1
00:00:03,819 --> 00:00:08,199
Bien, vamos a comenzar la primera parte de la explicación del tema 10,

2
00:00:09,099 --> 00:00:11,859
la unidad de trabajo 10 sobre cultivos celulares.

3
00:00:12,279 --> 00:00:16,079
Una vez acabada toda la parte de biología molecular del curso,

4
00:00:16,579 --> 00:00:20,140
vamos a comenzar un bloque de temas, tres temas,

5
00:00:20,399 --> 00:00:24,260
el 10, el 11 y el 12, sobre cultivos celulares y citogenética.

6
00:00:25,660 --> 00:00:30,820
En esta primera parte de esta unidad vamos a ver los dos primeros apartados,

7
00:00:30,820 --> 00:00:37,640
lo que hace referencia a la introducción, en la cual veremos una serie de conceptos muy importantes

8
00:00:37,640 --> 00:00:42,920
para poder entender bien cómo se pueden cultivar las células in vitro,

9
00:00:44,000 --> 00:00:48,280
cuál es la biología de las células que son cultivadas in vitro.

10
00:00:48,960 --> 00:00:54,799
En este primer apartado veremos además qué tipos de cultivos celulares podemos realizar en el laboratorio

11
00:00:54,799 --> 00:00:59,240
y algunas de las aplicaciones más importantes que tienen los cultivos celulares,

12
00:00:59,240 --> 00:01:08,099
sobre todo en el campo de la investigación, aunque últimamente también en el campo de la medicina regenerativa y la aplicación más clínica.

13
00:01:09,040 --> 00:01:17,079
En el segundo apartado que veremos en esta primera parte de la unidad estudiaremos la biología de las células en cultivo,

14
00:01:17,079 --> 00:01:24,959
es decir, cómo se comportan las células cuando son extraídas de su ambiente fisiológico y son cultivadas in vitro,

15
00:01:24,959 --> 00:01:29,239
en condiciones estándares, con una serie de requerimientos muy específicos.

16
00:01:29,560 --> 00:01:37,359
En concreto, estudiaremos la curva de crecimiento en general de cualquier tipo de célula que es crecida in vitro,

17
00:01:38,459 --> 00:01:47,079
qué formas de crecimiento existen, realmente existen dos tipos de cultivos celulares según la forma de crecimiento,

18
00:01:48,719 --> 00:01:52,040
fundamentalmente pueden ser en suspensión o en monocapa, como veremos.

19
00:01:52,040 --> 00:02:06,540
y cómo se comportan las células que han sido extraídas de un órgano, que han sido puestas en cultivo después de, digamos, una serie de pases sucesivos, es decir, a lo largo del tiempo.

20
00:02:08,060 --> 00:02:21,400
Dejaremos el resto de puntos, los factores que intervienen en el cultivo y los procedimientos propios, los procesos y procedimientos del laboratorio de cultivo celular, lo dejaremos para la segunda parte del tema

21
00:02:21,400 --> 00:02:25,039
y una breve mención al tema de las contaminaciones.

22
00:02:25,900 --> 00:02:28,800
Bien, comenzamos.

23
00:02:29,639 --> 00:02:35,599
A modo de introducción, ya sabéis que cuando hablamos de cultivos celulares,

24
00:02:36,620 --> 00:02:43,979
recordad que nos estamos refiriendo a cultivos de células eucariotas que proceden de organismos pluricelulares.

25
00:02:44,860 --> 00:02:50,759
Hay otro tipo de cultivos, por ejemplo, cultivos de células prokaryotas, bacterias,

26
00:02:50,759 --> 00:03:05,759
Y el cultivo de levaduras, que son células eucariotas del reino fungi, que al ser organismos unicelulares no se estudian dentro del capítulo de cultivos celulares, sino que se estudian como cultivos microbiológicos.

27
00:03:07,180 --> 00:03:14,000
Bien, ¿qué tipos de células podemos estudiar y podemos cultivar in vitro?

28
00:03:14,000 --> 00:03:21,560
Ahora, insisto, son células eucariotas que proceden de organismos pluricelulares.

29
00:03:21,840 --> 00:03:26,259
Lo primero que tenemos que tener en cuenta es que todas las células que vamos a poder cultivar

30
00:03:26,259 --> 00:03:34,180
y que proceden de un organismo pluricelular adulto proceden de una primera célula que es el cigoto.

31
00:03:35,020 --> 00:03:39,460
Esta primera célula contiene una combinación de genes única y repetible

32
00:03:39,460 --> 00:03:44,460
que hace que tenga una dinámica genética y de desarrollo muy característica.

33
00:03:45,460 --> 00:03:54,639
Ya sabemos que a partir de esta célula se van a generar una serie de células por divisiones mitóticas,

34
00:03:55,340 --> 00:04:00,219
pasando por diferentes estadios, en lo que llamamos el desarrollo embrionario temprano,

35
00:04:00,979 --> 00:04:04,780
por el embrión de dos células, el embrión de cuatro células,

36
00:04:04,780 --> 00:04:12,300
y así sucesivamente el embrión de 8 células, 16 células, etcétera, etcétera, ¿sí?

37
00:04:12,800 --> 00:04:18,000
Todas estas células que se generan a partir del cigoto, como veis están dentro de la zona pelúcida,

38
00:04:18,000 --> 00:04:23,899
que es una zona de protección, es una capa de protección, aunque cumple también otras funciones,

39
00:04:24,339 --> 00:04:30,079
estas primeras células que proceden de las divisiones mitóticas son los blastómeros.

40
00:04:30,560 --> 00:04:34,399
Los blastómeros son células madre, igual que el cigoto.

41
00:04:34,779 --> 00:04:38,300
una serie de características

42
00:04:38,300 --> 00:04:41,939
más adelante en el desarrollo a medida que va avanzando el desarrollo

43
00:04:41,939 --> 00:04:45,199
primero tenemos dos blastómeros 4, 8, 16

44
00:04:45,199 --> 00:04:46,920
esta estructura

45
00:04:46,920 --> 00:04:49,399
en desarrollo embrionario es lo que llamamos

46
00:04:49,399 --> 00:04:52,899
el estadio de embrión en estadio de mórula

47
00:04:52,899 --> 00:04:54,040
parece una mora

48
00:04:54,040 --> 00:04:56,360
dentro de la zona pelucida hay células

49
00:04:56,360 --> 00:05:00,360
bastantes células 16, 32, 64

50
00:05:00,360 --> 00:05:02,100
cada vez más pequeñitas

51
00:05:02,100 --> 00:05:04,540
y a partir de un momento determinado

52
00:05:04,779 --> 00:05:16,060
esta mórula se cavita, es decir, esta mórula se cavita y empieza a entrar un líquido para formar lo que llamamos el blastocele.

53
00:05:17,180 --> 00:05:21,600
Esto es importante, diréis, ¿y por qué es importante esto que no lo estudiemos en cultivos celulares?

54
00:05:21,600 --> 00:05:27,860
Porque en este momento, en esta etapa, la etapa del blastocisto es tremendamente crucial,

55
00:05:28,100 --> 00:05:33,819
porque desde este momento se diferencian ya dos poblaciones celulares muy diferentes.

56
00:05:33,819 --> 00:05:51,720
Entonces, si os dais cuenta, hay una serie de células que están en el exterior, que forman como una corteza, daos cuenta que esto sería como un balón que lo acabamos de cortar. Estas células son las células del trofoblasto. ¿Por qué son importantes estas células?

57
00:05:51,720 --> 00:06:05,420
Porque a partir de todas estas células que están aquí alrededor se van a originar todos los tejidos extraembrionarios. Los tejidos extraembrionarios, por ejemplo, el corium, el amnios, el cordón umbilical, la placenta.

58
00:06:05,420 --> 00:06:18,930
Y en el medio, si os dais cuenta, en el medio, os lo señalo aquí de este colorcito rosita, está lo que llamamos la masa celular interna.

59
00:06:19,189 --> 00:06:27,730
Masa celular interna son células muy pequeñitas, células madre muy pequeñitas, muy juntas, que forman lo que llamamos el embrioblasto.

60
00:06:27,730 --> 00:06:31,829
¿Por qué son importantes estas células del embrioblasto o de la masa celular interna?

61
00:06:31,970 --> 00:06:37,610
Porque a partir de ellas se van a originar todos los tejidos intraembrionarios.

62
00:06:38,170 --> 00:06:44,029
Todos los tipos celulares intraembrionarios se van a originar a partir de la masa celular interna.

63
00:06:44,029 --> 00:06:59,750
Y esto incluye, por supuesto, las neuronas, hepatocitos, células hemáticas, por ejemplo, glóbulos rojos, fibras musculares, células de la mucosa, etc.

64
00:07:00,569 --> 00:07:11,089
Toda esta diversidad de células, estamos hablando de más de 200 tipos diferentes de células diferenciadas, proceden, todas ellas, de la masa celular interna.

65
00:07:12,069 --> 00:07:17,170
Ninguna de ellas procede del trofoblasto y esto es muy importante que lo tengamos en cuenta.

66
00:07:17,970 --> 00:07:25,149
¿Por qué? Porque cuando ponemos aquí en la introducción tipos de células del organismo que podemos cultivar,

67
00:07:25,149 --> 00:07:33,149
en realidad, como se puede ya deducir, hay dos grandes categorías de células que podemos cultivar.

