1
00:00:00,060 --> 00:00:05,500
Bien, vamos a empezar la unidad de trabajo 8 sobre clonación de ácidos nucleicos.

2
00:00:05,860 --> 00:00:12,859
En realidad es la unidad de trabajo 7 del libro, pero como nosotros hemos visto primero la unidad de trabajo 7

3
00:00:12,859 --> 00:00:20,640
como el tema de bioinformática, este tema de clonación de ácidos nucleicos es la número 8.

4
00:00:21,080 --> 00:00:25,300
Este tema es importante y también es relativamente complicado.

5
00:00:25,300 --> 00:00:36,980
De hecho, junto con el tema 6 y el tema 9 son quizá los temas más complejos de las técnicas de biología molecular que vamos a ver.

6
00:00:38,460 --> 00:00:43,760
Primero vamos a ver, en la clase de hoy vamos a ver los métodos de clonación molecular,

7
00:00:44,600 --> 00:00:50,820
algunas generalidades, que es esto de la clonación molecular y los componentes de la clonación molecular.

8
00:00:50,820 --> 00:00:55,019
Es decir, qué elementos necesitamos para poder llevar a cabo una clonación.

9
00:00:55,300 --> 00:00:58,320
La clonación molecular o para clonar un gen.

10
00:00:59,240 --> 00:01:03,700
Dejaremos para las siguientes clases las fases de este proceso de clonación,

11
00:01:04,540 --> 00:01:12,880
cómo construir bibliotecas de DNA y un último apartado donde vamos a hablar de las aplicaciones de la clonación molecular en la actualidad,

12
00:01:13,420 --> 00:01:16,260
sobre todo en laboratorios de investigación biomédica.

13
00:01:19,100 --> 00:01:21,080
¿Qué es esto de la clonación molecular?

14
00:01:21,439 --> 00:01:25,260
Pues la clonación molecular no es ni más ni menos que un proceso de amplificación.

15
00:01:25,299 --> 00:01:26,959
De una secuencia.

16
00:01:27,480 --> 00:01:34,219
Ya conocemos las técnicas de PCR que son técnicas de amplificación de una secuencia.

17
00:01:34,780 --> 00:01:46,379
Para las técnicas de PCR necesitamos primers, necesitamos TAC polimerasa, necesitamos DNTPs, necesitamos cloruro de magnesio, buffer, etc.

18
00:01:47,200 --> 00:01:52,879
La PCR es un proceso de amplificación in vitro.

19
00:01:53,299 --> 00:01:54,879
En este caso la clonación.

20
00:01:55,299 --> 00:01:59,039
La clonación molecular es un proceso de amplificación in vivo.

21
00:01:59,659 --> 00:02:07,519
Lo vamos a llevar a cabo no en un tubo de ensayo y en un termociclador, sino que lo vamos a llevar a cabo en células.

22
00:02:08,099 --> 00:02:17,439
De tal manera que el fragmento, la secuencia, que puede ser de cDNA, o sea, DNA complementario, o puede ser de un DNA genómico,

23
00:02:17,439 --> 00:02:24,439
esa secuencia de interés que queremos amplificar, la vamos a introducir en un ser vivo, en una célula,

24
00:02:25,300 --> 00:02:35,020
vamos a permitir que la célula se expanda, se divida y a partir de una célula obtengamos millones y millones y millones de células

25
00:02:35,020 --> 00:02:51,080
y de ellas cada célula llevará una copia de esa secuencia, de las cuales después de cultivarlas in vitro podremos aislar la secuencia de interés de todas esas células.

26
00:02:52,580 --> 00:02:55,080
Es por ello que este proceso se le llama clonación.

27
00:02:55,300 --> 00:03:06,180
Clonación molecular, porque vamos a utilizar clones de células que van a amplificar in vivo un fragmento de cDNA, de DNA genómico,

28
00:03:06,980 --> 00:03:11,900
basado en lo que llamamos la tecnología del DNA recombinante.

29
00:03:12,220 --> 00:03:12,540
¿De acuerdo?

30
00:03:13,700 --> 00:03:16,520
Esta tecnología del DNA recombinante es muy importante.

31
00:03:16,520 --> 00:03:22,700
Tuvo su boom a nivel científico, sobre todo durante los años 70,

32
00:03:22,700 --> 00:03:28,580
pero son técnicas que se utilizan mucho en los laboratorios de investigación,

33
00:03:29,280 --> 00:03:35,520
sobre todo cuando queremos estudiar genes que no conocemos y los estamos estudiando por primera vez.

34
00:03:37,720 --> 00:03:43,700
Os recuerdo que el cDNA es el DNA copia, no existe como tal en la naturaleza,

35
00:03:44,860 --> 00:03:49,700
acordaos que se le llama DNA copia o DNA complementario porque es la copia

36
00:03:49,700 --> 00:03:52,320
obtenida a partir de un DNA genómico.

37
00:03:52,320 --> 00:03:52,680
Y es un DNA que se utiliza mucho en los laboratorios de investigación, sobre todo cuando queremos estudiar genes que no conocemos y los estamos estudiando por primera vez.

38
00:03:52,700 --> 00:03:55,380
A partir de un RNA de una célula, ¿de acuerdo?

39
00:03:55,520 --> 00:04:02,620
El enzima que lleva a cabo esta reacción de transcripción inversa,

40
00:04:02,940 --> 00:04:07,220
acordaos que es la transcriptasa inversa o retrotranscriptasa,

41
00:04:07,940 --> 00:04:13,480
que utiliza un RNA como molde para sintetizar un DNA copia.

42
00:04:19,879 --> 00:04:20,560
¿Qué es el DNA copia?

43
00:04:20,560 --> 00:04:22,480
A grandes rasgos de forma general,

44
00:04:22,699 --> 00:04:48,019
genérica, el proceso de clonación molecular, ya veis que hablamos de clonación molecular, clonación porque utilizamos clones de células y vamos a obtener copias exactas y por eso de ahí viene el nombre de clon y es molecular porque lo que vamos a clonar no son las células, sino que vamos a clonar y vamos a amplificar DNA, pues es una clonación molecular.

45
00:04:48,019 --> 00:04:57,439
Es muy diferente al concepto de clonación de seres vivos, de animales por ejemplo, no tiene nada que ver.

46
00:05:00,339 --> 00:05:16,719
El proceso de clonación tiene cuatro pasos fundamentales y los tenemos que conocer. El primer paso es la inserción, vamos a insertar un fragmento de DNA, el que queremos amplificar,

47
00:05:16,719 --> 00:05:17,719
nuestro fragmento.

48
00:05:18,019 --> 00:05:34,620
El fragmento de DNA de interés en una molécula que nos va a servir, va a ser una molécula portadora, va a transportar ese fragmento dentro de las células que veremos ahora, ¿de acuerdo?

49
00:05:34,620 --> 00:05:47,639
Por tanto, el primer paso es, voy a coger de todo el DNA de la célula, imaginaos que yo quiero amplificar solamente un gen, un único gen, de todo el DNA genómico de esta célula eucariota,

50
00:05:48,019 --> 00:06:17,399
que está dentro del núcleo, lo primero que hago es lizar esta célula, obtener, extraer y purificar su DNA y de aquí voy a aislar el fragmento, ojo, si recordáis, yo en las técnicas de PCR, a partir de este DNA genómico, con dos primers, un forward y un reverse, lo amplifico in vitro, aquí no, aquí voy a coger todo el DNA genómico,

51
00:06:18,019 --> 00:06:47,019
de mis células y voy a cortar con unos enzimas de restricción el fragmento que me interesa, con dos enzimas de restricción o un único enzima de restricción, en la parte de delante, cinco prima y la parte de atrás, tres prima, del fragmento que me interesa y lo voy a purificar, de tal manera que a partir del DNA genómico, yo no amplifico nada, no estoy amplificando, sino que estoy aislando y purificando,

52
00:06:48,019 --> 00:07:16,740
mi fragmento, ¿cómo lo hago?, cortándolo directamente de la molécula de DNA genómico, una vez ya tengo aislado y purificado este fragmento, lo que voy a hacer va a ser insertarlo, ¿en qué lo voy a insertar?, lo inserto en un vector, aquí nos han puesto el ejemplo de un fragmento de DNA genómico eucariota, que lo voy a insertar en un vector bacteriano,

53
00:07:16,740 --> 00:07:17,939
¿veis que esto es una bacteria?

54
00:07:18,019 --> 00:07:48,000
o representa una bacteria, donde tiene su DNA cromosómico, que sabemos que es circular y muy grande y también contiene moléculas circulares bicatenarias más pequeñas, que son los plásmidos, yo a partir de este plásmido lo puedo linearizar, es decir, también lo puedo cortar y en lugar de este fragmento propio del plásmido, lo voy a sustituir por mi fragmento de intestino,

55
00:07:48,019 --> 00:08:17,019
de tal manera que voy a obtener una molécula híbrida, híbrida en el sentido de que tiene una parte plasmídica bacteriana y una parte eucariota, en este caso, que lleva el inserto, ¿de acuerdo?, a este fragmento de interés, y ya vamos entrando en terminología de clonación molecular, a este fragmento de interés lo llamamos inserto, ¿de acuerdo?,

56
00:08:18,020 --> 00:08:43,500
pues cuando hablemos del inserto queremos referirnos a este fragmento de DNA, ¿por qué lo llamamos inserto?, porque lo vamos a insertar, ¿dónde lo vamos a insertar?, en un vector, este plásmido es el vector, ya veremos que hay muchos tipos de vectores, en este caso, este plásmido bacteriano es nuestro vector, en este vector voy a introducir el inserto,

57
00:08:43,500 --> 00:08:47,500
¿de acuerdo?, y voy a obtener lo que llamamos un vector recto.

