> 00:27:13,000 La formamida la conocemos, 569 00:27:13,000 --> 00:27:16,000 si os acordáis del tema 4 de hibridación. 570 00:27:16,000 --> 00:27:17,000 La formamida, 571 00:27:17,000 --> 00:27:21,000 los dos, tanto el DMSO como la formamida, 572 00:27:21,000 --> 00:27:24,000 lo que me ayudan es a la desnaturalización, 573 00:27:24,000 --> 00:27:26,000 a que el DNA molde se abra mejor 574 00:27:26,000 --> 00:27:29,000 y por tanto se desnaturalice mejor 575 00:27:29,000 --> 00:27:32,000 y la polimerasa pueda entrar mejor. 576 00:27:32,000 --> 00:27:34,000 ¿De acuerdo? 577 00:27:34,000 --> 00:27:35,000 Muy bien. 578 00:27:37,000 --> 00:27:40,000 Falta un componente que no está en el libro, 579 00:27:40,000 --> 00:27:42,000 lo voy a decir después. 580 00:27:42,000 --> 00:27:43,000 Bueno, lo iba a decir después, 581 00:27:43,000 --> 00:27:44,000 lo voy a decir ahora. 582 00:27:44,000 --> 00:27:46,000 Por tanto, en la mezcla de reacción, 583 00:27:46,000 --> 00:27:47,000 si os dais cuenta, 584 00:27:47,000 --> 00:27:48,000 tenemos, 585 00:27:48,000 --> 00:27:50,000 tiro para atrás, 586 00:27:50,000 --> 00:27:52,000 el buffer, 587 00:27:52,000 --> 00:27:54,000 que suele venir concentrado, 588 00:27:54,000 --> 00:27:56,000 tenemos cloro de magnesio, 589 00:27:56,000 --> 00:27:57,000 DNTPs, 590 00:27:57,000 --> 00:27:59,000 tenemos los primers, 591 00:27:59,000 --> 00:28:00,000 tenemos la polimerasa, 592 00:28:00,000 --> 00:28:01,000 el DNA molde, 593 00:28:01,000 --> 00:28:03,000 si se requiere algún aditivo 594 00:28:03,000 --> 00:28:05,000 y agua. 595 00:28:05,000 --> 00:28:06,000 ¿De acuerdo? 596 00:28:06,000 --> 00:28:07,000 Agua. 597 00:28:07,000 --> 00:28:09,000 Lo veremos ahora después. 598 00:28:09,000 --> 00:28:10,000 Hay que añadir agua 599 00:28:10,000 --> 00:28:11,000 y no es agua cualquiera, 600 00:28:11,000 --> 00:28:12,000 no es agua del grifo, 601 00:28:12,000 --> 00:28:14,000 sino que es agua miliQ, 602 00:28:14,000 --> 00:28:16,000 agua bi-destilada, 603 00:28:16,000 --> 00:28:18,000 estéril, 604 00:28:18,000 --> 00:28:19,000 por tanto autoclavada 605 00:28:19,000 --> 00:28:22,000 y preparada para técnicas de biología molecular. 606 00:28:22,000 --> 00:28:24,000 No vale cualquier tipo de agua. 607 00:28:24,000 --> 00:28:25,000 ¿Vale? 608 00:28:25,000 --> 00:28:26,000 Muy bien. 609 00:28:26,000 --> 00:28:29,000 En cuanto a la preparación de las muestras, 610 00:28:31,000 --> 00:28:34,000 cuando yo voy a preparar la mezcla de reacción, 611 00:28:34,000 --> 00:28:36,000 tengo que calcular qué volumen 612 00:28:36,000 --> 00:28:39,000 al tampón de reacción, 613 00:28:39,000 --> 00:28:41,000 le tengo que poner qué volumen, 614 00:28:41,000 --> 00:28:42,000 tengo que poner de magnesio, 615 00:28:42,000 --> 00:28:43,000 de DNTPs, 616 00:28:43,000 --> 00:28:45,000 todo esto lo voy a ir calculando, 617 00:28:45,000 --> 00:28:46,000 lo voy calculando, 618 00:28:46,000 --> 00:28:47,000 lo vais a calcular, 619 00:28:47,000 --> 00:28:49,000 voy a hacer infinidad de ejercicios 620 00:28:49,000 --> 00:28:50,000 porque es muy importante 621 00:28:50,000 --> 00:28:53,000 y un problema de estos saldrá en el examen, 622 00:28:53,000 --> 00:28:55,000 sí o sí, seguro. 623 00:28:56,000 --> 00:29:00,000 Y dependiendo del volumen final, 624 00:29:01,000 --> 00:29:02,000 el volumen final, 625 00:29:02,000 --> 00:29:04,000 normalmente la especie reconvencional 626 00:29:04,000 --> 00:29:08,000 se suele hacer o en 25 o en 50, 627 00:29:08,000 --> 00:29:11,000 pues imaginaos que yo he ido calculando 628 00:29:11,000 --> 00:29:14,000 y tengo que poner 1,5 microlitros de esto, 629 00:29:14,000 --> 00:29:17,000 0,5 microlitros de esto de los cebadores, 630 00:29:17,000 --> 00:29:20,000 1 microlitro de cada uno de la polimerasa, 631 00:29:20,000 --> 00:29:24,000 pues 0,5 microlitros del DNA molde, 632 00:29:24,000 --> 00:29:28,000 voy a poner, no lo sé, 20 microlitros. 633 00:29:29,000 --> 00:29:30,000 ¿De acuerdo? 634 00:29:30,000 --> 00:29:33,000 Voy sumando, voy sumando cada uno de estos volúmenes 635 00:29:35,000 --> 00:29:39,000 y tengo que llegar a un volumen final de reacción. 636 00:29:39,000 --> 00:29:40,000 Hemos dicho que el volumen final 637 00:29:40,000 --> 00:29:41,000 de la reacción de PCR 638 00:29:41,000 --> 00:29:44,000 normalmente suele ser o 25 microlitros 639 00:29:44,000 --> 00:29:46,000 o 50 microlitros. 640 00:29:46,000 --> 00:29:51,000 Entonces, hasta el volumen final de 25 o de 50, 641 00:29:51,000 --> 00:29:53,000 lo que voy a añadir, 642 00:29:53,000 --> 00:29:56,000 voy a ajustar al volumen final 643 00:29:56,000 --> 00:29:59,000 y voy a añadirlo de agua preparada, 644 00:29:59,000 --> 00:30:01,000 agua estéril, 645 00:30:01,000 --> 00:30:04,000 se le llama agua estéril de grado PCR 646 00:30:04,000 --> 00:30:07,000 o para técnicas de biología molecular. 647 00:30:07,000 --> 00:30:08,000 ¿De acuerdo? 648 00:30:08,000 --> 00:30:09,000 También se puede comprar comercial 649 00:30:09,000 --> 00:30:11,000 o se coge agua biodestilada, 650 00:30:11,000 --> 00:30:13,000 la autoclavas y la esterilizas. 651 00:30:13,000 --> 00:30:15,000 O sea que es mucho más barato. 652 00:30:15,000 --> 00:30:16,000 ¿De acuerdo? 653 00:30:16,000 --> 00:30:18,000 Por tanto, el componente que nos faltaba 654 00:30:18,000 --> 00:30:20,000 lo vamos a utilizar al final 655 00:30:20,000 --> 00:30:23,000 para ajustar al volumen de reacción. 656 00:30:23,000 --> 00:30:25,000 ¿De acuerdo? 657 00:30:25,000 --> 00:30:29,000 Normalmente, el agua es lo primero que se pone en el tubo. 658 00:30:29,000 --> 00:30:31,000 Esto ya lo veremos y lo haremos en prácticas. 659 00:30:31,000 --> 00:30:33,000 ¿De acuerdo? 660 00:30:33,000 --> 00:30:35,000 En segundo lugar, 661 00:30:35,000 --> 00:30:38,000 en cuanto a la preparación de las muestras, 662 00:30:38,000 --> 00:30:40,000 es que no vamos a preparar, 663 00:30:40,000 --> 00:30:42,000 y esto es muy importante, 664 00:30:42,000 --> 00:30:44,000 una mezcla de reacción, 665 00:30:44,000 --> 00:30:47,000 una mezcla con todos los componentes, 666 00:30:47,000 --> 00:30:50,000 por cada uno de los tubos que tenga que analizar. 667 00:30:50,000 --> 00:30:53,000 Es decir, imaginaos, 668 00:30:53,000 --> 00:30:55,000 imaginaos que me ha llegado al laboratorio 669 00:30:55,000 --> 00:30:58,000 y tengo que analizar 10 muestras de pacientes, 670 00:30:58,000 --> 00:31:00,000 10 muestras de pacientes. 671 00:31:00,000 --> 00:31:03,000 Por tanto, necesito 10 tubos de PCR. 672 00:31:03,000 --> 00:31:05,000 La pregunta es, 673 00:31:05,000 --> 00:31:11,000 ¿hago 10 tubos, 10 mezclas de reacción? 674 00:31:11,000 --> 00:31:13,000 ¿O no? 675 00:31:13,000 --> 00:31:16,000 La respuesta es no. 676 00:31:16,000 --> 00:31:19,000 Nunca se hacen 10 mezclas de reacción diferentes, 677 00:31:19,000 --> 00:31:22,000 sino que hacemos una supermezcla 678 00:31:22,000 --> 00:31:24,000 con todos los componentes, 679 00:31:24,000 --> 00:31:26,000 tampón, clodo de magnesio, 680 00:31:26,000 --> 00:31:29,000 DNTPs, cebadores, polimerasa, agua, 681 00:31:29,000 --> 00:31:33,000 la ponemos, menos el DNA molde. 682 00:31:33,000 --> 00:31:36,000 ¿De acuerdo? Esto es lo que llamamos 683 00:31:36,000 --> 00:31:39,000 la mezcla máster. 684 00:31:39,000 --> 00:31:41,000 Nadie habla de la mezcla máster, 685 00:31:41,000 --> 00:31:43,000 por favor no me pongáis esto en el examen, 686 00:31:43,000 --> 00:31:46,000 que yo solo de verlo aquí me duele el estómago. 687 00:31:46,000 --> 00:31:48,000 ¿De acuerdo? Todo el mundo habla de la máster mix, 688 00:31:48,000 --> 00:31:50,000 MM, máster mix. 689 00:31:50,000 --> 00:31:52,000 ¿De acuerdo? ¿Qué es una máster mix? 690 00:31:52,000 --> 00:31:56,000 Es una mega mezcla de reacción 691 00:31:56,000 --> 00:31:59,000 que va a contener el volumen 692 00:31:59,000 --> 00:32:01,000 de mezcla de reacción 693 00:32:01,000 --> 00:32:04,000 para los 10 tubos de los pacientes. 694 00:32:04,000 --> 00:32:06,000 ¿De acuerdo? 695 00:32:10,000 --> 00:32:12,000 Por ejemplo, 696 00:32:12,000 --> 00:32:15,000 suponiendo que el volumen final 697 00:32:15,000 --> 00:32:18,000 de cada tubo de PCR son 50 microlitros, 698 00:32:18,000 --> 00:32:20,000 ya hemos dicho que vamos a ajustar 699 00:32:20,000 --> 00:32:22,000 el volumen al volumen de reacción, 700 00:32:22,000 --> 00:32:24,000 pues el volumen de reacción 701 00:32:24,000 --> 00:32:26,000 son 50 microlitros. 702 00:32:26,000 --> 00:32:28,000 Me han pedido que haga esta PCR, 703 00:32:28,000 --> 00:32:31,000 el procedimiento del laboratorio 704 00:32:31,000 --> 00:32:33,000 es hacerlo en un volumen 705 00:32:33,000 --> 00:32:35,000 de 50 microlitros. 706 00:32:35,000 --> 00:32:37,000 También me han dicho que la cantidad 707 00:32:37,000 --> 00:32:39,000 de DNA molde que tengo que poner en el tubo 708 00:32:39,000 --> 00:32:41,000 es de un microlitro. 709 00:32:41,000 --> 00:32:43,000 Yo me imagino que ellos, 710 00:32:43,000 --> 00:32:45,000 sabiendo la concentración inicial 711 00:32:45,000 --> 00:32:47,000 y sabiendo la cantidad 712 00:32:47,000 --> 00:32:49,000 final que tienen que poner, 713 00:32:49,000 --> 00:32:51,000 ellos han calculado 714 00:32:51,000 --> 00:32:53,000 que tendrían que poner de DNA molde 715 00:32:53,000 --> 00:32:55,000 un microlitro. 716 00:32:55,000 --> 00:32:57,000 Pues supongamos que 717 00:32:57,000 --> 00:32:59,000 el volumen final del tubo son 50. 718 00:32:59,000 --> 00:33:01,000 La cantidad de DNA 719 00:33:01,000 --> 00:33:03,000 que tengo que añadir 720 00:33:03,000 --> 00:33:05,000 es un microlitro. 721 00:33:05,000 --> 00:33:07,000 ¿De acuerdo? 722 00:33:07,000 --> 00:33:09,000 Y me han llegado al laboratorio 723 00:33:09,000 --> 00:33:11,000 para analizar 8 muestras de pacientes. 