1 00:00:01,710 --> 00:00:06,030 Bien, vamos a empezar el tema 7 de hibridación de ácidos nucleicos. 2 00:00:06,349 --> 00:00:08,869 Este tema, os recuerdo que es... 3 00:00:08,869 --> 00:00:12,789 Vamos a ver los fundamentos de la hibridación de ácidos nucleicos 4 00:00:12,789 --> 00:00:15,929 que nos va a dar la base para poder entender bien 5 00:00:15,929 --> 00:00:18,230 todas las técnicas de hibridación. 6 00:00:20,620 --> 00:00:23,839 Bien, vamos a empezar a ver unas generalidades sobre la hibridación 7 00:00:23,839 --> 00:00:25,879 y su aplicación en la biología molecular. 8 00:00:26,359 --> 00:00:28,359 Y lo que vamos a ver en este vídeo, fundamentalmente, 9 00:00:28,420 --> 00:00:30,420 van a ser las bases teóricas de la hibridación. 10 00:00:30,420 --> 00:00:56,700 En la segunda parte del tema veremos los tipos y características de las sondas, cómo se marcan las sondas, fundamentalmente qué tipos de sondas podemos utilizar en las técnicas de hibridación, los métodos de marcaje y de purificación de la sonda no son tan importantes porque normalmente cuando compramos una sonda ya viene marcada, pues el marcaje y su purificación no suelen ser necesarios. 11 00:00:56,700 --> 00:01:01,520 Y una parte que es muy importante es las fases de la hibridación. 12 00:01:02,159 --> 00:01:04,719 Todo esto lo explicaremos en la segunda parte del tema. 13 00:01:05,099 --> 00:01:11,560 En este tema, por tanto, nos vamos a centrar en los dos primeros puntos de la unidad de trabajo. 14 00:01:13,650 --> 00:01:17,489 Bien, la hibridación de ácidos nucleicos, ya hemos hablado de la hibridación, 15 00:01:17,709 --> 00:01:23,689 en el tema 2 del temario consiste en la unión de dos moléculas que son monocatenarias 16 00:01:23,689 --> 00:01:27,069 para formar una molécula bicatenaria. 17 00:01:27,069 --> 00:01:41,969 La característica de la hibridación es que esta molécula es híbrida. Recordad que no es lo mismo el proceso de renaturalización y de desnaturalización-renaturalización que la hibridación. 18 00:01:41,969 --> 00:01:54,450 Cuando hablamos de hibridación hablamos de que estas dos moléculas monocatenarias no estaban unidas ni asociadas inicialmente, por tanto son de origen diferente. 19 00:01:55,049 --> 00:02:07,250 Por tanto la hibridación es un proceso de construcción artificial que no se da de forma natural y espontánea en el laboratorio, una construcción artificial de ácidos nucleicos bicatenarios. 20 00:02:07,250 --> 00:02:28,789 Lo único que tiene que cumplirse para que se pueda dar la hibridación es que las dos cadenas sean complementares. Es el único requisito, ¿de acuerdo? De esa manera ya sabéis que tenemos híbridos DNA-DNA, híbridos RNA-RNA, híbridos DNA-RNA, ¿de acuerdo? 21 00:02:28,789 --> 00:02:37,669 ¿no? ¿Cuál es el objetivo de todas las técnicas de hibridación? Si en las técnicas de PCR el objetivo 22 00:02:37,669 --> 00:02:44,629 es amplificar una secuencia, si en las técnicas de secuenciación el objetivo es conocer la secuencia 23 00:02:44,629 --> 00:02:49,750 de nucleótidos, ¿cuál es el objetivo de la hibridación, de las técnicas de hibridación? El 24 00:02:49,750 --> 00:02:57,169 objetivo es detectar, detectar secuencias concretas. Estas secuencias de ácidos nucleicos, imaginaos 25 00:02:57,169 --> 00:03:04,550 que purificamos el genoma completo de unas células, de un tejido, de un individuo y en ese genoma 26 00:03:04,550 --> 00:03:11,650 queremos detectar una secuencia de un gen, en concreto detectarla, identificarla, ¿se encuentra 27 00:03:11,650 --> 00:03:20,270 la secuencia o no? Ese proceso de detección es de secuencias concretas. Estas secuencias es lo que 28 00:03:20,270 --> 00:03:28,330 llamamos las secuencias diana. De tal manera que después de realizar la hibridación vamos a poder 29 00:03:28,330 --> 00:03:34,949 obtener estructuras bicatenarias que están formadas por una secuencia diana y una sonda 30 00:03:34,949 --> 00:03:41,889 pequeña, pequeñita, una sonda que es la que va a reconocer dicha secuencia diana. ¿De acuerdo? 