1 00:00:00,000 --> 00:00:07,120 Bien, vamos a ver la última parte del tema 6 sobre las técnicas de PCR. 2 00:00:07,120 --> 00:00:12,480 Si recordáis, el último día estuvimos viendo la PCR convencional, que es una técnica de 3 00:00:12,480 --> 00:00:19,040 PCR la más sencilla y la de uso rutinario en los laboratorios. 4 00:00:19,040 --> 00:00:22,120 Vamos a ver algunas modificaciones, otras técnicas de PCR. 5 00:00:22,120 --> 00:00:28,240 La primera de ellas es la PCR que llamamos anidada o nested PCR en inglés. 6 00:00:28,240 --> 00:00:30,040 ¿En qué consiste la PCR anidada? 7 00:00:30,040 --> 00:00:36,520 La PCR anidada consiste en realizar dos PCR simultáneas, seguidas, perdón, simultáneas 8 00:00:36,520 --> 00:00:38,520 no, sucesivas. 9 00:00:38,520 --> 00:00:42,880 Dos reacciones de PCR que van acopladas, que son sucesivas, de tal manera que voy a hacer 10 00:00:42,880 --> 00:00:50,600 una primera PCR con una pareja de primers y una segunda PCR a continuación en la que 11 00:00:50,600 --> 00:00:56,040 voy a utilizar como DNA molde los productos de amplificación de la primera. 12 00:00:57,040 --> 00:00:58,040 ¿De acuerdo? 13 00:00:58,040 --> 00:01:02,600 Para este tipo de PCR, ¿cuándo la utilizamos, la PCR anidada? 14 00:01:02,600 --> 00:01:07,840 Cuando tenemos problemas de sensibilidad o de especificidad, es decir, cuando hay problemas 15 00:01:07,840 --> 00:01:12,320 de sensibilidad, es decir, tenemos poco DNA, ¿de acuerdo? 16 00:01:12,320 --> 00:01:16,920 La muestra hemos podido extraer poquito DNA porque había poquitas células en la muestra 17 00:01:16,920 --> 00:01:23,760 de un paciente, por ejemplo, y por tanto nos está dando una PCR con muy bajo rendimiento. 18 00:01:23,920 --> 00:01:29,400 Esto significa que aunque ha amplificado la PCR, ha amplificado con un bajo rendimiento, 19 00:01:29,400 --> 00:01:34,160 hay pocas copias y me cuesta mucho analizarlas, ¿de acuerdo? 20 00:01:34,160 --> 00:01:39,520 Por tanto, si tengo baja sensibilidad, puedo utilizar la PCR anidada, que vamos a ver ahora 21 00:01:39,520 --> 00:01:40,520 en qué consiste. 22 00:01:40,520 --> 00:01:47,400 Pero también la puedo utilizar si tengo problemas de inespecificidad, es decir, no veo una única 23 00:01:47,400 --> 00:01:51,960 banda en el gel de agarosa, sino que veo varias bandas y por tanto los primers se han ido 24 00:01:51,960 --> 00:01:58,760 uniendo de forma inespecífica a muchos sitios del DNA molde, ¿de acuerdo? 25 00:01:58,760 --> 00:02:03,640 Tanto para aumentar la sensibilidad como para aumentar la especificidad, yo puedo utilizar 26 00:02:03,640 --> 00:02:05,900 la PCR anidada. 27 00:02:05,900 --> 00:02:13,080 Como decía antes, para poder realizar la PCR anidada necesito dos parejas de primers, 28 00:02:13,080 --> 00:02:19,960 unos primers que llamamos externos y unos primers internos, externos al fragmento del 29 00:02:19,960 --> 00:02:24,880 amplicón, al fragmento que quiero amplificar, el de interés, y unos cebadores internos 30 00:02:24,880 --> 00:02:30,760 que son los que van a amplificar el fragmento de interés. 31 00:02:30,760 --> 00:02:37,000 Estos cebadores externos los voy a utilizar en la primera PCR que realizo, ¿de acuerdo? 32 00:02:37,000 --> 00:02:44,480 Para esta primera PCR voy a utilizar el DNA molde que tengo poquito concentrado, el que 33 00:02:44,480 --> 00:02:50,840 he extraído, y una vez haya acabado esa primera PCR, cogeré esos amplicones, los 34 00:02:50,840 --> 00:02:57,600 voy a utilizar como DNA molde para una segunda PCR en la cual utilizaré una segunda pareja 35 00:02:57,600 --> 00:03:03,640 de primers que son los cebadores internos, ¿de acuerdo? 36 00:03:03,640 --> 00:03:09,560 Por tanto, para la primera PCR, si este es mi fragmento de interés, el que me interesa 37 00:03:09,560 --> 00:03:15,760 amplificar, y este es el DNA molde que, por ejemplo, lo tengo a una concentración muy 38 00:03:15,760 --> 00:03:21,400 baja, he podido extraer poco DNA, o lo he utilizado en otras PCRs pero me ha dado mucha 39 00:03:21,400 --> 00:03:29,880 inespecificidad, utilizo este DNA molde con esta pareja de primers externos, ¿de acuerdo? 40 00:03:29,880 --> 00:03:36,280 Externos significa que están el forward bastante por encima y el reverse bastante por debajo 41 00:03:36,280 --> 00:03:40,680 del fragmento que quiero amplificar, por eso se le llaman externos. 42 00:03:40,680 --> 00:03:48,520 Realizo la PCR y yo voy a obtener en mi tubo de PCR una serie de amplicones. 43 00:03:48,520 --> 00:03:54,320 Estos amplicones, como tengo poquito DNA, seguramente en un gel de agarosa no soy capaz 44 00:03:54,320 --> 00:03:59,160 de detectarlo porque se han amplificado poca cantidad. 45 00:03:59,160 --> 00:04:00,160 ¿Por qué? 46 00:04:00,160 --> 00:04:02,920 Porque el DNA estaba poco concentrado. 47 00:04:02,920 --> 00:04:10,120 Ahora parto de estos amplicones y los voy a utilizar como DNA molde para una segunda 48 00:04:10,120 --> 00:04:12,160 reacción de PCR. 49 00:04:12,160 --> 00:04:18,680 En esta segunda reacción de PCR voy a utilizar la segunda pareja de primers, como veis aquí, 50 00:04:18,680 --> 00:04:27,280 es la pareja interna, que es la que me va a permitir amplificar el fragmento que a mí 51 00:04:27,280 --> 00:04:28,640 me interesaba. 52 00:04:28,800 --> 00:04:34,760 Si os dais cuenta, gracias a haber realizado una primera PCR, imaginaos que yo tenía de 53 00:04:34,760 --> 00:04:42,920 DNA molde, voy a hacerlo así como si fuera una caricatura, tenía 100 copias, ¿de acuerdo? 54 00:04:42,920 --> 00:04:49,080 Y ahora he obtenido una cantidad exponencialmente mayor de amplicones. 55 00:04:49,080 --> 00:04:54,640 En lugar de 100, pues a lo mejor lo que tengo ahora es un millón de copias de amplicón 56 00:04:54,640 --> 00:04:59,120 y esto lo voy a utilizar como DNA molde en la segunda amplificación, de tal manera que 57 00:04:59,120 --> 00:05:05,440 ahora, después de la segunda PCR, la cantidad de amplicón que yo detecto de mi fragmento 58 00:05:05,440 --> 00:05:11,440 de interés sí que la puedo detectar en un gel de agarosa, ¿se entiende? 59 00:05:11,440 --> 00:05:16,200 Por tanto la PCR anidada la voy a utilizar cuando tengo problemas de sensibilidad y o 60 00:05:16,200 --> 00:05:20,920 problemas de especificidad, ¿de acuerdo? 61 00:05:20,920 --> 00:05:21,920 Muy bien. 62 00:05:21,920 --> 00:05:24,000 ¿Por qué también para problemas de especificidad? 63 00:05:24,360 --> 00:05:28,880 Porque si os dais cuenta, gracias a esta primera PCR, el DNA molde que pongo en la segunda 64 00:05:28,880 --> 00:05:36,800 PCR es este fragmento único y me quito de en medio todo el DNA que tengo por aquí y 65 00:05:36,800 --> 00:05:38,000 por aquí, ¿vale? 66 00:05:38,000 --> 00:05:43,360 Y todas las moléculas, todos los cromosomas de DNA que tengo, por ejemplo, en células 67 00:05:43,360 --> 00:05:48,240 eucariotas me lo he quitado de en medio, de tal manera que en la segunda PCR estoy metiendo 68 00:05:48,240 --> 00:05:54,360 un fragmento muy pequeñito de todo el genoma de las células eucariotas y por tanto, si 69 00:05:54,360 --> 00:05:58,440 tenía problemas de especificidad, aquí los voy a perder, ya no voy a tener problemas 70 00:05:58,440 --> 00:06:06,120 de especificidad porque estos cebadores forward y reverse, los primers internos, esta pareja 71 00:06:06,120 --> 00:06:12,640 de primers internos, solamente pueden unirse a este DNA molde, ¿de acuerdo? 