724 00:33:11,000 --> 00:33:13,000 ¿De acuerdo? 725 00:33:13,000 --> 00:33:15,000 Por tanto, voy a hacer 726 00:33:15,000 --> 00:33:17,000 una master mix, 727 00:33:17,000 --> 00:33:19,000 la master mix que tengo que hacer. 728 00:33:19,000 --> 00:33:21,000 Como son 8 muestras de pacientes, 729 00:33:21,000 --> 00:33:23,000 voy a preparar 730 00:33:23,000 --> 00:33:25,000 la master mix para 11 tubos de PCR. 731 00:33:27,000 --> 00:33:29,000 ¿De dónde vienen estos 11 tubos de PCR? 732 00:33:29,000 --> 00:33:31,000 Y esto es muy importante. 733 00:33:31,000 --> 00:33:33,000 Pues 8 tubitos de PCR 734 00:33:33,000 --> 00:33:35,000 van a ser para las 735 00:33:35,000 --> 00:33:37,000 8 muestras de los 736 00:33:37,000 --> 00:33:39,000 8 DNAs de los pacientes 737 00:33:39,000 --> 00:33:41,000 más 738 00:33:41,000 --> 00:33:43,000 2 tubos de PCR 739 00:33:43,000 --> 00:33:45,000 para el control positivo y negativo. 740 00:33:45,000 --> 00:33:47,000 Ahora hablamos de ellos. 741 00:33:47,000 --> 00:33:49,000 No puede haber 742 00:33:49,000 --> 00:33:51,000 una reacción de PCR que no tenga 743 00:33:51,000 --> 00:33:53,000 controles positivo y negativo. 744 00:33:53,000 --> 00:33:55,000 Por tanto, 745 00:33:55,000 --> 00:33:57,000 ya serían 10 746 00:33:57,000 --> 00:33:59,000 y siempre añado un tubo más. 747 00:33:59,000 --> 00:34:01,000 ¿De acuerdo? Siempre añado un tubo más. 748 00:34:01,000 --> 00:34:03,000 Este tubo más no va a ir 749 00:34:03,000 --> 00:34:05,000 al termociclador. 750 00:34:05,000 --> 00:34:07,000 ¿De acuerdo? 751 00:34:07,000 --> 00:34:09,000 Sino que es un tubo 752 00:34:09,000 --> 00:34:11,000 que yo añado para asegurarme 753 00:34:11,000 --> 00:34:13,000 que en estos 10 754 00:34:13,000 --> 00:34:15,000 tubos de aquí voy a poner 755 00:34:15,000 --> 00:34:17,000 el volumen de 756 00:34:17,000 --> 00:34:19,000 master mix correspondiente. 757 00:34:19,000 --> 00:34:21,000 Es decir, 758 00:34:21,000 --> 00:34:23,000 a ver si nos aclaramos. 759 00:34:23,000 --> 00:34:25,000 Tiro un poquito para atrás. 760 00:34:25,000 --> 00:34:27,000 Si yo tuviese que preparar 761 00:34:27,000 --> 00:34:29,000 solamente un tubo 762 00:34:29,000 --> 00:34:31,000 de PCR, pues lo haría 763 00:34:31,000 --> 00:34:33,000 así. Hago los cálculos para 764 00:34:33,000 --> 00:34:35,000 ese tubo, cuánto de cloruro de magnesio 765 00:34:35,000 --> 00:34:37,000 tengo que añadir, de NTP, 766 00:34:37,000 --> 00:34:39,000 de todos los componentes 767 00:34:39,000 --> 00:34:41,000 y voy añadiendo 768 00:34:41,000 --> 00:34:43,000 cada componente. ¿Qué es lo 769 00:34:43,000 --> 00:34:45,000 que ocurre? Que como estáis viendo 770 00:34:45,000 --> 00:34:47,000 ya veis las cantidades 771 00:34:47,000 --> 00:34:49,000 estamos hablando, estamos en torno a nanos 772 00:34:49,000 --> 00:34:51,000 y micros, 773 00:34:51,000 --> 00:34:53,000 gramos, nanomolar, 774 00:34:53,000 --> 00:34:55,000 micromolar. 775 00:34:55,000 --> 00:34:57,000 Normalmente los volúmenes que tenemos que 776 00:34:57,000 --> 00:34:59,000 pipetear de magnesio, de NTP, 777 00:34:59,000 --> 00:35:01,000 de cebadores, son tremendamente pequeños. 778 00:35:01,000 --> 00:35:03,000 Estamos hablando de 2 microlitros. 779 00:35:03,000 --> 00:35:05,000 Del buffer, 780 00:35:05,000 --> 00:35:07,000 del buffer, 781 00:35:07,000 --> 00:35:09,000 el buffer a lo mejor 782 00:35:09,000 --> 00:35:11,000 es de lo que más solemos 783 00:35:11,000 --> 00:35:13,000 pipetear y a lo mejor son 784 00:35:13,000 --> 00:35:15,000 5 microlitros, pero es que 785 00:35:15,000 --> 00:35:17,000 de la polimerasa se suelen pipetear 786 00:35:17,000 --> 00:35:19,000 0,2 microlitros, 787 00:35:19,000 --> 00:35:21,000 0,5 microlitros. 788 00:35:21,000 --> 00:35:23,000 En resumidas cuentas, 789 00:35:23,000 --> 00:35:25,000 los volúmenes que tengo que pipetear 790 00:35:25,000 --> 00:35:27,000 tubo a tubo, para cada tubo, 791 00:35:27,000 --> 00:35:29,000 son volúmenes muy pequeños. 792 00:35:29,000 --> 00:35:31,000 ¿Qué inconveniente tiene? 793 00:35:31,000 --> 00:35:33,000 El inconveniente fundamental es que 794 00:35:33,000 --> 00:35:35,000 puedo cometer 795 00:35:35,000 --> 00:35:37,000 muchos errores de pipeteo 796 00:35:37,000 --> 00:35:39,000 y estamos hablando de cantidades 797 00:35:39,000 --> 00:35:41,000 muy pequeñas, volúmenes muy pequeños. 798 00:35:41,000 --> 00:35:43,000 Si yo, en una reacción 799 00:35:43,000 --> 00:35:45,000 de 50 microlitros, 800 00:35:45,000 --> 00:35:47,000 donde tengo que añadir un microlitro, 801 00:35:47,000 --> 00:35:49,000 imaginemos, de la DNA polimerasa 802 00:35:49,000 --> 00:35:51,000 o tengo que añadir 803 00:35:51,000 --> 00:35:53,000 0,5 microlitros de la DNA polimerasa, 804 00:35:53,000 --> 00:35:55,000 por error de pipeteo 805 00:35:55,000 --> 00:35:57,000 pongo 0,4 806 00:35:57,000 --> 00:35:59,000 o 0,3, porque 807 00:35:59,000 --> 00:36:01,000 he pipeteado mal, eso puede 808 00:36:01,000 --> 00:36:03,000 hacer que la PCR no funcione 809 00:36:03,000 --> 00:36:05,000 y no sea eficiente. 810 00:36:05,000 --> 00:36:07,000 O si en lugar de los cebadores, si tengo que 811 00:36:07,000 --> 00:36:09,000 poner 3 microlitros, pongo 812 00:36:09,000 --> 00:36:11,000 2,4 813 00:36:11,000 --> 00:36:13,000 por error de pipeteo, 814 00:36:13,000 --> 00:36:15,000 eso va a hacer que la PCR 815 00:36:15,000 --> 00:36:17,000 no funcione bien, ¿de acuerdo? 816 00:36:17,000 --> 00:36:19,000 De tal manera que, 817 00:36:19,000 --> 00:36:21,000 ¿por qué tenemos que hacer una 818 00:36:21,000 --> 00:36:23,000 Master Mix? 819 00:36:23,000 --> 00:36:25,000 ¿Por qué hago una Master Mix 820 00:36:25,000 --> 00:36:27,000 para todos los tubos de los pacientes? 821 00:36:27,000 --> 00:36:29,000 Para todas las muestras 822 00:36:29,000 --> 00:36:31,000 y no hago 823 00:36:31,000 --> 00:36:33,000 8 tubos diferentes, pipeteados 824 00:36:33,000 --> 00:36:35,000 uno a uno todos los componentes? 825 00:36:35,000 --> 00:36:37,000 Uno, porque es tremendamente 826 00:36:37,000 --> 00:36:39,000 lento y un rollo. 827 00:36:39,000 --> 00:36:41,000 Y esto es así. Y en segundo 828 00:36:41,000 --> 00:36:43,000 lugar, ¿por qué? Si yo hago 829 00:36:43,000 --> 00:36:45,000 una mezcla Master, 830 00:36:45,000 --> 00:36:47,000 una Master Mix para 10, 831 00:36:47,000 --> 00:36:49,000 12, 11 tubos, a veces 832 00:36:49,000 --> 00:36:51,000 se hacen Master Mix para 50 tubos, 833 00:36:51,000 --> 00:36:53,000 os podéis imaginar que los volúmenes 834 00:36:53,000 --> 00:36:55,000 serán 50 veces 835 00:36:55,000 --> 00:36:57,000 mayores. Es decir, 836 00:36:57,000 --> 00:36:59,000 ya no tendré que pipetear 837 00:36:59,000 --> 00:37:01,000 0,5 microlitros de 838 00:37:01,000 --> 00:37:03,000 DNA polimerasa, 839 00:37:03,000 --> 00:37:05,000 con lo que conlleva el error que cometo, 840 00:37:05,000 --> 00:37:07,000 sino que tendría que multiplicar 841 00:37:07,000 --> 00:37:09,000 0,5 microlitros 842 00:37:09,000 --> 00:37:11,000 por 50, 843 00:37:11,000 --> 00:37:13,000 si son 50 tubos. 844 00:37:13,000 --> 00:37:15,000 ¿De acuerdo? Y por tanto, 845 00:37:15,000 --> 00:37:17,000 tendría que poner 25 microlitros. 846 00:37:17,000 --> 00:37:19,000 Pipetear 25 microlitros, 847 00:37:19,000 --> 00:37:21,000 el error que 848 00:37:21,000 --> 00:37:23,000 puedo cometer es asumible, 849 00:37:23,000 --> 00:37:25,000 porque de 25 microlitros, 850 00:37:25,000 --> 00:37:27,000 si yo pipeteo 24,5 851 00:37:27,000 --> 00:37:29,000 microlitros, la diferencia 852 00:37:29,000 --> 00:37:31,000 es mínima. ¿De acuerdo? 853 00:37:31,000 --> 00:37:33,000 Por tanto, en este 854 00:37:33,000 --> 00:37:35,000 ejemplo, si yo tuviese 855 00:37:35,000 --> 00:37:37,000 que hacer las PCRs en 856 00:37:37,000 --> 00:37:39,000 50 microlitros y un microlitro 857 00:37:39,000 --> 00:37:41,000 es el DNA molde, 858 00:37:41,000 --> 00:37:43,000 ¿sí? 859 00:37:43,000 --> 00:37:45,000 Tengo que 860 00:37:45,000 --> 00:37:47,000 calcular, hacer los cálculos 861 00:37:47,000 --> 00:37:49,000 para 49 microlitros 862 00:37:49,000 --> 00:37:51,000 de MasterMix que tendré que poner 863 00:37:51,000 --> 00:37:53,000 en cada tubo. 864 00:37:53,000 --> 00:37:55,000 Entonces, en cada tubo de PCR 865 00:37:55,000 --> 00:37:57,000 de los DNA de los pacientes van a ir 866 00:37:57,000 --> 00:37:59,000 49 microlitros de MasterMix 867 00:37:59,000 --> 00:38:01,000 y luego, al final, 868 00:38:01,000 --> 00:38:03,000 añadiré un microlitro del DNA. 869 00:38:03,000 --> 00:38:05,000 ¿De acuerdo? Del DNA del paciente 870 00:38:05,000 --> 00:38:07,000 1 en el tubo 1. 871 00:38:07,000 --> 00:38:09,000 DNA del paciente 2 en el tubo 2 872 00:38:09,000 --> 00:38:11,000 y así sucesivamente. 873 00:38:11,000 --> 00:38:13,000 Entonces, acordaos, 874 00:38:13,000 --> 00:38:15,000 en este caso, 875 00:38:15,000 --> 00:38:17,000 8 tubos tengo que preparar 876 00:38:17,000 --> 00:38:19,000 para la muestra de los pacientes, 877 00:38:19,000 --> 00:38:21,000 2 para control positivo y negativo 878 00:38:21,000 --> 00:38:23,000 y siempre añado 1 879 00:38:23,000 --> 00:38:25,000 por si acaso me equivoco. 880 00:38:25,000 --> 00:38:27,000 Si no pipeteo bien, 881 00:38:27,000 --> 00:38:29,000 si hay errores de pipeteo, 882 00:38:29,000 --> 00:38:31,000 lo que a veces ocurre es que si yo hago 883 00:38:31,000 --> 00:38:33,000 una MasterMix justita 884 00:38:33,000 --> 00:38:35,000 para los 10 tubos 885 00:38:35,000 --> 00:38:37,000 que necesito, 886 00:38:37,000 --> 00:38:39,000 pues pongo luego 49 microlitros 887 00:38:39,000 --> 00:38:41,000 en el primer tubo, 888 00:38:41,000 --> 00:38:43,000 49 en el segundo, en el tercero 889 00:38:43,000 --> 00:38:45,000 y cuando llego al último, a veces, 890 00:38:45,000 --> 00:38:47,000 por errores de pipeteo, 891 00:38:47,000 --> 00:38:49,000 no tengo 49 microlitros sino que tengo 892 00:38:49,000 --> 00:38:51,000 44. 