58
00:08:48,019 --> 00:09:10,659
El vector recto es el vector recombinante, por tanto, tenemos el inserto, tenemos el vector y tenemos el vector recombinante, que es aquel vector que ha introducido, que tiene en su secuencia insertada el fragmento, insertado el fragmento de interés, el inserto, ¿de acuerdo?, vale.

59
00:09:11,059 --> 00:09:17,659
El segundo paso, una vez ya he obtenido mi vector recombinante, es introducirlo.

60
00:09:18,019 --> 00:09:47,500
De nuevo, en células que llamamos hospedadoras, células vivas hospedadoras, como este es un plásmido bacteriano, lo normal es este plásmido meterlo en células de origen bacteriano, bacterias, no son bacterias cualquiera, son bacterias que están tratadas y se le llaman bacterias competentes, todo esto lo veremos más adelante en el tema.

61
00:09:48,019 --> 00:09:56,639
El segundo paso es la introducción del vector recombinante en la célula hospedadora.

62
00:09:56,980 --> 00:10:11,620
El tercer paso es la selección y multiplicación, es decir, ahora esta bacteria que ha introducido y tiene dentro el vector recombinante lo llamamos clon recombinante.

63
00:10:11,939 --> 00:10:17,699
Ahora ya es un clon recombinante que lo voy a poner en cultivo para que se pueda dividir y obtener millones.

64
00:10:18,019 --> 00:10:28,840
Millones y millones y millones de copias, ¿vale?, de clones exactamente idénticos a esta célula recombinante, a este clon recombinante, ¿de acuerdo?

65
00:10:30,559 --> 00:10:44,519
Claro, uno puede decir, sí, perfecto, pero ¿cómo diferencio yo aquellas bacterias que son recombinantes y tienen el vector recombinante de aquellas bacterias que no lo han introducido?

66
00:10:45,980 --> 00:10:48,000
Por eso, vamos a verlo ahora más adelante.

67
00:10:48,019 --> 00:10:51,179
Más adelante necesitamos un proceso de selección.

68
00:10:51,559 --> 00:11:04,779
Hay que seleccionar de todas las bacterias que tenga al final, voy a seleccionar las que tengan el clon recombinante y las otras las voy a, bueno, me las voy a cargar, ¿de acuerdo?

69
00:11:04,879 --> 00:11:05,860
Las voy a alisar.

70
00:11:06,960 --> 00:11:09,379
Ya veremos qué métodos de selección tenemos.

71
00:11:09,379 --> 00:11:14,819
Por tanto, primer paso, hemos obtenido el vector recombinante.

72
00:11:15,079 --> 00:11:17,379
En el segundo obtenemos el clon recombinante.

73
00:11:18,019 --> 00:11:25,960
El tercer paso es la multiplicación, división celular y la selección.

74
00:11:25,960 --> 00:11:44,919
Y por último, una vez ya tengo todas mis células seleccionadas de tal manera que yo sé que todas las células son recombinantes, ahora las puedo a todas alisar y purificar de ahí el vector recombinante, volver a cortarlo,

75
00:11:44,919 --> 00:11:46,919
y ya obtendría...

76
00:11:48,019 --> 00:11:53,120
El fragmento, recupero el inserto, el fragmento amplificado.

77
00:11:53,779 --> 00:12:02,559
Si recordáis, partía de un clon que tiene un único fragmento, un único inserto con un plásmido.

78
00:12:02,559 --> 00:12:06,500
Después de dejarlas en cultivo in vitro, ¿de acuerdo?

79
00:12:06,600 --> 00:12:17,559
De cultivo in vitro, voy a tener millones y millones de bacterias y por tanto millones y millones y millones de copias de este fragmento.

80
00:12:18,019 --> 00:12:23,019
Que yo ahora puedo alisar estas células y obtener de nuevo este fragmento.

81
00:12:23,019 --> 00:12:38,019
Por tanto, como veis, la clonación molecular es una técnica de amplificación in vivo de un fragmento determinado de cDNA o DNA genómico, que me interesa.

82
00:12:38,019 --> 00:12:40,019
¿De acuerdo?

83
00:12:42,019 --> 00:12:47,019
¿Qué ventajas tiene la clonación molecular?

84
00:12:48,019 --> 00:12:58,019
Porque claro, uno puede decir, pero si tengo que purificar y aislar el fragmento, luego debo introducirlo en un plásmido.

85
00:12:58,019 --> 00:13:03,019
Este plásmido lo tengo que introducir en estas células.

86
00:13:03,019 --> 00:13:06,019
Debo dejar que se multipliquen.

87
00:13:06,019 --> 00:13:14,019
Luego tengo que seleccionar estas células y más adelante, recuperar el fragmento amplificado,

88
00:13:14,019 --> 00:13:18,019
pues seguramente puedo estar fácilmente una semana en la clonación molecular.

89
00:13:18,019 --> 00:13:26,019
Para hacer lo mismo que una PCR podría hacer en dos o tres horitas de trabajo.

90
00:13:26,019 --> 00:13:28,019
¿De acuerdo?

91
00:13:28,019 --> 00:13:30,019
Sí, eso es cierto.

92
00:13:30,019 --> 00:13:41,019
Es un proceso mucho más largo, pero conlleva unas ventajas y unas diferencias que veremos ahora después con respecto a las técnicas de PCR.

93
00:13:41,019 --> 00:13:47,019
La primera es que, la primera ventaja es que podemos obtener cantidades ilimitadas de la secuencia de interés.

94
00:13:48,019 --> 00:13:59,019
Es decir, yo estas células, esta célula la puedo cultivar en un matraz aforado, que son bacterias, de 250 mililitros.

95
00:13:59,019 --> 00:14:02,019
O en un matraz aforado de 500 mililitros.

96
00:14:02,019 --> 00:14:06,019
O en un matraz aforado de 1000 mililitros, por tanto de un litro.

97
00:14:06,019 --> 00:14:10,019
O en un matraz aforado de 2 litros, que no sé si existen.

98
00:14:10,019 --> 00:14:14,019
O en un tanque industrial de 600 litros.

99
00:14:14,019 --> 00:14:16,019
Lo que quiero decir es que,

100
00:14:16,019 --> 00:14:22,019
dependiendo del volumen de medio de cultivo en el cual tengo estas células,

101
00:14:22,019 --> 00:14:30,019
puedo obtener trillones y trillones y trillones de células y por tanto de copias amplificadas.

102
00:14:30,019 --> 00:14:41,019
Esta cantidad ilimitada de amplificación, esta amplificación ilimitada de una secuencia de interés, no puedo realizarlo con la PCR.

103
00:14:41,019 --> 00:14:45,019
La clonación me permite también,

104
00:14:45,019 --> 00:14:49,019
me permite también la clonación de secuencias de DNA de gran tamaño.

105
00:14:49,019 --> 00:14:54,019
Por PCR puedo amplificar un tamaño máximo de 35 kilobases.

106
00:14:54,019 --> 00:14:56,019
¿De acuerdo? 35 mil letras.

107
00:14:56,019 --> 00:15:05,019
Aquí puedo, ya lo veremos, puedo incluso tener insertos, insertos de un millón de pares de bases, una megabase.

108
00:15:05,019 --> 00:15:06,019
¿De acuerdo?

109
00:15:06,019 --> 00:15:14,019
Y que son, ya lo veremos ahora, porque los puedo introducir en vectores muy grandes que los llamamos cromosomas.

110
00:15:15,019 --> 00:15:17,019
¿De acuerdo? Unos cromosomas artificiales.

111
00:15:17,019 --> 00:15:19,019
Ojo, que lo veremos ahora después.

112
00:15:19,019 --> 00:15:20,019
Tercera ventaja.

113
00:15:20,019 --> 00:15:27,019
Puedo crear librerías genómicas y librerías de DNA complementario, de cDNA.

114
00:15:27,019 --> 00:15:35,019
Esto lo veremos en un apartado exclusivo para las librerías o bibliotecas de DNA.

115
00:15:35,019 --> 00:15:43,019
Y por último puedo producir proteínas, hormonas y obtener organismos transgénicos, terapia génica, etcétera, etcétera.

116
00:15:43,019 --> 00:15:45,019
Es decir, las aplicaciones.

117
00:15:45,019 --> 00:15:56,019
Las aplicaciones que tiene la clonación molecular son, bueno, tiene una serie de aplicaciones que son imposibles de conseguir con las técnicas de PCR.