72 00:06:12,640 --> 00:06:17,560 Y por tanto disminuye mucho la inespecificidad. 73 00:06:17,560 --> 00:06:24,160 Una segunda técnica de PCR es lo que llamamos la PCR múltiple o en inglés multiplex PCR, 74 00:06:24,160 --> 00:06:25,160 ¿de acuerdo? 75 00:06:25,160 --> 00:06:32,320 Que consiste ni más ni menos que hacer una PCR pero en lugar de poner una pareja de primers, 76 00:06:32,320 --> 00:06:36,440 voy a poner dos parejas de primers o tres, ¿de acuerdo? 77 00:06:36,440 --> 00:06:37,440 ¿Para qué? 78 00:06:37,440 --> 00:06:45,560 Para amplificar más de una secuencia de DNA y en la misma PCR obtener dos, tres o cuatro 79 00:06:45,560 --> 00:06:49,480 fragmentos amplificados a la vez, ¿de acuerdo? 80 00:06:49,480 --> 00:06:55,760 Para que esto lo pueda realizar, la pareja de primers debe cumplir varios requisitos, 81 00:06:55,760 --> 00:07:01,200 el primero es que deben tener la misma temperatura de anilin, claro, si una pareja de primers 82 00:07:01,200 --> 00:07:08,440 su temperatura de anilin es 55 y la otra es 58, ¿cuál de las dos temperaturas pongo 83 00:07:08,440 --> 00:07:13,080 en el termociclador, en la programación del termociclador? 84 00:07:13,080 --> 00:07:14,080 Sería un lío. 85 00:07:14,080 --> 00:07:20,040 Por lo tanto, las dos o tres parejas de primers que utilice deben tener la misma temperatura 86 00:07:20,040 --> 00:07:21,040 de anilin. 87 00:07:21,040 --> 00:07:26,640 En segundo lugar, los amplicones deben ser muy diferentes de tamaños, de tal manera 88 00:07:26,640 --> 00:07:35,560 que cuando yo corra las PCRs en el gel de agarosa, vea de forma clara y nítida dos 89 00:07:35,560 --> 00:07:41,280 o tres bandas completamente diferentes, de tamaño muy diferentes, claro, si los tamaños 90 00:07:41,280 --> 00:07:46,120 son muy parecidos, las bandas van a sola par en el gel de agarosa y no voy a ser capaz 91 00:07:46,120 --> 00:07:47,120 de diferenciarlas. 92 00:07:47,120 --> 00:07:53,920 Y por último, que entre los cuatro primers, imaginaos que pongo dos parejas de primers, 93 00:07:53,920 --> 00:07:58,720 tendré dos forward y dos reverse, que entre ellos no haya hibridación cruzada y no se 94 00:07:58,720 --> 00:08:06,560 formen primer dimers, dimeros de primers que me puedan secuestrar los primers y por tanto 95 00:08:06,560 --> 00:08:11,200 me den problemas de bajo rendimiento, ¿de acuerdo? 96 00:08:12,120 --> 00:08:17,760 Por tanto, estas parejas de primers hay que diseñarlas muy bien para que no haya hibridación, 97 00:08:17,760 --> 00:08:24,080 para que amplifiquen amplicones muy diferentes de tamaño y la temperatura de anilin sea 98 00:08:24,080 --> 00:08:27,960 la misma, ¿de acuerdo? 99 00:08:27,960 --> 00:08:35,720 La aplicación más sencilla de PCR múltiple es aquella en la que en el mismo tubo de la 100 00:08:35,720 --> 00:08:41,360 PCR con la muestra del paciente voy a incorporar el control positivo, que es lo que llamamos 101 00:08:41,360 --> 00:08:45,560 un control positivo interno, ¿de acuerdo? 102 00:08:45,560 --> 00:08:50,600 Control positivo interno no es ni más ni menos que poner en la mezcla de reacción donde 103 00:08:50,600 --> 00:08:58,960 está el DNA molde del paciente una pareja de primers que yo sé que amplifican una secuencia 104 00:08:58,960 --> 00:09:02,560 control que van a amplificar sí o sí. 105 00:09:02,560 --> 00:09:08,240 De tal manera que ya no necesito poner, si os acordáis de lo que veíamos en la clase 106 00:09:08,240 --> 00:09:14,480 anterior, un tubo de PCR con el DNA de cada paciente y añadir un control positivo y un 107 00:09:14,480 --> 00:09:23,040 control negativo, sino que solamente añado a cada uno de los tubos que llevan el DNA 108 00:09:23,040 --> 00:09:27,800 del paciente añado los primers del control positivo y ya no tengo que poner un tubo de 109 00:09:27,800 --> 00:09:32,320 control positivo y un tubo de control negativo, ¿de acuerdo? 110 00:09:32,640 --> 00:09:39,600 De esta manera, con esta PCR múltiple, por un lado, me evito de tener que preparar un 111 00:09:39,600 --> 00:09:49,880 control positivo y un control negativo porque lo veo todo en el mismo gel y al correr cada 112 00:09:49,880 --> 00:09:52,520 una de las muestras de los pacientes, como vemos aquí. 113 00:09:52,520 --> 00:09:58,680 De tal manera que, en segundo lugar, yo podría obtener en una PCR múltiple de este estilo 114 00:09:58,680 --> 00:10:04,520 tres posibles resultados, un resultado positivo, un resultado negativo o un resultado no válido. 115 00:10:04,520 --> 00:10:07,320 ¿De acuerdo? 116 00:10:07,320 --> 00:10:16,240 Fijaos, en este gel hicieron un experimento con la muestra de ocho pacientes y en cada 117 00:10:16,240 --> 00:10:20,880 uno de los tubos de PCR metieron dos parejas de primers. 118 00:10:20,880 --> 00:10:26,760 La pareja de primers que amplifica un fragmento más pequeño, este de aquí, es la pareja 119 00:10:26,840 --> 00:10:29,280 de primers que corresponde al control positivo. 120 00:10:29,280 --> 00:10:35,160 Si os dais cuenta, todos los pacientes, en todos los pacientes, en todos los DNAs, esta 121 00:10:35,160 --> 00:10:42,160 banda tiene que amplificar sí o sí, pero además añadieron la pareja de primers específica 122 00:10:42,160 --> 00:10:45,200 para el gen que querían detectar. 123 00:10:45,200 --> 00:10:53,600 Si os dais cuenta, en el paciente 1, 2, 3 y 8, el resultado es positivo, es decir, los 124 00:10:53,600 --> 00:11:01,480 pacientes tienen el gen, tened cuenta, tienen el gen, pero además es el resultado positivo 125 00:11:01,480 --> 00:11:07,280 y me lo puedo creer porque también ha amplificado el control positivo. 126 00:11:07,280 --> 00:11:14,660 Los pacientes 4, 5 y 6 y 7 me dan un resultado negativo, si os dais cuenta, no ha amplificado 127 00:11:14,660 --> 00:11:19,760 la banda específica, yo diría, estos pacientes son negativos para ese gen. 128 00:11:19,760 --> 00:11:25,200 Imaginaos que estoy haciendo un análisis del coronavirus, me lo invento, yo diría, 129 00:11:25,200 --> 00:11:33,960 el paciente 1, 2, 3 y 8 son positivos, los pacientes 4, 5, 6 y 7 son negativos porque 130 00:11:33,960 --> 00:11:42,360 no detecto el DNA del virus, del coronavirus, ¿de acuerdo? 131 00:11:42,360 --> 00:11:45,320 ¿Cuándo diré que el resultado no es válido? 132 00:11:45,320 --> 00:11:49,520 Cuando no se amplifique la banda del control. 133 00:11:49,520 --> 00:11:58,360 Imaginaos que en el paciente 1 observo la banda específica, pero no observo esta. 134 00:11:58,360 --> 00:12:01,440 Este resultado no me lo puedo creer, ¿por qué? 135 00:12:01,440 --> 00:12:06,120 Porque esta banda de aquí, la del control, tendría que haber amplificado sí o sí. 136 00:12:06,120 --> 00:12:12,920 Si no ha amplificado es que ha habido algún problema, algún problema en este tubo o con 137 00:12:12,920 --> 00:12:13,920 esta muestra. 138 00:12:13,920 --> 00:12:17,560 Por tanto, esta muestra la tendría que repetir. 139 00:12:17,560 --> 00:12:24,000 Por tanto, con esta PCR múltiple en la cual incorporo una segunda pareja de primers, además 140 00:12:24,000 --> 00:12:30,400 del primer específico correspondiente a esta segunda pareja a un control positivo interno, 141 00:12:30,400 --> 00:12:36,600 hace que en la misma muestra con el mismo DNA del paciente y en el mismo tubo con la 142 00:12:36,600 --> 00:12:41,840 misma PCR yo pueda decir si el resultado es positivo, si es negativo o incluso si no fuera 143 00:12:41,840 --> 00:12:47,600 válido y hubiera que repetir, ¿de acuerdo? 