893 00:38:51,000 --> 00:38:53,000 Me faltan 5 microlitros. 894 00:38:53,000 --> 00:38:55,000 Ese tubo, la PCR de ese tubo, 895 00:38:55,000 --> 00:38:57,000 ya es diferente, 896 00:38:57,000 --> 00:38:59,000 porque la cantidad de MasterMix es diferente 897 00:38:59,000 --> 00:39:01,000 y estoy introduciendo un error. 898 00:39:01,000 --> 00:39:03,000 Para evitar esto, 899 00:39:03,000 --> 00:39:05,000 ya está la regla de que más vale que sobre 900 00:39:05,000 --> 00:39:07,000 que no que falte. 901 00:39:07,000 --> 00:39:09,000 Entonces, una vez calculados 902 00:39:09,000 --> 00:39:11,000 cuántos tubos tengo de PCR, 903 00:39:11,000 --> 00:39:13,000 cuántos tubos que son, 904 00:39:13,000 --> 00:39:15,000 nuevamente, el número de DNAs 905 00:39:15,000 --> 00:39:17,000 que tienes que analizar más 906 00:39:17,000 --> 00:39:19,000 control positivo y negativo, 907 00:39:19,000 --> 00:39:21,000 se le suele añadir un tubo más. 908 00:39:21,000 --> 00:39:23,000 ¿De acuerdo? Para que sobre más 909 00:39:23,000 --> 00:39:25,000 MasterMix y no que nos falte. 910 00:39:25,000 --> 00:39:27,000 Este ejemplo 911 00:39:27,000 --> 00:39:29,000 con 11 tubos lo tenéis en el libro. 912 00:39:29,000 --> 00:39:31,000 Está aquí. 913 00:39:31,000 --> 00:39:33,000 Se ha puesto la tablita del tubo 914 00:39:33,000 --> 00:39:35,000 en el cual ellos han calculado 915 00:39:35,000 --> 00:39:37,000 para este ejemplo 916 00:39:37,000 --> 00:39:39,000 han calculado 917 00:39:39,000 --> 00:39:41,000 para 11 tubos. 918 00:39:41,000 --> 00:39:43,000 ¿De acuerdo? Son 8 pacientes, 919 00:39:43,000 --> 00:39:45,000 control positivo y negativo y el tubo de más. 920 00:39:45,000 --> 00:39:47,000 Y han ido calculando 921 00:39:47,000 --> 00:39:49,000 qué volumen tendrían que poner por cada tubo. 922 00:39:49,000 --> 00:39:51,000 Pues del tampón, 923 00:39:51,000 --> 00:39:53,000 como el volumen es 924 00:39:53,000 --> 00:39:55,000 50 microlitros 925 00:39:55,000 --> 00:39:57,000 y está 10 veces concentrado, 926 00:39:57,000 --> 00:39:59,000 el volumen final, 927 00:39:59,000 --> 00:40:01,000 para saber cuánto hay que poner 928 00:40:01,000 --> 00:40:03,000 del tampón, el volumen final, 929 00:40:03,000 --> 00:40:05,000 hay que dividirlo entre 930 00:40:05,000 --> 00:40:07,000 la concentración, que son 10, 931 00:40:07,000 --> 00:40:09,000 10 veces concentrado, por tanto, 932 00:40:09,000 --> 00:40:11,000 serían 5 microlitros. 933 00:40:11,000 --> 00:40:13,000 50 entre 10, 5 microlitros. 934 00:40:13,000 --> 00:40:15,000 Esto sería el volumen 935 00:40:15,000 --> 00:40:17,000 para un tubo, pero como tengo que hacer 936 00:40:17,000 --> 00:40:19,000 100, multiplico. 937 00:40:19,000 --> 00:40:21,000 Y en mi MasterMix pondré 55 microlitros. 938 00:40:21,000 --> 00:40:23,000 ¿Cuál es la concentración final? 939 00:40:23,000 --> 00:40:25,000 Estaba 10 por, 940 00:40:25,000 --> 00:40:27,000 y ahora ya no está concentrado. 941 00:40:27,000 --> 00:40:29,000 1 por es, que ya no está concentrado. 942 00:40:29,000 --> 00:40:31,000 Está a la concentración 943 00:40:31,000 --> 00:40:33,000 idónea. 944 00:40:33,000 --> 00:40:35,000 ¿Cloro de magnesio? Vaya, pues aquí el cloro de magnesio 945 00:40:35,000 --> 00:40:37,000 me dicen que está a 50 milimolar. 946 00:40:37,000 --> 00:40:39,000 Suavecenamente. 947 00:40:39,000 --> 00:40:41,000 Entonces, ellos han calculado, para este volumen 948 00:40:41,000 --> 00:40:43,000 final, todos estos ejercicios de MasterMix 949 00:40:43,000 --> 00:40:45,000 los vamos a hacer, ¿de acuerdo? 950 00:40:45,000 --> 00:40:47,000 De tal manera que el volumen de cada 951 00:40:47,000 --> 00:40:49,000 reactivo que me sale, 952 00:40:49,000 --> 00:40:51,000 ¿de acuerdo? Yo lo tengo que multiplicar 953 00:40:51,000 --> 00:40:53,000 por el número de tubos. 954 00:40:53,000 --> 00:40:55,000 Y ese es el volumen que yo pondré en mi MasterMix. 955 00:40:55,000 --> 00:40:57,000 Por tanto, 956 00:40:57,000 --> 00:40:59,000 de cebador forward en la MasterMix 957 00:40:59,000 --> 00:41:01,000 tendré que poner 11 microlitros 958 00:41:01,000 --> 00:41:03,000 y no un microlitro. 959 00:41:03,000 --> 00:41:05,000 ¿Me entiende? 960 00:41:05,000 --> 00:41:07,000 Por tanto, ¿cuáles son los componentes 961 00:41:07,000 --> 00:41:09,000 de la MasterMix? 962 00:41:09,000 --> 00:41:11,000 Todos los componentes de la PCR, 963 00:41:11,000 --> 00:41:13,000 todos los reactivos, menos 964 00:41:13,000 --> 00:41:15,000 el DNA. 965 00:41:15,000 --> 00:41:17,000 Entonces, yo voy a hacer mi 966 00:41:17,000 --> 00:41:19,000 MasterMix con el tampón, también con el 967 00:41:19,000 --> 00:41:21,000 agua. Ya os he dicho, 968 00:41:21,000 --> 00:41:23,000 y lo veremos en prácticas, que el agua, 969 00:41:23,000 --> 00:41:25,000 aunque lo calculamos al final, 970 00:41:25,000 --> 00:41:27,000 es el primer reactivo que ponemos 971 00:41:27,000 --> 00:41:29,000 porque es el que tiene mayor volumen. 972 00:41:29,000 --> 00:41:31,000 Es el que ponemos siempre en mayor volumen. 973 00:41:31,000 --> 00:41:33,000 Pondría el agua, luego ponemos 974 00:41:33,000 --> 00:41:35,000 el tampón, luego se suelen poner 975 00:41:35,000 --> 00:41:37,000 en orden el magnesio, 976 00:41:37,000 --> 00:41:39,000 los DNTPs, los cebadores 977 00:41:39,000 --> 00:41:41,000 y lo último ponemos la TAC 978 00:41:41,000 --> 00:41:43,000 polimeras. Una vez ya tengo 979 00:41:43,000 --> 00:41:45,000 la MasterMix, lo mezclo muy bien 980 00:41:45,000 --> 00:41:47,000 y lo que hago es, fijaos que 981 00:41:47,000 --> 00:41:49,000 el volumen final son 539 982 00:41:49,000 --> 00:41:51,000 microlitros, preparo mis 983 00:41:51,000 --> 00:41:53,000 10 tubos 984 00:41:53,000 --> 00:41:55,000 y los rotulo. Tubo 1, 985 00:41:55,000 --> 00:41:57,000 paciente 1, paciente 2, paciente 3, 986 00:41:57,000 --> 00:41:59,000 control positivo, control negativo 987 00:41:59,000 --> 00:42:01,000 y a cada uno de los tubos, 988 00:42:01,000 --> 00:42:03,000 de los 10 tubos, voy a 989 00:42:03,000 --> 00:42:05,000 añadir ¿qué volumen? 990 00:42:05,000 --> 00:42:07,000 49 microlitros. 991 00:42:07,000 --> 00:42:09,000 ¿De acuerdo? 992 00:42:11,000 --> 00:42:13,000 De tal manera que si os dais cuenta, 993 00:42:13,000 --> 00:42:15,000 en todos los 994 00:42:15,000 --> 00:42:17,000 tubos voy a tener la misma 995 00:42:17,000 --> 00:42:19,000 mezcla de reacción y 996 00:42:19,000 --> 00:42:21,000 por tanto, me puedo fiar 997 00:42:21,000 --> 00:42:23,000 mucho de los resultados, porque los 998 00:42:23,000 --> 00:42:25,000 reactivos que estoy utilizando para la 999 00:42:25,000 --> 00:42:27,000 reacción son idénticos. 1000 00:42:27,000 --> 00:42:29,000 Están mezclados a la vez 1001 00:42:29,000 --> 00:42:31,000 y proceden del mismo tubo. 1002 00:42:31,000 --> 00:42:33,000 Por tanto, en todas las 1003 00:42:33,000 --> 00:42:35,000 PCRs, en todos los tubos de PCRs 1004 00:42:35,000 --> 00:42:37,000 tengo la misma MasterMix. 1005 00:42:37,000 --> 00:42:39,000 La misma mezcla de reacción. 1006 00:42:39,000 --> 00:42:41,000 Idéntica. Una vez 1007 00:42:41,000 --> 00:42:43,000 ya he dispensado 49 microlitros 1008 00:42:43,000 --> 00:42:45,000 en cada uno de los tubos, 1009 00:42:45,000 --> 00:42:47,000 solo faltaría añadir 1010 00:42:47,000 --> 00:42:49,000 un microlitro del DNA correspondiente 1011 00:42:49,000 --> 00:42:51,000 a cada tubo. Mezclo bien 1012 00:42:51,000 --> 00:42:53,000 y 1013 00:42:53,000 --> 00:42:55,000 lo pongo en el termociclador. 1014 00:42:55,000 --> 00:42:57,000 ¿De acuerdo? 1015 00:42:57,000 --> 00:42:59,000 ¿Qué es esto 1016 00:42:59,000 --> 00:43:01,000 de los controles positivos y negativos? 1017 00:43:01,000 --> 00:43:03,000 Tremendamente importante. 1018 00:43:03,000 --> 00:43:05,000 Yo al final, cuando veamos 1019 00:43:05,000 --> 00:43:07,000 cómo analizamos los resultados, 1020 00:43:07,000 --> 00:43:09,000 lo hacemos en geldagarosa y vemos 1021 00:43:09,000 --> 00:43:11,000 si ha amplificado o no ha amplificado 1022 00:43:11,000 --> 00:43:13,000 con una banda. Yo veo una banda. 1023 00:43:13,000 --> 00:43:15,000 Ah, pero ¿cómo me fío yo? 1024 00:43:15,000 --> 00:43:17,000 ¿Cómo sé yo que esa banda 1025 00:43:17,000 --> 00:43:19,000 amplificada corresponde al fragmento 1026 00:43:19,000 --> 00:43:21,000 al fragmento 1027 00:43:21,000 --> 00:43:23,000 que quiero amplificar 1028 00:43:23,000 --> 00:43:25,000 y no es una banda 1029 00:43:25,000 --> 00:43:27,000 inespecífica por ahí? 1030 00:43:27,000 --> 00:43:29,000 ¿De acuerdo? Porque voy a usar 1031 00:43:29,000 --> 00:43:31,000 controles positivos y controles negativos. 1032 00:43:31,000 --> 00:43:33,000 ¿De acuerdo? 1033 00:43:33,000 --> 00:43:35,000 Entonces, muy importante. Primero, 1034 00:43:35,000 --> 00:43:37,000 siempre tiene que haber un control positivo 1035 00:43:37,000 --> 00:43:39,000 y un control negativo. Ahora veremos 1036 00:43:39,000 --> 00:43:41,000 en qué consisten. 1037 00:43:41,000 --> 00:43:43,000 Segundo, importante. 1038 00:43:43,000 --> 00:43:45,000 El control positivo y el control negativo 1039 00:43:45,000 --> 00:43:47,000 deben llevar la misma Master Mix. 1040 00:43:47,000 --> 00:43:49,000 Por eso lo añado aquí. 1041 00:43:49,000 --> 00:43:51,000 Si os dais cuenta, 1042 00:43:51,000 --> 00:43:53,000 8 pacientes, 2 tubos más. 1043 00:43:53,000 --> 00:43:55,000 Si fueran 29 pacientes, 1044 00:43:55,000 --> 00:43:57,000 pues pondría 29 pacientes más 1045 00:43:57,000 --> 00:43:59,000 2 más 1. 