31 00:03:41,889 --> 00:03:54,389 Por tanto, las técnicas de hibridación nos van a permitir detectar secuencias diana empleando, utilizando sondas marcadas. 32 00:03:54,729 --> 00:04:06,449 Os recuerdo que en biología molecular una sonda es un pequeño fragmento monocatenario de ácidos nucleicos parecido a un primer. 33 00:04:06,990 --> 00:04:11,610 La diferencia entre una sonda y un primer es que la sonda suele ir marcada. 34 00:04:11,889 --> 00:04:28,689 ¿Cómo podemos marcar estas sondas? Normalmente se pueden marcar por radiación, con fluorescencia, se pueden marcar con aptenos, todo esto lo veremos en la segunda parte de la explicación del tema. 35 00:04:28,689 --> 00:04:40,370 ¿De acuerdo? Por tanto, en todas las técnicas de hibridación, en todas, partimos de una muestra, en este caso, en el ejemplo que nos ponen en el dibujo, es un DNA bicatenario. 36 00:04:41,149 --> 00:04:49,829 Para poder realizar la hibridación necesitamos las hebras monocatenarias, el DNA del paciente, el DNA que hemos extraído monocatenario. 37 00:04:49,829 --> 00:04:52,970 Para ello podemos jugar con la temperatura, como ya sabemos. 38 00:04:54,129 --> 00:05:07,470 Este DNA monocatenario le vamos a tirar, entre comillas, le vamos a lanzar la sonda marcada y vamos a estudiar si la sonda complementaria existe en el DNA del paciente o no. 39 00:05:08,670 --> 00:05:17,089 ¿Cómo lo veremos? Si hay secuencia complementaria la sonda queda unida y veremos una hibridación positiva por marcaje positivo. 40 00:05:17,089 --> 00:05:27,370 Si no hay complementariedad de bases, por tanto, en el DNA del paciente no existe la secuencia diana, la hibridación es negativa, no observaremos el marcaje. 41 00:05:29,410 --> 00:05:45,339 Bien. Hay diferentes técnicas de hibridación y todas ellas se diferencian, se pueden clasificar dependiendo de estos cuatro parámetros, dependiendo del tipo de ácido nucleico que detectamos. 42 00:05:45,339 --> 00:05:49,040 O sea, la secuencia diana puede ser de DNA o de RNA 43 00:05:49,040 --> 00:05:55,300 El tipo de sonda que vamos a utilizar también puede ser una sonda de DNA, de RNA 44 00:05:55,300 --> 00:05:58,740 O incluso una sonda sintética, ya lo veremos 45 00:05:58,740 --> 00:06:02,779 El tipo de marcaje, que ya hemos dicho que puede ser radioactivo 46 00:06:02,779 --> 00:06:06,000 Pueden ser fluorocromos, pueden ser aptenos 47 00:06:06,000 --> 00:06:08,540 Y el medio o soporte 48 00:06:08,540 --> 00:06:14,019 De esta manera tenemos técnicas de hibridación en medio sólido, en medio líquido 49 00:06:14,019 --> 00:06:21,600 y técnicas de hibridación in situ. ¿De acuerdo? Muy bien. Para poder entender bien todo el proceso 50 00:06:21,600 --> 00:06:29,480 de la hibridación que ya hemos dicho que es un proceso artificial que hacemos en el laboratorio 51 00:06:29,480 --> 00:06:35,959 que no ocurre en la naturaleza, hemos de repasar el proceso de desnaturalización y de renaturalización 52 00:06:35,959 --> 00:06:41,259 porque la hibridación comparte muchas características de la desnaturalización y de la 53 00:06:41,259 --> 00:06:47,379 renaturalización. Hay cosas que vamos a ver en este apartado que en realidad son un repaso de lo que 54 00:06:47,379 --> 00:06:53,040 ya vimos en el tema 2. La desnaturalización ya sabemos que es una propiedad físico-química de 55 00:06:53,040 --> 00:07:00,120 todos los ácidos nucleicos, en concreto del DNA, que es bicatenario y consiste en la separación de 56 00:07:00,120 --> 00:07:06,379 las dos hebras complementarias que forman parte del DNA. Esta desnaturalización la podemos conseguir 57 00:07:06,379 --> 00:07:12,120 de dos maneras, o aumentando la temperatura o aumentando el pH. Aumentando la temperatura es 58 00:07:12,120 --> 00:07:20,480 lo que hacemos en los ciclos de PCR, en la fase de desnaturalización. Esta cinética y la dinámica 59 00:07:20,480 --> 00:07:25,899 de la