68
00:07:33,149 --> 00:07:41,149
cultivar. Un primer tipo de células que son propias del desarrollo embrionario, todas estas de aquí,

69
00:07:41,629 --> 00:07:48,769
que son lo que llamamos las células madre. Y las células que están presentes en el adulto, que es

70
00:07:48,769 --> 00:07:55,790
lo que llamamos las células diferenciadas. Las células madre son células indiferenciadas, no

71
00:07:55,790 --> 00:08:03,259
pertenecen a ningún tejido, tienen una elevada potencialidad, es decir, a partir de cualquiera

72
00:08:03,259 --> 00:08:10,639
de estas células vamos a poder generar cantidad de células diferenciadas muy diferentes ya veis

73
00:08:10,639 --> 00:08:15,199
que estas células aunque todas tienen la misma carga genética morfológicamente solamente

74
00:08:15,199 --> 00:08:20,800
morfológicamente son muy diferentes a una neurona de un glóbulo rojo entre otras cosas porque el

75
00:08:20,800 --> 00:08:27,860
glóbulo rojo eritrocito no tiene núcleo por tanto las células madres son indiferenciadas tienen una

76
00:08:27,860 --> 00:08:33,799
elevada potencialidad. Tienen capacidad de autorrenovación, de perpetuarse en el tiempo,

77
00:08:34,360 --> 00:08:41,460
de manera que no se agotan ni siquiera en el adulto. Hay células madre residentes en tejido,

78
00:08:41,539 --> 00:08:46,879
que son las células madre adultas. Y además muchas de ellas, sobre todo las adultas,

79
00:08:46,879 --> 00:08:51,480
están en fase G0, están en reposo. Sin embargo, las células diferenciadas,

80
00:08:51,559 --> 00:08:55,399
hablamos de células diferenciadas como aquellas células propias ya de un tejido,

81
00:08:55,399 --> 00:09:00,419
pertenecen a un tejido y cumplen funciones específicas dentro de ese tejido.

82
00:09:02,340 --> 00:09:06,639
En principio, cualquier tipo de célula, tanto células madre como células diferenciadas,

83
00:09:07,200 --> 00:09:11,539
podemos ser capaces de cultivarlas in vitro en el laboratorio.

84
00:09:12,700 --> 00:09:13,019
¿De acuerdo?

85
00:09:13,940 --> 00:09:14,179
Bien.

86
00:09:15,000 --> 00:09:18,600
Pero al hablar de cultivos celulares, en realidad no nos referimos solamente

87
00:09:18,600 --> 00:09:24,360
al cultivo de células individuales, sino que hay diferentes tipos de cultivos celulares.

88
00:09:24,360 --> 00:09:50,159
De manera que así, a nivel general, cuando hablamos de cultivo celular, nos referimos a un conjunto de procedimientos que hacen posible el mantenimiento de células de organismos pluricelulares, falta el apellido, organismos pluricelulares eucariotas, preservando al máximo todas sus características normales, bioquímicas, genéticas y fisiológicas.

89
00:09:50,159 --> 00:09:56,399
Entonces, dentro de cultivos celulares diferenciamos tres grandes tipos de cultivos

90
00:09:56,399 --> 00:10:06,480
Yendo de lo macro a lo micro, el primer tipo de cultivo que podemos realizar en el laboratorio es el cultivo de órganos

91
00:10:06,480 --> 00:10:10,980
Es decir, podemos coger un órgano a partir de un animal de experimentación

92
00:10:10,980 --> 00:10:17,600
Si fuesen células vegetales y tejidos vegetales, los métodos de cultivo son diferentes

93
00:10:17,600 --> 00:10:22,360
Pues aquí no vamos a referir sobre todo organismos pluricelulares, pero animales.

94
00:10:23,539 --> 00:10:29,679
Partiendo de un organismo pluricelular, un animal de experimentación,

95
00:10:30,100 --> 00:10:32,580
podemos directamente cultivar un órgano completo.

96
00:10:32,899 --> 00:10:34,940
Órgano completo, corazón, el riñón.

97
00:10:35,340 --> 00:10:37,639
Esto se realiza mucho, por ejemplo, con órganos embrionarios.

98
00:10:38,740 --> 00:10:41,720
¿De manera qué? ¿Qué es un cultivo de órganos?

99
00:10:42,539 --> 00:10:43,419
¿De qué se trata?

100
00:10:43,419 --> 00:10:47,159
Se trata de intentar mantener el órgano entero, como vemos aquí,

101
00:10:47,600 --> 00:10:56,240
o una parte de él, en una interfase entre un medio de cultivo artificial, nutritivo

102
00:10:56,240 --> 00:11:03,519
y una atmósfera controlada, es decir, un medio líquido y una atmósfera, un medio gaseoso.

103
00:11:04,299 --> 00:11:06,620
Se utilizan este tipo de placas que tenemos aquí abajo,

104
00:11:06,620 --> 00:11:13,960
en los cuales sobre un soporte que contiene medio de cultivo,

105
00:11:13,960 --> 00:11:18,279
Depositamos el órgano y el órgano va a crecer durante unos días

106
00:11:18,279 --> 00:11:21,820
Lo vamos a mantener vivo durante unos días en este cultivo

107
00:11:21,820 --> 00:11:26,539
En la interfase que está entre el medio de cultivo que estaría por aquí abajo

108
00:11:26,539 --> 00:11:30,279
Y toda la atmósfera gaseosa que tenemos encima

109
00:11:30,279 --> 00:11:36,320
Este tipo de cultivos tiene muchos problemas, muchas desventajas

110
00:11:36,320 --> 00:11:41,919
En algunos momentos nos puede convenir, incluso nos permite y nos da mucha información

111
00:11:41,919 --> 00:11:45,279
porque contiene todos los tipos celulares de ese órgano

112
00:11:45,279 --> 00:11:49,399
y podemos estudiar in vitro durante un tiempo limitado

113
00:11:49,399 --> 00:11:52,059
primera característica de este tipo de cultivos

114
00:11:52,059 --> 00:11:53,440
durante un tiempo limitado

115
00:11:53,440 --> 00:11:56,000
una serie de características fisiológicas

116
00:11:56,000 --> 00:12:00,179
una desventaja es que no se puede propagar

117
00:12:00,179 --> 00:12:03,539
es decir, a partir de un órgano no vamos a obtener otro órgano

118
00:12:03,539 --> 00:12:09,480
es decir, que son cultivos, digamos, únicos

119
00:12:10,440 --> 00:12:12,240
Entonces, si yo quiero obtener los mismos resultados,

120
00:12:12,419 --> 00:12:16,100
tengo que replicar el experimento completo con otro órgano diferente.

121
00:12:17,639 --> 00:12:18,500
¿Crecen algunas células?

122
00:12:19,139 --> 00:12:23,000
Pues se puede llegar a dar el crecimiento de algunas células,

123
00:12:23,120 --> 00:12:25,000
pero las que son más indiferenciadas.

124
00:12:25,580 --> 00:12:30,259
Las células que son como más plásticas y que tienen plasticidad dentro del organismo,

125
00:12:30,259 --> 00:12:32,259
dentro del órgano adulto.

126
00:12:32,639 --> 00:12:34,639
¿Para qué se utilizan este tipo de cultivos?

127
00:12:34,919 --> 00:12:38,259
Para el estudio, por ejemplo, de interacciones y relaciones intercelulares.

128
00:12:38,259 --> 00:12:43,120
intercelulares. Es decir, si es el corazón, oye, pues cómo interacciona el endocardio,

129
00:12:43,200 --> 00:12:48,360
que son células endoteliales especializadas, con el miocardio, las células del músculo

130
00:12:48,360 --> 00:12:56,860
del corazón. Si yo les pongo una droga, se acelera la contractilidad, se ralentiza, etcétera,

131
00:12:56,919 --> 00:13:04,399
etcétera. Entonces, son realmente un tipo de cultivos, a ver, no es muy reproducible,

132
00:13:04,399 --> 00:13:06,639
duran unos días in vitro

133
00:13:06,639 --> 00:13:08,240
y da una serie de información

134
00:13:08,240 --> 00:13:09,840
pero que no es

135
00:13:09,840 --> 00:13:12,320
normalmente un pelín escaso

136
00:13:12,320 --> 00:13:14,220
por ello

137
00:13:14,220 --> 00:13:19,000
bueno, en esta otra diapositiva

138
00:13:19,000 --> 00:13:20,779
os he puesto este esquema que se ve

139
00:13:20,779 --> 00:13:23,019
un pelín mejor del tipo de placas que se utilizan

140
00:13:23,019 --> 00:13:24,419
ya veis que lo que ponemos aquí es

141
00:13:24,419 --> 00:13:27,080
tiene dos cámaras, una cámara alrededor

142
00:13:27,080 --> 00:13:28,600
que es esta que estoy señalando

143
00:13:28,600 --> 00:13:30,139
con un gris clarito

144
00:13:30,139 --> 00:13:31,740
donde ponemos agua

145
00:13:31,740 --> 00:13:33,120
agua miliq

146
00:13:33,120 --> 00:13:35,700
sencillamente es una cámara de humedad

147
00:13:35,700 --> 00:13:39,679
para que no se seque el órgano ni se seque todo el sistema.

148
00:13:40,379 --> 00:13:44,059
Tenemos un segundo pocillo, que es este de gris oscuro, que aquí lo vemos,

149
00:13:44,440 --> 00:13:45,960
que es el que está lleno de medio de cultivo.