1046 00:43:59,000 --> 00:44:01,000 ¿De acuerdo? 1047 00:44:01,000 --> 00:44:03,000 Más el tubo para el error 1048 00:44:03,000 --> 00:44:05,000 de pipeteo. 1049 00:44:05,000 --> 00:44:07,000 ¿De acuerdo? Entonces haría el cálculo. 1050 00:44:07,000 --> 00:44:09,000 Siempre los tengo que añadir. 1051 00:44:09,000 --> 00:44:11,000 Y esto es muy importante. 1052 00:44:11,000 --> 00:44:13,000 Deben llevar la misma Master Mix 1053 00:44:13,000 --> 00:44:15,000 y lo debo de poner a la vez 1054 00:44:15,000 --> 00:44:17,000 en el termociclador con el mismo programa. 1055 00:44:17,000 --> 00:44:19,000 De tal manera que es 1056 00:44:19,000 --> 00:44:21,000 como si fueran 2 pacientes más. 1057 00:44:21,000 --> 00:44:23,000 ¿Vale? Como si en lugar 1058 00:44:23,000 --> 00:44:25,000 de 8 pacientes tuviera 10 pacientes. 1059 00:44:25,000 --> 00:44:27,000 ¿En qué consiste el control positivo? 1060 00:44:27,000 --> 00:44:29,000 El control positivo es 1061 00:44:29,000 --> 00:44:31,000 la mezcla de reacción y un microlitro 1062 00:44:31,000 --> 00:44:33,000 de DNA de un DNA 1063 00:44:33,000 --> 00:44:35,000 que yo sé que es positivo. 1064 00:44:35,000 --> 00:44:37,000 Donde tengo que 1065 00:44:37,000 --> 00:44:39,000 observar sí o sí la banda 1066 00:44:39,000 --> 00:44:41,000 de amplificación. 1067 00:44:41,000 --> 00:44:43,000 ¿De acuerdo? 1068 00:44:43,000 --> 00:44:45,000 Esto ahora cuando veamos el análisis de los resultados 1069 00:44:45,000 --> 00:44:47,000 lo entenderemos mejor. 1070 00:44:47,000 --> 00:44:49,000 Pero entonces es un DNA que yo ya lo he testado. 1071 00:44:49,000 --> 00:44:51,000 Yo ya lo he probado. 1072 00:44:51,000 --> 00:44:53,000 Y yo ya sé que ahí tiene que amplificar 1073 00:44:53,000 --> 00:44:55,000 la polimerasa y por tanto la reacción 1074 00:44:55,000 --> 00:44:57,000 tiene que ser positiva y tengo que observar 1075 00:44:57,000 --> 00:44:59,000 ¿Qué es el control negativo? 1076 00:44:59,000 --> 00:45:01,000 El control negativo lleva de todo 1077 00:45:01,000 --> 00:45:03,000 todo igual, todo igual, todo igual 1078 00:45:03,000 --> 00:45:05,000 la misma Master Mix. 1079 00:45:05,000 --> 00:45:07,000 Acordaos que eso es muy importante. 1080 00:45:07,000 --> 00:45:09,000 Es una Master Mix pero en lugar de llevar 1081 00:45:09,000 --> 00:45:11,000 DNA, en lugar de poner un microlitro 1082 00:45:11,000 --> 00:45:13,000 de DNA, pongo un microlitro 1083 00:45:13,000 --> 00:45:15,000 de agua. 1084 00:45:15,000 --> 00:45:17,000 Por tanto, en este tubo 1085 00:45:17,000 --> 00:45:19,000 lleva todos los reactivos para 1086 00:45:19,000 --> 00:45:21,000 hacer la PCR pero no tiene DNA 1087 00:45:21,000 --> 00:45:23,000 molde. Si no tiene DNA molde 1088 00:45:23,000 --> 00:45:25,000 ¿Puede amplificar 1089 00:45:25,000 --> 00:45:27,000 algo? No. 1090 00:45:27,000 --> 00:45:29,000 No puede amplificar nada porque la 1091 00:45:29,000 --> 00:45:31,000 polimerasa no puede leer porque no hay DNA 1092 00:45:31,000 --> 00:45:33,000 molde. 1093 00:45:33,000 --> 00:45:35,000 La pregunta ahora es ¿qué es lo que ocurre 1094 00:45:35,000 --> 00:45:37,000 si yo en el control negativo 1095 00:45:37,000 --> 00:45:39,000 que no tendría que ver una banda 1096 00:45:39,000 --> 00:45:41,000 no tendría que amplificar 1097 00:45:41,000 --> 00:45:43,000 observo una banda? 1098 00:45:43,000 --> 00:45:45,000 Si yo observo una banda en el control negativo 1099 00:45:45,000 --> 00:45:47,000 significa que ha habido 1100 00:45:47,000 --> 00:45:49,000 contaminación de un DNA 1101 00:45:49,000 --> 00:45:51,000 extraño, exógeno 1102 00:45:51,000 --> 00:45:53,000 un DNA contaminante 1103 00:45:53,000 --> 00:45:55,000 y esto es 1104 00:45:55,000 --> 00:45:57,000 esto es 1105 00:45:57,000 --> 00:45:59,000 desgraciadamente es frecuente 1106 00:45:59,000 --> 00:46:01,000 ¿Vale? Que se nos contamine. ¿Y qué se ha contaminado? 1107 00:46:01,000 --> 00:46:03,000 Pues a lo mejor alguno de los reactivos 1108 00:46:03,000 --> 00:46:05,000 desde el agua a los cebadores 1109 00:46:05,000 --> 00:46:07,000 a los DNTPs 1110 00:46:07,000 --> 00:46:09,000 por tanto sin el control 1111 00:46:09,000 --> 00:46:11,000 negativo observo una banda 1112 00:46:11,000 --> 00:46:13,000 significa que 1113 00:46:13,000 --> 00:46:15,000 ha habido contaminación 1114 00:46:15,000 --> 00:46:17,000 ¿De acuerdo? De un DNA extraño 1115 00:46:17,000 --> 00:46:19,000 algún reactivo está contaminado y por 1116 00:46:19,000 --> 00:46:21,000 tanto los resultados 1117 00:46:21,000 --> 00:46:23,000 de esa PCR de esos 1118 00:46:23,000 --> 00:46:25,000 ocho pacientes no me los puedo creer 1119 00:46:25,000 --> 00:46:27,000 tengo que repetirlo 1120 00:46:27,000 --> 00:46:29,000 todo y normalmente hay que repetirlo 1121 00:46:29,000 --> 00:46:31,000 con reactivos nuevos 1122 00:46:31,000 --> 00:46:33,000 ojo 1123 00:46:33,000 --> 00:46:35,000 a las contaminaciones 1124 00:46:35,000 --> 00:46:37,000 ojo a los controles negativos 1125 00:46:37,000 --> 00:46:39,000 fijaos es importante 1126 00:46:39,000 --> 00:46:41,000 si yo no pongo el control negativo y hay algún 1127 00:46:43,000 --> 00:46:45,000 alguna contaminación en alguno de los reactivos 1128 00:46:45,000 --> 00:46:47,000 si yo no pongo el control 1129 00:46:47,000 --> 00:46:49,000 negativo no sé si 1130 00:46:49,000 --> 00:46:51,000 esa banda que amplifica 1131 00:46:51,000 --> 00:46:53,000 en las muestras de los pacientes 1132 00:46:53,000 --> 00:46:55,000 corresponde al DNA del paciente 1133 00:46:55,000 --> 00:46:57,000 y por tanto el paciente es positivo o 1134 00:46:57,000 --> 00:46:59,000 que ha habido una contaminación 1135 00:46:59,000 --> 00:47:01,000 por tanto el control positivo 1136 00:47:01,000 --> 00:47:03,000 es muy importante 1137 00:47:03,000 --> 00:47:05,000 el control negativo también es muy importante 1138 00:47:05,000 --> 00:47:07,000 si el control negativo observo banda 1139 00:47:07,000 --> 00:47:09,000 no me lo puedo creer, tengo que repetirlo 1140 00:47:09,000 --> 00:47:11,000 y lo tengo que repetir con reactivos 1141 00:47:11,000 --> 00:47:13,000 nuevos 1142 00:47:13,000 --> 00:47:15,000 ¿De acuerdo? Esto es muy importante 1143 00:47:15,000 --> 00:47:17,000 ¿De acuerdo? 1144 00:47:17,000 --> 00:47:19,000 Muy bien 1145 00:47:19,000 --> 00:47:21,000 ya tengo preparada la MasterMix 1146 00:47:21,000 --> 00:47:23,000 he preparado mi MasterMix 1147 00:47:23,000 --> 00:47:25,000 para mis 10 reacciones de PCR 1148 00:47:25,000 --> 00:47:27,000 para 11 tubos 1149 00:47:27,000 --> 00:47:29,000 he dispensado 1150 00:47:29,000 --> 00:47:31,000 la MasterMix 49 microlitros 1151 00:47:31,000 --> 00:47:33,000 en cada uno de los tubos y le he añadido 1152 00:47:33,000 --> 00:47:35,000 un microlitro de DNA molde 1153 00:47:35,000 --> 00:47:37,000 perfecto, tapo los tubitos 1154 00:47:37,000 --> 00:47:39,000 les pongo las tapas 1155 00:47:39,000 --> 00:47:41,000 y me voy al termociclador 1156 00:47:41,000 --> 00:47:43,000 muy bien 1157 00:47:45,000 --> 00:47:47,000 el termociclador hay que programarlo 1158 00:47:47,000 --> 00:47:49,000 ¿Qué es el termociclador? 1159 00:47:49,000 --> 00:47:51,000 pues no ni más ni menos que un aparato 1160 00:47:51,000 --> 00:47:53,000 que tiene un termobloque 1161 00:47:53,000 --> 00:47:55,000 que es capaz 1162 00:47:55,000 --> 00:47:57,000 de cambiar de temperaturas 1163 00:47:57,000 --> 00:47:59,000 de forma rapidísima 1164 00:47:59,000 --> 00:48:01,000 de tal manera que pasa 1165 00:48:01,000 --> 00:48:03,000 de 95 a 57 grados 1166 00:48:03,000 --> 00:48:05,000 en cuestión de 3 segundos 1167 00:48:05,000 --> 00:48:07,000 nada 1168 00:48:07,000 --> 00:48:09,000 y a 72 grados lo mismo 1169 00:48:09,000 --> 00:48:11,000 y yo lo voy a programar 1170 00:48:11,000 --> 00:48:13,000 de tal manera que 1171 00:48:13,000 --> 00:48:15,000 la programación del termociclador 1172 00:48:15,000 --> 00:48:17,000 todas las PCRs convencionales 1173 00:48:17,000 --> 00:48:19,000 tienen estas 4 fases 1174 00:48:19,000 --> 00:48:21,000 la primera fase 1175 00:48:21,000 --> 00:48:23,000 es una fase de desnaturalización inicial 1176 00:48:23,000 --> 00:48:25,000 la desnaturalización 1177 00:48:25,000 --> 00:48:27,000 a 94, normalmente a 95 grados 1178 00:48:29,000 --> 00:48:31,000 al principio de todo 1179 00:48:31,000 --> 00:48:33,000 hago un ciclo 1180 00:48:33,000 --> 00:48:35,000 un ciclo significa que lo voy a hacer solamente una vez 1181 00:48:35,000 --> 00:48:37,000 de tal manera que 1182 00:48:37,000 --> 00:48:39,000 esta desnaturalización inicial 1183 00:48:39,000 --> 00:48:41,000 de partida 1184 00:48:41,000 --> 00:48:43,000 cojo la mezcla de reacción con el DNA molde 1185 00:48:43,000 --> 00:48:45,000 y la voy a poner a 95 grados 1186 00:48:45,000 --> 00:48:47,000 aquí en el esquema 1187 00:48:49,000 --> 00:48:51,000 han puesto 3 minutos 1188 00:48:51,000 --> 00:48:53,000 y suelen poner 5 minutos 1189 00:48:53,000 --> 00:48:55,000 mínimo 5 minutos de desnaturalización 1190 00:48:55,000 --> 00:48:57,000 que es una burrada 1191 00:48:57,000 --> 00:48:59,000 es mucho tiempo 1192 00:49:03,000 --> 00:49:05,000 ¿por qué tanto tiempo? 1193 00:49:05,000 --> 00:49:07,000 ¿cuál es el objetivo? 