144 00:12:47,600 --> 00:12:51,600 Y después tenemos la PCR con transcripción inversa. 145 00:12:51,600 --> 00:12:54,340 Se utiliza muchísimo. 146 00:12:54,340 --> 00:12:59,440 Ya sabemos que la DNA polimerasa estermoestable utiliza como molde DNA. 147 00:12:59,440 --> 00:13:05,280 ¿Qué es lo que ocurre si lo que yo quiero hacer es una PCR no de un DNA molde, sino 148 00:13:05,280 --> 00:13:10,500 de un RNA, por ejemplo, de un RNA mensajero de la célula? 149 00:13:10,500 --> 00:13:17,000 Como la DNA polimerasa solamente, estas DNA polimerasas termoestables solamente utilizan 150 00:13:17,000 --> 00:13:27,940 como molde DNA, este RNA mensajero que quiero detectar y amplificar por PCR tengo que pasarlo 151 00:13:27,940 --> 00:13:32,180 y transformarlo primero en DNA. 152 00:13:32,180 --> 00:13:39,600 Para ello utilizo la retrotranscriptasa, ¿de acuerdo?, o transcriptasa inversa, que si 153 00:13:39,600 --> 00:13:45,340 os acordáis, si os acordáis que ya lo vimos en temas anteriores, la transcriptasa inversa 154 00:13:45,340 --> 00:13:54,720 es una DNA polimerasa RNA dependiente que tienen los retrovirus, por ejemplo, el virus 155 00:13:54,720 --> 00:14:03,480 del SIDA es un retrovirus, tiene su genoma es RNA, cuando infecta una célula, inyecta 156 00:14:03,480 --> 00:14:10,560 también la infecta con el RNA, inyecta la retrotranscriptasa dentro de la célula, transforma 157 00:14:10,560 --> 00:14:22,040 su RNA en un DNA que llamamos cDNA, que es DNA copia o complementario y es este DNA complementario 158 00:14:22,040 --> 00:14:29,760 el que el virus integra para que pase desapercibido dentro de la célula eucariota, ¿de acuerdo? 159 00:14:29,760 --> 00:14:33,400 Por encima la retrotranscriptasa la podemos utilizar en el laboratorio, de tal manera 160 00:14:33,400 --> 00:14:41,400 que yo para poder realizar una RT-PCR voy a hacer dos pasos, un primer paso previo en 161 00:14:41,400 --> 00:14:47,680 el cual voy a coger el RNA que he extraído, ¡ojo!, y esto es importante, yo no voy a 162 00:14:47,680 --> 00:14:53,200 extraer DNA, sino que yo de las células del tejido que tengo que analizar voy a extraer 163 00:14:53,200 --> 00:15:01,360 el RNA, no lo hemos visto como se hace, pero extraigo el RNA y a partir de este RNA extraído 164 00:15:01,360 --> 00:15:08,480 hago un primer paso de retrotranscripción o transcripción inversa con la RT, de tal 165 00:15:08,480 --> 00:15:15,320 manera que ese RNA lo transformo en su DNA copia o DNA complementario y este DNA complementario 166 00:15:15,320 --> 00:15:22,880 es el que voy a utilizar ahora sí como DNA molde para el segundo paso que es la PCR convencional 167 00:15:22,880 --> 00:15:31,960 normal, ¿de acuerdo? Bueno, no es una PCR convencional normal, sino que ahora veremos 168 00:15:31,960 --> 00:15:39,360 en qué se diferencia, ¿de acuerdo? Entonces estos dos pasos puedo realizarlos en tubos 169 00:15:39,360 --> 00:15:45,400 diferentes, por tanto primero hago en un tubito el cDNA y una vez ya tengo el cDNA en otro 170 00:15:45,400 --> 00:15:52,520 tubito hago la PCR o hay sistemas actualmente donde puedo hacerlo todo en el mismo tubo 171 00:15:52,520 --> 00:15:58,280 y a la vez, ¿de acuerdo? De tal manera que en el mismo tubo lo meto en el termociclador 172 00:15:58,280 --> 00:16:04,160 con un programa para sintetizar cDNA y después cambio el programa del termociclador sin ni 173 00:16:04,160 --> 00:16:09,840 siquiera abrir el termociclador, pongo el programa de la PCR y me hace la PCR en el 174 00:16:09,840 --> 00:16:18,240 mismo tubo, ¿de acuerdo? Muy importante, la transcriptase inversa como es una DNA polimerasa 175 00:16:18,240 --> 00:16:25,720 RNA dependiente requiere un cebador, si no hay cebador no puede sintetizar, de tal manera 176 00:16:25,720 --> 00:16:32,560 que para la transcripción inversa además de la encima de la transcriptase inversa o 177 00:16:32,560 --> 00:16:41,200 RT tengo que añadir un único cebador. Este cebador se unirá al RNA de tal manera que 178 00:16:41,200 --> 00:16:47,040 ahora sí que tengo ya una zona, una región de bicatenaria y la transcriptase inversa 179 00:16:47,040 --> 00:16:56,040 que es una DNA polimerasa RNA dependiente se unirá y se sintetizará un DNA complementario. 180 00:16:56,040 --> 00:17:05,720 Con este DNA complementario después de naturalizarlo es el que yo voy a utilizar para hacer mi 181 00:17:05,720 --> 00:17:19,840 PCR, ¿de acuerdo? Para hacer la PCR. Muy bien. Este cebador lo puedo diseñar de tal 182 00:17:19,840 --> 00:17:27,600 manera que gracias a este cebador yo pueda amplificar todos los RNAs de la célula, transformarlos 183 00:17:27,600 --> 00:17:37,280 a cDNAs o incluso un único RNA mensaje. ¿Por qué? Porque para la transcripción 184 00:17:37,280 --> 00:17:43,920 inversa del RNA molde yo puedo utilizar tres estrategias, tres primers diferentes. El primer 185 00:17:43,920 --> 00:17:48,200 tipo de primers que puedo utilizar son lo que llamamos los random priming. Los random 186 00:17:48,200 --> 00:17:55,880 priming son hexanucleótidos degenerados, son primers de seis nucleótidos, por tanto 187 00:17:55,880 --> 00:18:00,360 son primers tremendamente pequeños. ¿Y por qué le llamamos degenerados? Porque están 188 00:18:00,360 --> 00:18:07,720 hechos al azar. La secuencia de primers es al azar. Son seis nucleótidos que los genera 189 00:18:07,720 --> 00:18:13,160 una máquina, los generamos artificialmente en el laboratorio. De tal manera que tengo 190 00:18:13,160 --> 00:18:20,160 una mezcla, cuando hablo de un primer random no es ni más ni menos que una mezcla de primers 191 00:18:20,160 --> 00:18:28,640 pequeñitos de seis nucleótidos de secuencia random, aleatoria. Claro, cuando yo ponga 192 00:18:28,640 --> 00:18:36,400 estos primers se van a pegar a cualquier tipo del RNA que yo he extraído. RNA ribosómico, 193 00:18:36,400 --> 00:18:43,640 mensajero, RNA de transferencia, por tanto, utilizando la estrategia de primers random 194 00:18:43,640 --> 00:18:52,760 aleatorios voy a transformar en cDNA todos los RNAs de la célula. ¿Qué ocurre si lo 195 00:18:52,760 --> 00:18:58,200 que yo quiero es amplificar solo los mensajeros? Acordaos que el RNA ribosómico es el 80% 196 00:18:58,200 --> 00:19:04,080 del RNA de las células y yo lo que quiero amplificar es un mensajero. Utilizo una segunda 197 00:19:04,080 --> 00:19:09,880 estrategia que es utilizar lo que llamamos un primer oligo de T, que no es ni más ni 198 00:19:09,880 --> 00:19:17,520 menos que un primer en el que tengo oligo unas cuantos timinas. Son timinas. Es un primer todo 199 00:19:17,520 --> 00:19:28,040 de timinas. Puede tener 14, 16, 18 hasta 22 timinas. ¿Cómo este primer oligo de T solamente 200 00:19:28,040 --> 00:19:34,680 me amplifica el mensajero? Muy sencillo. Solo amplifica a los mensajeros porque de toda la 201 00:19:34,680 --> 00:19:41,440 secuencia de los RNAs un oligo de T es complementario a la cola polia, si os dais cuenta. 