150
00:13:46,039 --> 00:13:49,059
El medio de cultivo estándar, que lo veremos después, es el de MEM.

151
00:13:49,879 --> 00:13:54,460
Aquí tendríamos la interfaz líquida del medio de cultivo.

152
00:13:54,960 --> 00:13:58,980
Y entonces tenemos un soporte, lo veis aquí, aquí tendríamos el soporte,

153
00:13:59,179 --> 00:14:01,100
encima ponemos el tejido o el órgano.

154
00:14:01,779 --> 00:14:04,700
Y por encima tendríamos la atmósfera gaseosa.

155
00:14:04,700 --> 00:14:14,159
Todo esto de aquí sería la atmósfera gaseosa. Por tanto, el órgano se cultiva en la interfaz entre un medio líquido y un medio gaseoso.

156
00:14:15,720 --> 00:14:23,500
¿Ventajas? Pues mira, se mantiene la estructura tridimensional completa, tal y como está en vivo. Es una ventaja importante.

157
00:14:24,000 --> 00:14:31,899
Vamos a tener varios tipos de células ya diferenciadas, que interactúan entre ellas, pero como desventaja, como hemos dicho, es un crecimiento muy limitado,

158
00:14:31,899 --> 00:14:35,820
no se puede propagar y tiene baja reproducibilidad.

159
00:14:35,980 --> 00:14:40,960
Es decir, si yo quiero obtener el mismo resultado,

160
00:14:41,379 --> 00:14:46,320
tengo que intentar reproducir las mismas condiciones exactas en un cultivo nuevo.

161
00:14:46,460 --> 00:14:47,620
Y eso es muy complicado.

162
00:14:52,059 --> 00:14:55,539
A partir del órgano, podemos establecer un segundo tipo de cultivo,

163
00:14:55,899 --> 00:14:57,500
que es el cultivo de esplantes.

164
00:14:58,539 --> 00:14:59,720
¿Qué es un esplante?

165
00:15:00,399 --> 00:15:02,620
¿O en qué consiste el cultivo de esplantes?

166
00:15:02,620 --> 00:15:29,620
El cultivo de planta no es ni más ni menos que adherir un fragmento de tejido a una superficie y ponerlo con un medio de cultivo. Es decir, yo puedo, como hemos visto antes, cultivar el órgano completo o, mediante un proceso de disección o microdisección del órgano en cuestión, separar el tejido que me interesa estudiar.

167
00:15:29,620 --> 00:15:36,240
estudiar. ¿Entiende? Y este tejido, este explante, explante primario, lo voy a poner en una placa de

168
00:15:36,240 --> 00:15:44,360
cultivo. Lo normal es que en la placa de cultivo yo ponga el explante y el explante, que lo pongo

169
00:15:44,360 --> 00:15:50,379
aquí, se adhiere al fondo de la placa y lo que hago es recubrirlo por encima con medio de cultivo.

170
00:15:50,379 --> 00:16:07,539
Por tanto, el esplante primario es un cultivo en el cual la interfase, vamos a tener el esplante en la interfase entre el sólido, el plástico, si es poliuretano, de la placa, en este caso del frasco, y el líquido, que es el medio de cultivo.

171
00:16:08,659 --> 00:16:19,899
¿Qué ventajas tiene? Pues que aquí sí que va a haber adhesión al sustrato y sí que van a proliferar células. Hay células de este tejido que van a ir escapándose y van a empezar a migrar alrededor. ¿Cuáles?

172
00:16:19,899 --> 00:16:31,200
Las células más periféricas pueden llegar a migrar y proliferar. Entonces estas células sí que crecen de nuevo in vitro y las puedo estudiar.

173
00:16:31,200 --> 00:16:39,480
El cultivo de esplantes, el cultivo de esplantes se utiliza mucho, se utiliza mucho

174
00:16:39,480 --> 00:16:42,860
Por ejemplo, os pongo dos ejemplos

175
00:16:42,860 --> 00:16:48,759
Se pueden hacer cultivo de retina, retina embrionaria de embriones de ratón

176
00:16:48,759 --> 00:16:57,240
Esto está sacado de una revisión científica en la cual vamos a coger en un estadio determinado de desarrollo

177
00:16:57,240 --> 00:17:00,340
hacemos una microdisección importante

178
00:17:00,340 --> 00:17:02,580
para poder hacer un cultivo de esplantes

179
00:17:02,580 --> 00:17:05,160
siempre a partir del órgano completo

180
00:17:05,160 --> 00:17:08,759
debo hacer una microdisección del tejido que quiero estudiar

181
00:17:08,759 --> 00:17:10,900
aquí lo que han hecho es

182
00:17:10,900 --> 00:17:14,200
retiran la lente, retiran el resto de estructuras

183
00:17:14,200 --> 00:17:15,480
y se quedan con la retina

184
00:17:15,480 --> 00:17:18,319
y es la retina la que van a poner en cultivo

185
00:17:18,319 --> 00:17:20,140
durante unos días

186
00:17:20,140 --> 00:17:21,720
¿qué pueden estudiar?

187
00:17:21,720 --> 00:17:26,359
pues si lo tienen de 1 a 14 días

188
00:17:26,359 --> 00:17:47,720
Pueden estudiar cómo se van desarrollando todas las células, tanto los fotorreceptores, conos y bastones, como todas las células nerviosas, las neuronas bipolares, etcétera, etcétera, todo este tipo de neuronas, cómo se van desarrollando, cómo se forman, cómo interactúan unas con otras.

189
00:17:47,720 --> 00:17:53,559
simulando, entre comillas, cómo sería, cómo el proceso que ocurriría,

190
00:17:53,640 --> 00:17:57,380
poder estudiar el proceso que ocurriría en vivo en el embrión,

191
00:17:57,819 --> 00:18:00,299
poderlo estudiar in vitro durante 10-15 días.

192
00:18:01,940 --> 00:18:05,359
El cultivo de esplantes para desarrollo embrionario se utiliza mucho.

193
00:18:05,579 --> 00:18:08,539
Otro ejemplo que os pongo aquí son las rodajas de cerebro.

194
00:18:09,019 --> 00:18:11,519
Este es un cerebro de rata, de roedor, yo creo que es rata,

195
00:18:12,339 --> 00:18:15,359
aunque el de ratón es un pelín más pequeño, pero tiene la misma estructura,

196
00:18:15,359 --> 00:18:43,119
Y lo que se hace realmente es una rodaja, una rodaja gruesa de 2-3 milímetros y esta rodaja gruesa se suele poner en una placa de cultivo para hacer estudios de electrofisiología. Es decir, ahora podemos coger unas micropipetas de vidrio tremendamente finas y podemos estudiar impulsos nerviosos, corrientes de calcio, corrientes de iones, por ejemplo, cuando pongo esta rodaja en presencia de una droga o de un neurotransmisor.

197
00:18:43,119 --> 00:18:53,819
Y estudiar en vivo realmente qué es lo que está ocurriendo, cómo se transmite el impulso nervioso de neuronas a neuronas, en la corteza, en el hipocampo, en determinadas regiones.

198
00:18:54,680 --> 00:19:05,819
Estos ejemplos no es el órgano entero. Lo que ponemos in vitro es un fragmento diseccionado, un tejido diseccionado del órgano.

199
00:19:05,819 --> 00:19:29,420
Por tanto, ya hemos visto que podemos cultivar el órgano, tiene sus limitaciones, pudimos cultivar esplantes, pero lo normal es que del órgano, por medio de un proceso de disección, obtengamos un esplante y del esplante hagamos un cultivo de células.

200
00:19:29,420 --> 00:20:00,160
¿Cómo? A partir o a través de un proceso de disgregación. Es decir, ya no me interesa cultivar el órgano completo, ni me interesa cultivar el esplante que contiene varios tipos de células, sino que lo que voy a intentar es disgregar todas sus células para poder obtener, cuando hablamos de disgregación, la disgregación es un proceso por el cual a partir de un tejido pluricelular con muchas células y muchos tipos de células diferenciadas,

201
00:20:00,160 --> 00:20:03,039
vamos a obtener una suspensión celular.

202
00:20:03,519 --> 00:20:08,950
Por tanto, la disgregación me va a permitir obtener una suspensión celular

203
00:20:08,950 --> 00:20:13,369
en las cuales voy a tener todas las células de ese tejido, de ese esplante,

204
00:20:13,930 --> 00:20:15,549
pero individualizadas.

205
00:20:17,490 --> 00:20:22,589
Y son estas células individuales las que ahora voy a cultivar directamente en la placa.

206
00:20:24,130 --> 00:20:26,609
A esto es a lo que llamamos cultivo de células.

207
00:20:27,869 --> 00:20:31,289
Cultivos de células, en realidad tenemos dos tipos de cultivos.

208
00:20:31,470 --> 00:20:46,089
Cultivos celulares. Esto es lo que sería propiamente cultivos celulares. Pero hablamos de cultivos de células porque cultivos celulares también es cultivo de órganos y de esplantes. Entonces, cultivos de células tenemos de dos tipos. Un cultivo histotípico y cultivo órgano típico.

209
00:20:46,089 --> 00:21:07,869
¿Qué quiere decir un cultivo histotípico? El cultivo histotípico es aquel que procede de un tejido histotípico que después de un proceso de disección y de disgregación obtenemos una suspensión celular con todas las células diferenciadas del tejido y las ponemos in vitro y las dejamos que crezcan.