1194 00:49:07,000 --> 00:49:09,000 el objetivo de esta fase de desnaturalización inicial 1195 00:49:09,000 --> 00:49:11,000 es que todo el DNA molde 1196 00:49:11,000 --> 00:49:13,000 sí o sí desnaturalice 1197 00:49:15,000 --> 00:49:17,000 se encuentre ya desnaturalizado 1198 00:49:17,000 --> 00:49:19,000 cuando vayan a empezar los ciclos 1199 00:49:19,000 --> 00:49:21,000 de replicación 1200 00:49:21,000 --> 00:49:23,000 que son los ciclos de replicación 1201 00:49:23,000 --> 00:49:25,000 todo el DNA ya esté desnaturalizado 1202 00:49:25,000 --> 00:49:27,000 y si se han formado dimeros de primers 1203 00:49:27,000 --> 00:49:29,000 también desnaturalizan 1204 00:49:29,000 --> 00:49:31,000 y estén todos los primers 1205 00:49:31,000 --> 00:49:33,000 en forma monocatenaria 1206 00:49:33,000 --> 00:49:35,000 por tanto al final de esta primera fase 1207 00:49:35,000 --> 00:49:37,000 si yo tuviese un microscopio y pudiese mirar 1208 00:49:37,000 --> 00:49:39,000 dentro del tubo 1209 00:49:39,000 --> 00:49:41,000 lo que vería serían hebras monocatenarias 1210 00:49:41,000 --> 00:49:43,000 ¿de acuerdo? 1211 00:49:43,000 --> 00:49:45,000 la segunda fase son los ciclos de replicación 1212 00:49:45,000 --> 00:49:47,000 los ciclos de replicación 1213 00:49:47,000 --> 00:49:49,000 ya sabemos que estos ciclos de replicación 1214 00:49:49,000 --> 00:49:51,000 es una repetición 1215 00:49:51,000 --> 00:49:53,000 cíclica de 3 temperaturas 1216 00:49:53,000 --> 00:49:55,000 95ºC 1217 00:49:55,000 --> 00:49:57,000 temperatura de anilin 1218 00:49:57,000 --> 00:49:59,000 baja la temperatura de anilin 1219 00:49:59,000 --> 00:50:01,000 que sabemos que está en torno a 1220 00:50:01,000 --> 00:50:03,000 60ºC 1221 00:50:03,000 --> 00:50:05,000 55ºC 1222 00:50:05,000 --> 00:50:07,000 60ºC y temperatura de extensión 1223 00:50:07,000 --> 00:50:09,000 72ºC 1224 00:50:09,000 --> 00:50:11,000 anilin 1225 00:50:11,000 --> 00:50:13,000 extensión 1226 00:50:13,000 --> 00:50:15,000 ¿se os acordáis? 1227 00:50:15,000 --> 00:50:17,000 ¿cuánto tiempo le ponemos? 1228 00:50:17,000 --> 00:50:19,000 ya daos cuenta que en el termociclador 1229 00:50:19,000 --> 00:50:21,000 en el termociclador 1230 00:50:21,000 --> 00:50:23,000 podemos programar 3 parámetros 1231 00:50:23,000 --> 00:50:25,000 temperatura 1232 00:50:25,000 --> 00:50:27,000 tiempo y ciclos 1233 00:50:27,000 --> 00:50:29,000 en la primera fase 1234 00:50:29,000 --> 00:50:31,000 temperatura 95ºC 1235 00:50:31,000 --> 00:50:33,000 tiempo 95ºC 1236 00:50:33,000 --> 00:50:35,000 ciclos, un solo ciclo 1237 00:50:35,000 --> 00:50:37,000 y aquí lo mismo, temperatura 1238 00:50:37,000 --> 00:50:39,000 tiempo 1239 00:50:39,000 --> 00:50:41,000 y número de ciclos 1240 00:50:41,000 --> 00:50:43,000 son los 3 parámetros 1241 00:50:43,000 --> 00:50:45,000 que se pueden 1242 00:50:45,000 --> 00:50:47,000 que podemos programar 1243 00:50:47,000 --> 00:50:49,000 ¿de acuerdo? 1244 00:50:49,000 --> 00:50:51,000 ¿qué tiempo le ponemos? 1245 00:50:51,000 --> 00:50:53,000 normalmente suelen ser 30, 30 1246 00:50:53,000 --> 00:50:55,000 ¿de acuerdo? 30 segundos 1247 00:50:55,000 --> 00:50:57,000 30 segundos y acordaos que 1248 00:50:57,000 --> 00:50:59,000 el tiempo de extensión 1249 00:50:59,000 --> 00:51:01,000 ya os dije que son 1250 00:51:01,000 --> 00:51:03,000 10 segundos 1251 00:51:03,000 --> 00:51:05,000 10 segundos de amplificación de extensión 1252 00:51:05,000 --> 00:51:07,000 por cada 100 pares de bases 1253 00:51:07,000 --> 00:51:09,000 que queremos amplificar 1254 00:51:09,000 --> 00:51:11,000 esto en la PCR convencional 1255 00:51:11,000 --> 00:51:13,000 ¿y cuántos ciclos ponemos? 1256 00:51:13,000 --> 00:51:15,000 ¿cuántas veces lo va a repetir? 1257 00:51:15,000 --> 00:51:17,000 pues suele ser entre 25 y 35 ciclos 1258 00:51:17,000 --> 00:51:19,000 y esto ya 1259 00:51:19,000 --> 00:51:21,000 hay que verlo de forma experimental 1260 00:51:21,000 --> 00:51:23,000 menos de 25 ciclos 1261 00:51:23,000 --> 00:51:25,000 no es suficiente 1262 00:51:25,000 --> 00:51:27,000 no da tiempo para que lo podamos ver bien 1263 00:51:27,000 --> 00:51:29,000 en un gel de agarosa 1264 00:51:29,000 --> 00:51:31,000 y más de 35 ciclos 1265 00:51:31,000 --> 00:51:33,000 ya no es fiable 1266 00:51:33,000 --> 00:51:35,000 porque si ponemos muchos, muchos ciclos 1267 00:51:35,000 --> 00:51:37,000 hay un problema, el primer problema es que 1268 00:51:37,000 --> 00:51:39,000 acordaos que la DNA polimerasa se va a inactivar 1269 00:51:39,000 --> 00:51:41,000 ¿vale? porque tiene que pasar muchas veces 1270 00:51:41,000 --> 00:51:43,000 por 95 grados 1271 00:51:43,000 --> 00:51:45,000 entonces si ponemos muchos ciclos 1272 00:51:45,000 --> 00:51:47,000 es más probable que se inactive y empiece a funcionar mal 1273 00:51:47,000 --> 00:51:49,000 y en segundo lugar 1274 00:51:49,000 --> 00:51:51,000 pueden empezar a amplificar 1275 00:51:51,000 --> 00:51:53,000 pueden empezar a amplificarse 1276 00:51:53,000 --> 00:51:55,000 fragmentos 1277 00:51:55,000 --> 00:51:57,000 inespecíficos y eso es muy habitual 1278 00:51:57,000 --> 00:51:59,000 por tanto hay que jugar 1279 00:51:59,000 --> 00:52:01,000 con el número de ciclos 1280 00:52:01,000 --> 00:52:03,000 30 ciclos está muy bien 1281 00:52:03,000 --> 00:52:05,000 normalmente cuando es una PCR que no hemos 1282 00:52:05,000 --> 00:52:07,000 hecho nunca se empieza por 1283 00:52:07,000 --> 00:52:09,000 35 ciclos 1284 00:52:09,000 --> 00:52:11,000 le damos caña 1285 00:52:11,000 --> 00:52:13,000 le das caña a la PCR 1286 00:52:13,000 --> 00:52:15,000 pero con 35 ciclos si los cebadores funcionan 1287 00:52:15,000 --> 00:52:17,000 y la polimerasa también, tienes que amplificar 1288 00:52:17,000 --> 00:52:19,000 sí o sí 1289 00:52:19,000 --> 00:52:21,000 si en la primera PCR pongo 25 y no 1290 00:52:21,000 --> 00:52:23,000 observo amplificación, pues la tengo 1291 00:52:23,000 --> 00:52:25,000 que repetir, pero si a 35 ciclos 1292 00:52:25,000 --> 00:52:27,000 observo PCR, entonces luego 1293 00:52:27,000 --> 00:52:29,000 ya voy disminuyendo, 32 ciclos 1294 00:52:29,000 --> 00:52:31,000 30, 28 1295 00:52:31,000 --> 00:52:33,000 y ya me quedaría con el número 1296 00:52:33,000 --> 00:52:35,000 de ciclos suficiente para poderlo ver 1297 00:52:35,000 --> 00:52:37,000 para que amplifique bien 1298 00:52:37,000 --> 00:52:39,000 y verlo en un gel lagroso 1299 00:52:39,000 --> 00:52:41,000 por tanto, primera fase 1300 00:52:41,000 --> 00:52:43,000 desnaturalización inicial, segunda fase 1301 00:52:43,000 --> 00:52:45,000 los ciclos de amplificación 1302 00:52:45,000 --> 00:52:47,000 esta es la fase 1303 00:52:47,000 --> 00:52:49,000 más importante 1304 00:52:49,000 --> 00:52:51,000 una tercera fase 1305 00:52:51,000 --> 00:52:53,000 que también es un solo ciclo 1306 00:52:53,000 --> 00:52:55,000 de extensión final 1307 00:52:55,000 --> 00:52:57,000 ¿qué es esto de la extensión final? 1308 00:52:57,000 --> 00:52:59,000 vamos a poner la mezcla 1309 00:52:59,000 --> 00:53:01,000 de reacción, una vez ya han acabado 1310 00:53:01,000 --> 00:53:03,000 los ciclos de replicación a 72 grados 1311 00:53:03,000 --> 00:53:05,000 un tiempo que va entre 1312 00:53:05,000 --> 00:53:07,000 5 y 10 minutos 1313 00:53:07,000 --> 00:53:09,000 se suelen poner 10 minutos 1314 00:53:09,000 --> 00:53:11,000 ¿por qué? 1315 00:53:11,000 --> 00:53:13,000 esto se hace para hacer 1316 00:53:13,000 --> 00:53:15,000 una extensión final 1317 00:53:15,000 --> 00:53:17,000 es decir, imaginaos que a lo largo 1318 00:53:17,000 --> 00:53:19,000 de todos estos ciclos 1319 00:53:19,000 --> 00:53:21,000 llegan 40 segundos 1320 00:53:21,000 --> 00:53:23,000 de extensión 1321 00:53:23,000 --> 00:53:25,000 42, 45 1322 00:53:25,000 --> 00:53:27,000 y a algunas polimerasas no les ha dado tiempo 1323 00:53:27,000 --> 00:53:29,000 a acabar de amplificar 1324 00:53:29,000 --> 00:53:31,000 los fragmentos que tenían que amplificar 1325 00:53:31,000 --> 00:53:33,000 ¿de acuerdo? imaginaos 1326 00:53:33,000 --> 00:53:35,000 y se han quedado a medias 1327 00:53:35,000 --> 00:53:37,000 pues le damos un tiempo 1328 00:53:37,000 --> 00:53:39,000 5-10 minutos a 72 grados 1329 00:53:39,000 --> 00:53:41,000 para que las polimerasas 1330 00:53:41,000 --> 00:53:43,000 que no han acabado, les dé tiempo 1331 00:53:43,000 --> 00:53:45,000 más que de sobra para acabar 1332 00:53:45,000 --> 00:53:47,000 de sintetizar y amplificar los fragmentos 1333 00:53:47,000 --> 00:53:49,000 que se hayan podido quedar medias 1334 00:53:49,000 --> 00:53:51,000 ¿de acuerdo? 1335 00:53:51,000 --> 00:53:53,000 y el último paso es a 4 grados 1336 00:53:53,000 --> 00:53:55,000 ¿vale? es el de mantenimiento 1337 00:53:55,000 --> 00:53:57,000 es decir, le vamos a decir al termociclador 1338 00:53:57,000 --> 00:53:59,000 ojo, cuando acabe 1339 00:53:59,000 --> 00:54:01,000 la extensión final, pones el termobloque 1340 00:54:01,000 --> 00:54:03,000 a 4 grados, es decir, como si estuviera 1341 00:54:03,000 --> 00:54:05,000 en la nevera 1342 00:54:05,000 --> 00:54:07,000 es lo mismo que si yo llego, abro el termociclador 1343 00:54:07,000 --> 00:54:09,000 cojo las reacciones 1344 00:54:09,000 --> 00:54:11,000 y las meto en la nevera 1345 00:54:11,000 --> 00:54:13,000 pues tú vas a poner el termobloque a 4 grados 1346 00:54:13,000 --> 00:54:15,000 un tiempo infinito 1347 00:54:15,000 --> 00:54:17,000 es decir, hasta que yo llegue 1348 00:54:17,000 --> 00:54:19,000 y lo quite 1349 00:54:19,000 --> 00:54:21,000 esta fase es muy importante 1350 00:54:21,000 --> 00:54:23,000 ¿por qué? porque esto nos permite 1351 00:54:23,000 --> 00:54:25,000 por ejemplo, poner una PCR 1352 00:54:25,000 --> 00:54:27,000 a las 5 de la tarde, cuando ya nos vamos a ir 1353 00:54:27,000 --> 00:54:29,000 la dejamos puesta 1354 00:54:29,000 --> 00:54:31,000 el termociclador 1355 00:54:31,000 --> 00:54:33,000 hace toda la PCR, que puede durar 1356 00:54:33,000 --> 00:54:35,000 dos horitas y media, y cuando acaba 1357 00:54:35,000 --> 00:54:37,000 se queda toda la noche a 4 grados 1358 00:54:37,000 --> 00:54:39,000 llego a la mañana siguiente 1359 00:54:39,000 --> 00:54:41,000 y ya la tengo preparada, ¿se entiende? 