202 00:19:41,440 --> 00:19:48,640 Los oligo de T, ese cebador oligo de T se va a unir a la cola polia. ¿Qué RNAs de la célula tienen 203 00:19:48,640 --> 00:19:58,680 polia? La cola polia solamente los RNA mensajeros. De tal manera que los oligo de T se van a unir a 204 00:19:58,680 --> 00:20:05,800 la cola polia de todos los RNA mensajeros y la retotranscriptasa va a sintetizar el DNA copia 205 00:20:05,800 --> 00:20:13,760 de todos los RNA mensajeros. ¿De acuerdo? Por tanto, con oligo de T amplificaré todos los mensajeros. 206 00:20:13,760 --> 00:20:20,800 Pero si yo lo que quiero es amplificar de todos los mensajeros solamente uno, el RNA mensajero 207 00:20:20,800 --> 00:20:26,320 de un gen en concreto que quiero estudiar, entonces lo que tengo que hacer es diseñar un primer, 208 00:20:26,320 --> 00:20:34,200 que es lo que han hecho aquí, diseñar un primer que sea específico, único, exclusivo de la 209 00:20:34,200 --> 00:20:41,520 secuencia de ese RNA mensajero. De tal manera que ese cebador no solamente voy a cribar los 210 00:20:41,520 --> 00:20:46,960 RNA ribosómicos, sino que también voy a cribar dentro de los RNA mensajeros para que se una 211 00:20:46,960 --> 00:20:56,680 específicamente a un solo mensajero. De tal manera que el cDNA que obtengo, este cDNA que lo voy a 212 00:20:56,680 --> 00:21:03,960 utilizar como molde para mi PCR, es un único cDNA que procede de un único RNA mensajero. De tal manera 213 00:21:03,960 --> 00:21:12,320 que estos amplicones son tremendamente específicos para un único mensaje. ¿De acuerdo? Muy bien. 214 00:21:12,320 --> 00:21:18,560 Estas otras técnicas, si os dais cuenta, están basadas en la PCR convencional. Cuando hablamos 215 00:21:18,560 --> 00:21:26,240 de yo realizo un ciclo de PCR, estamos hablando de realizo una PCR convencional, pero parto de 216 00:21:26,240 --> 00:21:32,800 material diferente en cada uno de estos tres tipos de PCR. Vamos a ver ahora, en la última parte del 217 00:21:32,800 --> 00:21:41,720 tema, un tipo de PCR completamente diferente. ¿De acuerdo? Es la PCR a tiempo real. ¿Por qué 218 00:21:42,720 --> 00:21:48,680 se llama PCR a tiempo real? Porque todas las PCR que hemos visto en el tema hasta ahora son 219 00:21:48,680 --> 00:21:57,480 reacciones de PCR a punto final o a tiempo final. Es decir, hago la mezcla de reacción, pongo el 220 00:21:57,480 --> 00:22:06,080 MasterMix en los tubos, añado el DNA molde, la pongo en el termociclador, hace toda la PCR y 221 00:22:06,080 --> 00:22:14,520 analizo a tiempo final, después de acabar la PCR, analizo los resultados. ¿La PCR a tiempo real? No. 222 00:22:14,520 --> 00:22:21,280 Voy a monitorizar el proceso de amplificación. ¿Cómo? Voy a utilizar productos fluorescentes y 223 00:22:21,280 --> 00:22:28,400 un termociclador que tiene un lector de fluorescencia. De tal manera que voy a ir 224 00:22:28,400 --> 00:22:37,360 detectando ciclo a ciclo el número de amplicones que se van generando. Y esto es muy importante, 225 00:22:37,360 --> 00:22:43,040 por eso se llama a tiempo real. De tal manera que ciclo a ciclo yo voy a saber, voy a tener un dato 226 00:22:43,040 --> 00:22:51,960 exacto, exacto, de cuántos amplicones se van generando ciclo a ciclo. ¿Cómo lo hago? Utilizando 227 00:22:52,040 --> 00:22:59,040 fluorocromos. ¿De acuerdo? Fluorocromos ya sabéis que son moléculas fluorescentes y por tanto necesito 228 00:22:59,040 --> 00:23:06,120 un termociclador un poquito especial que tenga un lector de fluorescencia. ¿Ventajas? Y esto es 229 00:23:06,120 --> 00:23:15,600 muy importante. Tremendamente rápida. Ya os dije que la PCR convencional aproximadamente 30 ciclos, 230 00:23:15,600 --> 00:23:23,360 son dos horas y media de PCR. Para una PCR a tiempo real, que se suele hacer 35, normalmente 231 00:23:23,360 --> 00:23:32,920 suele hacer 40 ciclos, lo realiza en tres cuartos de hora. Si yo quiero realizar después un análisis 232 00:23:32,920 --> 00:23:40,800 para ver las bandas de fusión, que lo veremos al final, ¿de acuerdo? Se alarga un poquito más y 233 00:23:40,800 --> 00:23:46,920 puede llegar a una hora y media, a una hora tres cuartos. Por tanto es muchísimo más rápido la 234 00:23:46,920 --> 00:23:52,920 detección cualitativa. Segunda ventaja. Los resultados son muchísimo más fidedignos. Es 235 00:23:52,920 --> 00:24:02,080 decir, no voy a ver los resultados en un gel de agarosa que hasta cierto punto puede ser subjetivo 236 00:24:02,080 --> 00:24:08,800 porque yo veo la banda más intensa o menos intensa según mi ojo. Por tanto aquí el resultado es muy 237 00:24:08,800 --> 00:24:15,200 objetivo porque los datos los va a leer un lector de fluorescencia y van a ser datos matemáticos, 238 00:24:15,200 --> 00:24:23,960 ¿de acuerdo? Son datos concretos de cantidad de amplicones, ¿de acuerdo? Y además es tremendamente 239 00:24:23,960 --> 00:24:31,080 más sensible, muchísimo más sensible. Es decir, si os acordáis, si yo el DNA lo tenía muy poquito 240 00:24:31,080 --> 00:24:37,080 concentrado, ya hemos visto antes que tengo que hacer una PCR anidada. Aquí no hace falta. Aquí 241 00:24:37,080 --> 00:24:44,520 la PCR a tiempo real va a detectar el DNA aunque esté muy poquito concentrado. Tercera ventaja. Menor 242 00:24:44,520 --> 00:24:50,760 probabilidad de contaminación, ¿de acuerdo? Yo pongo la mezcla de reacción, pongo el DNA, lo meto en el 243 00:24:50,760 --> 00:24:57,520 termociclador y no vuelvo a tocar. Cuando acaba la PCR tengo todos los datos en el ordenador y los 244 00:24:57,520 --> 00:25:03,520 analizo en el ordenador. No tengo que abrir el tubo, hacer la mezcla, meterlo en el gel de agarosa. 245 00:25:03,520 --> 00:25:10,200 En todo este proceso se puede contaminar el producto de PCR. Y por último, y quizás la más 246 00:25:10,200 --> 00:25:17,440 importante como ventaja, es que puedo obtener datos cuantitativos de dos parámetros. Sé 247 00:25:17,440 --> 00:25:23,480 cuantitativamente, ciclo a ciclo, cuántos amplicones están generando y también puedo 248 00:25:23,480 --> 00:25:32,400 cuantificar la cantidad de DNA inicial que tenía de una forma muy exacta, ¿de acuerdo? Tantos 249 00:25:32,400 --> 00:25:38,680 microgramos de DNA tenía mi muestra, tantos picogramos, etcétera, etcétera. ¿De acuerdo? 250 00:25:38,680 --> 00:25:44,520 Muy bien, ya hemos dicho que utilizamos sistemas fluorescentes para detectar los amplicones. 251 00:25:44,520 --> 00:25:48,640 Primero vamos a hacer una pequeña introducción, que no viene en el libro, sobre qué es la 252 00:25:48,640 --> 00:25:53,840 fluorescencia por si alguno no lo habéis visto. Los sistemas fluorescentes utilizan fluorocromos, 253 00:25:53,840 --> 00:26:00,520 son moléculas de este estilo que tienen muchos anillos aromáticos, ¿vale? Esta me parece, 254 00:26:00,520 --> 00:26:06,600 si no recuerdo mal, es la fluorescina. ¿Qué ventaja o qué característica tienen estas 255 00:26:06,600 --> 00:26:13,800 moléculas de fluorocromos? Que si yo a esta molécula le hago incidir una luz de una longitud 256 00:26:13,800 --> 00:26:19,800 de onda determinada, un láser, ¡bum!, y la irradio con un láser, parte de los electrones 257 00:26:19,800 --> 00:26:27,520 que tienen en estos anillos aromáticos saltan a un orbital de mayor energía. Ya sabéis 258 00:26:27,520 --> 00:26:32,240 que los electrones en los átomos están en los orbitales. Este electrón está tan pancho, 259 00:26:32,240 --> 00:26:40,640 está en su orbital, tranquilo. Si yo lo excito, ¿vale?, porque le hago incidir un rayo láser de 260 00:26:40,640 --> 00:26:47,560 una longitud de onda determinada, capta esa energía y se va a un estado energético superior. 