118
00:15:56,019 --> 00:15:58,019
Todo esto ya lo veremos.

119
00:15:58,019 --> 00:16:02,019
Es decir, mirad, ¿cómo que puedo producir proteínas?

120
00:16:02,019 --> 00:16:13,019
Pues mirad, sabéis que hay una enfermedad que se llama la diabetes, que la sufren muchas personas en nuestra población, que lo que ocurre es que les falta el gen de la insulina,

121
00:16:13,019 --> 00:16:24,019
tienen mutaciones o tienen una producción baja de insulina y tienen que administrarse insulina varias veces al día o últimamente los tratamientos actuales es una vez al día.

122
00:16:24,019 --> 00:16:26,019
¿De dónde viene esa insulina?

123
00:16:26,019 --> 00:16:28,019
Esa insulina es una proteína.

124
00:16:28,019 --> 00:16:34,019
La insulina es una proteína, es una hormona proteica, muy pequeñita, tiene nueve aminoácidos.

125
00:16:34,019 --> 00:16:36,019
Esa insulina, ¿cómo se ha conseguido?

126
00:16:36,019 --> 00:16:38,019
Pues es una insulina recombinante.

127
00:16:38,019 --> 00:16:42,019
Es decir, es una insulina que hemos aislado su gen.

128
00:16:42,019 --> 00:16:47,019
Lo hemos clonado en un plásmido, lo hemos metido en bacterias.

129
00:16:47,019 --> 00:16:55,019
Ojo, esta bacteria en su interior ahora tiene un gen eucariota humano, que es el gen de la insulina.

130
00:16:55,019 --> 00:17:11,019
Y por las características del plásmido voy a multiplicar estas células y voy a hacer que la maquinaria de la célula sea capaz de leer y transcribir este gen.

131
00:17:11,019 --> 00:17:14,019
Por tanto...

132
00:17:14,019 --> 00:17:18,019
Las baterías las voy a utilizar como biofactorías.

133
00:17:18,019 --> 00:17:24,019
De tal manera que una vez haya introducido el gen de la insulina voy a obligar a todas estas bacterias

134
00:17:24,019 --> 00:17:29,019
a que lean, transcriban el gen y

135
00:17:29,019 --> 00:17:33,019
produzcan la proteína con sus ribosomas.

136
00:17:33,019 --> 00:17:39,019
De tal manera que voy a tener a 300 ayudantes, 300 soldaditos,

137
00:17:39,019 --> 00:17:44,240
como trillones de biofactorías que van a producir insulina

138
00:17:44,240 --> 00:17:46,180
y la van a secretar al medio de cultivo.

139
00:17:46,700 --> 00:17:49,420
De tal manera que yo ahora puedo recoger el medio de cultivo,

140
00:17:49,420 --> 00:17:56,740
aislar y purificar la insulina y prepararla en plumas o en bolígrafos

141
00:17:56,740 --> 00:17:58,920
para los pacientes de diabetes.

142
00:17:59,339 --> 00:18:06,359
Esta aplicación es, por supuesto, impensable en técnicas de PCR

143
00:18:06,360 --> 00:18:09,020
porque son técnicas únicamente de amplificación.

144
00:18:09,980 --> 00:18:14,300
Aquí, además de amplificar ese fragmento, puedo hacer que las bacterias hagan más cosas.

145
00:18:14,300 --> 00:18:19,260
Por tanto, la clonación molecular tiene una serie de aplicaciones

146
00:18:19,260 --> 00:18:27,340
mucho más amplias y de mayor aplicación clínica, por ejemplo, que las técnicas de PCR.

147
00:18:29,320 --> 00:18:33,520
Aquí el libro os pone esta tabla. Está muy bien, una tabla comparativa.

148
00:18:34,420 --> 00:18:36,300
Si no la hubiera puesto el libro, os...

149
00:18:36,360 --> 00:18:38,700
os hubiera pedido que la hicierais vosotros.

150
00:18:39,280 --> 00:18:41,080
Sabemos que es clonación molecular.

151
00:18:41,200 --> 00:18:45,520
La primera diferencia es que esta es in vivo y esta es in vitro, por supuesto.

152
00:18:45,520 --> 00:18:49,040
Aquí el fragmento en clonación molecular, el fragmento de interés,

153
00:18:49,560 --> 00:18:53,520
lo introducimos en una célula viva y vamos a aprovechar su maquinaria replicativa

154
00:18:54,140 --> 00:18:55,460
para amplificarlo.

155
00:18:56,200 --> 00:19:00,620
Y aquí, sin embargo, el DNA lo vamos a amplificar in vitro, en un tubo de ensayo,

156
00:19:01,340 --> 00:19:05,980
en condiciones artificiales que las vamos a generar en nuestro tubo de PCR.

157
00:19:06,360 --> 00:19:06,840
¿De acuerdo?

158
00:19:07,140 --> 00:19:10,320
Por tanto, un contexto in vivo, un contexto in vitro.

159
00:19:11,740 --> 00:19:16,320
La clonación molecular es una técnica manual y dura varios días, ya hemos dicho,

160
00:19:17,160 --> 00:19:18,480
fácilmente una semana.

161
00:19:19,820 --> 00:19:24,500
Mientras que la PCR es automatizada, puede ser automatizada, de hecho,

162
00:19:24,940 --> 00:19:30,740
existen robots que realizan las PCRs introduciendo los reactivos,

163
00:19:30,960 --> 00:19:34,580
hacen la PCR, corren el gel de agarosa y nos dan el resultado.

164
00:19:34,580 --> 00:19:36,080
Y eso en una...

165
00:19:36,360 --> 00:19:36,900
en unas horitas.

166
00:19:37,380 --> 00:19:37,660
¿De acuerdo?

167
00:19:37,980 --> 00:19:45,340
En clonación molecular, esta técnica nos permite obtener prácticamente cualquier cantidad de DNA,

168
00:19:45,520 --> 00:19:47,060
cantidades ingentes de DNA.

169
00:19:47,760 --> 00:19:52,440
Mientras que aquí, la cantidad que obtenemos de amplicones,

170
00:19:52,880 --> 00:19:56,520
de amplicones, varía dependiendo del número de ciclos,

171
00:19:56,640 --> 00:20:00,220
pero hay un número de ciclos máximo, que son 40, acordaos.

172
00:20:00,660 --> 00:20:00,940
¿De acuerdo?

173
00:20:00,940 --> 00:20:05,280
A partir de 40 ciclos, la TAC polimerasa se empieza ya a deteriorar

174
00:20:05,280 --> 00:20:06,340
y ya no se...

175
00:20:06,360 --> 00:20:07,040
no se especifica.

176
00:20:07,300 --> 00:20:07,600
¿De acuerdo?

177
00:20:09,260 --> 00:20:13,440
Y por último, la clonación molecular nos permite amplificar secuencias de DNA

178
00:20:13,440 --> 00:20:16,780
larguísimas, incluso millones de pares de bases,

179
00:20:17,240 --> 00:20:24,620
mientras que aquí, el amplicón máximo, las PCRs de cadena larga, ¿de acuerdo?

180
00:20:25,900 --> 00:20:32,320
Pues el tamaño máximo es de unas 35 kilobases, 35.000 pares de bases.

181
00:20:32,540 --> 00:20:32,800
¿De acuerdo?

182
00:20:33,360 --> 00:20:36,340
Frente a los millones de pares de bases que se pueden obtener,

183
00:20:36,360 --> 00:20:46,100
es importante conocer las similitudes entre ambas técnicas

184
00:20:46,100 --> 00:20:49,980
y las diferencias para saber cuándo puedo utilizar una,

185
00:20:50,280 --> 00:20:51,640
cuándo debo utilizar la otra.

186
00:20:52,040 --> 00:20:52,340
¿De acuerdo?

187
00:20:53,420 --> 00:20:57,680
No sería raro que preguntara algunas cosas relacionadas con esto.

188
00:20:58,640 --> 00:21:02,260
Vamos a ver ahora los componentes de la clonación,

189
00:21:02,520 --> 00:21:05,200
es decir, qué elementos, qué componentes necesitamos

190
00:21:05,200 --> 00:21:06,340
para realizar una clonación.

191
00:21:06,360 --> 00:21:10,240
Lo primero, ya hemos ido hablando de algunos de ellos,

192
00:21:10,460 --> 00:21:12,800
lo primero que necesitamos son vectores de clonación.

193
00:21:13,160 --> 00:21:14,540
¿Qué es un vector de clonación?

194
00:21:15,040 --> 00:21:18,120
De forma genérica, nosotros, y tiro para atrás,

195
00:21:18,860 --> 00:21:22,740
aquí hemos hablado de un caso particular, un ejemplo particular,

196
00:21:23,120 --> 00:21:27,920
en el que hemos utilizado un vector bacteriano, que es un plásmido,

197
00:21:28,400 --> 00:21:30,720
y como células hospedadoras, bacterias.

198
00:21:31,100 --> 00:21:34,400
Pero podemos utilizar otro tipo de vectores, que los veremos ahora,

199
00:21:34,400 --> 00:21:36,180
y también podemos,

200
00:21:36,360 --> 00:21:38,360
y también podemos introducirlos en otro tipo de células.