1360 00:54:41,000 --> 00:54:43,000 entonces, esta fase de mantenimiento 1361 00:54:43,000 --> 00:54:45,000 es muy importante, porque si 1362 00:54:45,000 --> 00:54:47,000 la mantenemos a temperatura ambiente 1363 00:54:47,000 --> 00:54:49,000 y no se mantiene como si estuviera en la nevera 1364 00:54:49,000 --> 00:54:51,000 pueden haber amplificaciones 1365 00:54:51,000 --> 00:54:53,000 podrían haber 1366 00:54:53,000 --> 00:54:55,000 amplificaciones inespecíficas 1367 00:54:55,000 --> 00:54:57,000 ¿de acuerdo? 1368 00:54:57,000 --> 00:54:59,000 por tanto, sería raro 1369 00:54:59,000 --> 00:55:01,000 esto es muy importante, la programación del termociclador 1370 00:55:01,000 --> 00:55:03,000 y las fases 1371 00:55:03,000 --> 00:55:05,000 del termociclador, sería raro 1372 00:55:05,000 --> 00:55:07,000 que no se lo preguntase en el examen 1373 00:55:07,000 --> 00:55:09,000 hay que saber interpretar 1374 00:55:09,000 --> 00:55:11,000 una gráfica de este estilo y saberla 1375 00:55:11,000 --> 00:55:13,000 explicar, ¿de acuerdo? cada una de las fases 1376 00:55:13,000 --> 00:55:15,000 en este cuadro 1377 00:55:15,000 --> 00:55:17,000 que viene en el libro 1378 00:55:17,000 --> 00:55:19,000 se recoge el protocolo 1379 00:55:19,000 --> 00:55:21,000 ¿de acuerdo? como lo han programado 1380 00:55:21,000 --> 00:55:23,000 para un fragmento 1381 00:55:23,000 --> 00:55:25,000 que quieren amplificar 1382 00:55:25,000 --> 00:55:27,000 un amplicón de 500 pares de bases 1383 00:55:27,000 --> 00:55:29,000 ¿de acuerdo? 1384 00:55:29,000 --> 00:55:31,000 de naturalización inicial, 3 minutos 1385 00:55:31,000 --> 00:55:33,000 30 segundos, 30 segundos es suficiente 1386 00:55:33,000 --> 00:55:35,000 para que haga la anilin 1387 00:55:35,000 --> 00:55:37,000 ¿de acuerdo? 1388 00:55:37,000 --> 00:55:39,000 extensión, 45 segundos 1389 00:55:39,000 --> 00:55:41,000 daos cuenta, 500 pares de bases 1390 00:55:41,000 --> 00:55:43,000 cada 100 pares de bases, 10 segundos 1391 00:55:43,000 --> 00:55:45,000 50 pares de bases serían 1392 00:55:45,000 --> 00:55:47,000 50 segundos, estamos ahí 1393 00:55:47,000 --> 00:55:49,000 en torno a eso 1394 00:55:49,000 --> 00:55:51,000 una extensión final, cercana a los 10 minutos 1395 00:55:51,000 --> 00:55:53,000 y luego el mantenimiento 1396 00:55:53,000 --> 00:55:55,000 ¿de acuerdo? 1397 00:55:55,000 --> 00:55:57,000 ¿como analizamos 1398 00:55:57,000 --> 00:55:59,000 los productos amplificados? 1399 00:55:59,000 --> 00:56:01,000 esto también es muy importante, es decir, como sé 1400 00:56:01,000 --> 00:56:03,000 si la PCR me ha salido bien o no me ha salido 1401 00:56:03,000 --> 00:56:05,000 bien, pues lo hacemos mediante 1402 00:56:05,000 --> 00:56:07,000 un gel de agarosa 1403 00:56:07,000 --> 00:56:09,000 una electroforesis en gel de agarosa 1404 00:56:09,000 --> 00:56:11,000 es un gel de agarosa 1405 00:56:11,000 --> 00:56:13,000 que el porcentaje 1406 00:56:13,000 --> 00:56:15,000 de agarosa es muy importante 1407 00:56:15,000 --> 00:56:17,000 y suele ir de 0,5 a 2% 1408 00:56:17,000 --> 00:56:19,000 incluso un poquito más 1409 00:56:19,000 --> 00:56:21,000 ¿de acuerdo? 1410 00:56:21,000 --> 00:56:23,000 el porcentaje puede ser hasta 2,5% 1411 00:56:23,000 --> 00:56:25,000 ¿de acuerdo? 1412 00:56:25,000 --> 00:56:27,000 cuanto mayor porcentaje 1413 00:56:27,000 --> 00:56:29,000 y esto quiero que lo apuntéis 1414 00:56:29,000 --> 00:56:31,000 que no lo pone el libro 1415 00:56:31,000 --> 00:56:33,000 cuanto mayor porcentaje de agarosa 1416 00:56:33,000 --> 00:56:35,000 mejor 1417 00:56:35,000 --> 00:56:37,000 se van a ver los amplicones 1418 00:56:37,000 --> 00:56:39,000 pequeñitos 1419 00:56:39,000 --> 00:56:41,000 ¿de acuerdo? amplicones de 100 pares de bases 1420 00:56:41,000 --> 00:56:43,000 200, 50, 300 1421 00:56:43,000 --> 00:56:45,000 hasta 500 pares de bases 1422 00:56:45,000 --> 00:56:47,000 tengo que poner un porcentaje 1423 00:56:47,000 --> 00:56:49,000 de agarosa elevado 1424 00:56:49,000 --> 00:56:51,000 si el porcentaje de agarosa es bajito 1425 00:56:51,000 --> 00:56:53,000 uno, por ejemplo, 0,81 1426 00:56:53,000 --> 00:56:55,000 1,2% 1427 00:56:55,000 --> 00:56:57,000 esos geles los hago cuando 1428 00:56:57,000 --> 00:56:59,000 los amplicones son muy grandes 1429 00:56:59,000 --> 00:57:01,000 una kilobase, dos kilobases 1430 00:57:01,000 --> 00:57:03,000 3,5 kilobases 1431 00:57:03,000 --> 00:57:05,000 ¿de acuerdo? entonces se ven muchísimo 1432 00:57:05,000 --> 00:57:07,000 mejor cuando el porcentaje del gel 1433 00:57:07,000 --> 00:57:09,000 es bajito 1434 00:57:09,000 --> 00:57:11,000 ¿de acuerdo? ¿cómo veréis si el paciente 1435 00:57:11,000 --> 00:57:13,000 es positivo o es negativo? 1436 00:57:13,000 --> 00:57:15,000 una vez hecha la electroforesis lo veré 1437 00:57:15,000 --> 00:57:17,000 una banda específica 1438 00:57:17,000 --> 00:57:19,000 lo vamos a ver ahora 1439 00:57:19,000 --> 00:57:21,000 y después, para decir que el resultado 1440 00:57:21,000 --> 00:57:23,000 ha sido positivo, acordaos que 1441 00:57:23,000 --> 00:57:25,000 el control negativo no tiene que haber 1442 00:57:25,000 --> 00:57:27,000 amplificado y no tiene que haber banda 1443 00:57:27,000 --> 00:57:29,000 ¿cuándo diré que el paciente es negativo? 1444 00:57:29,000 --> 00:57:31,000 cuando en el carril 1445 00:57:31,000 --> 00:57:33,000 de ese paciente no haya una banda 1446 00:57:33,000 --> 00:57:35,000 ¿de acuerdo? 1447 00:57:35,000 --> 00:57:37,000 y en el control positivo 1448 00:57:37,000 --> 00:57:39,000 si haya banda, esto es muy importante 1449 00:57:39,000 --> 00:57:41,000 vamos a ver un ejemplo 1450 00:57:41,000 --> 00:57:43,000 vale, este es un ejemplo, un análisis que hicieron 1451 00:57:43,000 --> 00:57:45,000 ¿de acuerdo? esto es un análisis 1452 00:57:45,000 --> 00:57:47,000 real, es un gel de agarosa 1453 00:57:47,000 --> 00:57:49,000 que lo han corrido y lo hemos 1454 00:57:49,000 --> 00:57:51,000 visto en un documentador de gels 1455 00:57:51,000 --> 00:57:53,000 ¿de acuerdo? son 1456 00:57:53,000 --> 00:57:55,000 6 carriles, los lanes 1457 00:57:55,000 --> 00:57:57,000 6 carriles, el primero lo han dejado vacío 1458 00:57:57,000 --> 00:57:59,000 como veis aquí, el pocillo 1459 00:57:59,000 --> 00:58:01,000 empty well, el pocillo 1460 00:58:01,000 --> 00:58:03,000 vacío, en el segundo 1461 00:58:03,000 --> 00:58:05,000 está el marcador 1462 00:58:05,000 --> 00:58:07,000 de pesos moleculares 1463 00:58:07,000 --> 00:58:09,000 ¿de acuerdo? nos están diciendo que es un marcador 1464 00:58:09,000 --> 00:58:11,000 de pesos moleculares de 50 1465 00:58:11,000 --> 00:58:13,000 pares de bases, eso significa que 1466 00:58:13,000 --> 00:58:15,000 cada banda son 50 pares 1467 00:58:15,000 --> 00:58:17,000 de bases, o sea, esta banda tiene 1468 00:58:17,000 --> 00:58:19,000 un tamaño de 50 pares de bases 1469 00:58:19,000 --> 00:58:21,000 bien, 150 1470 00:58:21,000 --> 00:58:23,000 200 y así sucesivamente 1471 00:58:23,000 --> 00:58:25,000 ¿de acuerdo? 1472 00:58:25,000 --> 00:58:27,000 en el carril 3 1473 00:58:27,000 --> 00:58:29,000 tenemos el control negativo 1474 00:58:29,000 --> 00:58:31,000 por tanto no observo banda 1475 00:58:31,000 --> 00:58:33,000 en el carril 4 tengo el control 1476 00:58:33,000 --> 00:58:35,000 positivo, aquí siempre 1477 00:58:35,000 --> 00:58:37,000 tengo que observar banda 1478 00:58:37,000 --> 00:58:39,000 y en los pacientes, que son dos pacientes 1479 00:58:39,000 --> 00:58:41,000 muestra 1, muestra 2, sample 1 1480 00:58:41,000 --> 00:58:43,000 sample 2, ¿vale? 1481 00:58:43,000 --> 00:58:45,000 muestra 1 y muestra 2, tengo dos pacientes 1482 00:58:45,000 --> 00:58:47,000 pues resulta que los dos son positivos 1483 00:58:47,000 --> 00:58:49,000 ¿y cómo sé que esta 1484 00:58:49,000 --> 00:58:51,000 banda corresponde al fragmento 1485 00:58:51,000 --> 00:58:53,000 que tenía yo que amplificar? 1486 00:58:53,000 --> 00:58:55,000 porque tiene el mismo tamaño que 1487 00:58:55,000 --> 00:58:57,000 tiene el control positivo, y es aproximadamente 1488 00:58:57,000 --> 00:58:59,000 un poquito más 1489 00:58:59,000 --> 00:59:01,000 de 150 pares de bases, en 1490 00:59:01,000 --> 00:59:03,000 concreto 166 1491 00:59:03,000 --> 00:59:05,000 pares de bases, por tanto 1492 00:59:05,000 --> 00:59:07,000 esta PCR, control negativo 1493 00:59:07,000 --> 00:59:09,000 ha salido negativo, control positivo 1494 00:59:09,000 --> 00:59:11,000 ha salido positivo, el resultado 1495 00:59:11,000 --> 00:59:13,000 de estos pacientes me lo puedo 1496 00:59:13,000 --> 00:59:15,000 creer, ¿de acuerdo? 