desnaturalización la podemos representar gráficamente con lo que llamamos una curva de 60 00:07:25,899 --> 00:07:33,180 fusión de cualquier molécula de DNA. Pues cualquier molécula de DNA picadenario podemos elaborar su 61 00:07:33,180 --> 00:07:41,319 curva de fusión. La curva de fusión, como muchos parámetros en biología molecular, va a tener una 62 00:07:41,319 --> 00:07:48,199 forma sigmoidea. ¿Cómo la hacemos? Vamos midiendo la absorbancia a 260 nanómetros de forma continua, 63 00:07:48,959 --> 00:07:57,699 o sea, tenemos el DNA en un tubo y le vamos a irradiar con luz de 260 nanómetros y vamos a ir 64 00:07:57,699 --> 00:08:02,699 midiendo la absorbancia de forma continua y de la misma manera simultáneamente vamos a ir 65 00:08:02,699 --> 00:08:09,800 aumentando la temperatura. A medida que aumentamos la temperatura ocurre, obtenemos la curva de 66 00:08:09,800 --> 00:08:15,860 fusión. La curva de fusión tiene esta morfología sigmoidea. Aquí representamos la temperatura 67 00:08:15,860 --> 00:08:22,939 desde normalmente 4 grados, vamos a ir aumentando paulatinamente la temperatura y aquí vamos a ir 68 00:08:22,939 --> 00:08:30,180 detectando y graficando el porcentaje de desnaturalización, es decir, entre comillas, el número de puentes 69 00:08:30,180 --> 00:08:38,460 de hidrógeno de esta molécula que se han desnaturalizado y se han roto, ¿de acuerdo? Ya veis que como todas 70 00:08:38,460 --> 00:08:46,000 las gráficas y sigmoideas tiene tres regiones, una primera región o región de latencia en la cual 71 00:08:46,000 --> 00:08:51,820 aunque vayamos aumentando la temperatura, esa temperatura no es suficiente como para que se 72 00:08:51,820 --> 00:08:58,139 produzca desnaturalización. No es suficiente para romper puentes de hidrógeno. Por tanto, durante 73 00:08:58,139 --> 00:09:05,139 esta fase, al aumentar la temperatura, seguimos en el 0% de desnaturalización. Hasta que llega un 74 00:09:05,139 --> 00:09:12,200 momento, en la segunda fase, donde hay un punto de inflexión, como veis aquí. Es aquel en el cual, 75 00:09:13,120 --> 00:09:18,080 al aumentar un poquito más la temperatura, ya se empiezan a romper puentes de hidrógeno. 76 00:09:18,080 --> 00:09:34,519 Bien, esta fase es una fase exponencial, como toda curva sigma idea, de tal manera que al aumentar muy poquito, muy poquito, muy poquito a poco la temperatura, los puentes de hidrógeno que se van rompiendo son muchos. 77 00:09:34,519 --> 00:09:48,899 De tal manera que en muy poco rango de temperaturas, prácticamente pasamos del 0% o 10% de desnaturalización al 80-90% de desnaturalización. 78 00:09:51,019 --> 00:10:04,000 Y llega un momento en el que ya se llega al 100% de desnaturalización y por mucho que aporte más temperatura ya las cadenas no se produce más desnaturalización porque las cadenas están completamente separadas. 79 00:10:04,519 --> 00:10:29,200 Muy bien, en esta curva distinguimos un parámetro que es muy importante que es la temperatura de melting. ¿Qué es la temperatura de melting? La temperatura de melting o de fusión es la temperatura a la cual el 50% de los puentes de hidrógeno se han roto. Por tanto, es aquella temperatura en la cual se alcanza el 50% de desnaturalización. 80 00:10:29,200 --> 00:10:33,259 ¿De qué depende esta temperatura de melting? 81 00:10:33,720 --> 00:10:38,919 Esta temperatura de melting depende de la composición de bases nitrogenadas 82 00:10:38,919 --> 00:10:45,919 De tal manera que, si os acordáis, entre guaninas y citosinas tenemos tres puentes de hidrógeno 83 00:10:47,080 --> 00:10:54,039 Si aquí en esta línea continua tenemos la curva de fusión de una molécula ideal de ácido nucleico 84 00:10:54,039 --> 00:10:57,919 En la cual el 50% son guaninas y citosinas 85 00:10:57,919 --> 00:11:01,600 por tanto el otro 50% son adeninas y timinas 86 00:11:01,600 --> 00:11:04,000 pues tendríamos esta curva, ¿sí? 87 00:11:04,259 --> 00:11:08,080 ¿Qué es lo que ocurre o cuál es la curva de fusión 88 00:11:08,080 --> 00:11:12,059 para una molécula en la cual el porcentaje de GCs 89 00:11:12,059 --> 00:11:16,759 es del 20% y por tanto el 80% son adeninas y timinas? 