201
00:21:39,740 --> 00:21:43,600
Pues un vector de clonación, de forma genérica, son moléculas de DNA

202
00:21:43,600 --> 00:21:48,400
que pueden replicarse autónomamente en una célula huésped.

203
00:21:49,300 --> 00:21:54,840
Por tanto, una célula huésped, yo puedo introducir un plásmido o un vector,

204
00:21:55,220 --> 00:21:57,720
así vamos a hablar de forma genérica, un vector,

205
00:21:58,160 --> 00:22:03,120
lo introduzco en esa célula y él por sí solo se puede replicar dentro de la célula,

206
00:22:03,120 --> 00:22:06,340
de tal manera que de una copia de ese vector pueda tener más.

207
00:22:06,360 --> 00:22:12,360
Primera característica, por tanto, de los vectores deben ser autorreplicativos.

208
00:22:12,560 --> 00:22:19,760
Y segunda característica, que permitan que yo le pueda insertar un DNA extraño

209
00:22:19,760 --> 00:22:24,360
sin que pierdan esa capacidad de replicación autónoma.

210
00:22:25,180 --> 00:22:28,360
Son las dos características que le voy a pedir a cualquier molécula

211
00:22:28,960 --> 00:22:31,740
para que pueda servirme de vector de clonación.

212
00:22:32,740 --> 00:22:34,880
Ya sabéis que este DNA,

213
00:22:36,360 --> 00:22:40,200
que no es propio, sino que es extraño para el vector,

214
00:22:40,380 --> 00:22:42,700
porque no es suyo, no es de su secuencia,

215
00:22:43,240 --> 00:22:44,760
lo llamamos inserto.

216
00:22:44,880 --> 00:22:49,120
Inserto es el fragmento de DNA que voy a clonar en el vector.

217
00:22:50,320 --> 00:22:51,060
¿De acuerdo?

218
00:22:52,200 --> 00:22:56,060
¿Qué características deben tener los vectores de clonación?

219
00:22:56,240 --> 00:22:58,500
Esta parte es muy importante.

220
00:22:58,980 --> 00:22:59,300
¿De acuerdo?

221
00:23:01,040 --> 00:23:02,360
Cuatro características fundamentales.

222
00:23:02,860 --> 00:23:06,220
Todos los vectores de clonación, todos, sin excepción,

223
00:23:06,360 --> 00:23:10,440
ninguna, deben contener estas cuatro características,

224
00:23:10,660 --> 00:23:12,660
estos cuatro componentes en su secuencia.

225
00:23:13,660 --> 00:23:13,980
¿De acuerdo?

226
00:23:14,300 --> 00:23:14,880
Por tanto,

227
00:23:15,820 --> 00:23:20,580
estas características son aspectos que debo tener en cuenta

228
00:23:20,580 --> 00:23:24,300
para que una molécula de DNA la pueda utilizar como vector.

229
00:23:24,800 --> 00:23:27,000
Es decir, ¿cómo elijo el vector?

230
00:23:27,880 --> 00:23:31,940
Pues primero, para que sea un vector, debe cumplir estas cuatro condiciones.

231
00:23:31,940 --> 00:23:35,880
Si no cumple alguna de ellas, no es vector.

232
00:23:35,880 --> 00:23:38,200
Y no lo voy a utilizar para clonación molécula.

233
00:23:38,640 --> 00:23:42,340
Primero, debe contener un origen de replicación.

234
00:23:42,860 --> 00:23:47,880
Si os acordáis, para que un fragmento de DNA se pueda replicar,

235
00:23:48,680 --> 00:23:50,580
tanto si es bacteriano como eucariota,

236
00:23:51,100 --> 00:23:52,880
requiere de un origen de replicación.

237
00:23:53,660 --> 00:23:56,880
Si os acordáis del tema 2, ya vimos esto,

238
00:23:57,780 --> 00:24:00,280
y en bacterias lo llamábamos el oricé,

239
00:24:00,500 --> 00:24:04,880
es una secuencia donde se va a anclar la maquinaria de replicación,

240
00:24:04,880 --> 00:24:05,480
y se va a anclar la maquinaria de replicación,

241
00:24:05,880 --> 00:24:09,500
de tal manera que a partir del origen de replicación

242
00:24:09,500 --> 00:24:10,880
se va a replicar toda la molécula.

243
00:24:12,040 --> 00:24:14,880
Por tanto, si yo quiero que el vector sea autorreplicativo,

244
00:24:16,460 --> 00:24:18,540
debe contener un origen de replicación.

245
00:24:18,800 --> 00:24:21,700
El origen de replicación, ya veremos, puede ser bacteriano,

246
00:24:21,900 --> 00:24:26,420
puede ser eucariota, dependiendo de la célula donde yo lo vaya a meter,

247
00:24:27,120 --> 00:24:28,520
pondré uno o pondré otro.

248
00:24:29,640 --> 00:24:34,880
Segunda característica, debe contener un sitio de inserción múltiple.

249
00:24:34,880 --> 00:24:38,680
Es lo que llamamos un polilínquer, ¿de acuerdo?

250
00:24:39,000 --> 00:24:42,580
Entonces, en la secuencia del vector va a haber una región,

251
00:24:43,140 --> 00:24:44,080
lo vamos a ver ahora,

252
00:24:45,500 --> 00:24:51,100
una región que va a ser la región donde se va a insertar el DNA

253
00:24:51,100 --> 00:24:53,640
que queremos amplificar, ¿de acuerdo?

254
00:24:53,760 --> 00:24:55,260
Es lo que llamamos el polilínquer.

255
00:24:55,780 --> 00:24:57,880
Y este polilínquer está formado,

256
00:24:59,080 --> 00:25:01,280
tiene un poquito hacia adelante, por aquí se ve muy bien,

257
00:25:02,280 --> 00:25:04,560
aquí tenemos un plásmido,

258
00:25:04,880 --> 00:25:06,660
vamos a volver a repasar ahora después,

259
00:25:07,940 --> 00:25:10,360
donde tenemos el origen de replicación

260
00:25:10,360 --> 00:25:14,120
y tenemos un polilínquer, aquí lo tenemos,

261
00:25:14,120 --> 00:25:22,100
que es una región en la cual encontramos la secuencia,

262
00:25:22,380 --> 00:25:25,700
su secuencia, la secuencia de esta región,

263
00:25:26,060 --> 00:25:29,280
no es ni más ni menos que la secuencia de restricción

264
00:25:29,280 --> 00:25:33,420
de un montón de enzimas de restricción una detrás de la otra.

265
00:25:34,260 --> 00:25:34,860
¿Os acordáis?

266
00:25:34,880 --> 00:25:42,120
Los enzimas de restricción eran aquellos enzimas que se unían al DNA

267
00:25:42,120 --> 00:25:46,480
y eran capaces de reconocer una secuencia diana

268
00:25:46,480 --> 00:25:50,720
o secuencia de restricción y cortar el DNA.

269
00:25:51,300 --> 00:25:53,620
De tal manera que en este polilínquer,

270
00:25:54,240 --> 00:25:56,240
este polilínquer en concreto,

271
00:25:56,700 --> 00:26:00,400
puede ser reconocido por todos estos enzimas de restricción.

272
00:26:00,820 --> 00:26:01,520
¿Por qué?

273
00:26:01,520 --> 00:26:03,820
Porque aquí una detrás de otra

274
00:26:03,820 --> 00:26:04,860
están todos los polilínquers,

275
00:26:04,880 --> 00:26:07,700
todas las secuencias específicas

276
00:26:07,700 --> 00:26:10,440
que reconocen todos estos enzimas de restricción.

277
00:26:10,740 --> 00:26:13,380
Por tanto, para cortar este vector,

278
00:26:13,600 --> 00:26:15,560
como si fuera con unas tijeras,

279
00:26:15,740 --> 00:26:19,040
yo puedo utilizar cualquiera de estos enzimas de restricción.

280
00:26:19,480 --> 00:26:22,100
Cualquiera de ellos van a ir chequeando por aquí

281
00:26:22,100 --> 00:26:23,700
dónde está su secuencia diana

282
00:26:23,700 --> 00:26:25,560
y ahí lo van a cortar.

283
00:26:26,380 --> 00:26:28,800
De tal manera que una vez yo lo haya cortado,

284
00:26:28,980 --> 00:26:31,120
aquí en este punto de corte,

285
00:26:31,120 --> 00:26:34,280
una vez este plásmido ya lo he linearizado,

286
00:26:34,880 --> 00:26:36,880
ya no es circular, lo he linearizado,

287
00:26:36,880 --> 00:26:38,880
aquí es donde se va a insertar

288
00:26:38,880 --> 00:26:40,880
el fragmento que quiero amplificar.

289
00:26:42,640 --> 00:26:43,580
¿De acuerdo?

290
00:26:43,580 --> 00:26:46,580
Por tanto, un origen de replicación,

291
00:26:46,580 --> 00:26:49,580
el polilínquer,

292
00:26:49,580 --> 00:26:51,580
un marcador de selección

293
00:26:51,580 --> 00:26:53,580
y un marcador de identificación.