1497 00:59:17,000 --> 00:59:19,000 por tanto diría que el resultado 1498 00:59:19,000 --> 00:59:21,000 es correcto 1499 00:59:23,000 --> 00:59:25,000 no es raro 1500 00:59:25,000 --> 00:59:27,000 el ejemplo que os ponen en el libro 1501 00:59:27,000 --> 00:59:29,000 que yo observe esta banda aquí abajo 1502 00:59:29,000 --> 00:59:31,000 esta es una bandita 1503 00:59:33,000 --> 00:59:35,000 de un tamaño muy pequeño, acordaos que esta tenía 1504 00:59:35,000 --> 00:59:37,000 150 pares de bases 1505 00:59:37,000 --> 00:59:39,000 por tanto esto tiene 1506 00:59:39,000 --> 00:59:41,000 20, 40 pares de bases 1507 00:59:41,000 --> 00:59:43,000 aproximadamente, esto es lo que llamamos los 1508 00:59:43,000 --> 00:59:45,000 primer dimers 1509 00:59:45,000 --> 00:59:47,000 los dimers de primers, a veces los primers 1510 00:59:47,000 --> 00:59:49,000 queramos o no queramos, los hayamos 1511 00:59:49,000 --> 00:59:51,000 diseñado bien o no tan bien 1512 00:59:51,000 --> 00:59:53,000 da igual si están perfectamente diseñados 1513 00:59:53,000 --> 00:59:55,000 es muy fácil que entre ellos 1514 00:59:55,000 --> 00:59:57,000 formen dimers 1515 00:59:57,000 --> 00:59:59,000 ¿vale? que son 1516 00:59:59,000 --> 01:00:01,000 híbridos bicatenarios 1517 01:00:01,000 --> 01:00:03,000 ¿vale? porque son híbridos 1518 01:00:03,000 --> 01:00:05,000 de un primer con otro primer 1519 01:00:05,000 --> 01:00:07,000 los dos primers hacen un burluño 1520 01:00:07,000 --> 01:00:09,000 aunque tengan una pequeña 1521 01:00:09,000 --> 01:00:11,000 porción complementaria 1522 01:00:11,000 --> 01:00:13,000 y forman dimers, y los vemos aquí 1523 01:00:13,000 --> 01:00:15,000 abajo, esto es muy normal observarlo 1524 01:00:15,000 --> 01:00:17,000 pero ¿por qué no 1525 01:00:17,000 --> 01:00:19,000 aceptamos esta PCR? 1526 01:00:19,000 --> 01:00:21,000 porque si os dais cuenta 1527 01:00:21,000 --> 01:00:23,000 hay varias bandas 1528 01:00:23,000 --> 01:00:25,000 quizá esta que es la mayoritaria y la que se ve mejor 1529 01:00:25,000 --> 01:00:27,000 es la que yo quiero amplificar, pero si os dais cuenta 1530 01:00:27,000 --> 01:00:29,000 hay muestras 1531 01:00:29,000 --> 01:00:31,000 donde hay una banda 1532 01:00:31,000 --> 01:00:33,000 encima, por tanto tengo bandas 1533 01:00:33,000 --> 01:00:35,000 inespecíficas, un poquito más 1534 01:00:35,000 --> 01:00:37,000 exagerado es lo que vemos aquí 1535 01:00:37,000 --> 01:00:39,000 si solamente en 1536 01:00:39,000 --> 01:00:41,000 cada PCR estándar amplifico 1537 01:00:41,000 --> 01:00:43,000 un solo fragmento, fijaos aquí 1538 01:00:43,000 --> 01:00:45,000 la cantidad de bandas inespecíficas 1539 01:00:45,000 --> 01:00:47,000 que tenemos, por tanto 1540 01:00:47,000 --> 01:00:49,000 este resultado 1541 01:00:49,000 --> 01:00:51,000 sería rechazado 1542 01:00:51,000 --> 01:00:53,000 ¿de acuerdo? 1543 01:00:53,000 --> 01:00:55,000 rechazado 1544 01:00:55,000 --> 01:00:57,000 podríamos pensar que es lo que podemos 1545 01:00:57,000 --> 01:00:59,000 hacer para quitar toda esta 1546 01:00:59,000 --> 01:01:01,000 inespecificidad, pero bueno 1547 01:01:01,000 --> 01:01:03,000 no es tema de 1548 01:01:03,000 --> 01:01:05,000 para esta clase, sino que ya lo veremos 1549 01:01:05,000 --> 01:01:07,000 y ya os lo contaré en clase 1550 01:01:07,000 --> 01:01:09,000 o en prácticas 1551 01:01:09,000 --> 01:01:11,000 ¿de acuerdo? 1552 01:01:11,000 --> 01:01:13,000 muy bien 1553 01:01:13,000 --> 01:01:15,000 muy bien 1554 01:01:15,000 --> 01:01:17,000 de esta PCR estándar se han 1555 01:01:19,000 --> 01:01:21,000 desarrollado otro tipo de 1556 01:01:21,000 --> 01:01:23,000 modalidades, que es lo que llamamos la 1557 01:01:23,000 --> 01:01:25,000 PCR con inicio en caliente 1558 01:01:25,000 --> 01:01:27,000 PCR para fragmentos grandes 1559 01:01:27,000 --> 01:01:29,000 y PCR de alta fidelidad 1560 01:01:29,000 --> 01:01:31,000 cada una de ellas con un objetivo 1561 01:01:31,000 --> 01:01:33,000 diferente ¿de acuerdo? 1562 01:01:33,000 --> 01:01:35,000 la PCR con inicio en caliente 1563 01:01:37,000 --> 01:01:39,000 es una PCR que se diseñó 1564 01:01:41,000 --> 01:01:43,000 porque se observaba 1565 01:01:43,000 --> 01:01:45,000 que algunas de estas bandas que vemos aquí 1566 01:01:45,000 --> 01:01:47,000 inespecíficas, no se producían 1567 01:01:49,000 --> 01:01:51,000 durante la reacción 1568 01:01:51,000 --> 01:01:53,000 de PCR en sí misma 1569 01:01:53,000 --> 01:01:55,000 dentro del termociclador 1570 01:01:55,000 --> 01:01:57,000 sino que se producían 1571 01:01:59,000 --> 01:02:01,000 a temperatura ambiente 1572 01:02:01,000 --> 01:02:03,000 o sea que había polimerasas 1573 01:02:03,000 --> 01:02:05,000 que eran capaces de amplificar de forma 1574 01:02:05,000 --> 01:02:07,000 inespecífica, hay algunas polimerasas 1575 01:02:07,000 --> 01:02:09,000 cuando están a temperatura ambiente 1576 01:02:09,000 --> 01:02:11,000 antes, una vez hemos puesto 1577 01:02:11,000 --> 01:02:13,000 la MasterMix en el tubo 1578 01:02:13,000 --> 01:02:15,000 hemos añadido el DNA 1579 01:02:15,000 --> 01:02:17,000 hasta que lo metemos 1580 01:02:17,000 --> 01:02:19,000 en el termociclador, que pasan unos minutos 1581 01:02:19,000 --> 01:02:21,000 porque no somos flash 1582 01:02:21,000 --> 01:02:23,000 ¿de acuerdo? no somos rayos 1583 01:02:23,000 --> 01:02:25,000 y lo que observan los investigadores 1584 01:02:25,000 --> 01:02:27,000 era que se amplificaban 1585 01:02:27,000 --> 01:02:29,000 a temperatura ambiente 1586 01:02:29,000 --> 01:02:31,000 bandas inespecíficas 1587 01:02:31,000 --> 01:02:33,000 ¿qué es lo que se suele hacer? 1588 01:02:33,000 --> 01:02:35,000 para evitar eso, se hace 1589 01:02:35,000 --> 01:02:37,000 una inicio en caliente 1590 01:02:37,000 --> 01:02:39,000 es decir 1591 01:02:39,000 --> 01:02:41,000 también se le llama Hot Start 1592 01:02:41,000 --> 01:02:43,000 ¿de acuerdo? la PCR 1593 01:02:43,000 --> 01:02:45,000 Hot Start PCR 1594 01:02:45,000 --> 01:02:47,000 de inicio en caliente 1595 01:02:47,000 --> 01:02:49,000 ¿de acuerdo? 1596 01:02:49,000 --> 01:02:51,000 se basa fundamentalmente 1597 01:02:51,000 --> 01:02:53,000 podemos intentar 1598 01:02:53,000 --> 01:02:55,000 evitar esto de tres maneras 1599 01:02:55,000 --> 01:02:57,000 la primera, que es muy engorrosa 1600 01:02:57,000 --> 01:02:59,000 es, hago la MasterMix 1601 01:02:59,000 --> 01:03:01,000 sin la DNA polimerasa 1602 01:03:01,000 --> 01:03:03,000 en los tubos, añado la MasterMix 1603 01:03:03,000 --> 01:03:05,000 acordaos, en esa MasterMix van a faltar 1604 01:03:05,000 --> 01:03:07,000 dos cosas, polimerasa 1605 01:03:07,000 --> 01:03:09,000 y DNA molde 1606 01:03:09,000 --> 01:03:11,000 cojo cada tubo 1607 01:03:11,000 --> 01:03:13,000 pongo la MasterMix, pongo el DNA molde 1608 01:03:13,000 --> 01:03:15,000 ojo, todavía no tiene DNA polimerasa 1609 01:03:15,000 --> 01:03:17,000 por tanto, no 1610 01:03:17,000 --> 01:03:19,000 puede amplificar nada 1611 01:03:19,000 --> 01:03:21,000 lo meto en el termociclador 1612 01:03:21,000 --> 01:03:23,000 ¿de acuerdo? 1613 01:03:23,000 --> 01:03:25,000 hago que el termociclador 1614 01:03:25,000 --> 01:03:27,000 suba a 65 grados 1615 01:03:27,000 --> 01:03:29,000 aproximadamente 1616 01:03:29,000 --> 01:03:31,000 o sea, que ya se caliente 1617 01:03:31,000 --> 01:03:33,000 y lo que hago es, paro el termociclador 1618 01:03:33,000 --> 01:03:35,000 y con las muestras a 65 grados 1619 01:03:35,000 --> 01:03:37,000 abro el termociclador 1620 01:03:37,000 --> 01:03:39,000 quito las tapas 1621 01:03:39,000 --> 01:03:41,000 y añado la polimerasa ya 1622 01:03:41,000 --> 01:03:43,000 a esa temperatura 1623 01:03:43,000 --> 01:03:45,000 lo único que puede amplificar 1624 01:03:45,000 --> 01:03:47,000 ya es el fragmento 1625 01:03:47,000 --> 01:03:49,000 el fragmento específico 1626 01:03:49,000 --> 01:03:51,000 como veis, esta modalidad es muy engorrosa 1627 01:03:51,000 --> 01:03:53,000 es un rollo, es un petardo 1628 01:03:53,000 --> 01:03:55,000 claro, y las posibilidades 1629 01:03:55,000 --> 01:03:57,000 de contaminación 1630 01:03:57,000 --> 01:03:59,000 son muy grandes, ¿por qué? 1631 01:03:59,000 --> 01:04:01,000 porque tengo que manejar y abrir 1632 01:04:01,000 --> 01:04:03,000 y destapar los tubos muchas veces 1633 01:04:03,000 --> 01:04:05,000 la segunda estrategia 1634 01:04:05,000 --> 01:04:07,000 era aislando la DNA polimerasa 1635 01:04:07,000 --> 01:04:09,000 del resto de componentes, hacer una MasterMix 1636 01:04:09,000 --> 01:04:11,000 con una polimerasa 1637 01:04:11,000 --> 01:04:13,000 un poquito específica 1638 01:04:13,000 --> 01:04:15,000 un poco especial, de tal manera que 1639 01:04:15,000 --> 01:04:17,000 la venden comercial 1640 01:04:17,000 --> 01:04:19,000 y la polimerasa va dentro de unas 1641 01:04:19,000 --> 01:04:21,000 nanoesferas de cera 1642 01:04:21,000 --> 01:04:23,000 de tal manera que 1643 01:04:23,000 --> 01:04:25,000 a temperatura ambiente, la DNA polimerasa 1644 01:04:25,000 --> 01:04:27,000 está secuestrada 1645 01:04:27,000 --> 01:04:29,000 dentro de las esferas y no funciona 1646 01:04:29,000 --> 01:04:31,000 cuando la ponga en el termociclador 1647 01:04:31,000 --> 01:04:33,000 a medida que vaya aumentando 1648 01:04:33,000 --> 01:04:35,000 la temperatura, cuando llegue a alrededor 1649 01:04:35,000 --> 01:04:37,000 de unos 55 grados 1650 01:04:37,000 --> 01:04:39,000 la cera funde 1651 01:04:39,000 --> 01:04:41,000 se funde, la DNA polimerasa 1652 01:04:41,000 --> 01:04:43,000 se libera 1653 01:04:43,000 --> 01:04:45,000 y no puede actuar 1654 01:04:47,000 --> 01:04:49,000 y otra modalidad, otra estrategia 1655 01:04:49,000 --> 01:04:51,000 es suministrando 1656 01:04:51,000 --> 01:04:53,000 lo que llamamos las DNA polimerasas 1657 01:04:53,000 --> 01:04:55,000 inactivas, es decir 1658 01:04:55,000 --> 01:04:57,000 a temperatura ambiente son inactivas 1659 01:04:57,000 --> 01:04:59,000 y solamente se activan 1660 01:04:59,000 --> 01:05:01,000 cuando están ya 1661 01:05:01,000 --> 01:05:03,000 a temperatura elevada 1662 01:05:03,000 --> 01:05:05,000 dependiendo de la PCR 1663 01:05:07,000 --> 01:05:09,000 suelen llevar un bloqueante 1664 01:05:09,000 --> 01:05:11,000 un bloqueante termolábil 1665 01:05:11,000 --> 01:05:13,000 ya que cuando está por encima 1666 01:05:13,000 --> 01:05:15,000 de los 55 grados 1667 01:05:15,000 --> 01:05:17,000 se rompe el bloqueante 1668 01:05:17,000 --> 01:05:19,000 porque es termolábil 1669 01:05:19,000 --> 01:05:21,000 la unión y la DNA polimerasa 1670 01:05:21,000 --> 01:05:23,000 quedaría nuevamente libre 1671 01:05:23,000 --> 01:05:25,000 esto es lo que llamamos 1672 01:05:25,000 --> 01:05:27,000 la PCR 1673 01:05:27,000 --> 01:05:29,000 en inicio incaliente, ¿cuándo la utilizaremos? 