261 00:26:49,280 --> 00:26:57,200 Claro, aquí no puede estar eternamente, sino que este electrón llega un momento que va dando 262 00:26:57,200 --> 00:27:05,400 saltos hasta que vuelve nuevamente a su estado energético donde tendría que estar. ¿Cuál es la 263 00:27:05,400 --> 00:27:10,960 peculiaridad de estos fluorocromos? Que estos electrones, cuando vuelven a su estado inicial, 264 00:27:10,960 --> 00:27:19,760 emiten una luz también. Pero esta luz es de una longitud de onda diferente. Esto de las 265 00:27:19,760 --> 00:27:23,640 longitudes de onda, para los que no habéis visto nunca esto de las longitudes de onda, 266 00:27:23,640 --> 00:27:30,200 no es ni más ni menos que yo voy a excitar con una luz de un color y cuando este electrón vuelva 267 00:27:30,200 --> 00:27:38,880 a su estado va a emitir luz de un color diferente, longitud de onda diferente. ¿De acuerdo? De tal 268 00:27:38,880 --> 00:27:44,960 manera que si yo este tipo de fluorocromos los ilumino con luz de una longitud de onda, 269 00:27:44,960 --> 00:27:52,800 emiten luz de otro color. ¿De acuerdo? Ya sabemos este es el espectro del visible. ¿De acuerdo? 270 00:27:52,800 --> 00:27:57,080 Tendríamos aquí el ultravioleta, el infrarrojo. ¿Por qué le decimos el espectro del visible? 271 00:27:57,080 --> 00:28:01,080 Porque todos estos colores, que son los del arco iris, son los que podemos, son las 272 00:28:01,080 --> 00:28:06,520 longitudes de onda que nuestro ojo humano puede detectar. De tal manera que, en concreto, 273 00:28:06,520 --> 00:28:16,720 la fluoresceína tiene un espectro de absorción, absorbe luz azul y emite luz verde. ¿De acuerdo? 274 00:28:16,720 --> 00:28:22,640 Por tanto, todos los fluorocromos tienen un espectro de absorción, que hay que conocerlo, 275 00:28:22,640 --> 00:28:29,080 para saber con qué luz tengo que irradiarlos y tienen un espectro de emisión, que también tengo 276 00:28:29,080 --> 00:28:35,600 que conocerlo para saber qué color de, qué luz de qué color emiten. Tengo fluorocromos que emiten 277 00:28:35,600 --> 00:28:42,520 en verde, en amarillo, en rojo, etcétera. En concreto, para las PCR se van a utilizar este 278 00:28:42,520 --> 00:28:51,800 tipo de moléculas que son irradiadas, absorben el azul y emiten el verde. ¿De acuerdo? 279 00:28:53,400 --> 00:28:59,280 Muy bien. Para la PCR podemos utilizar sistemas fluorescentes independientes de secuencia o 280 00:28:59,280 --> 00:29:04,200 específicos de secuencia. Los sistemas independientes de secuencia se basan en 281 00:29:04,200 --> 00:29:11,800 emplear fluorocromos, agentes fluorescentes intercalantes. Es decir, que se van a meter 282 00:29:11,800 --> 00:29:18,680 dentro de la doble hélice, entre las puentes de hidrógeno de las bases nitrogenadas del DNA 283 00:29:18,680 --> 00:29:25,600 y ahí se queda. Por tanto, si tengo un DNA monocatenario, porque acabo de desnaturalizar, 284 00:29:25,600 --> 00:29:31,720 estos agentes fluorescentes no pueden intercalarse y, por tanto, no vería fluorescencia. 285 00:29:33,080 --> 00:29:39,760 Pero lo único que necesitan estos agentes fluorescentes es un DNA de doble cadena, 286 00:29:40,080 --> 00:29:45,680 independientemente de la secuencia. Sin embargo, hay otros sistemas que son más específicos de 287 00:29:45,680 --> 00:29:51,360 secuencia y se basan en sondas. Ya conocemos las sondas de hibridación. ¿De acuerdo? Son 288 00:29:51,360 --> 00:29:57,440 sondas que están marcadas con fluorocromos. Las vamos a ver ahora y hibridan específicamente en 289 00:29:57,440 --> 00:30:04,240 un gen. ¿De acuerdo? En la región central del amplicón que yo quiero detectar. Vamos a ver 290 00:30:04,240 --> 00:30:09,440 primero los sistemas de detección independientes y después los específicos de secuencia. ¿De acuerdo? 291 00:30:10,600 --> 00:30:15,760 Los sistemas independientes de secuencia, ya hemos dicho que utilizan agentes intercalantes. Por 292 00:30:15,760 --> 00:30:22,640 tanto, solamente veré fluorescencia cuando tenga el DNA y tenga moléculas bicatenarias. ¿De acuerdo? 293 00:30:22,640 --> 00:30:29,360 De tal manera que, a medida que va avanzando la PCR y aumenta el número de amplicones, acordaos 294 00:30:29,360 --> 00:30:37,160 que tengo fase de desnaturalización, fase de hibridación, fase de extensión. Cuando acaba la 295 00:30:37,160 --> 00:30:44,080 fase de extensión, todos estos agentes intercalantes que yo ya he puesto en la Master 296 00:30:44,080 --> 00:30:51,320 Mix, en la mezcla de reacción, se van a unir a los amplicones. De tal manera que voy a poder 297 00:30:51,320 --> 00:30:58,200 medir la fluorescencia. Por tanto, la fluorescencia la vamos a medir al finalizar la fase de extensión 298 00:30:58,200 --> 00:31:03,800 de cada ciclo. De cada ciclo. Y esto es muy importante. De tal manera que, a medida que 299 00:31:03,800 --> 00:31:12,040 van avanzando los ciclos, 10, 12, 15 ciclos, tengo más amplicones, tengo mayor cantidad de 300 00:31:12,040 --> 00:31:17,120 fluorocromos que se unen a los amplicones y, por tanto, a mayor número de amplicones, mayor 301 00:31:17,120 --> 00:31:24,560 fluorescencia voy detectando. Creo que esto es sencillo de entender. ¿De acuerdo? La gran desventaja 302 00:31:24,560 --> 00:31:30,500 de estos sistemas independientes es que, pues tengo una baja en especificidad. ¿Es así? ¿Por qué? 303 00:31:30,620 --> 00:31:39,100 Porque no son sistemas específicos de un gen, de un amplicón determinado. Igual que si lo son los 304 00:31:39,100 --> 00:31:46,020 primers. De tal manera que se van a unir donde hagan una doble cadena. ¿De acuerdo? El agente 305 00:31:46,020 --> 00:31:50,740 intercalante más utilizado es el CyberGreen. El CyberGreen hay que conocerlo. Es el sistema 306 00:31:50,740 --> 00:31:55,820 de detección independiente más utilizado. Tiene esta fórmula química, esta estructura química, 307 00:31:56,380 --> 00:32:03,860 con anillos aromáticos. Es decir, voy a comenzar la PCR. He puesto en la mezcla de reacción de mi 308 00:32:03,860 --> 00:32:11,460 tubo todos los reactivos. He puesto el CyberGreen y he puesto el DNA. El CyberGreen, como el DNA no 309 00:32:11,460 --> 00:32:18,260 ha empezado la PCR, lo tengo en forma bicatenaria. Se va a unir el CyberGreen. ¿De acuerdo? Se va a 310 00:32:18,260 --> 00:32:24,940 intercalar y el termociclador a ciclo cero, todavía no ha empezado, hace la primera medición de 311 00:32:25,100 --> 00:32:31,420 fluorescencia. Esa medición de fluorescencia es lo que llamamos la fluorescencia basal. ¿De acuerdo? 312 00:32:31,420 --> 00:32:41,820 Correspondiente al DNA molde. Comienza el primer ciclo, desnaturalizo, tengo hebras sencillas y 313 00:32:41,820 --> 00:32:50,900 por tanto el CyberGreen se libera. ¿Tendría en la desnaturalización fluorescencia? No. Segunda 314 00:32:50,900 --> 00:32:58,300 fase, la segunda fase del primer ciclo, hibridan. ¿De acuerdo? Y en la extensión, las polimerasas 315 00:32:58,300 --> 00:33:08,500 extienden. Ahora sí, al final de la extensión, el CyberGreen ve un amplicón, una región larga, 316 00:33:08,500 --> 00:33:15,220 grande, de doble cadena, por tanto se puede intercalar y aquí sí que detectaría fluorescencia. 