294
00:26:53,580 --> 00:26:55,580
Ya hemos dicho,

295
00:26:55,580 --> 00:26:57,580
y tiro otra vez para atrás,

296
00:26:57,580 --> 00:27:01,580
que una vez que ya he introducido el vector

297
00:27:01,580 --> 00:27:03,580
en la célula hospedadora

298
00:27:03,580 --> 00:27:04,740
y se ha amplificado,

299
00:27:04,740 --> 00:27:06,740
debo de llevar a cabo un proceso de selección.

300
00:27:06,740 --> 00:27:08,740
Este proceso de selección

301
00:27:08,740 --> 00:27:10,740
lo puedo llevar a cabo gracias

302
00:27:10,740 --> 00:27:12,740
a que en el vector tengo

303
00:27:12,740 --> 00:27:14,740
un marcador de selección

304
00:27:14,740 --> 00:27:16,740
y un marcador de identificación.

305
00:27:16,740 --> 00:27:18,740
¿Qué es el marcador de selección

306
00:27:18,740 --> 00:27:20,740
y el marcador de identificación?

307
00:27:20,740 --> 00:27:22,740
Son dos genes.

308
00:27:22,740 --> 00:27:24,740
Dos genes que yo he introducido en el vector.

309
00:27:24,740 --> 00:27:26,740
El marcador de selección

310
00:27:26,740 --> 00:27:28,740
me va a permitir determinar

311
00:27:28,740 --> 00:27:30,740
cuál de esas células,

312
00:27:30,740 --> 00:27:32,740
quién lleva el vector.

313
00:27:32,740 --> 00:27:34,740
¿Vale?

314
00:27:34,740 --> 00:27:36,740
Por tanto,

315
00:27:36,740 --> 00:27:38,740
de todas las bacterias,

316
00:27:38,740 --> 00:27:40,740
¿cuáles han introducido el vector?

317
00:27:40,740 --> 00:27:42,740
Tienen el vector.

318
00:27:42,740 --> 00:27:44,740
Pero, ¡ojo!

319
00:27:44,740 --> 00:27:46,740
Ese vector puede ser vector normal,

320
00:27:46,740 --> 00:27:48,740
vacío,

321
00:27:48,740 --> 00:27:50,740
o puede ser vector recombinante.

322
00:27:50,740 --> 00:27:52,740
Por tanto,

323
00:27:52,740 --> 00:27:54,740
y esto no lo he explicado antes,

324
00:27:54,740 --> 00:27:56,740
lo explico ahora.

325
00:27:56,740 --> 00:27:58,740
Algunas de estas células,

326
00:27:58,740 --> 00:28:00,740
cuando yo hago este proceso

327
00:28:00,740 --> 00:28:02,740
de insertar el fragmento

328
00:28:02,740 --> 00:28:04,740
en el plásmido,

329
00:28:04,740 --> 00:28:06,740
algunos de estos plásmidos

330
00:28:06,740 --> 00:28:08,740
no lo introducen

331
00:28:08,740 --> 00:28:10,740
y lo único que hacen es

332
00:28:10,740 --> 00:28:12,740
se vuelven a unir.

333
00:28:12,740 --> 00:28:14,740
De tal manera que tendré plásmidos vacíos

334
00:28:14,740 --> 00:28:16,740
y plásmidos recombinantes.

335
00:28:16,740 --> 00:28:18,740
Vectores vacíos,

336
00:28:18,740 --> 00:28:20,740
vectores recombinantes.

337
00:28:20,740 --> 00:28:22,740
Cuando yo coja esta mezcla

338
00:28:22,740 --> 00:28:24,740
y la introduzca dentro de las células,

339
00:28:24,740 --> 00:28:26,740
habrá células que introducirán

340
00:28:26,740 --> 00:28:28,740
el vector recombinante

341
00:28:28,740 --> 00:28:30,740
y células que introducirán vector vacío.

342
00:28:30,740 --> 00:28:32,740
¿De acuerdo?

343
00:28:32,740 --> 00:28:34,740
El marcador de selección

344
00:28:34,740 --> 00:28:36,740
me permite discriminar

345
00:28:36,740 --> 00:28:38,740
las células vacías

346
00:28:38,740 --> 00:28:40,740
que no tienen vector

347
00:28:40,740 --> 00:28:42,740
de las células que llevan vector.

348
00:28:42,740 --> 00:28:44,740
Y el marcador de identificación

349
00:28:44,740 --> 00:28:46,740
me permite determinar

350
00:28:46,740 --> 00:28:48,740
dentro de las que llevan vector

351
00:28:48,740 --> 00:28:50,740
las que llevan vector vacío

352
00:28:50,740 --> 00:28:52,740
de las que llevan vector recombinante.

353
00:28:52,740 --> 00:28:54,740
¿De acuerdo?

354
00:28:54,740 --> 00:28:56,740
Todo esto lo vamos a ver

355
00:28:56,740 --> 00:28:58,740
ahora más adelante.

356
00:29:02,740 --> 00:29:04,740
¿Qué tipos de vectores tenemos?

357
00:29:04,740 --> 00:29:06,740
El más utilizado,

358
00:29:06,740 --> 00:29:08,740
los más utilizados son los plásmidos

359
00:29:08,740 --> 00:29:10,740
que ya sabemos que son moléculas

360
00:29:10,740 --> 00:29:12,740
de DNA circular,

361
00:29:12,740 --> 00:29:14,740
bicatenario,

362
00:29:14,740 --> 00:29:16,740
que poseen un origen de replicación

363
00:29:16,740 --> 00:29:18,740
¿De acuerdo?

364
00:29:18,740 --> 00:29:20,740
Y que sabemos

365
00:29:20,740 --> 00:29:22,740
que tienen capacidad

366
00:29:22,740 --> 00:29:24,740
de autorreplicación,

367
00:29:24,740 --> 00:29:26,740
replicación autónoma.

368
00:29:26,740 --> 00:29:28,740
Normalmente todos estos plásmidos

369
00:29:28,740 --> 00:29:30,740
son de origen bacteriano,

370
00:29:30,740 --> 00:29:32,740
contienen un origen de replicación bacteriano,

371
00:29:32,740 --> 00:29:34,740
es un oricén,

372
00:29:34,740 --> 00:29:36,740
y suelen llevar

373
00:29:36,740 --> 00:29:38,740
incorporado, porque nosotros

374
00:29:38,740 --> 00:29:40,740
le solemos incorporar,

375
00:29:40,740 --> 00:29:42,740
un gen de resistencia a un antibiótico.

376
00:29:42,740 --> 00:29:44,740
¿De acuerdo?

377
00:29:44,740 --> 00:29:46,740
Un gen de resistencia a un antibiótico.

378
00:29:48,740 --> 00:29:50,740
En este caso es un gen de resistencia

379
00:29:50,740 --> 00:29:52,740
a ampicilina.

380
00:29:52,740 --> 00:29:54,740
De tal manera que

381
00:29:54,740 --> 00:29:56,740
este va a ser mi marcador de selección.

382
00:29:58,740 --> 00:30:00,740
¿Por qué es el marcador de selección?

383
00:30:00,740 --> 00:30:02,740
¿Por qué es el marcador de selección?

384
00:30:02,740 --> 00:30:04,740
Bueno,

385
00:30:04,740 --> 00:30:06,740
esto lo voy a explicar un poquito más adelante.

386
00:30:06,740 --> 00:30:08,740
¿De acuerdo?

387
00:30:08,740 --> 00:30:10,740
Pero este sería mi marcador de selección.

388
00:30:10,740 --> 00:30:12,740
De tal manera que aquí tengo el plásmido

389
00:30:12,740 --> 00:30:14,740
que va a ser mi vector.

390
00:30:14,740 --> 00:30:16,740
Los plásmidos se utilizan muchísimo como vectores.

391
00:30:16,740 --> 00:30:18,740
Ya lo he dicho.

392
00:30:18,740 --> 00:30:20,740
¿Cómo seleccionamos cuál es el plásmido adecuado?

393
00:30:20,740 --> 00:30:22,740
Pues nos vamos a fijar en dos parámetros importantes.

394
00:30:22,740 --> 00:30:24,740
El primero, el tamaño del inserto.

395
00:30:24,740 --> 00:30:26,740
Hay plásmidos que admiten

396
00:30:26,740 --> 00:30:28,740
insertos

397
00:30:28,740 --> 00:30:30,740
grandes.

398
00:30:30,740 --> 00:30:32,740
Un inserto muy grande,

399
00:30:32,740 --> 00:30:34,740
de kilobases.

400
00:30:34,740 --> 00:30:36,740
Hay otros plásmidos

401
00:30:36,740 --> 00:30:38,740
que soportan

402
00:30:38,740 --> 00:30:40,740
y pueden transportar

403
00:30:40,740 --> 00:30:42,740
insertos más pequeños.

404
00:30:42,740 --> 00:30:44,740
Dependiendo del tamaño del inserto,

405
00:30:44,740 --> 00:30:46,740
elijo un plásmido u otro.