210
00:21:07,869 --> 00:21:16,950
De tal manera que a lo largo del tiempo, a medida que va pasando el tiempo, las células más resistentes continúan proliferando.

211
00:21:17,109 --> 00:21:25,849
De manera que al final, al cabo de una serie de semanas, lo que vamos a obtener es un cultivo de un único tipo de células.

212
00:21:27,349 --> 00:21:28,170
¿Se entiende?

213
00:21:29,730 --> 00:21:32,170
Por eso hablamos de cultivo histotípico.

214
00:21:32,170 --> 00:21:33,789
¿Qué es un cultivo histotípico?

215
00:21:33,789 --> 00:21:42,750
Un cultivo estotípico es un cultivo de células en el cual hemos obtenido un único tipo de células, normalmente las células más plásticas de ese tejido.

216
00:21:43,609 --> 00:21:59,789
¿Cómo podemos realizar la disgregación? Esto ya lo hemos visto. Cuando vimos el tema de extracción y purificación de DNA, vimos cómo se pueden disgregar las células, pero principalmente se pueden disgregar por métodos mecánicos o por métodos enzimáticos,

217
00:21:59,789 --> 00:22:07,009
utilizando proteasas, que vayan digiriendo la matriz extracelular y liberando las células.

218
00:22:10,759 --> 00:22:17,700
Además del cultivo histotípico, actualmente hay otro tipo de cultivo de células que es el cultivo organotípico.

219
00:22:18,900 --> 00:22:25,500
El cultivo organotípico ya no es un cultivo del órgano completo, ni es un cultivo desplante,

220
00:22:25,500 --> 00:22:33,039
sino que es un cultivo artificial en el que artificialmente

221
00:22:33,039 --> 00:22:37,160
vamos a juntar en la misma placa de cultivo

222
00:22:37,160 --> 00:22:40,319
dos o tres tipos celulares diferenciados.

223
00:22:41,000 --> 00:22:46,200
Por ejemplo, fibroblastos, neutrófilos y células endoteliales.

224
00:22:47,019 --> 00:22:51,480
Todas ellas, estos dos, tres, cuatro tipos diferentes de células,

225
00:22:51,720 --> 00:22:55,079
different cells, co-culture, es lo que llamamos co-cultivos,

226
00:22:55,079 --> 00:23:02,680
con o sin un tipo de matriz de soporte, que ya la veremos más adelante,

227
00:23:03,619 --> 00:23:08,839
las puedo cultivar, co-cultivar a la vez e intentar estudiar cómo interrelacionan entre ellas.

228
00:23:09,480 --> 00:23:13,559
Este tipo de cultivo, que son cultivos de células individuales, por supuesto,

229
00:23:13,559 --> 00:23:22,220
es un cultivo organotípico porque, entre comillas, intentamos simular la formación de un tejido in vitro

230
00:23:22,220 --> 00:23:27,359
con diferentes tipos de células para que se puedan ordenar en el espacio como formando

231
00:23:27,359 --> 00:23:34,480
una estructura pseudotisular. Por tanto, y en resumen, tipos de cultivos. Tenemos el cultivo

232
00:23:34,480 --> 00:23:40,559
de órganos, el cultivo de esplantes y el cultivo de células individuales. Este cultivo de células

233
00:23:40,559 --> 00:23:46,839
individuales puede ser histotípico cuando cultivo un tipo de células o un cultivo organotípico si

234
00:23:46,839 --> 00:24:01,880
al ave, co-cultivo diferentes tipos de células y estudio como interacción. Muy bien, ¿qué es esto

235
00:24:01,880 --> 00:24:07,240
del cultivo celular primario y secundario que vamos a ver ahora? Estamos dentro del tercer tipo,

236
00:24:07,839 --> 00:24:14,640
estamos hablando del cultivo de células. Dentro del cultivo de células tenemos dos tipos, ya hemos

237
00:24:14,640 --> 00:24:21,220
visto, el cultivo histotípico y el cultivo organotípico. Normalmente dentro del cultivo

238
00:24:21,220 --> 00:24:29,000
histotípico, el cultivo histotípico puede ser un cultivo primario o un cultivo secundario.

239
00:24:29,480 --> 00:24:35,779
¿Esto qué significa? Fijaos, volvemos a ver todo el procedimiento que hemos hecho desde

240
00:24:35,779 --> 00:24:43,160
el principio. Desde el órgano anatómicamente, por ejemplo, imaginaos que hemos extraído

241
00:24:43,160 --> 00:24:50,039
el corazón de un animal, del órgano, por un proceso de microdisección hemos obtenido

242
00:24:50,039 --> 00:24:55,960
un tejido, un pedazo, un fragmento de tejido. Esto es lo que llamamos un explante primario.

243
00:24:56,619 --> 00:25:00,460
Por un proceso de disgregación, en este caso es una disgregación mecánica, ya veis que

244
00:25:00,460 --> 00:25:04,400
es un tubo en el cual tengo un émbolo, que es una pala, y lo que hago es meto aquí el

245
00:25:04,400 --> 00:25:09,599
pedazo de tubo y le empiezo de forma mecánica el émbolo hacia arriba y hacia abajo, de

246
00:25:09,599 --> 00:25:14,660
manera que como el espacio que queda aquí en medio es tan finito, se va a empezar a

247
00:25:14,660 --> 00:25:20,380
romper la estructura del tejido y se van a librar las células. A través de, gracias

248
00:25:20,380 --> 00:25:24,880
al proceso de diliración mecánica, obtenemos, que esto ya lo habíamos visto, células en

249
00:25:24,880 --> 00:25:30,559
suspensión. Y estas células en suspensión, hemos dicho que las vamos a poner a cultivar.

250
00:25:32,240 --> 00:25:39,119
Este cultivo de células, de células individuales, es un cultivo histotípico. Al principio no

251
00:25:39,119 --> 00:25:43,019
es histotípico, porque es un cultivo que contiene muchos tipos de células que son

252
00:25:43,019 --> 00:25:49,539
que venían del tejido. Pero este cultivo es lo que llamamos un cultivo primario. ¿Qué es un cultivo

253
00:25:49,539 --> 00:25:58,779
primario? Es un cultivo de células que procede directamente o del órgano o de un esplante. Es

254
00:25:58,779 --> 00:26:05,400
decir, estas células que yo tengo aquí en la placa, que acabo de poner y que acabo de plaquear, es la

255
00:26:05,400 --> 00:26:12,400
primera vez que están in vitro. Antes estaban en el órgano o en el esplante o en el tejido o en el

256
00:26:12,400 --> 00:26:20,119
animal. Como es la primera vez que están in vitro, estas células establecen un cultivo primario. Es

257
00:26:20,119 --> 00:26:26,279
la primera vez que esas células están in vitro. Esas células yo las voy a mantener una serie de

258
00:26:26,279 --> 00:26:34,980
tiempo, 24, 48, 72, 96 horas, depende, dejo que crezcan hasta que llenan la placa. Y una vez que

259
00:26:34,980 --> 00:26:40,700
llenan la placa y ya no caben más, lo que tengo que hacer es despegarlas y hacer un subcultivo.

260
00:26:40,700 --> 00:27:04,109
¿Qué es un subcultivo? Un subcultivo es el procedimiento por el cual voy a volver a coger estas células, despegarlas y ponerlas en una placa nueva. He hecho un subcultivo, también se llama pase, he hecho un pase de las células. He pasado las células de una placa a otra.

261
00:27:04,109 --> 00:27:17,109
¿De acuerdo? La pregunta es, ahora, estas células que tengo aquí después del subcultivo, ¿estas células de dónde proceden directamente? ¿Proceden del órgano?

262
00:27:17,109 --> 00:27:20,190
justo antes de estar en esta placa

263
00:27:20,190 --> 00:27:22,410
donde estaba, ¿ya estaba en in vitro?

264
00:27:23,109 --> 00:27:24,289
sí, por tanto

265
00:27:24,289 --> 00:27:25,769
a partir de aquí

266
00:27:25,769 --> 00:27:28,089
a partir de este momento

267
00:27:28,089 --> 00:27:30,410
desde el primer pase

268
00:27:30,410 --> 00:27:31,950
todo lo que viene

269
00:27:31,950 --> 00:27:33,309
a partir de aquí

270
00:27:33,309 --> 00:27:36,069
lo consideramos cultivo secundario

271
00:27:36,069 --> 00:27:38,109
¿cuál es la diferencia

272
00:27:38,109 --> 00:27:40,430
por tanto entre un cultivo primario y un cultivo secundario?

273
00:27:40,509 --> 00:27:41,990
que las células

274
00:27:41,990 --> 00:27:43,869
del cultivo secundario proceden

275
00:27:43,869 --> 00:27:45,490
de un cultivo primario

276
00:27:45,490 --> 00:28:08,470
Es decir, ya estaban in vitro, no es la primera vez que están in vitro. ¿De acuerdo? A partir de aquí, de este cultivo secundario, yo las puedo dejar crecer más tiempo, volver a hacer otro subcultivo y obtener otra placa. Seguimos siendo, sigue siendo un cultivo secundario porque estas nuevas células de esta nueva placa ya estaban también in vitro, no vienen del órgano directamente.