1674 01:05:29,000 --> 01:05:31,000 ya os digo, cuando observemos 1675 01:05:31,000 --> 01:05:33,000 bandas 1676 01:05:33,000 --> 01:05:35,000 inespecíficas 1677 01:05:35,000 --> 01:05:37,000 segunda modalidad 1678 01:05:37,000 --> 01:05:39,000 o modificación de la PCR estándar 1679 01:05:39,000 --> 01:05:41,000 PCR para grandes fragmentos 1680 01:05:41,000 --> 01:05:43,000 imaginaos que no son 500 pares de bases 1681 01:05:43,000 --> 01:05:45,000 normalmente la PCR estándar 1682 01:05:45,000 --> 01:05:47,000 convencional está diseñada 1683 01:05:47,000 --> 01:05:49,000 para fragmentos como mucho 1684 01:05:49,000 --> 01:05:51,000 de 3 kilobases, 3,5 1685 01:05:51,000 --> 01:05:53,000 kilobases como mucho 1686 01:05:53,000 --> 01:05:55,000 si yo quiero amplificar fragmentos mayores 1687 01:05:55,000 --> 01:05:57,000 pues tengo que añadir 1688 01:05:57,000 --> 01:05:59,000 una serie de modificaciones 1689 01:05:59,000 --> 01:06:01,000 en la mezcla de reacción 1690 01:06:01,000 --> 01:06:03,000 voy a añadir 1691 01:06:03,000 --> 01:06:05,000 una mezcla de 1692 01:06:05,000 --> 01:06:07,000 polimerasas 1693 01:06:07,000 --> 01:06:09,000 una polimerasa 1694 01:06:09,000 --> 01:06:11,000 va a ser mayoritaria y otra 1695 01:06:11,000 --> 01:06:13,000 va a ser minoritaria 1696 01:06:13,000 --> 01:06:15,000 la mayoritaria va a ser una polimerasa 1697 01:06:15,000 --> 01:06:17,000 que solo es polimerasa 1698 01:06:17,000 --> 01:06:19,000 no tiene actividad correctora 1699 01:06:19,000 --> 01:06:21,000 y esa la pongo en cantidades ingentes 1700 01:06:21,000 --> 01:06:23,000 de tal manera que 1701 01:06:23,000 --> 01:06:25,000 esa polimerasa lo único que hace es 1702 01:06:25,000 --> 01:06:27,000 una vez encuentra un primer 1703 01:06:27,000 --> 01:06:29,000 amplifica, amplifica, amplifica 1704 01:06:29,000 --> 01:06:31,000 y por detrás 1705 01:06:31,000 --> 01:06:33,000 va una segunda polimerasa que la pongo 1706 01:06:33,000 --> 01:06:35,000 en cantidad minoritaria 1707 01:06:35,000 --> 01:06:37,000 mucho mejor, unas 10 veces menos 1708 01:06:37,000 --> 01:06:39,000 y esta lo único que va haciendo es 1709 01:06:39,000 --> 01:06:41,000 releer 1710 01:06:41,000 --> 01:06:43,000 lo que la otra ha sintetizado 1711 01:06:43,000 --> 01:06:45,000 y si detecta errores las corrige 1712 01:06:45,000 --> 01:06:47,000 porque tiene actividad exonucleasa 1713 01:06:47,000 --> 01:06:49,000 ¿de acuerdo? 1714 01:06:49,000 --> 01:06:51,000 Primera modificación que se introduce 1715 01:06:51,000 --> 01:06:53,000 una mezcla de polimerasas 1716 01:06:53,000 --> 01:06:55,000 en segundo lugar hay que añadir 1717 01:06:55,000 --> 01:06:57,000 aditivos, aquí si son obligatorios 1718 01:06:57,000 --> 01:06:59,000 y puedo añadir el glicerol o el DMSO 1719 01:06:59,000 --> 01:07:01,000 el DMSO acordaos que es 1720 01:07:01,000 --> 01:07:03,000 el DMSO es dimetilsulfóxido 1721 01:07:03,000 --> 01:07:05,000 apuntadlo 1722 01:07:05,000 --> 01:07:07,000 no se si estará el nombre en el libro 1723 01:07:07,000 --> 01:07:09,000 no me acuerdo, dimetilsulfóxido 1724 01:07:09,000 --> 01:07:11,000 hay que conocer el nombre 1725 01:07:11,000 --> 01:07:13,000 el DMSO es como la forma amida 1726 01:07:13,000 --> 01:07:15,000 ayuda a desnaturalizar el DNA 1727 01:07:15,000 --> 01:07:17,000 claro cuando son fragmentos muy grandes 1728 01:07:17,000 --> 01:07:19,000 cuesta más desnaturalizarlos 1729 01:07:19,000 --> 01:07:21,000 porque son más largos, por tanto el DMSO 1730 01:07:21,000 --> 01:07:23,000 ayuda a la desnaturalización 1731 01:07:23,000 --> 01:07:25,000 y el glicerol ayuda 1732 01:07:25,000 --> 01:07:27,000 a estabilizar las DNA polimerasas 1733 01:07:27,000 --> 01:07:29,000 a que aguanten 1734 01:07:29,000 --> 01:07:31,000 mejor, ¿por qué? 1735 01:07:31,000 --> 01:07:33,000 porque como vamos a ver ahora 1736 01:07:33,000 --> 01:07:35,000 voy a cambiar 1737 01:07:35,000 --> 01:07:37,000 el programa de termociclador 1738 01:07:37,000 --> 01:07:39,000 y la fase de extensión de 72 grados 1739 01:07:39,000 --> 01:07:41,000 la tengo que alargar muchísimo 1740 01:07:41,000 --> 01:07:43,000 eso significa 1741 01:07:43,000 --> 01:07:45,000 que la polimerasa va a estar mucho más 1742 01:07:45,000 --> 01:07:47,000 tiempo a altas temperaturas 1743 01:07:47,000 --> 01:07:49,000 ¿de acuerdo? por tanto 1744 01:07:49,000 --> 01:07:51,000 añado glicerol para proteger las polimerasas 1745 01:07:51,000 --> 01:07:53,000 y estabilizarlas, y por último 1746 01:07:53,000 --> 01:07:55,000 añado en la mezcla de reacción 1747 01:07:55,000 --> 01:07:57,000 concentraciones bajas de glucopotasio 1748 01:07:57,000 --> 01:07:59,000 ¿de acuerdo? 1749 01:07:59,000 --> 01:08:01,000 en el tampón de reacción 1750 01:08:01,000 --> 01:08:03,000 no se sabe muy bien 1751 01:08:03,000 --> 01:08:05,000 por qué 1752 01:08:05,000 --> 01:08:07,000 las bajas 1753 01:08:07,000 --> 01:08:09,000 concentraciones de potasio favorecen 1754 01:08:09,000 --> 01:08:11,000 que se amplifiquen bien los fragmentos 1755 01:08:11,000 --> 01:08:13,000 grandes, pero experimentalmente 1756 01:08:13,000 --> 01:08:15,000 se ve que es así, ¿de acuerdo? 1757 01:08:15,000 --> 01:08:17,000 bajas concentraciones de potasio 1758 01:08:17,000 --> 01:08:19,000 se amplifican mejor los grandes fragmentos 1759 01:08:19,000 --> 01:08:21,000 y por último tenemos la que llamamos 1760 01:08:21,000 --> 01:08:23,000 PCR de alta fidelidad 1761 01:08:23,000 --> 01:08:25,000 ¿cuándo haremos una PCR de alta fidelidad? 1762 01:08:25,000 --> 01:08:27,000 la PCR de alta fidelidad 1763 01:08:27,000 --> 01:08:29,000 la vamos a utilizar 1764 01:08:29,000 --> 01:08:31,000 cuando nos interese 1765 01:08:31,000 --> 01:08:33,000 reutilizar el amplicón 1766 01:08:33,000 --> 01:08:35,000 es decir, hago la PCR 1767 01:08:35,000 --> 01:08:37,000 y del gel de agarosa 1768 01:08:37,000 --> 01:08:39,000 de este gel de agarosa 1769 01:08:39,000 --> 01:08:41,000 yo puedo 1770 01:08:41,000 --> 01:08:43,000 aislar esta banda, la corto 1771 01:08:43,000 --> 01:08:45,000 con un bisturí 1772 01:08:45,000 --> 01:08:47,000 aíslo y purifico ese DNA 1773 01:08:47,000 --> 01:08:49,000 amplificado porque lo voy a utilizar 1774 01:08:49,000 --> 01:08:51,000 para más experimentos 1775 01:08:51,000 --> 01:08:53,000 en ese caso me interesa 1776 01:08:53,000 --> 01:08:55,000 que la secuencia 1777 01:08:55,000 --> 01:08:57,000 de todos los fragmentos amplificados 1778 01:08:57,000 --> 01:08:59,000 sea perfecta y la polimerasa 1779 01:08:59,000 --> 01:09:01,000 no cometa errores 1780 01:09:01,000 --> 01:09:03,000 eso es muy importante, ¿de acuerdo? 1781 01:09:03,000 --> 01:09:05,000 y entonces 1782 01:09:05,000 --> 01:09:07,000 ¿qué variaciones 1783 01:09:07,000 --> 01:09:09,000 vamos a añadir 1784 01:09:09,000 --> 01:09:11,000 para hacer una PCR de alta fidelidad? 1785 01:09:11,000 --> 01:09:13,000 primero, vamos a 1786 01:09:13,000 --> 01:09:15,000 utilizar DNA polimerasas 1787 01:09:15,000 --> 01:09:17,000 con 1788 01:09:17,000 --> 01:09:19,000 actividad correctora, siempre 1789 01:09:19,000 --> 01:09:21,000 son las que llamamos, la primera que salió 1790 01:09:21,000 --> 01:09:23,000 fue la tag gold 1791 01:09:23,000 --> 01:09:25,000 la tag dorada 1792 01:09:25,000 --> 01:09:27,000 es decir, es una polimerasa que además de polimerasa 1793 01:09:27,000 --> 01:09:29,000 es, ella misma 1794 01:09:29,000 --> 01:09:31,000 puede ir corrigiendo actividad exonucleasa 1795 01:09:33,000 --> 01:09:35,000 ¿de acuerdo? y en segundo lugar 1796 01:09:35,000 --> 01:09:37,000 favorecer las condiciones 1797 01:09:37,000 --> 01:09:39,000 de mayor fidelidad 1798 01:09:39,000 --> 01:09:41,000 ¿de acuerdo? 1799 01:09:41,000 --> 01:09:43,000 enzimática, por tanto, vamos a intentar 1800 01:09:43,000 --> 01:09:45,000 poner las condiciones 1801 01:09:45,000 --> 01:09:47,000 para que la DNA polimerasa 1802 01:09:47,000 --> 01:09:49,000 no cometa errores, ¿cómo? 1803 01:09:49,000 --> 01:09:51,000 ajustando el pH, fundamentalmente 1804 01:09:51,000 --> 01:09:53,000 ajustando el pH, ¿de acuerdo? 1805 01:09:53,000 --> 01:09:55,000 algunas enzimas presentan 1806 01:09:55,000 --> 01:09:57,000 mayor fidelidad, hay que ver cuál es nuestra tag 1807 01:09:57,000 --> 01:09:59,000 polimerasa, si es la gold o cuál 1808 01:09:59,000 --> 01:10:01,000 porque hay muchísimas 1809 01:10:01,000 --> 01:10:03,000 y hay polimerasas que trabajan 1810 01:10:03,000 --> 01:10:05,000 mejor, de forma más fiel 1811 01:10:05,000 --> 01:10:07,000 a un pH bajo 1812 01:10:07,000 --> 01:10:09,000 más bajo de lo habitual, más bajo 1813 01:10:09,000 --> 01:10:11,000 de 8, y hay otras que tienen que ser al revés 1814 01:10:11,000 --> 01:10:13,000 un poquito más básico, un poquito 1815 01:10:13,000 --> 01:10:15,000 más elevado de 9, ¿de acuerdo? 1816 01:10:15,000 --> 01:10:17,000 entonces, dependiendo de la polimerasa que utilicemos 1817 01:10:17,000 --> 01:10:19,000 de alta fidelidad, pondremos un pH 1818 01:10:19,000 --> 01:10:21,000 u otro, y, en segundo lugar 1819 01:10:21,000 --> 01:10:23,000 el magnesio 1820 01:10:23,000 --> 01:10:25,000 hay que dar con la concentración 1821 01:10:25,000 --> 01:10:27,000 de magnesio, un exceso de magnesio 1822 01:10:27,000 --> 01:10:29,000 inhibe la 1823 01:10:29,000 --> 01:10:31,000 fidelidad, y por tanto hace que 1824 01:10:31,000 --> 01:10:33,000 la polimerasa cometa más errores 1825 01:10:33,000 --> 01:10:35,000 entonces, experimentalmente 1826 01:10:35,000 --> 01:10:37,000 habría que dar con el pH 1827 01:10:37,000 --> 01:10:39,000 adecuado y la concentración de magnesio 1828 01:10:39,000 --> 01:10:41,000 adecuada, ¿de acuerdo?