317 00:33:15,220 --> 00:33:24,740 Podemos decir, a modo para que nos entendamos, que ahora, ahora el termociclador detectaría el 318 00:33:24,740 --> 00:33:32,780 doble de fluorescencia que al principio, puesto que tengo el doble de cadenas bicatenarias. 319 00:33:33,900 --> 00:33:42,460 Comienza el segundo ciclo, desnaturalización, se libera el CyberGreen. Hibridación, extensión. 320 00:33:42,460 --> 00:33:51,460 Ahora, al final de la extensión, nuevamente el CyberGreen encuentra regiones largas de estructuras 321 00:33:51,460 --> 00:33:59,220 bicatenarias, se intercala y nuevamente el CyberGreen emite fluorescencia. ¿De acuerdo? 322 00:33:59,220 --> 00:34:05,540 Esta fluorescencia al final de la extensión la puedo detectar. Si os dais cuenta, teóricamente 323 00:34:05,580 --> 00:34:11,540 la fluorescencia sería el doble que en el ciclo anterior y, si os dais cuenta, 324 00:34:11,540 --> 00:34:16,940 cuatro veces más que al principio y así sucesivamente. ¿De acuerdo? Por tanto, 325 00:34:16,940 --> 00:34:23,980 el CyberGreen es un agente intercalante pero que es inespecífico. Solamente va a detectar 326 00:34:25,140 --> 00:34:33,060 estructuras bicatenarias, se une a ellas. Los sistemas específicos de secuencia tenemos dos 327 00:34:33,060 --> 00:34:38,820 tipos. Las balizas y tenemos las sondas de hidrólisis, que también se le llaman sondas 328 00:34:38,820 --> 00:34:46,380 TACMAN. Ojo, nadie habla de sondas de hidrólisis, todo el mundo habla de sondas TACMAN. TACMAN es 329 00:34:46,380 --> 00:34:53,100 la empresa que las comercializó. Las sondas TACMAN son sondas de hibridación, que las conocemos. 330 00:34:53,100 --> 00:34:58,700 Sondas de hibridación, que ya conocemos lo que son, especificas de un amplicón, del gen de interés 331 00:34:58,700 --> 00:35:03,260 que yo quiero amplificar. Y esta sonda de hibridación se va a unir al amplicón en su 332 00:35:03,260 --> 00:35:09,260 centro, entre el Forward, Primer Forward, y el Primer Reverse. Y se va a unir de forma 333 00:35:09,260 --> 00:35:15,020 tremendamente específica, de tal manera que si esta sonda yo la pongo con el DNA genómico de 334 00:35:15,020 --> 00:35:23,940 una célula, solamente se puede unir a un sitio, que es el centro del gen, la parte central del 335 00:35:23,980 --> 00:35:32,980 gen que yo quiero amplificar. ¿De acuerdo? Estas sondas TACMAN detectan la fluorescencia del 336 00:35:32,980 --> 00:35:38,740 amplicón, y única y exclusivamente del amplicón, como vamos a ver ahora. Por tanto, las sondas 337 00:35:38,740 --> 00:35:45,180 TACMAN son tremendamente específicas, y esta es su gran ventaja. De tal manera que la fluorescencia 338 00:35:45,180 --> 00:35:51,940 que va a medir el termociclador procede no de estructuras bicatenarias, sino que va a corresponder 339 00:35:51,940 --> 00:36:00,700 única y exclusivamente del amplicón, ¿vale? De tal manera que ciclo tras ciclo, a medida que va 340 00:36:00,700 --> 00:36:08,700 aumentando el número de ciclos, específicamente irá aumentando también la fluorescencia. ¿Qué 341 00:36:08,700 --> 00:36:16,060 características tienen estas sondas TACMAN? Pues el extremo 3' de la sonda lo tienen fosforilado, 342 00:36:16,900 --> 00:36:26,300 es decir, lo tienen bloqueado. He puesto un fosfato. ¿De acuerdo? En el carbono 3' de la 343 00:36:26,300 --> 00:36:33,460 pentosa he puesto un grupo fosfato, de tal manera que bloqueo que se pueda unir ahí, como veremos 344 00:36:33,460 --> 00:36:40,260 ahora en el esquema que está en la diapositiva siguiente, impido que la ADNA polimerasa se una 345 00:36:40,420 --> 00:36:46,780 y amplifique. Cosas erróneas, de tal manera que no se pueda amplificar a partir de la sonda. 346 00:36:48,460 --> 00:36:55,260 Y la sonda, segunda característica, está marcada con dos moléculas. Un reporter, un reporter no 347 00:36:55,260 --> 00:36:59,980 es más ni menos que un informador, entre comillas, nadie dice informador, todo el mundo habla de 348 00:36:59,980 --> 00:37:09,100 reporters, en el extremo 5' que es un fluorocromo. Y en el extremo 3', además de que está fosforilado, 349 00:37:09,580 --> 00:37:17,860 se le ha añadido lo que llamamos un quencher. Ya veremos la función del quencher. Son dos 350 00:37:17,860 --> 00:37:24,460 moléculas diferentes. Ojo, el quencher no es un fluorocromo. Veremos la diferencia entre el 351 00:37:24,460 --> 00:37:30,980 reporter y el quencher, ahora lo explicaré en la diapositiva. Y nuevamente, aquí también la 352 00:37:30,980 --> 00:37:38,180 fluorescencia la vamos a ir leyendo al final de la fase de extensión de cada título. ¿De acuerdo? 353 00:37:38,180 --> 00:37:45,580 Entonces, aquí tengo mi sonda TACMAN. Ya hemos dicho que el extremo 3' está fosforilado, 354 00:37:45,580 --> 00:37:52,500 en el extremo 3' tengo un quencher, que es una molécula, y aquí tengo, si os dais cuenta, 355 00:37:52,500 --> 00:38:03,300 el fluorocromo. ¿Cuál es la función del quencher? Absorber la fluorescencia que emite el fluorocromo, 356 00:38:03,300 --> 00:38:10,780 de tal manera que yo esta sonda, si yo la irradio, imaginaos que es una sonda, este 357 00:38:10,780 --> 00:38:18,100 fluorocromo emite en verde, por tanto tiene un aspecto de absorción de azul, irradio con luz 358 00:38:18,100 --> 00:38:26,340 azul y emite luz verde. Pero esta luz verde, en lugar de propagarse, lo que hace es que es 359 00:38:26,340 --> 00:38:33,620 absorbida por el quencher. De tal manera que esta sonda, aunque es fluorescente, yo no lo detecto 360 00:38:33,620 --> 00:38:42,180 porque la fluorescencia que emite el fluorocromo la absorbe el quencher. ¿De acuerdo? Hasta aquí 361 00:38:42,180 --> 00:38:52,660 bien. ¿Cuándo detectaré fluorescencia? Detectaré fluorescencia cuando no tenga un quencher. ¿Vale? 362 00:38:52,660 --> 00:38:58,900 Porque el quencher absorbe esa fluorescencia. Si yo no tuviera el quencher, la fluorescencia que 363 00:38:58,900 --> 00:39:06,780 emite el fluorocromo la detectaría. Y la voy a detectar al final de la fase de extensión. Lo 364 00:39:06,780 --> 00:39:14,100 vamos a ver ahora. Comienza la PCR. Primer ciclo. Desnaturalización. Tengo mi sonda TACMAN y tengo 365 00:39:14,100 --> 00:39:21,260 los primers. ¿De acuerdo? Aquí en este esquema solamente han puesto el primer forward. Bueno, 366 00:39:21,260 --> 00:39:28,420 estaría al revés también. ¿De acuerdo? Hibridación. ¿Cómo es la temperatura de 367 00:39:28,420 --> 00:39:35,100 hibridación? Tanto la sonda de hibridación, la sonda TACMAN, como el primer hibridan. ¿Dónde? 