277
00:28:08,470 --> 00:28:23,470
No se me explico, ¿se entiende? Por tanto, ¿qué es un cultivo primario? Es un cultivo que se obtiene directamente a partir de un esplante, de un órgano, por un proceso de disgregación tisular.

278
00:28:25,539 --> 00:28:36,640
Estas células, ya hemos dicho y veremos más adelante, pueden crecer en monocapa, que son estas que digo que crecen pegaditas en el suelo o en suspensión, por ejemplo los linfocitos, los linfocitos crecen en suspensión.

279
00:28:36,640 --> 00:28:41,680
¿Hasta cuándo proliferan? Hasta un estado que se llama confluencia

280
00:28:41,680 --> 00:28:43,259
Lo veremos ahora después

281
00:28:43,259 --> 00:28:47,720
¿Qué es la confluencia? Es el estado en el cual ya no caben más células

282
00:28:47,720 --> 00:28:52,339
Como no caben más células, lo único que puedo hacer es un pase o un subcultivo

283
00:28:52,339 --> 00:28:54,160
Las tengo que pasar a otra placa

284
00:28:54,160 --> 00:28:59,440
En el momento en que este cultivo primario lo paso y hago un subcultivo

285
00:28:59,440 --> 00:29:03,299
A partir de este momento ya hablamos de cultivos secundarios

286
00:29:03,299 --> 00:29:05,599
Ya no existe el cultivo primario

287
00:29:05,599 --> 00:29:16,220
Importante, si yo parto del órgano o directamente de un pedazo de tejido, de un esplante

288
00:29:16,220 --> 00:29:24,079
y he obtenido estas células y las he puesto in vitro y he obtenido un cultivo primario

289
00:29:24,079 --> 00:29:30,539
ya hemos dicho que en este cultivo primario lo normal es que haya dos o tres tipos de células que proceden del tejido

290
00:29:30,539 --> 00:29:36,140
Con el tiempo, al cabo de dos, tres, cuatro pases

291
00:29:36,140 --> 00:29:37,759
Yo sigo pasando las células

292
00:29:37,759 --> 00:29:40,779
Llegará un momento en el que en la placa

293
00:29:40,779 --> 00:29:45,099
Las células menos resistentes se habrán ido muriendo

294
00:29:45,099 --> 00:29:48,920
Los tipos celulares menos resistentes se habrán ido muriendo

295
00:29:48,920 --> 00:29:52,000
Y me quedarán en la placa uno o dos tipos como mucho

296
00:29:52,000 --> 00:29:56,220
Y el cultivo, a partir más o menos del tercer, cuarto

297
00:29:56,220 --> 00:29:59,319
El cultivo se estabiliza, se homogeneiza

298
00:29:59,319 --> 00:30:25,680
Y así podemos obtener un cultivo realmente histotípico con un único tipo de células. ¿Se entiende? De acuerdo. Por tanto, a partir del cultivo primario, con el tiempo, vamos a establecer un cultivo secundario.

299
00:30:25,680 --> 00:30:41,430
Bien, acordaos, el cultivo primario, cultivo celular primario, viene directamente del órgano o del desplante. Es la primera vez que esas células, esas células es la primera vez que están in vitro. Por eso hablamos de cultivo celular primario.

300
00:30:41,430 --> 00:30:58,009
En cuanto empiezo a realizar pases, y los pongo en una placa, y luego en otra placa, y luego en otra placa, todo esto lo llamamos cultivo celular secundario, porque las células de estos cultivos ya estaban in vitro, no vienen directamente del esplante ni del oro.

301
00:30:58,009 --> 00:31:13,769
Al cabo del tiempo, hemos dicho que el cultivo, tiro para atrás, se estabiliza. ¿Esto qué significa? Significa que acabo de obtener lo que llamamos una línea celular. ¿Qué es una línea celular?

302
00:31:13,769 --> 00:31:19,170
Una línea celular es un cultivo celular secundario

303
00:31:19,170 --> 00:31:24,750
Un cultivo celular secundario que está formado por un único tipo de células

304
00:31:24,750 --> 00:31:29,710
Entonces no hablamos de cultivo celular, sino que ya hablamos de línea celular

305
00:31:29,710 --> 00:31:33,069
Solo hay un linaje, y hay el nombre de línea celular

306
00:31:33,069 --> 00:31:37,490
Solo hay un linaje, o como máximo dos muy parecidos

307
00:31:37,490 --> 00:31:39,250
¿De acuerdo?

308
00:31:39,250 --> 00:31:57,250
Por tanto, la línea celular se origina a partir de un cultivo primario. Esto es muy importante. A partir del cultivo primario, obtuvimos un cultivo secundario y con el tiempo hemos obtenido la línea celular. ¿Por qué es importante esto? Porque hay líneas celulares que yo las mantengo congeladas.

309
00:31:57,250 --> 00:32:04,190
congeladas. Entonces hablamos de líneas celulares inmortalizadas que no proceden de un cultivo

310
00:32:04,190 --> 00:32:10,079
primario, sino que proceden de un vial que estaba congelado. Normalmente estas son las

311
00:32:10,079 --> 00:32:16,519
características de una línea celular. Se origina a partir de un cultivo primario, hay un predominio

312
00:32:16,519 --> 00:32:24,400
de un tipo celular, a veces dos muy parecidos. La población celular suele ser uniforme y homogénea,

313
00:32:24,400 --> 00:32:27,480
Es decir, normalmente fibroblastos, que crecen muy bien.

314
00:32:28,140 --> 00:32:29,960
Tiene unas características conservadas.

315
00:32:30,460 --> 00:32:32,640
Todas las células más o menos se comportan igual.

316
00:32:33,119 --> 00:32:36,259
Y va aumentando el número de células.

317
00:32:37,059 --> 00:32:40,140
Con cada pase que voy haciendo, voy teniendo más células.

318
00:32:40,559 --> 00:32:45,440
De una placa obtengo dos, de esas dos, cuatro, de las cuatro, ocho, y así sucesivamente.

319
00:32:45,980 --> 00:32:52,500
Entonces una línea celular normalmente se va produciendo un aumento paulativo del número de células.

320
00:32:52,500 --> 00:32:54,039
hasta que llega un momento

321
00:32:54,039 --> 00:32:55,480
y esto es muy importante

322
00:32:55,480 --> 00:32:57,500
esta línea celular

323
00:32:57,500 --> 00:33:00,859
que procede de un cultivo primario

324
00:33:00,859 --> 00:33:02,200
la llamamos

325
00:33:02,200 --> 00:33:04,380
línea celular primaria

326
00:33:04,380 --> 00:33:08,759
¿qué significa primaria?

327
00:33:08,920 --> 00:33:11,200
que procede de un cultivo celular

328
00:33:11,200 --> 00:33:13,220
primario

329
00:33:13,220 --> 00:33:15,079
por tanto viene directamente

330
00:33:15,079 --> 00:33:17,099
del órgano, viene directamente

331
00:33:17,099 --> 00:33:18,880
de un esplante

332
00:33:18,880 --> 00:33:21,059
de un tejido, a partir de un proceso

333
00:33:21,059 --> 00:33:22,799
de disgregación, etcétera

334
00:33:22,799 --> 00:33:24,299
estas células

335
00:33:24,299 --> 00:33:26,339
Línea celular primaria

336
00:33:26,339 --> 00:33:27,680
Tiene una vida finita

337
00:33:27,680 --> 00:33:28,640
Y esto es muy importante

338
00:33:28,640 --> 00:33:30,940
No la voy a poder mantener in vivo

339
00:33:30,940 --> 00:33:31,960
In vitro

340
00:33:31,960 --> 00:33:33,759
No la voy a poder mantener mucho tiempo

341
00:33:33,759 --> 00:33:35,799
Llega un momento

342
00:33:35,799 --> 00:33:37,980
Que esas células entran en un proceso

343
00:33:37,980 --> 00:33:39,720
Que llamamos senescencia

344
00:33:39,720 --> 00:33:40,740
Importante

345
00:33:40,740 --> 00:33:41,799
¿Qué es la senescencia?

346
00:33:41,799 --> 00:33:45,599
Es el proceso de envejecimiento celular

347
00:33:45,599 --> 00:33:46,740
Las células envejecen

348
00:33:46,740 --> 00:33:47,480
Dejan de crecer

349
00:33:47,480 --> 00:33:50,099
¿Qué puedo hacer

350
00:33:50,099 --> 00:33:52,799
Para que esta línea celular

351
00:33:52,799 --> 00:33:56,259
no entra en senescencia

352
00:33:56,259 --> 00:33:57,859
y poderla mantener in vitro

353
00:33:57,859 --> 00:34:00,799
de forma indefinida

354
00:34:00,799 --> 00:34:03,700
puedo establecer lo que llamamos

355
00:34:03,700 --> 00:34:06,240
una línea celular continua

356
00:34:06,240 --> 00:34:09,980
se puede llamar línea celular continua

357
00:34:09,980 --> 00:34:15,280
transformada o inmortal

358
00:34:15,280 --> 00:34:17,739
veremos cómo lo conseguimos

359
00:34:17,739 --> 00:34:20,300
pero estas células que vienen del órgano

360
00:34:20,300 --> 00:34:42,000
Esta línea celular primaria yo la puedo inmortalizar, la puedo transformar en una línea celular continua. Esto es propio de las células tumorales. Las células tumorales crecen forever, in vitro también, y constituyen en sí mismas líneas celulares continuas, transformadas, inmortales. Son inmortales estas células.