406
00:30:46,740 --> 00:30:48,740
Y en segundo lugar, el número de copias

407
00:30:48,740 --> 00:30:50,740
del plásmido por célula.

408
00:30:50,740 --> 00:30:52,740
En este ejemplo, este plásmido

409
00:30:52,740 --> 00:30:54,740
su número de copias es 3.

410
00:30:54,740 --> 00:30:56,740
Cada célula puede soportar

411
00:30:56,740 --> 00:30:58,740
3 copias

412
00:30:58,740 --> 00:31:00,740
como máximo.

413
00:31:00,740 --> 00:31:02,740
El número de copias es mucho mayor.

414
00:31:02,740 --> 00:31:04,740
Se pueden auto-replicar

415
00:31:04,740 --> 00:31:06,740
hasta 50 veces.

416
00:31:06,740 --> 00:31:08,740
Con una sola bacteria

417
00:31:08,740 --> 00:31:10,740
tendría 50 copias

418
00:31:10,740 --> 00:31:12,740
del inserto.

419
00:31:12,740 --> 00:31:14,740
De mi fragmento de interés.

420
00:31:14,740 --> 00:31:16,740
Dependiendo del tamaño del inserto

421
00:31:16,740 --> 00:31:18,740
y del número de copias del plásmido,

422
00:31:18,740 --> 00:31:20,740
voy a elegir un vector u otro.

423
00:31:20,740 --> 00:31:22,740
Aquí, por ejemplo,

424
00:31:22,740 --> 00:31:24,740
el libro nos pone estos dos ejemplos.

425
00:31:24,740 --> 00:31:26,740
Hay cientos y cientos

426
00:31:26,740 --> 00:31:28,740
de vectores plasmídicos

427
00:31:28,740 --> 00:31:30,740
disponibles.

428
00:31:30,740 --> 00:31:32,740
Para los laboratorios de

429
00:31:32,740 --> 00:31:34,740
biología molecular.

430
00:31:34,740 --> 00:31:36,740
Este de aquí, ya veis por ejemplo

431
00:31:36,740 --> 00:31:38,740
que tiene el oricé

432
00:31:38,740 --> 00:31:40,740
y tiene dos genes de resistencia.

433
00:31:40,740 --> 00:31:42,740
Un gen de resistencia

434
00:31:42,740 --> 00:31:44,740
a ampicilina y un gen de resistencia

435
00:31:44,740 --> 00:31:46,740
a tetraciclina. Ya hemos dicho antes

436
00:31:46,740 --> 00:31:48,740
que los marcadores de selección

437
00:31:48,740 --> 00:31:50,740
y los marcadores de identificación

438
00:31:50,740 --> 00:31:52,740
suelen ser genes. Genes de resistencia

439
00:31:52,740 --> 00:31:54,740
a antibióticos.

440
00:31:54,740 --> 00:31:56,740
En este caso, también lleva el gen

441
00:31:56,740 --> 00:31:58,740
de resistencia a ampicilina

442
00:31:58,740 --> 00:32:00,740
¿De acuerdo?

443
00:32:00,740 --> 00:32:02,740
Como marcador de selección.

444
00:32:02,740 --> 00:32:04,740
Lleva su oricé y aquí

445
00:32:04,740 --> 00:32:06,740
nos han puesto un gen LAGZ

446
00:32:06,740 --> 00:32:08,740
que ya veremos para qué se utiliza

447
00:32:08,740 --> 00:32:10,740
y su polilínquer. En este caso,

448
00:32:10,740 --> 00:32:12,740
este vector no tiene

449
00:32:12,740 --> 00:32:14,740
un polilínquer delimitado

450
00:32:14,740 --> 00:32:16,740
en una región muy específica y pequeñita

451
00:32:16,740 --> 00:32:18,740
sino que el polilínquer está

452
00:32:18,740 --> 00:32:20,740
a lo largo de

453
00:32:20,740 --> 00:32:22,740
toda la secuencia

454
00:32:22,740 --> 00:32:24,740
del plásmido.

455
00:32:24,740 --> 00:32:26,740
Hay diferentes tipos de plásmidos

456
00:32:26,740 --> 00:32:28,740
con diferentes características.

457
00:32:28,740 --> 00:32:30,740
Este, por ejemplo, admite

458
00:32:30,740 --> 00:32:32,740
genes pequeños

459
00:32:32,740 --> 00:32:34,740
y tiene un número de copia de 20.

460
00:32:34,740 --> 00:32:36,740
Este, en cambio, admite

461
00:32:36,740 --> 00:32:38,740
hasta 10 kilobases, 10.000

462
00:32:38,740 --> 00:32:40,740
pares de bases, que son insectos grandes

463
00:32:40,740 --> 00:32:42,740
y tiene una alta tasa

464
00:32:42,740 --> 00:32:44,740
de replicación, 500 copias por célula.

465
00:32:44,740 --> 00:32:46,740
De tal manera que si yo tengo

466
00:32:46,740 --> 00:32:48,740
500 células, pues entonces

467
00:32:48,740 --> 00:32:50,740
tendré 500 por 500

468
00:32:50,740 --> 00:32:52,740
25.000

469
00:32:52,740 --> 00:32:54,740
o 250.000, si no me equivoco

470
00:32:54,740 --> 00:32:56,740
250.000 copias

471
00:32:56,740 --> 00:32:58,740
del insecto.

472
00:32:58,740 --> 00:33:00,740
¿De acuerdo? Hemos dicho

473
00:33:00,740 --> 00:33:02,740
que los marcadores de selección

474
00:33:02,740 --> 00:33:04,740
e identificación son genes de resistencia

475
00:33:04,740 --> 00:33:06,740
ampicilina.

476
00:33:06,740 --> 00:33:08,740
¿Por qué se utilizan genes de resistencia

477
00:33:08,740 --> 00:33:10,740
ampicilina, tetraciclina, cannamicina,

478
00:33:10,740 --> 00:33:12,740
antibióticos? ¿Por qué?

479
00:33:12,740 --> 00:33:14,740
Porque eso me va a permitir seleccionar

480
00:33:14,740 --> 00:33:16,740
y tiro para atrás otra vez

481
00:33:16,740 --> 00:33:18,740
qué células

482
00:33:18,740 --> 00:33:20,740
tienen el vector.

483
00:33:20,740 --> 00:33:22,740
De tal manera que yo

484
00:33:22,740 --> 00:33:24,740
estas células, hemos dicho que una vez

485
00:33:24,740 --> 00:33:26,740
que han introducido el vector

486
00:33:26,740 --> 00:33:28,740
recombinante, estas células

487
00:33:28,740 --> 00:33:30,740
las vamos a

488
00:33:30,740 --> 00:33:32,740
poner en cultivo.

489
00:33:32,740 --> 00:33:34,740
Pero las vamos a poner en cultivo

490
00:33:34,740 --> 00:33:36,740
y en el medio de cultivo, además de todos

491
00:33:36,740 --> 00:33:38,740
los nutrientes que necesitan las bacterias

492
00:33:38,740 --> 00:33:40,740
voy a poner un antibiótico, que es

493
00:33:40,740 --> 00:33:42,740
ampicilina. De tal manera que

494
00:33:42,740 --> 00:33:44,740
sólo aquellas células que hayan

495
00:33:44,740 --> 00:33:46,740
introducido y sean

496
00:33:46,740 --> 00:33:48,740
células recombinantes, clones

497
00:33:48,740 --> 00:33:50,740
recombinantes, van a poder

498
00:33:50,740 --> 00:33:52,740
sobrevivir. ¿Por qué?

499
00:33:52,740 --> 00:33:54,740
Porque habrán incorporado

500
00:33:54,740 --> 00:33:56,740
el marcador de selección, que

501
00:33:56,740 --> 00:33:58,740
no es ni más ni menos

502
00:33:58,740 --> 00:34:00,740
que el gen de resistencia

503
00:34:00,740 --> 00:34:02,740
a la ampicilina. Es un gen

504
00:34:02,740 --> 00:34:04,740
que permite a la bacteria introducir

505
00:34:04,740 --> 00:34:06,740
la ampicilina y romperla.

506
00:34:06,740 --> 00:34:08,739
De tal manera que hace que esta bacteria

507
00:34:08,739 --> 00:34:10,739
sea resistente a la ampicilina.

508
00:34:10,739 --> 00:34:12,739
Por tanto, ¿qué bacterias

509
00:34:12,739 --> 00:34:14,739
serán resistentes a la ampicilina?

510
00:34:14,739 --> 00:34:16,739
Solamente

511
00:34:16,739 --> 00:34:18,739
aquellas que contengan el

512
00:34:18,739 --> 00:34:20,739
plásmido, el vector recombinante.

513
00:34:20,739 --> 00:34:22,739
¿De acuerdo?

514
00:34:24,739 --> 00:34:26,739
Además de plásmidos, que son los que más

515
00:34:26,739 --> 00:34:28,739
se utilizan, luego tenemos bacteriófagos.