90 00:11:17,360 --> 00:11:19,000 Que la temperatura de melting, 91 00:11:19,220 --> 00:11:22,720 aquella temperatura en la que se alcanza el 50% de desnaturalización 92 00:11:22,720 --> 00:11:26,539 si os dais cuenta, la temperatura de melting es menor. 93 00:11:27,059 --> 00:11:32,399 Necesito aportar menos energía para que se rompan los puentes de hidrógeno. 94 00:11:32,480 --> 00:11:36,960 ¿Por qué? Porque hay muchísimas menos guaninas y citosinas que adeninas y timinas. 95 00:11:37,659 --> 00:11:43,379 El caso contrario lo representa esta molécula, donde el 80% son guaninas y citosinas. 96 00:11:43,759 --> 00:11:46,039 Por tanto, la temperatura de melting será mayor. 97 00:11:46,639 --> 00:11:50,779 Necesito aportar más energía para que se puedan desnaturalizar. 98 00:11:52,019 --> 00:11:52,340 ¿De acuerdo? 99 00:11:52,340 --> 00:12:01,399 cualquier molécula de dna siempre se va a representar va a tener una temperatura de 100 00:12:01,399 --> 00:12:08,620 melting que va a estar comprendida entre una molécula poliate esto es una molécula de dna 101 00:12:08,620 --> 00:12:14,419 bicatenaria en la que todas las bases son adeninas y timinas no hay ni una sola citosina ni una 102 00:12:14,419 --> 00:12:20,379 guanina esta molécula es la que presenta la temperatura de melting menor que sería esta de 103 00:12:20,379 --> 00:12:30,539 aquí. El extremo opuesto lo compone una secuencia, una molécula de DNA cuya secuencia está formada 104 00:12:30,539 --> 00:12:36,559 única y exclusivamente por guaninas y citosinas, ¿sí? Presentará una temperatura de melting 105 00:12:36,559 --> 00:12:43,299 máxima. Entonces, entre esta temperatura de melting mínima del poliate y esta temperatura 106 00:12:43,299 --> 00:12:51,220 de melting máxima del poligc, tenemos todo un rango de temperaturas de melting, de tal manera 107 00:12:51,220 --> 00:12:56,919 que cualquier molécula de dna cualquier molécula de dna tendrá una temperatura de melting comprendida 108 00:12:56,919 --> 00:13:06,340 entre la mínima y la máxima de acuerdo muy bien y la re naturalización cuando hablamos de la red 109 00:13:06,340 --> 00:13:15,980 actualización si os acordáis en el tema 2 decíamos hablamos de re naturalización como el proceso por 110 00:13:15,980 --> 00:13:23,639 el cual dos moléculas de DNA que están separadas, que se han separado por desnaturalización térmica, 111 00:13:23,639 --> 00:13:31,320 se vuelven a reasociar. Por tanto, hablamos de renaturalización cuando dos hebras monocatenarias 112 00:13:31,320 --> 00:13:39,220 que ya estaban unidas y las hemos desnaturalizado se vuelven a reasociar. Esto ocurre en la naturaleza 113 00:13:39,220 --> 00:13:43,279 cuando disminuimos la temperatura, y esto ya lo sabemos, ¿de acuerdo? 114 00:13:45,179 --> 00:13:53,279 Importante, el proceso de renaturalización es tremendamente más complejo, 115 00:13:53,960 --> 00:13:59,159 muchísimo más complejo, es una cinética distinta y más compleja que la desnaturalización. 116 00:13:59,940 --> 00:14:01,600 Romper puentes de hidrógeno es muy fácil. 117 00:14:02,419 --> 00:14:06,340 Ahora, dos moléculas tremendamente largas, grandes, 118 00:14:06,340 --> 00:14:13,120 que encuentren secuencias complementarias, que encuentren la base nitrogenada complementaria 119 00:14:13,120 --> 00:14:17,340 y empiecen a formar de nuevo los puentes de hidrógeno, 120 00:14:17,519 --> 00:14:20,720 esto es un proceso mucho más lento y muchísimo más complejo. 121 00:14:21,059 --> 00:14:22,659 Esto lo tenemos que tener siempre en cuenta. 122 00:14:25,230 --> 00:14:28,629 Muy bien, ¿de qué depende la cinética de renaturalización? 