368 00:39:35,100 --> 00:39:40,540 Este hibridaría al principio del amplicón y este ya hemos dicho que suele caer en la región central 369 00:39:40,540 --> 00:39:47,580 del amplicón. Y empieza la extensión. ¿Qué característica tiene la extensión? Es que 370 00:39:47,580 --> 00:39:54,700 la ADNA polimerasa que voy a utilizar tiene actividad exonucleasa. De tal manera que comienza 371 00:39:54,700 --> 00:39:59,940 a extender, a extender, a extender, pero llega un momento que se topa con la sonda TACMAN. ¿Y qué 372 00:39:59,940 --> 00:40:08,300 es lo que hace? Utiliza su actividad exonucleasa 3'-5' y va hidrolizando. Por eso se le llaman 373 00:40:08,300 --> 00:40:14,660 también sondas de hidrólisis. Va hidrolizando, va rompiendo la sonda y va liberando nucleótido a 374 00:40:14,660 --> 00:40:22,740 nucleótido, destruyendo esta sonda. De tal manera que al final de la extensión, una vez haya acabado 375 00:40:22,740 --> 00:40:31,420 la fase de extensión, tendré el amplicón y tendré la sonda hechatrizas. De tal manera que si yo ahora 376 00:40:31,420 --> 00:40:40,460 irradio con luz azul, la fluorescencia sí la puedo detectar. ¿Por qué? Porque el cuencher está 377 00:40:40,460 --> 00:40:47,180 tremendamente lejos. Me acabo de cargar este cuencher. ¿Por qué? Se me olvidó decirlo antes 378 00:40:47,180 --> 00:40:55,140 que porque este cuencher absorbe la fluorescencia, pero la que está en un radio en una distancia muy 379 00:40:55,140 --> 00:41:03,380 cortita. De tal manera que la hidrólisis de la sonda hace que se separen espacialmente, se distancien 380 00:41:03,380 --> 00:41:13,740 fluoro cromo de sonda de cuencher y ahora cuando yo irradie con luz azul sí que podré detectar la 381 00:41:13,740 --> 00:41:20,540 fluorescencia verde porque no está el cuencher que la absorbe. ¿Se entiende? De tal manera que al final 382 00:41:20,540 --> 00:41:28,620 de cada ciclo, al final de la fase de extensión, yo voy a ir detectando la fluorescencia verde. 383 00:41:28,980 --> 00:41:34,300 ¿De acuerdo? Muy bien. ¿Cómo es la cinética de amplificación? Es decir, 384 00:41:35,860 --> 00:41:40,980 la cinética de amplificación se suele estudiar en una curva de amplificación. ¿Cómo es esta curva 385 00:41:40,980 --> 00:41:45,260 de amplificación? Pues no es ni más ni menos que una gráfica. Esto es lo que me saca después de la 386 00:41:45,260 --> 00:41:53,060 pcr de tiempo real, lo que me saca el ordenador, ¿de acuerdo? El programa, en la cual se representa 387 00:41:53,060 --> 00:41:59,820 el número de ciclos, 0, 1 ciclo, el segundo ciclo, hasta ya os he dicho que se suele hacer hasta 35, 388 00:41:59,820 --> 00:42:06,940 más bien 40 ciclos y aquí voy a graficar la fluorescencia que voy detectando. Entonces, 389 00:42:06,940 --> 00:42:15,260 en esta curva de amplificación se distinguen tres regiones. Lo voy a poner aquí porque se 390 00:42:15,260 --> 00:42:20,380 ve un poquito más grande. Una primera región, que es lo que llamamos fase de ruido, en la cual 391 00:42:21,380 --> 00:42:28,060 pues van pasando los ciclos, primero, segundo, tercero, diez ciclos y la cantidad de fluorescencia 392 00:42:28,060 --> 00:42:36,540 que se va generando todavía no es representativa. De tal manera que la llamamos fase de ruido 393 00:42:36,540 --> 00:42:45,100 porque la fluorescencia todavía no es suficiente como para considerarla apreciable. ¿De acuerdo? 394 00:42:45,100 --> 00:42:52,420 Hasta que llega un momento, hay un punto de inflexión en el cual, a medida que van sucediendo 395 00:42:52,420 --> 00:42:59,260 ya los ciclos, la fluorescencia va aumentando. Es lo que llamamos la fase exponencial lineal. 396 00:42:59,260 --> 00:43:05,620 De tal manera que, a cada ciclo, la cantidad de fluorescencia que voy detectando es mucho 397 00:43:05,620 --> 00:43:10,980 mayor, mucho mayor, mucho mayor. Aquí, en esta fase exponencial, es donde se está llevando a 398 00:43:10,980 --> 00:43:20,540 cabo la amplificación exponencial de la PCR. ¿De acuerdo? Y esto acaba, llega a un número de ciclos, 399 00:43:20,540 --> 00:43:27,140 en el cual llegamos a la fase que llamamos de saturación, en la cual, aunque yo vaya aumentando 400 00:43:27,140 --> 00:43:31,780 el número de ciclos, llega un momento que, por mucho que yo vaya amplificando y vaya poniendo 401 00:43:31,780 --> 00:43:40,500 más ciclos, 35, 38, 40 ciclos, la fluorescencia ya no crece más. O sea, ya no puede amplificar más, 402 00:43:40,500 --> 00:43:46,500 ya no se puede amplificar mucho más. Se ha llegado a una saturación. La polimerasa ya no puede 403 00:43:46,500 --> 00:43:52,980 amplificar más. O bien porque se están acabando los reactivos, o bien porque la polimerasa se 404 00:43:52,980 --> 00:43:58,620 está ya inactivando. ¿De acuerdo? Por tanto, la curva y la cinética de la amplificación en una PCR 405 00:43:58,620 --> 00:44:05,820 a tiempo real tiene esta forma de curva sigmoidea. Curva sigmoidea porque tiene forma de S. Una fase 406 00:44:05,820 --> 00:44:11,300 de ruido, una fase exponencial, que es la importante, y una fase de saturación. ¿De acuerdo? 407 00:44:12,700 --> 00:44:23,380 En esta curva yo puedo marcar aquí un umbral. ¿Cuál es este umbral? Es justo, este umbral lo 408 00:44:23,380 --> 00:44:31,020 marco justo en el punto de inflexión que diferencia, ¿vale? Que separa la fase de 409 00:44:31,020 --> 00:44:37,780 ruido de la fase exponencial. ¿De acuerdo? Pues aquí, en este punto de inflexión, yo voy a 410 00:44:37,780 --> 00:44:47,500 determinar lo que llamamos el CT. El CT es el ciclo threshold en inglés. Es decir, es el ciclo 411 00:44:47,500 --> 00:44:57,700 umbral. Es decir, es el ciclo a partir del cual la PCR y la fluorescencia van aumentando de forma 412 00:44:57,700 --> 00:45:07,820 exponencial. ¿De acuerdo? ¿Por qué es importante este ciclo umbral? Es importante este ciclo umbral, 413 00:45:07,820 --> 00:45:15,260 este punto de inflexión, porque me va a permitir la principal aplicación, que es la cuantificación, 414 00:45:15,260 --> 00:45:21,180 que es lo que me permite la PCR a tiempo real. De hecho, la PCR a tiempo real la veréis en muchos 415 00:45:21,180 --> 00:45:29,620 sitios que se le habla de QPCR, PCRQ, PCR cuantitativa. ¿De acuerdo? Y puedo realizar dos 416 00:45:29,620 --> 00:45:35,420 tipos de cuantificaciones, cuantificación absoluta o cuantificación relativa. ¿Cuantificación de qué? 417 00:45:35,420 --> 00:45:44,660 Cuantificación de la cantidad de DNA de partida que tenía. Por ejemplo, en esta gráfica, en esta 418 00:45:44,660 --> 00:45:53,620 gráfica se muestran las curvas de amplificación de PCR cuantitativa, de PCR a tiempo real, de seis 419 00:45:53,620 --> 00:45:59,660 muestras diferentes. ¿Cuál es la diferencia entre estas muestras? La diferencia es que aquí tengo 420 00:45:59,660 --> 00:46:08,700 100 nanogramos de DNA de partida, 10 nanogramos, 1 nanogramo, 0,1 nanogramos, 0,01 nanogramos y 421 00:46:08,700 --> 00:46:14,020 un picogramo. O sea, en cada curva, en cada una de estas PCRs, en cada uno de estos tubos he 422 00:46:14,020 --> 00:46:26,300 utilizado 10 veces menos de DNA. Si os dais cuenta, el threshold cycle, el ciclo umbral, aparece antes 423 00:46:26,300 --> 00:46:36,860 cuanto más concentrado tengo el DNA. Cuanto más DNA tengo en mi tubo, antes, hay un ciclo antes, 424 00:46:36,860 --> 00:46:45,140 antes aparece la fase exponencial. ¿De acuerdo? Necesito menos ciclos para empezar a detectar la 425 00:46:45,140 --> 00:46:51,660 fluorescencia de verdad. ¿Se entiende? De tal manera que si yo tengo muy poquito DNA, prácticamente 426 00:46:51,660 --> 00:47:00,100 me tengo que ir a los 36, 37 ciclos para empezar a detectar la fluorescencia. ¿De acuerdo? De tal 427 00:47:00,100 --> 00:47:09,140 manera que, gracias al ciclo umbral, a la determinación cuantitativa del ciclo umbral, 428 00:47:09,140 --> 00:47:16,380 si os dais cuenta, yo puedo determinar de forma cuantitativa y muy exacta cuánto DNA de partida 429 00:47:16,380 --> 00:47:22,900 tenía. ¿De acuerdo? Esto es una aplicación, la PCR cuantitativa, el poder cuantificar cuánto DNA 430 00:47:22,900 --> 00:47:28,980 tengo en una muestra de forma cuantitativa, tiene muchísimas aplicaciones, muchísimas, 431 00:47:28,980 --> 00:47:37,100 muchísimas. ¿De acuerdo? De tal manera que, si os dais cuenta, yo puedo hacer, gracias a esta PCR 432 00:47:37,100 --> 00:47:43,540 cuantitativa, saber exactamente en una muestra determinada cuánto DNA tengo. ¿De acuerdo? 