516
00:34:28,739 --> 00:34:30,739
Es decir, virus,

517
00:34:30,740 --> 00:34:32,740
los bacteriófagos o fagos en general

518
00:34:32,740 --> 00:34:34,740
son los virus que infectan

519
00:34:34,740 --> 00:34:36,740
bacterias. Entonces, de tal

520
00:34:36,740 --> 00:34:38,740
manera que yo puedo coger un virus

521
00:34:38,740 --> 00:34:40,740
dentro de su genoma, meterle el

522
00:34:40,740 --> 00:34:42,740
fragmento de interés

523
00:34:42,740 --> 00:34:44,740
y hacer que el virus propague

524
00:34:44,740 --> 00:34:46,740
ese

525
00:34:46,740 --> 00:34:48,740
fragmento infectando a las

526
00:34:48,740 --> 00:34:50,740
bacterias. De tal manera que vaya

527
00:34:50,740 --> 00:34:52,740
introduciendo, si recordáis, por

528
00:34:52,740 --> 00:34:54,740
el ciclo lítico lisogénico

529
00:34:54,740 --> 00:34:56,740
introduzca, llega

530
00:34:56,740 --> 00:34:58,740
el virus, según

531
00:34:58,740 --> 00:35:00,740
su ciclo, llega el virus y lo

532
00:35:00,740 --> 00:35:02,740
normal es que introduzca todo

533
00:35:02,740 --> 00:35:04,740
su genoma

534
00:35:04,740 --> 00:35:06,740
y lo inserte,

535
00:35:06,740 --> 00:35:08,740
si sigue el ciclo lisogénico,

536
00:35:08,740 --> 00:35:10,740
que lo vamos a ver rápidamente,

537
00:35:10,740 --> 00:35:12,740
inserte este fragmento suyo

538
00:35:12,740 --> 00:35:14,740
de su genoma en el cromosoma

539
00:35:14,740 --> 00:35:16,740
bacteriano. ¿De acuerdo?

540
00:35:16,740 --> 00:35:18,740
De tal manera que la bacteria cuando se duplica

541
00:35:18,740 --> 00:35:20,740
va duplicando

542
00:35:20,740 --> 00:35:22,740
el genoma del

543
00:35:22,740 --> 00:35:24,740
virus. Si yo dentro del

544
00:35:24,740 --> 00:35:26,740
genoma del virus además

545
00:35:26,740 --> 00:35:28,740
he añadido aquí dentro

546
00:35:28,740 --> 00:35:30,500
mi fragmento de interés,

547
00:35:30,740 --> 00:35:32,740
utilizo como vector el virus

548
00:35:32,740 --> 00:35:34,740
y el virus va infectando bacterias,

549
00:35:34,740 --> 00:35:36,740
va introduciendo en las bacterias

550
00:35:36,740 --> 00:35:38,740
mi gen de interés

551
00:35:38,740 --> 00:35:40,740
junto con su genoma

552
00:35:40,740 --> 00:35:42,740
y a medida que se amplifican

553
00:35:42,740 --> 00:35:44,740
las bacterias, pues se va

554
00:35:44,740 --> 00:35:46,740
amplificando también el genoma del virus

555
00:35:46,740 --> 00:35:48,740
y mi inserto.

556
00:35:48,740 --> 00:35:50,740
¿De acuerdo? En determinadas

557
00:35:50,740 --> 00:35:52,740
circunstancias de este ciclo lisogénico

558
00:35:52,740 --> 00:35:54,740
un virus puede

559
00:35:54,740 --> 00:35:56,740
hacer un ciclo lítico y por tanto

560
00:35:56,740 --> 00:35:58,740
producir más viriones,

561
00:35:58,740 --> 00:36:00,740
lisar la bacteria

562
00:36:00,740 --> 00:36:02,740
y producir más virus que vayan a infectar

563
00:36:02,740 --> 00:36:04,740
más bacterias. ¿De acuerdo?

564
00:36:04,740 --> 00:36:06,740
Por tanto, puedo utilizar bacteriófagos,

565
00:36:06,740 --> 00:36:08,740
virus,

566
00:36:08,740 --> 00:36:10,740
como vectores para llevar

567
00:36:10,740 --> 00:36:12,740
mi inserto de unas células

568
00:36:12,740 --> 00:36:14,740
a otras por medio del

569
00:36:14,740 --> 00:36:16,740
ciclo de infección

570
00:36:16,740 --> 00:36:18,740
normal de los virus.

571
00:36:22,740 --> 00:36:24,740
Estos de aquí, los virus

572
00:36:24,740 --> 00:36:26,740
que siguen un ciclo lisogénico pueden

573
00:36:26,740 --> 00:36:28,740
insertar temporalmente su material genético

574
00:36:28,740 --> 00:36:30,740
como ya hemos dicho dentro del

575
00:36:30,740 --> 00:36:32,740
genoma de las bacterias.

576
00:36:32,740 --> 00:36:34,740
El que más se utiliza bacteriófago

577
00:36:34,740 --> 00:36:36,740
como vector de clonación

578
00:36:36,740 --> 00:36:38,740
es el fago lambda.

579
00:36:38,740 --> 00:36:40,740
Tenemos aquí su estructura

580
00:36:40,740 --> 00:36:42,740
¿De acuerdo? Con una región izquierda,

581
00:36:42,740 --> 00:36:44,740
una central y una derecha

582
00:36:44,740 --> 00:36:46,740
y aquí se utiliza mucho el fago lambda

583
00:36:46,740 --> 00:36:48,740
para insertar en estas

584
00:36:48,740 --> 00:36:50,740
zonas de CoR1

585
00:36:50,740 --> 00:36:52,740
que es una enzima de restricción

586
00:36:52,740 --> 00:36:54,740
para insertar los fragmentos de interés.

587
00:36:54,740 --> 00:36:56,740
¿De acuerdo?

588
00:36:56,740 --> 00:36:58,740
Muy bien.

589
00:36:58,740 --> 00:37:00,740
Tenemos los cósmidos. Los cósmidos son

590
00:37:00,740 --> 00:37:02,740
vectores híbridos que tienen

591
00:37:02,740 --> 00:37:04,740
una parte del cromosoma del fago

592
00:37:04,740 --> 00:37:06,740
y una parte del plásmido y permiten

593
00:37:06,740 --> 00:37:08,740
insertos de hasta 50.000

594
00:37:08,740 --> 00:37:10,740
pares de bases.

595
00:37:10,740 --> 00:37:12,740
Los fagémidos que también son

596
00:37:12,740 --> 00:37:14,740
vectores híbridos que están compuestos por

597
00:37:14,740 --> 00:37:16,740
un plásmido ¿De acuerdo?

598
00:37:16,740 --> 00:37:18,740
con su origen de replicación bacteriano

599
00:37:18,740 --> 00:37:20,740
y le insertamos también un origen de replicación

600
00:37:20,740 --> 00:37:22,740
del fago M13.

601
00:37:22,740 --> 00:37:24,740
Se utiliza muy poco

602
00:37:24,740 --> 00:37:26,740
los fagémidos y para

603
00:37:26,740 --> 00:37:28,740
usos muy específicos.

604
00:37:28,740 --> 00:37:30,740
Y después tenemos los cromosomas

605
00:37:30,740 --> 00:37:32,740
artificiales. Los cromosomas artificiales

606
00:37:32,740 --> 00:37:34,740
son vectores de clonación con gran

607
00:37:34,740 --> 00:37:36,740
capacidad de tal manera

608
00:37:36,740 --> 00:37:38,740
que podemos insertarles

609
00:37:38,740 --> 00:37:40,740
fragmentos enormes, de gran tamaño.

610
00:37:40,740 --> 00:37:42,740
Tenemos dos tipos diferentes.

611
00:37:42,740 --> 00:37:44,740
Le llamamos cromosomas porque son

612
00:37:44,740 --> 00:37:46,740
muy grandes pero tiene una

613
00:37:46,740 --> 00:37:48,740
estructura parecida a los cromosomas eucariotas

614
00:37:48,740 --> 00:37:50,740
pero no son cromosomas

615
00:37:50,740 --> 00:37:52,740
eucariotas. Son cromosomas

616
00:37:52,740 --> 00:37:54,740
artificiales que pueden ser bacterianos

617
00:37:54,740 --> 00:37:56,740
por tanto con toda la estructura

618
00:37:56,740 --> 00:37:58,740
de un cromosoma bacteriano

619
00:37:58,740 --> 00:38:00,740
que permiten insertos de hasta

620
00:38:00,740 --> 00:38:02,740
300 kilobases

621
00:38:02,740 --> 00:38:04,740
300.000 pares de bases

622
00:38:04,740 --> 00:38:06,740
y los artificiales de

623
00:38:06,740 --> 00:38:08,740
levaduras

624
00:38:08,740 --> 00:38:10,740
los GIST Artificial Chromosomes

625
00:38:10,740 --> 00:38:12,740
JAX en inglés

626
00:38:12,740 --> 00:38:14,740
por las siglas en inglés

627
00:38:14,740 --> 00:38:16,740
que alcanzan millones

628
00:38:16,740 --> 00:38:18,740
de pares de bases. Más

629
00:38:18,740 --> 00:38:20,740
de una megabase.

630
00:38:20,740 --> 00:38:22,740
Los hay incluso de dos megabases.