361
00:34:42,000 --> 00:34:51,519
A, por la contra, suelen tener un crecimiento aberrante, pueden ser malignas, genéticamente son inestables.

362
00:34:52,079 --> 00:34:58,599
Las células tumorales normalmente acumulan muchas aberraciones cromosómicas, mutaciones y les da igual.

363
00:34:59,480 --> 00:35:05,739
Pero para estudiar determinados tumores nos vienen muy bien este tipo de líneas celulares continuas o transformadas.

364
00:35:06,219 --> 00:35:10,619
¿Cómo una línea celular primaria la puedo transformar en continua inmortalizada?

365
00:35:10,619 --> 00:35:13,539
puede ser de forma espontánea

366
00:35:13,539 --> 00:35:14,480
como hemos dicho

367
00:35:14,480 --> 00:35:17,239
las células que vienen de una biopsia

368
00:35:17,239 --> 00:35:17,679
tumoral

369
00:35:17,679 --> 00:35:20,800
son líneas celulares

370
00:35:20,800 --> 00:35:22,380
directamente continuas

371
00:35:22,380 --> 00:35:24,460
de forma espontánea son inmortales

372
00:35:24,460 --> 00:35:27,239
porque por eso son tumorales

373
00:35:27,239 --> 00:35:29,639
pero yo artificialmente

374
00:35:29,639 --> 00:35:30,480
como veremos después

375
00:35:30,480 --> 00:35:32,880
puedo inducir la inmortalización

376
00:35:32,880 --> 00:35:34,039
esto es muy importante

377
00:35:34,039 --> 00:35:37,139
¿por qué? porque entonces a partir de una línea celular

378
00:35:37,139 --> 00:35:38,880
primaria, si yo soy capaz

379
00:35:38,880 --> 00:35:40,239
de inmortalizarla

380
00:35:40,239 --> 00:35:42,679
si soy capaz de inmortalizarla

381
00:35:42,679 --> 00:35:43,920
la puedo estudiar ya para siempre

382
00:35:43,920 --> 00:35:47,179
una línea celular primaria

383
00:35:47,179 --> 00:35:49,139
que no consigo inmortalizarla

384
00:35:49,139 --> 00:35:50,760
podré trabajar con ella

385
00:35:50,760 --> 00:35:53,619
relativamente poco tiempo

386
00:35:53,619 --> 00:35:55,760
si yo quiero volver a trabajar con ellas

387
00:35:55,760 --> 00:35:57,159
tengo que partir nuevamente

388
00:35:57,159 --> 00:35:58,340
de un cultivo primario

389
00:35:58,340 --> 00:36:00,059
estirpar el órgano

390
00:36:00,059 --> 00:36:01,860
diseccionar el tejido

391
00:36:01,860 --> 00:36:02,940
disgregar las células

392
00:36:02,940 --> 00:36:05,260
y volver a establecer una línea celular primaria

393
00:36:05,260 --> 00:36:06,920
¿se ve la diferencia?

394
00:36:07,500 --> 00:36:09,039
por tanto una línea celular primaria

395
00:36:09,039 --> 00:36:11,400
es una línea celular finita

396
00:36:11,400 --> 00:36:12,940
que procede de un cultivo primario

397
00:36:12,940 --> 00:36:15,539
que entra al final en senescencia

398
00:36:15,539 --> 00:36:17,199
una línea celular

399
00:36:17,199 --> 00:36:18,780
continua es una línea celular

400
00:36:18,780 --> 00:36:19,940
inmortal

401
00:36:19,940 --> 00:36:23,059
no deja de crecer in vitro nunca

402
00:36:23,059 --> 00:36:24,380
y esto es porque

403
00:36:24,380 --> 00:36:26,440
o bien de forma espontánea

404
00:36:26,440 --> 00:36:28,360
esas células son inmortales

405
00:36:28,360 --> 00:36:29,940
como el caso de las células tumorales

406
00:36:29,940 --> 00:36:33,059
o bien porque yo he cogido una línea celular primaria

407
00:36:33,059 --> 00:36:35,300
y por un proceso de inmortalización

408
00:36:35,300 --> 00:36:37,000
las he transformado

409
00:36:37,000 --> 00:36:38,880
esto lo veremos ahora

410
00:36:38,880 --> 00:36:56,340
¿De acuerdo? Aquí os dejo el link de un vídeo que tenéis en el aula virtual de cómo se puede establecer un cultivo celular primario y una línea celular primaria del hipocampo, hipocampo de, me parece que es cerebro, del cerebro de ratón, me parece.

411
00:36:56,340 --> 00:37:08,699
Es muy curioso cómo a partir del cerebro diseccionan el hipocampo, del hipocampo diseccionan las células y van explicando paso a paso cómo establecen una línea celular primaria.

412
00:37:09,559 --> 00:37:10,679
¿De acuerdo? Bien.

413
00:37:11,940 --> 00:37:17,840
Os pongo otro ejemplo. Aquí en imágenes se pueden obtener, por ejemplo, MEF, CEFS.

414
00:37:17,840 --> 00:37:26,159
¿Qué son los CEFS? Son células que se utilizan mucho. Los CEFS son fibroblastos embrionarios de chicken.

415
00:37:26,340 --> 00:37:33,840
de pollo. Partiendo de embriones de pollo, se hace una microdisección de una serie de tejidos

416
00:37:33,840 --> 00:37:40,239
donde son muy ricos en fibroblastos, tejido conjuntivo, y a partir de ellos se hace una

417
00:37:40,239 --> 00:37:46,099
disgregación mecánica y enzimática, se cuentan las células y al final en nuestra placa de cultivo

418
00:37:46,099 --> 00:37:53,260
vamos a poner la suspensión celular. Vamos a cultivarlas, estas células, y a lo largo de

419
00:37:53,260 --> 00:37:59,820
Varios pases pasan de ser un cultivo primario a establecerse un cultivo secundario, una línea celular primaria.

420
00:38:00,480 --> 00:38:00,739
¿De acuerdo?

421
00:38:01,019 --> 00:38:05,159
Esta línea celular primaria tiene una vida finita, pero nos permite estudiar muchas cosas.

422
00:38:06,760 --> 00:38:11,739
Este es un ejemplo de una micrografía de crecimiento epitelial de un esplante.

423
00:38:12,360 --> 00:38:12,599
¿De acuerdo?

424
00:38:12,679 --> 00:38:15,420
Aquí hemos hecho un esplante primario de mucosa.

425
00:38:15,420 --> 00:38:16,719
Habría que ver qué mucosa es.

426
00:38:16,780 --> 00:38:17,719
Es mucosa bucal.

427
00:38:18,340 --> 00:38:20,739
Suele ser intestinal, que es muy fácil y crece muy bien.

428
00:38:21,320 --> 00:38:21,460
¿Veis?

429
00:38:21,460 --> 00:38:36,960
Han puesto aquí el esplante, que sería esta parte de aquí, lo han dejado aproximadamente 10 días y después de 10 días ya veis todas las células que hay alrededor, que han crecido y que han ido migrando hacia la periferia.

430
00:38:36,960 --> 00:38:51,119
Estas células, si yo ahora cojo y quito el esplante, estas células las puedo recoger y ponerlas in vitro y a partir de ellas también podría establecer una línea celular primaria. ¿De acuerdo? Muy bien.

431
00:38:51,460 --> 00:39:18,780
¿Qué aplicaciones tienen los cultivos celulares? Pues como bien sabéis, aplicaciones de cultivos celulares es un único módulo, un único módulo del curso de especialización en cultivos celulares. Es decir, aplicaciones muy variopintas, tanto en investigación básica, acordaos, investigación básica es la investigación para poder entender los procesos, cómo funciona una célula, cómo funciona un gen, qué función cumple una proteína en la membrana, dónde estás, si está en el núcleo.

432
00:39:18,780 --> 00:39:47,940
Para eso los cultivos celulares son muy útiles. Investigación aplicada, por ejemplo, screening de fármacos. Yo puedo tener células cardiomiocitos in vitro en este tipo de placas que tienen multipocillos y en cada uno de ellos puedo poner un fármaco o el mismo fármaco a diferentes dosis y hacer un estudio de toxicidad para intentar establecer qué dosis es tóxica y qué dosis no es tóxica o qué dosis produce un efecto que yo espero.

433
00:39:48,780 --> 00:40:09,579
Eso sería una investigación aplicada porque busco una aplicación concreta. Y luego hay mil aplicaciones modernas en medicina regenerativa, en toxicología, en estudios de células madre, terapia celular, terapia génica, ingeniería de tejidos, pero básicamente lo dejo aquí.

434
00:40:09,579 --> 00:40:12,840
solamente quiero que os pique un poquito la curiosidad

435
00:40:12,840 --> 00:40:14,960
por el mundo de la ciencia y de la investigación

436
00:40:14,960 --> 00:40:18,380
y si os animáis a hacer el curso de especialización en cultivos celulares

437
00:40:18,380 --> 00:40:20,000
vais a disfrutar como chinos

438
00:40:20,000 --> 00:40:21,639
eso lo aseguro

439
00:40:21,639 --> 00:40:23,360
bien

440
00:40:23,360 --> 00:40:27,139
después de esta introducción vamos a ver brevemente

441
00:40:27,139 --> 00:40:28,739
cómo se comportan las células

442
00:40:28,739 --> 00:40:31,519
cuando están fuera de su ambiente fisiológico

443
00:40:31,519 --> 00:40:34,260
y las ponemos en una placa

444
00:40:34,260 --> 00:40:37,519
por supuesto una placa de poliuretano, de cristal

445
00:40:37,519 --> 00:40:38,820
ya veremos de muchos materiales

446
00:40:38,820 --> 00:40:41,400
pero no es ni muchísimo menos su ambiente fisiológico.