123 00:14:29,289 --> 00:14:32,049 Pues una diferencia muy importante con la desnaturalización 124 00:14:32,049 --> 00:14:34,350 es que si hemos dicho que la desnaturalización 125 00:14:34,350 --> 00:14:39,090 Influye la composición de bases, porcentaje de guaninas y citosinas 126 00:14:39,090 --> 00:14:45,129 En la renaturalización uno de los factores que influyen es la concentración 127 00:14:45,129 --> 00:14:48,330 A mayor concentración del DNA 128 00:14:48,330 --> 00:14:55,750 Mayor probabilidad de que se encuentren las secuencias complementarias 129 00:14:55,750 --> 00:14:58,149 Y por tanto la renaturalización es más sencilla 130 00:14:58,149 --> 00:15:02,710 Mayor concentración, mayor cantidad de DNA en el tubo 131 00:15:02,710 --> 00:15:19,950 Pero más fácil es la renaturalización, mayor velocidad de renaturalización, ¿de acuerdo? Primera idea que tenemos que tener clara en la cinética de renaturalización, ¿de acuerdo? Esto sencillamente es para recordaros la idea que he dicho antes. 132 00:15:19,950 --> 00:15:42,509 Fijaos, aquí tenemos un DNA bicatenario que lo hemos desnaturalizado y ahora tenemos esto. Son moléculas tremendamente largas que se tienen que reasociar otra vez, pero no de cualquier manera, sino que cada base nitrogenada tiene que encontrar su complementaria en la secuencia de la otra hebra. 133 00:15:42,509 --> 00:16:05,070 Por lo tanto, es un proceso muchísimo más complejo y más lento. ¿De acuerdo? Esta cinética de la renaturalización tiene dos fases. Esto los científicos que lo estudian son científicos teóricos, pero sí que parece ser que hay una primera fase de nucleación que es muy lenta, muy lenta. ¿Qué es esto de la nucleación? 134 00:16:06,070 --> 00:16:28,789 Pues si teníamos nuestro DNA bicatenario, que lo hemos desnaturalizado, lo que se observa es que al ir disminuyendo la temperatura poco a poco, hay un momento en el que estas moléculas monocatenarias, estas hebras, se empiezan a aproximar unas con otras y a lo largo de toda la molécula se empiezan a formar lo que vemos aquí, un centro de nucleación. 135 00:16:28,789 --> 00:16:36,789 Un sitio donde hay 3 o 4, 5, 6, 7 pares de bases que son complementarias y forman puente de hidrógeno. 136 00:16:37,710 --> 00:16:52,250 Y esto ocurre, a ver si puedo pintar, esto ocurre no solamente en esta zona, sino que ocurre, puede ocurrir muy a lo largo de toda la molécula, en varios sitios. 137 00:16:52,250 --> 00:17:09,829 ¿De acuerdo? De tal manera que se pueden reasociar en varios sitios, ¿de acuerdo? Sí, aquí se forman puentes de hidrógeno, aquí también se formarían puentes de hidrógeno, ¿de acuerdo? Y aquí se formarían puentes de hidrógeno. 138 00:17:09,829 --> 00:17:24,470 En este caso, tenemos tres zonas de nucleación. Esta fase de nucleación, ya he dicho que es muy lenta, muy lenta. ¿Por qué? Porque, claro, daos cuenta que estas hebras monocatenarias son tremendamente largas. 139 00:17:24,470 --> 00:17:52,849 Se tienen que posicionar una al lado de la otra para que se vayan encontrando pequeñas regiones de secuencia complementaria y formen puentes de hidrógeno, ¿de acuerdo? Una vez ocurren y se empiezan a formar estos centros de nucleación, ahora lo que ocurre es una fase que llaman en inglés ziperin, con dos P's, aquí lo tenemos, el ziperin o zipping, ¿de acuerdo? Es la fase de cierre en cremallera. 140 00:17:52,849 --> 00:18:16,490 Esta fase es tremendamente rápida. ¿Y qué es lo que ocurre? Algo así parecido a lo que se está dibujando aquí. ¿De acuerdo? Es como si desde estos centros de nucleación hacia arriba y hacia abajo se empiezan a formar los puentos de hidrógeno complementarios ahora de forma muy rápida. ¿Por qué? Porque esta base y su base complementaria ahora están muy próximas. 141 00:18:16,490 --> 00:18:20,250 esta y esta también están muy próximas 142 00:18:20,250 --> 00:18:23,950 por tanto, este puente de hidrógeno se forma de forma muy fácil 143 00:18:23,950 --> 00:18:27,509 pero es que este de aquí ahora ya ha quedado próximo con este 144 00:18:27,509 --> 00:18:30,549 por tanto, este nuevo puente de hidrógeno también se forma de forma 145 00:18:30,549 --> 00:18:34,170 se forma muy rápidamente, ¿de acuerdo? 