433 00:47:43,540 --> 00:47:49,580 Entonces, eso puedo hacerlo con una cuantificación absoluta. ¿De acuerdo? La cuantificación absoluta 434 00:47:49,580 --> 00:47:57,420 es que yo voy a poner un DNA que conozco su concentración y voy a poner de ese DNA que 435 00:47:57,420 --> 00:48:02,500 conozco su concentración, porque lo tengo a 100 nanogramos, voy a hacer diluciones seriadas, 436 00:48:02,500 --> 00:48:09,220 si os dais cuenta, que es lo que han hecho aquí, y entre medias, además de estos seis tubos, 437 00:48:09,220 --> 00:48:14,180 que son los seis tubos control de las seis diluciones, voy a meter el séptimo tubo, 438 00:48:14,180 --> 00:48:18,500 que va a ser el tubo con la muestra de mi paciente, del cual yo quiero saber cuánto 439 00:48:18,500 --> 00:48:28,700 DNA tiene. ¿Se entiende? Y pongo en marcha la PCR. Entonces, obtendría estas curvas de amplificación 440 00:48:28,700 --> 00:48:34,500 y obtendría, además, una séptima. Imaginaos que viene por aquí, por donde voy señalando con el 441 00:48:34,500 --> 00:48:42,260 puntero, plum, plum, plum, plum, plum. ¿De acuerdo? Y esa va a ser la curva de mi paciente, del DNA de 442 00:48:42,260 --> 00:48:49,300 mi paciente. De tal manera que, con el threshold, ¿de acuerdo?, con este ciclo umbral y con estos 443 00:48:49,300 --> 00:48:56,100 seis ciclos umbrales, yo hago una gráfica. Y en esta gráfica, ahora yo también voy a graficar el 444 00:48:56,100 --> 00:49:01,900 ciclo umbral de mi paciente, que estaría por aquí, de tal manera que estaría por aquí, aproximadamente. 445 00:49:02,900 --> 00:49:14,020 Entonces, en esta gráfica, yo pongo el ciclo umbral versus la cantidad de DNA. Y sobre esta 446 00:49:14,020 --> 00:49:20,380 gráfica, voy a extrapolar, voy a extrapolar el ciclo de mi paciente. Si mi paciente, el ciclo 447 00:49:20,380 --> 00:49:26,820 umbral estaba aquí, ya sé de forma cuantitativa y exacta, una cuantificación absoluta, de la 448 00:49:26,820 --> 00:49:33,700 cantidad de DNA que tenía en su muestra. ¿De acuerdo? Esto, si queréis, luego lo vemos también 449 00:49:33,700 --> 00:49:39,380 en clase, ¿vale?, con ejercicios. Hablamos de una cuantificación relativa, no cuando quiero saber de 450 00:49:39,380 --> 00:49:45,580 forma cuantitativa exacta los nanogramos, microgramos que tengo en el DNA de un paciente, sino que yo la 451 00:49:45,580 --> 00:49:50,540 quiero comparar, por eso es relativa, con una muestra control. De tal manera que yo meto una 452 00:49:50,540 --> 00:49:56,020 muestra control y voy a meter las muestras de los pacientes. Y quiero saber si el paciente tiene el 453 00:49:56,020 --> 00:50:07,860 gen X en la misma cantidad que la muestra control, o está dos veces, está el doble de concentrado, 454 00:50:07,860 --> 00:50:13,820 o está dos veces menos, ¿de acuerdo?, ¿se entiende? Esa es una cuantificación relativa, cuando yo los 455 00:50:13,820 --> 00:50:19,740 resultados de mi paciente los quiero comparar con una muestra control, ¿de acuerdo? Os pongo un 456 00:50:19,740 --> 00:50:25,180 ejemplo. Normalmente cuando se extrae una biopsia de un tumor, un paciente le están operando de un 457 00:50:25,180 --> 00:50:33,100 tumor, se cogen varias muestras, varias muestras del tumor, varios trocitos de tumor y también un 458 00:50:33,100 --> 00:50:39,620 fragmento, una pequeña biopsia de tejido sano del paciente. Si yo quiero saber si un gen está 459 00:50:39,620 --> 00:50:50,780 expresado en el tumor, puedo hacer una cuantificación relativa, es decir, cojo el DNA del 460 00:50:50,780 --> 00:50:58,740 fragmento de la biopsia de tejido sano y ese va a ser mi control. Imaginaos que la expresión del 461 00:50:58,740 --> 00:51:07,660 gen que yo quiero estudiar es 10, se expresa 10 veces. Yo lo que voy a comparar contra ese dato, 462 00:51:07,660 --> 00:51:15,060 voy a ir comparando la expresión de las biopsias de los tejidos tumorales de ese mismo paciente, 463 00:51:15,060 --> 00:51:20,580 ¿se entiende? Y voy a hacer una cuantificación relativa que la voy a comparar con el tejido 464 00:51:20,580 --> 00:51:25,700 sano de ese propio paciente, ¿de acuerdo? Esto darle unas vueltas si queréis. Os voy a dejar 465 00:51:25,700 --> 00:51:31,820 unos vídeos también complementarios, si os ayudan a la hora de entenderlo y de estudiarlo, ¿de 466 00:51:31,820 --> 00:51:38,620 acuerdo? Y si no, pues me vais preguntando. Muy importante, después de la PCR a tiempo real 467 00:51:38,620 --> 00:51:44,260 tenemos que hacer una curva de fusión, que no es ni más ni menos que cuando ha acabado la PCR, 468 00:51:44,260 --> 00:51:50,180 yo al termociclador le digo, ahora que ya se ha acabado la PCR, vas a coger y vas a ir 469 00:51:50,180 --> 00:52:01,780 aumentando la temperatura poco a poco a razón de 0,1 grados por segundo y me vas a ir midiendo 470 00:52:01,780 --> 00:52:08,140 la fluorescencia. Entonces el termociclador lo va realizando y va midiendo la fluorescencia 471 00:52:08,140 --> 00:52:14,860 de forma continua. Y si os dais cuenta, lo que se obtiene es una curva de fusión, en la cual, 472 00:52:14,860 --> 00:52:22,140 en la muestra, si os dais cuenta, obtengo que la fluorescencia va disminuyendo porque se va 473 00:52:22,140 --> 00:52:28,340 desnaturalizando todo el DNA hasta que llega un momento cuando llego a su temperatura de 474 00:52:28,340 --> 00:52:34,220 melting, la temperatura de melting del amplicón, que la fluorescencia cae de golpe. ¿Por qué? 475 00:52:34,460 --> 00:52:43,780 Porque todos los amplicones se han desnaturalizado a la vez. Entonces aquí tenemos, nos muestran una 476 00:52:43,780 --> 00:52:50,380 muestra A y una muestra B. Esta curva de fusión, el programa de análisis, me lo transforma en 477 00:52:50,380 --> 00:52:59,540 picos de fusión. De tal manera que si os dais cuenta, este punto de inflexión me lo traduce 478 00:52:59,540 --> 00:53:06,020 en un pico. Este pico significa que se ha amplificado una banda. Solo tengo un amplicón. 479 00:53:06,020 --> 00:53:11,900 ¿Qué es lo que ocurre en la muestra B? En la muestra B va disminuyendo la fluorescencia a medida 480 00:53:11,900 --> 00:53:17,180 que disminuye la temperatura, pero veo un punto de inflexión y después un megapunto de inflexión 481 00:53:17,180 --> 00:53:23,180 más grande. Esto, cuando lo traduzco a picos de fusión, veo un doble pico. Esto lo que significa 482 00:53:23,220 --> 00:53:29,740 es que la PCR no ha sido específica. Ha amplificado mayoritariamente el amplicón que yo quería, 483 00:53:29,740 --> 00:53:35,980 pero también ha amplificado de forma inespecífica un segundo pico. Por tanto, 484 00:53:35,980 --> 00:53:42,260 la PCR de la muestra 2, algo le ha pasado, la tendría que repetir. ¿De acuerdo? Por tanto, 485 00:53:42,260 --> 00:53:50,540 esta curva de fusión y la obtención de los picos de fusión es un control que me habla sobre si la 486 00:53:50,540 --> 00:53:58,340 PCR a tiempo real ha sido más o menos específica y, por tanto, si tendría o no que repetir la PCR 487 00:53:58,340 --> 00:54:08,340 de alguna muestra en concreto. ¿De acuerdo? Y con esto acabamos el tema 6 de técnicas de PCR.