447
00:40:42,760 --> 00:40:46,960
Bien, lo primero que tenemos que tener en cuenta es que cualquier tipo de célula diferenciada,

448
00:40:47,260 --> 00:40:49,820
hablamos ahora de células diferenciadas, células madre es otro mundo,

449
00:40:51,119 --> 00:40:53,880
cualquier tipo de células diferenciadas, especialmente las epiteliales,

450
00:40:55,159 --> 00:40:57,860
siguen la misma dinámica de crecimiento.

451
00:40:58,820 --> 00:41:03,719
De tal manera que nosotros, a lo largo del tiempo, podemos ir contando el número de células,

452
00:41:03,920 --> 00:41:08,440
concentración de células por mililitro, a lo largo del tiempo, días de cultivo

453
00:41:08,440 --> 00:41:10,320
y establecer una curva de crecimiento.

454
00:41:10,440 --> 00:41:12,019
¿Qué es la curva de crecimiento de un cultivo?

455
00:41:12,380 --> 00:41:15,960
Pues es una gráfica, una representación gráfica de la dinámica,

456
00:41:16,019 --> 00:41:17,300
de cómo crece ese cultivo,

457
00:41:18,719 --> 00:41:22,559
en la cual vamos a representar cómo crece el número de células,

458
00:41:23,380 --> 00:41:26,500
la concentración, la relación entre la concentración de células

459
00:41:26,500 --> 00:41:29,559
y los días de cultivo a lo largo del tiempo.

460
00:41:29,559 --> 00:41:31,539
Y como no podía ser de otra manera,

461
00:41:32,019 --> 00:41:36,000
esta curva de crecimiento, igual que mil parámetros en el mundo de la biología,

462
00:41:36,000 --> 00:41:38,940
sigue una dinámica sigmoidea.

463
00:41:39,599 --> 00:41:42,800
Como toda dinámica sigmoidea que ya hemos estudiado,

464
00:41:43,179 --> 00:41:44,780
tiene tres fases fundamentales.

465
00:41:45,239 --> 00:41:47,219
En este caso, tenemos una primera fase,

466
00:41:47,320 --> 00:41:48,360
que es la fase de latencia.

467
00:41:49,619 --> 00:41:51,420
Si os dais cuenta, yo voy a partir,

468
00:41:52,139 --> 00:41:53,059
¿esto qué significa?

469
00:41:53,320 --> 00:41:56,840
A día cero, el día cero es el día en el que yo pongo

470
00:41:56,840 --> 00:41:58,500
las células por primera vez en la placa.

471
00:41:59,460 --> 00:42:02,480
Bien, si es un cultivo primario,

472
00:42:02,480 --> 00:42:05,099
porque viene directamente de la deshidratación del tejido,

473
00:42:05,099 --> 00:42:07,340
o bien porque viene de un subcultivo.

474
00:42:07,579 --> 00:42:08,000
Da igual.

475
00:42:09,159 --> 00:42:11,619
Esas células es la primera vez que están en esa placa.

476
00:42:13,380 --> 00:42:15,679
Si os dais cuenta, en esta fase de latencia,

477
00:42:16,360 --> 00:42:19,239
cuando hablamos de la PCR a tiempo real y de otros parámetros,

478
00:42:19,719 --> 00:42:23,300
era una fase recta y luego empezaba a crecer.

479
00:42:23,460 --> 00:42:23,820
Aquí no.

480
00:42:24,320 --> 00:42:26,380
Aquí normalmente partimos de un número de células

481
00:42:26,380 --> 00:42:30,239
y algunas de ellas se produce una disminución en el número de células.

482
00:42:30,239 --> 00:42:33,679
Y esto es importante porque hay células que al principio se mueren.

483
00:42:33,679 --> 00:42:56,300
Por tanto, en esta fase de latencia, ¿qué es lo que ocurre? En esta fase de latencia, digamos que es la fase en la que las células se están adaptando al nuevo ambiente, adaptando al nuevo medio de cultivo, adaptándose a la nueva placa, adaptándose a crecer, a crecer, digamos, entre comillas, in vitro. ¿Cuánto dura? Aproximadamente 24 horas.

484
00:42:56,300 --> 00:42:59,820
Un día, aproximadamente

485
00:42:59,820 --> 00:43:01,840
Sobre todo si son células que crecen en monocapa

486
00:43:01,840 --> 00:43:04,639
Las células en suspensión, como veremos ahora

487
00:43:04,639 --> 00:43:07,059
La fase de latencia es más corta

488
00:43:07,059 --> 00:43:09,860
¿De qué depende la fase de latencia?

489
00:43:11,199 --> 00:43:11,800
¿De qué depende?

490
00:43:12,679 --> 00:43:15,659
¿Puede ser la fase de latencia más larga o más corta?

491
00:43:16,440 --> 00:43:18,440
Sí, depende de diferentes factores

492
00:43:18,440 --> 00:43:19,679
Algunos los veremos ahora

493
00:43:19,679 --> 00:43:23,920
Por lo tanto, la fase de latencia es la fase de adaptación

494
00:43:24,719 --> 00:43:32,920
El número de células suele disminuir un pelín hasta que llega un momento pasado a las 24 horas en el cual entramos en la fase exponencial.

495
00:43:33,360 --> 00:43:38,519
¿Qué es la fase exponencial? La fase exponencial no es ni más ni menos que la fase de crecimiento activo.

496
00:43:38,679 --> 00:43:45,699
Las células ya están a gusto, están creciendo a tope, el medio de cultivo que vamos a ver es súper nutritivo,

497
00:43:45,699 --> 00:43:49,380
tienen todo lo que necesitan y además lo tienen sin limitación.

498
00:43:49,380 --> 00:44:10,099
Tiene una atmósfera gaseosa, con dióxido de carbono, con oxígeno, todo lo que necesitan. En la fase exponencial se produce el crecimiento activo. Aproximadamente en 5, 6, 7 días, suele ser lo normal, depende del tipo de células, llegamos al tope máximo de crecimiento.

499
00:44:10,099 --> 00:44:26,940
Y por tanto entramos en la tercera fase, que es la fase que llamamos estacionario. ¿Qué ocurre en la fase estacionaria? Bien, el crecimiento se ralentiza completamente hasta que llega un momento que ya se para. Las células no crecen más. Y esto es por dos motivos fundamentales.

500
00:44:26,940 --> 00:44:48,860
Uno. Las células entran en fase estacionaria, uno, porque no caben más. Ya hay suficientes células. No caben más células, uno. Es lo que llamamos la inhibición por contacto en las células que crecen en monocapa o inhibición por densidad. Ya no caben más células. Por tanto, paran el crecimiento. La tasa de crecimiento baja prácticamente a cero.

501
00:44:48,860 --> 00:45:05,519
Y el segundo motivo es porque se han agotado los reactivos del medio de cultivo, los nutrientes, de tal manera que se ha gastado la glucosa, los aminoácidos, todo lo que veremos en la composición del medio de cultivo y se han ido acumulando sustancias de desecho.

502
00:45:06,039 --> 00:45:11,519
Las sustancias de desecho también ralentizan el crecimiento y la división celular.

503
00:45:11,519 --> 00:45:16,159
Como veis aquí, antes de llegar a la fase de latencia

504
00:45:16,159 --> 00:45:18,619
Antes de entrar en fase de latencia

505
00:45:18,619 --> 00:45:21,219
Y que se pare el crecimiento de esas células

506
00:45:21,219 --> 00:45:23,860
Tendríamos que realizar el subcultivo o el pase

507
00:45:23,860 --> 00:45:27,159
Es muy importante

508
00:45:27,159 --> 00:45:31,960
Todas las células, todas las células eucariotas de organismos pluricelulares

509
00:45:31,960 --> 00:45:32,980
Siguen esta dinámica

510
00:45:32,980 --> 00:45:36,400
Cada vez que yo cojo las células y las pongo en una placa

511
00:45:36,400 --> 00:45:38,719
Hay una fase de latencia, de adaptación

512
00:45:38,719 --> 00:45:40,860
Todas se tienen que volver a adaptar a esa placa

513
00:45:40,860 --> 00:45:43,719
una fase exponencial y al final

514
00:45:43,719 --> 00:45:45,619
si no hago el subcultivo

515
00:45:45,619 --> 00:45:47,360
las células dejan de crecer

516
00:45:47,360 --> 00:45:48,480
y entran en una fase estacional

517
00:45:48,480 --> 00:45:50,500
¿entienden?

518
00:45:51,920 --> 00:45:53,340
esta parte es muy importante

519
00:45:53,340 --> 00:45:55,599
y claro que la voy a preguntar en el examen

520
00:45:55,599 --> 00:45:57,440
bien

521
00:45:57,440 --> 00:45:59,420
esto hay que adaptarlo

522
00:45:59,420 --> 00:46:01,400
porque hay dos maneras

523
00:46:01,400 --> 00:46:03,659
de cultivar las células, porque hay dos tipos de células

524
00:46:03,659 --> 00:46:05,320
dos formas de realizar

525
00:46:05,320 --> 00:46:07,619
los cultivos celulares dependiendo del tipo de célula

526
00:46:07,619 --> 00:46:08,440
que cultivamos

527
00:46:08,440 --> 00:46:24,179
Por un lado, el más abundante son las células que crecen en monocapa, son células endoteliales, son células epiteliales, son hepatocitos, son células que crecen, ¿qué quiere decir en monocapa? Crecen adheridas al sustrato, ¿sí?