146 00:18:34,170 --> 00:18:41,109 por tanto, parece ser que en la dinámica de la renaturalización 147 00:18:41,109 --> 00:18:45,809 hay una fase lenta de formación de centros de nucleación 148 00:18:45,809 --> 00:18:48,549 y una vez formado unos cuantos centros de nucleación 149 00:18:48,549 --> 00:18:52,809 se produce un cierre en cremallera, una fase tremendamente rápida. 150 00:18:53,430 --> 00:18:53,690 ¿De acuerdo? 151 00:18:53,950 --> 00:18:56,609 Bueno, esto solamente para que sepamos un poquito más 152 00:18:56,609 --> 00:18:58,829 de cómo es la cinética de renaturalización. 153 00:18:59,809 --> 00:19:02,329 Estamos hablando de la velocidad de renaturalización. 154 00:19:02,750 --> 00:19:04,289 Esta velocidad de renaturalización, 155 00:19:04,930 --> 00:19:07,450 hemos dicho que depende de la concentración. 156 00:19:07,730 --> 00:19:08,269 Aquí la tenemos. 157 00:19:09,029 --> 00:19:09,589 Concentración. 158 00:19:09,970 --> 00:19:14,230 Se puede calcular con esta fórmula que no hay que aprender la fórmula. 159 00:19:14,630 --> 00:19:14,930 ¿De acuerdo? 160 00:19:14,930 --> 00:19:29,910 Aquí el parámetro más importante es este de aquí, este término de aquí, C0T, es decir, la concentración inicial por el tiempo. Fijaos que está en el denominador y esto es importante. 161 00:19:29,910 --> 00:19:36,509 De tal manera que en base a este parámetro de la velocidad de renaturalización 162 00:19:36,509 --> 00:19:42,829 Podemos obtener una gráfica también con la cinética de renaturalización 163 00:19:42,829 --> 00:19:44,930 Uy, no sé qué le ha pasado a la presentación 164 00:19:44,930 --> 00:19:50,410 Pero bueno, entonces representando la fracción de DNA renaturalizado 165 00:19:50,410 --> 00:19:52,829 El porcentaje frente al logaritmo de CT 166 00:19:52,829 --> 00:19:55,750 Que es este parámetro de aquí, ¿de acuerdo? 167 00:19:55,750 --> 00:20:10,609 Podemos representar la curva de renaturalización y esta curva, la renaturalización, está relacionada con la complejidad del DNA que se renaturaliza, ¿de acuerdo? 168 00:20:11,210 --> 00:20:15,930 Y esta es la segunda diferencia entre la renaturalización y la desnaturalización. 169 00:20:15,930 --> 00:20:21,410 es decir, en la renaturalización no influye la longitud de la molécula 170 00:20:21,410 --> 00:20:24,990 las moléculas pueden ser muy largas o muy cortas, da igual 171 00:20:24,990 --> 00:20:28,529 se van a desnaturalizar siguiendo la misma dinámica 172 00:20:28,529 --> 00:20:30,670 pero en la renaturalización no 173 00:20:30,670 --> 00:20:36,109 renaturalizan a una velocidad mayor aquellas moléculas más simples 174 00:20:36,109 --> 00:20:40,470 menos complejas, más pequeñas, menos largas 175 00:20:40,470 --> 00:20:48,829 Aquí, por ejemplo, vemos la cinética de renaturalización de ADN complementario de un virus 176 00:20:48,829 --> 00:20:52,490 Fijaos qué tamaño tiene, 3.500 pares de bases, es pequeñito 177 00:20:52,490 --> 00:20:56,869 ¿De acuerdo? Por tanto, su velocidad va a ser menor 178 00:20:56,869 --> 00:21:00,789 Perdón, el CT va a ser menor 179 00:21:00,789 --> 00:21:02,990 Eso significa que la velocidad va a ser mayor 180 00:21:02,990 --> 00:21:04,809 Va a renaturalizar más fácilmente 181 00:21:04,809 --> 00:21:06,869 Os recuerdo que el CT está en el denominador 182 00:21:06,869 --> 00:21:07,769 Tiro para atrás 183 00:21:07,769 --> 00:21:10,089 El CT está en el denominador 184 00:21:10,089 --> 00:21:34,480 ¿Os acordáis? Por tanto, si esto es muy grande, la velocidad es muy pequeña. ¿Sí? ¿De acuerdo? Por tanto, aquí estamos representando el logaritmo, tampoco nos confundamos. Cuanto más sencillo es el DNA, cuanto más cortas son las moléculas de DNA, mayor velocidad de renaturalización, renaturaliza mejor. 185 00:21:34,480 --> 00:21:40,420 Fijaos que esta es mucho más larga y ya si nos vamos a Escherichia coli, que es una bacteria, todavía más larga 186 00:21:40,420 --> 00:21:43,380 La velocidad es menor, ¿de acuerdo? 