631
00:38:22,740 --> 00:38:24,740
Esto en cuanto

632
00:38:24,740 --> 00:38:26,740
a los vectores. Ya hemos dicho

633
00:38:26,740 --> 00:38:28,740
que además de los vectores y del inserto

634
00:38:28,740 --> 00:38:30,740
necesitamos

635
00:38:30,740 --> 00:38:32,740
también los vectores lanzadera.

636
00:38:32,740 --> 00:38:34,740
Se utilizan muy poco y estos vectores lanzadera

637
00:38:34,740 --> 00:38:36,740
los vamos a utilizar para meter

638
00:38:36,740 --> 00:38:38,740
un gen y que nos sirva para

639
00:38:38,740 --> 00:38:40,740
transportarlo entre dos

640
00:38:40,740 --> 00:38:42,740
tipos de células.

641
00:38:42,740 --> 00:38:44,740
Son también vectores híbridos

642
00:38:44,740 --> 00:38:46,740
contienen orígenes de replicación

643
00:38:46,740 --> 00:38:48,740
de dos hospedadores por ejemplo

644
00:38:48,740 --> 00:38:50,740
de bacterias y de células eucariotas

645
00:38:50,740 --> 00:38:52,740
o de bacterias y virus

646
00:38:52,740 --> 00:38:54,740
y solamente se utilizan

647
00:38:54,740 --> 00:38:56,740
como transbordadores.

648
00:38:56,740 --> 00:38:58,740
Para transportar el fragmento

649
00:38:58,740 --> 00:39:00,740
de un tipo de célula a otra

650
00:39:00,740 --> 00:39:02,740
utilizamos los vectores

651
00:39:02,740 --> 00:39:04,740
lanzaderas.

652
00:39:06,740 --> 00:39:08,740
Además de los vectores

653
00:39:08,740 --> 00:39:10,740
necesitamos células hospedadoras

654
00:39:10,740 --> 00:39:12,740
por supuesto.

655
00:39:12,740 --> 00:39:14,740
¿Cómo definimos las células hospedadoras?

656
00:39:14,740 --> 00:39:16,740
Pues aquellas en las que vamos a poder

657
00:39:16,740 --> 00:39:18,740
introducir el vector de clonación

658
00:39:18,740 --> 00:39:20,740
para que se pueda amplificar

659
00:39:20,740 --> 00:39:22,740
el inserto.

660
00:39:22,740 --> 00:39:24,740
Por tanto deben ser células

661
00:39:24,740 --> 00:39:26,740
que permitan

662
00:39:26,740 --> 00:39:28,740
y que puedan albergar

663
00:39:28,740 --> 00:39:30,740
vectores de clonación.

664
00:39:30,740 --> 00:39:32,740
Las cultivamos en medio

665
00:39:32,740 --> 00:39:34,740
de cultivos adecuados

666
00:39:34,740 --> 00:39:36,740
en los que se van a multiplicar

667
00:39:36,740 --> 00:39:38,740
¿De acuerdo?

668
00:39:38,740 --> 00:39:40,740
En los que se van a seleccionar

669
00:39:40,740 --> 00:39:42,740
y van a dar lugar a las células hijas.

670
00:39:42,740 --> 00:39:44,740
Todas ellas

671
00:39:44,740 --> 00:39:46,740
con la misma carga genética

672
00:39:46,740 --> 00:39:48,740
incluido el vector.

673
00:39:48,740 --> 00:39:50,740
Todas ellas van a contener el vector

674
00:39:50,740 --> 00:39:52,740
por eso las llamamos clones.

675
00:39:52,740 --> 00:39:54,740
Son clónicas a la primera célula.

676
00:39:54,740 --> 00:39:56,740
¿De acuerdo?

677
00:39:56,740 --> 00:39:58,740
Y por eso las llamamos a todas ellas

678
00:39:58,740 --> 00:40:00,740
componentes.

679
00:40:00,740 --> 00:40:02,740
Las células que más se utilizan

680
00:40:02,740 --> 00:40:04,740
son las células bacterianas, son prokaryotas

681
00:40:04,740 --> 00:40:06,740
son células

682
00:40:06,740 --> 00:40:08,740
muy, muy utilizadas

683
00:40:08,740 --> 00:40:10,740
y en ellas podemos clonar

684
00:40:10,740 --> 00:40:12,740
por supuesto plásmidos,

685
00:40:12,740 --> 00:40:14,740
fagos y cósmidos.

686
00:40:14,740 --> 00:40:16,740
¿De acuerdo?

687
00:40:16,740 --> 00:40:18,740
Son células muy fácilmente

688
00:40:20,740 --> 00:40:22,740
se pueden transformar de forma

689
00:40:22,740 --> 00:40:24,740
muy fácil

690
00:40:24,740 --> 00:40:26,740
y que son células muy versátiles

691
00:40:26,740 --> 00:40:28,740
de tal manera que además crecen

692
00:40:28,740 --> 00:40:30,740
con mucha rapidez.

693
00:40:30,740 --> 00:40:32,740
Todo esto son ventajas de las bacterias.

694
00:40:32,740 --> 00:40:34,740
Las que más se utilizan son

695
00:40:34,740 --> 00:40:36,740
Escherichia coli, hay que conocerla.

696
00:40:36,740 --> 00:40:38,740
Escherichia coli es una bacteria

697
00:40:38,740 --> 00:40:40,740
intestinal, la tenemos en el colon

698
00:40:40,740 --> 00:40:42,740
todos los seres humanos

699
00:40:42,740 --> 00:40:44,740
y la mayoría de los mamíferos

700
00:40:44,740 --> 00:40:46,740
Escherichia coli, en concreto dos cepas

701
00:40:46,740 --> 00:40:48,740
que es la cepa K12

702
00:40:48,740 --> 00:40:50,740
y la cepa DH5 alfa.

703
00:40:50,740 --> 00:40:52,740
Estas dos cepas

704
00:40:52,740 --> 00:40:54,740
se utilizan muchísimo

705
00:40:54,740 --> 00:40:56,740
y son cepas que llamamos bacterias

706
00:40:56,740 --> 00:40:58,740
competentes.

707
00:40:58,740 --> 00:41:00,740
Están tratadas

708
00:41:00,740 --> 00:41:02,740
de tal manera que

709
00:41:02,740 --> 00:41:04,740
permiten, están preparadas

710
00:41:04,740 --> 00:41:06,740
para que puedan albergar

711
00:41:06,740 --> 00:41:08,740
estos vectores de clonación.

712
00:41:08,740 --> 00:41:10,740
Y luego tenemos

713
00:41:10,740 --> 00:41:12,740
células hospedadoras eucariotas

714
00:41:12,740 --> 00:41:14,740
que pueden ser

715
00:41:14,740 --> 00:41:16,740
levaduras, células vegetales, animales

716
00:41:16,740 --> 00:41:18,740
o de mamíferos.

717
00:41:18,740 --> 00:41:20,740
¿De acuerdo?

718
00:41:20,740 --> 00:41:22,740
Por ejemplo, de levaduras

719
00:41:22,740 --> 00:41:24,740
la que más se utiliza son

720
00:41:24,740 --> 00:41:26,740
como levaduras Saccharomyces cerevisiae

721
00:41:26,740 --> 00:41:28,740
y Saccharomyces

722
00:41:28,740 --> 00:41:30,740
cerevisiae

723
00:41:30,740 --> 00:41:32,740
Hay que conocerlas.

724
00:41:32,740 --> 00:41:34,740
Saccharomyces cerevisiae

725
00:41:34,740 --> 00:41:36,740
es una levadura que se utiliza muchísimo

726
00:41:36,740 --> 00:41:38,740
como célula hospedadora eucariota.

727
00:41:38,740 --> 00:41:40,740
En células

728
00:41:40,740 --> 00:41:42,740
vegetales y animales

729
00:41:42,740 --> 00:41:44,740
las utilizamos para genes

730
00:41:44,740 --> 00:41:46,740
para insertar genes

731
00:41:46,740 --> 00:41:48,740
siempre y cuando queramos

732
00:41:48,740 --> 00:41:50,740
obtener

733
00:41:50,740 --> 00:41:52,740
plantas o animales transgénicos.

734
00:41:52,740 --> 00:41:54,740
Por tanto,

735
00:41:54,740 --> 00:41:56,740
de forma rutinaria

736
00:41:56,740 --> 00:41:58,740
no se suelen utilizar células vegetales

737
00:41:58,740 --> 00:42:00,740
solamente para amplificar

738
00:42:00,740 --> 00:42:02,740
un fragmento de DNA.

739
00:42:02,740 --> 00:42:04,740
Para amplificar un fragmento de DNA

740
00:42:04,740 --> 00:42:06,740
y obtener muchas copias

741
00:42:06,740 --> 00:42:08,740
utilizamos levaduras.

742
00:42:08,740 --> 00:42:10,740
¿Cuándo utilizaremos células vegetales y animales?

743
00:42:10,740 --> 00:42:12,740
Cuando queramos obtener plantas

744
00:42:12,740 --> 00:42:14,740
y animales transgénicos.