187 00:21:43,640 --> 00:21:45,880 La velocidad de renaturalización es menor 188 00:21:45,880 --> 00:21:51,960 Este DNA de E. coli renaturaliza mucho más despacio, ¿de acuerdo? 189 00:21:51,960 --> 00:21:55,440 Nos quiero contar lo que ocurre en eucariotas 190 00:21:55,440 --> 00:21:58,039 En eucariotas es todavía más complejo 191 00:21:58,039 --> 00:22:23,819 Entonces, si aquí representamos la gráfica de renaturalización de un DNA eucariota genómico, este sería un DNA genómico, es muy complejo, en realidad no es una única gráfica, sino que tenemos tres solapadas, porque depende de los tipos de secuencia que se encuentran en ese genoma y del número de repeticiones de esas secuencias. 192 00:22:23,819 --> 00:22:26,380 esto ya lo veremos más adelante 193 00:22:26,380 --> 00:22:29,480 de todas maneras esta parte tampoco es tan importante 194 00:22:29,480 --> 00:22:32,880 sencillamente que veáis que en realidad se solapan 195 00:22:32,880 --> 00:22:35,440 dependiendo del número de secuencias que tenga 196 00:22:35,440 --> 00:22:38,819 el DNA genómico de esa secuencia 197 00:22:38,819 --> 00:22:41,599 ¿de acuerdo? así llegamos a la hibridación 198 00:22:41,599 --> 00:22:45,000 la hibridación tiene cosas comunes 199 00:22:45,000 --> 00:22:47,880 con la desnaturalización y la renaturalización 200 00:22:47,880 --> 00:22:51,240 ¿de acuerdo? ya sabemos que el híbrido sonda secuencia diana 201 00:22:51,240 --> 00:22:55,619 va a tener las mismas propiedades que una molécula bicatenaria de DNA. 202 00:22:56,559 --> 00:22:59,900 Por tanto, puede desnaturalizarse y se puede renaturalizar. 203 00:22:59,900 --> 00:23:05,380 Y la dinámica y cinética de desnaturalización y renaturalización de este híbrido 204 00:23:05,380 --> 00:23:09,759 es idéntica a la de cualquier DNA, bicatenario, claro. 205 00:23:10,359 --> 00:23:10,680 ¿De acuerdo? 206 00:23:11,660 --> 00:23:18,819 Las ondas reconocen regiones de DNA o RNA que son únicas, secuencias únicas. 207 00:23:19,240 --> 00:23:19,519 ¿De acuerdo? 208 00:23:19,519 --> 00:23:48,500 Por tanto, en todo el genoma, una sonda se unirá a un único sitio, a una única secuencia diaria. Esto hace que la cinética de hibridación sea muy parecida, similar, a la cinética de renaturalización del DNA bicatenario, pero de secuencias únicas. ¿De acuerdo? Secuencias únicas, que sería este de aquí. Secuencias únicas. Por tanto, sigue un patrón sigmoideo. La hibridación. ¿De acuerdo? 209 00:23:49,519 --> 00:23:51,579 que para cualquier DNA bicatenario 210 00:23:51,579 --> 00:23:53,519 hemos calculado la temperatura de 211 00:23:53,519 --> 00:23:55,460 melting, la temperatura 212 00:23:55,460 --> 00:23:57,460 de melting de un híbrido también es 213 00:23:57,460 --> 00:23:59,299 exclusiva. Cada híbrido 214 00:23:59,299 --> 00:24:01,519 sonda secuencia 215 00:24:01,519 --> 00:24:03,519 diana va a tener una curva 216 00:24:03,519 --> 00:24:05,680 de fusión y por tanto una temperatura 217 00:24:05,680 --> 00:24:06,440 de melting 218 00:24:06,440 --> 00:24:09,279 específica, exclusiva 219 00:24:09,279 --> 00:24:11,480 de ese híbrido. ¿De acuerdo? 220 00:24:12,279 --> 00:24:13,539 Por tanto la temperatura 221 00:24:13,539 --> 00:24:14,759 de melting del híbrido 222 00:24:14,759 --> 00:24:17,420 también va a depender del porcentaje 223 00:24:17,420 --> 00:24:19,099 de guaninas y citosinas. 224 00:24:19,519 --> 00:24:37,960 Porque se comporta igual que cualquier DNA cuando desnaturaliza. Estas son unas ideas introductorias, pero que tenemos que tener claras sobre la hibridación. Por tanto, esto es cierto para cualquier técnica de hibridación que veremos posteriormente. 225 00:24:37,960 --> 00:24:53,920 ¿De acuerdo? ¿Qué factores influyen en la hibridación? Esto es muy importante. Lo voy a preguntar en el examen. ¿De acuerdo? Tres factores. El primer factor es la fuerza iónica, es decir, la concentración de sales. 226 00:24:53,920 --> 00:25:06,559 ¿Qué relación tiene la concentración de sales con la hibridación y la desnaturalización? A mayor concentración de sales, mayor temperatura de melting. ¿De acuerdo? Esta es la relación que hay. 227 00:25:06,559 --> 00:25:26,420 Por tanto, si yo quiero aumentar la temperatura de melting de mi híbrido y por tanto que sea muy difícil que desnaturalice porque haya que aportar prácticamente 105 grados, una manera de hacerlo es hacer la hibridación en una solución con elevada concentración de sales. 228 00:25:26,420 --> 00:25:38,880 A mayor concentración de sales, mayor temperatura de melting. Por tanto, el híbrido es más estable. Es mucho más difícil desnaturalizarlo. ¿De acuerdo? Muy bien. Primer factor. 229 00:25:38,880 --> 00:25:48,279 segundo factor puedo añadir si me interesa agentes desnaturalizantes a la solución son agentes que 230 00:25:48,279 --> 00:25:53,759 van a interferir con los puentes de hidrógeno del DNA desestabilizan la doble hélice y por tanto 231 00:25:53,759 --> 00:26:01,099 hacen que sea más fácil la desnaturalización un ejemplo es el de MSO dimetilsulfóxido o la 232 00:26:01,099 --> 00:26:07,339 formamida que se utiliza mucho de tal manera que si yo en el tampón en la solución subo la 233 00:26:07,339 --> 00:26:13,099 concentración de forma amida y pongo forma amida la temperatura de melting disminuye ahora va a 234 00:26:13,099 --> 00:26:20,940 ser mucho más fácil a menor temperatura el híbrido va a desnaturalizar ya veremos cuando nos interesa 235 00:26:20,940 --> 00:26:27,859 poner mucha cantidad de sales o cuando nos interesa poner agentes desnaturalizantes etcétera y el 236 00:26:27,859 --> 00:26:38,839 último ejemplo es la el número el porcentaje de bases nitrogenadas que no aparean no complementarias 237 00:26:38,839 --> 00:26:44,700 lo que llamamos el mismatch que es el mismatch bueno pues imaginaos que este es el dna donde 238 00:26:44,700 --> 00:26:51,880 tenemos la secuencia diana aquí se ha unido nuestra sonda de forma específica porque aquí está su 239 00:26:51,880 --> 00:26:59,160 secuencia diana de acuerdo está formado a lo largo está formando a lo largo de toda su longitud está 240 00:26:59,160 --> 00:27:06,500 formando puentes de hidrógeno imaginaos que de forma inespecífica esta sonda se ha unido también 241 00:27:06,500 --> 00:27:13,680 por aquí sí pero claro como es inespecífica solamente se forman unos pocos puentes de 242 00:27:13,680 --> 00:27:20,960 hidrógeno y hay una parte de la sonda una cola de la sonda que no forma puentes de hidrógeno la 243 00:27:20,960 --> 00:27:30,619 pregunta es cuál de las dos uniones cuál de los dos híbridos es más fácil que desnaturaliza por 244 00:27:30,619 --> 00:27:36,240 supuesto este de aquí pero que todo el mundo lo vea hay que romper menos puentes de hidrógeno 245 00:27:36,240 --> 00:27:46,079 por tanto a mayor porcentaje de mismas menor temperatura de melty igual que la forma mira 246 00:27:46,079 --> 00:27:49,339 Estos dos factores van en el mismo sentido 247 00:27:49,339 --> 00:27:54,299 A mayor forma mida o de MSO o a mayor porcentaje de mismatch 248 00:27:54,299 --> 00:27:56,319 Menor temperatura de melting 249 00:27:56,319 --> 00:28:00,359 Va a ser más fácil quitarme de en medio estas uniones inespecíficas 250 00:28:00,359 --> 00:28:00,880 ¿De acuerdo? 251 00:28:01,859 --> 00:28:04,880 Sin embargo, a mayor fuerza iónica 252 00:28:04,880 --> 00:28:07,220 Mayor temperatura de melting 253 00:28:07,220 --> 00:28:08,220 Como vemos aquí 254 00:28:08,220 --> 00:28:14,380 Eso significa que en condiciones de alta fuerza iónica 255 00:28:14,380 --> 00:28:15,980 Alta concentración de sales 256 00:28:15,980 --> 00:28:36,380 las únicas uniones que van a permanecer son las que sean fuertes, ¿de acuerdo? ¿Se entiende? Muy bien, pues nada, con esto acabamos la primera parte de la explicación del tema 7 sobre los fundamentos de la hibridación.