528
00:46:24,179 --> 00:46:26,460
Aquí tenemos el sustrato, que es el plástico.

529
00:46:27,219 --> 00:46:31,739
Normalmente en el organismo están pegadas y ancladas a la matriz extracelular.

530
00:46:32,579 --> 00:46:35,519
Son lo que llamamos células dependientes de anclaje.

531
00:46:36,059 --> 00:46:39,340
Si estas células, yo las pongo en la placa,

532
00:46:39,480 --> 00:46:42,880
y estas células no son capaces de anclarse al plástico,

533
00:46:43,340 --> 00:46:45,280
como son células dependientes de anclaje,

534
00:46:45,699 --> 00:46:49,820
sufren un proceso denominado anoiquis.

535
00:46:50,639 --> 00:46:52,119
¿Qué es la anoiquis?

536
00:46:52,119 --> 00:47:05,800
La anoiquis es un tipo de apoptosis de muerte celular programada que se produce por la falta de anclaje al sustrato. Eso es el anoiquis.

537
00:47:06,199 --> 00:47:20,039
Entonces, cuando yo cojo las células y las pongo por primera vez en la placa, todas aquellas que son capaces de anclarse, aquellas células que son capaces de anclarse, empezarán a proliferar.

538
00:47:20,039 --> 00:47:31,019
La célula que por cualquier circunstancia no es capaz de anclarse, sufrirá un proceso automático que está programado genéticamente de anoitis y esa célula morirá por apoptosis.

539
00:47:33,780 --> 00:47:42,599
Las células en monocapa, si os dais cuenta, las etapas del desarrollo de un cultivo, de un crecimiento en monocapa tiene tres fases.

540
00:47:42,599 --> 00:47:44,099
la fase de adhesión

541
00:47:44,099 --> 00:47:47,159
esta fase de adhesión

542
00:47:47,159 --> 00:47:49,780
de adhesión a la superficie

543
00:47:49,780 --> 00:47:52,320
coincide con la fase de latencia

544
00:47:52,320 --> 00:47:52,980
por supuesto

545
00:47:52,980 --> 00:47:54,719
de la curva de crecimiento

546
00:47:54,719 --> 00:47:56,039
pues en la fase de latencia

547
00:47:56,039 --> 00:47:57,559
las células que crecen en monocapa

548
00:47:57,559 --> 00:47:59,980
¿qué es lo que hacen durante la fase de latencia?

549
00:48:00,699 --> 00:48:01,659
en la fase de latencia

550
00:48:01,659 --> 00:48:04,519
hemos dicho que las células se adaptan

551
00:48:04,519 --> 00:48:06,099
¿qué es eso de adaptarse?

552
00:48:06,340 --> 00:48:07,460
en un cultivo en monocapa

553
00:48:07,460 --> 00:48:09,059
significa que estas células

554
00:48:09,059 --> 00:48:11,659
se van a adherir a la superficie

555
00:48:11,659 --> 00:48:33,579
Es decir, la célula se va a ir depositando y va a ir decantando sobre el sustrato, en este caso es el plástico de la placa, que yo le puedo poner algún tipo de, por ejemplo, gelatina, algo que parezca la matriz extracelular, y la célula, esta fase de adhesión se lleva a cabo en tres etapas.

556
00:48:33,579 --> 00:48:56,699
La primera etapa es el attachment, el anclaje. Lo primero que hace es decantar y anclarse. Ves que la célula está redondita. La segunda etapa es el self-spreading. La célula se empieza a extender y empieza a formar pequeñas uniones a través de una serie de prolongaciones de la membrana.

557
00:48:56,699 --> 00:49:02,360
y empieza a formar pequeñas uniones, está tocando, es como cuando metemos el pie en la piscina

558
00:49:02,360 --> 00:49:08,519
para ver si está muy hondo o poco hondo, metemos primero un pie, esto es lo que está haciendo.

559
00:49:09,179 --> 00:49:13,719
¿Se pueden establecer aquí bien los contactos, la matriz extracelular o el plástico es adecuado?

560
00:49:14,039 --> 00:49:19,480
Sí o no, esto ya veis que es un proceso reversible, puede ir para adelante y puede ir para atrás.

561
00:49:20,559 --> 00:49:25,159
Si el sustrato es adecuado, entonces se lleva a cabo la tercera etapa que es la adhesión.

562
00:49:25,159 --> 00:49:46,119
En la adhesión, ya veis que se forman múltiples puntos de adhesión, de adhesiones focales, focal adhesions en inglés, adhesiones focales. ¿Qué son las adhesiones focales? Son puntos concretos de la membrana de la célula a través de los cuales se va a anclar al sustrato.

563
00:49:46,119 --> 00:49:48,099
Ya hemos dicho

564
00:49:48,099 --> 00:49:50,000
La célula que no es capaz de llegar aquí

565
00:49:50,000 --> 00:49:52,440
Se va a morir por Anoikis

566
00:49:52,440 --> 00:49:55,380
Esto hay que tenerlo en cuenta

567
00:49:55,380 --> 00:49:58,159
Hemos terminado la primera fase

568
00:49:58,159 --> 00:49:59,400
La fase de latencia

569
00:49:59,400 --> 00:50:02,179
Se ha llevado a cabo la adhesión a la superficie

570
00:50:02,179 --> 00:50:03,840
Las células ya están adheridas

571
00:50:03,840 --> 00:50:04,880
La célula

572
00:50:04,880 --> 00:50:07,199
Comienza la fase exponencial

573
00:50:07,199 --> 00:50:08,840
¿Qué es lo que ocurre?

574
00:50:09,119 --> 00:50:10,280
La célula prolifera

575
00:50:10,280 --> 00:50:12,239
Y forma colonias

576
00:50:12,239 --> 00:50:15,980
Para que la célula pueda proliferar

577
00:50:15,980 --> 00:50:23,579
y formar colonias, la célula se tiene que desaderir, desanclar parcialmente. Fijaos aquí

578
00:50:23,579 --> 00:50:28,559
en esta imagen, estas células redonditas que os he puesto aquí en estos círculos, son células que

579
00:50:28,559 --> 00:50:34,420
están dividiéndose. La morfología normal de estas células, que deben ser fibroblastos, es esta que

580
00:50:34,420 --> 00:50:41,500
señala la flecha. Son células fusiformes con forma estrellada. Esa es su morfología normal.

581
00:50:41,500 --> 00:51:07,400
Esta morfología es propia de las células que están completamente ancladas. Estas células que están completamente ancladas no pueden proliferar así. Para poder proliferar, como ya hemos dicho, puesto que este proceso de adhesión es reversible, la célula debe revertir el proceso de anclaje parcialmente.

582
00:51:07,400 --> 00:51:35,400
De tal manera que la célula pasa de estar estirada, formando en este caso esta forma estrellada, fusiforme, bien aplanada, pasa de estar con esa morfología a tener una morfología más redondeada en la cual podríamos decir que la célula queda anclada únicamente por un pequeño tallo de anclaje en un punto concreto.

583
00:51:35,400 --> 00:51:52,400
De esta manera, la célula, la morfología de la célula, vuelve a ser redondeada. Una vez acabada la mitosis, este proceso, como es reversible, la célula vuelve a hacer el cell spreading y nuevamente cell adhesion.

584
00:51:52,400 --> 00:52:01,630
adhesión. Por tanto, durante toda la fase exponencial de proliferación y de formación

585
00:52:01,630 --> 00:52:10,590
de colonias, la célula está haciendo continuamente el proceso reversible de célula adherida

586
00:52:10,590 --> 00:52:18,030
a célula anclada. De célula anclada al cell spreading, la expansión, la extensión y

587
00:52:18,030 --> 00:52:23,110
otra vez la adhesión. Si os dais cuenta, ¿por qué pone proliferación y formación

588
00:52:23,110 --> 00:52:29,010
de colonias porque normalmente si os dais cuenta las células empiezan a proliferar y las células

589
00:52:29,010 --> 00:52:34,090
hijas quedan cerca de la célula madre de tal manera que se empiezan a formar pequeñas colonias

590
00:52:34,090 --> 00:52:40,289
pequeñas agrupaciones que son estas que os pongo aquí aquí tenemos una colonia aquí tendríamos

591
00:52:40,289 --> 00:52:48,510
otra colonia aquí tendríamos otra colonia de células aquí tenemos otra colonia grande se está

592
00:52:48,510 --> 00:52:54,349
formando otra colonia aquí, si os dais cuenta, de tal manera que se van formando pequeños núcleos

593
00:52:54,349 --> 00:53:02,690
de células proliferativas. ¿Cuándo para? ¿Cuándo acaba la fase exponencial? Cuando la célula llega

594
00:53:02,690 --> 00:53:11,369
a la fase de meseta, llega a la saturación, de tal manera que deja de crecer. Esa es la tercera etapa

595
00:53:11,369 --> 00:53:18,670
del desarrollo de un cultivo en monocapa. ¿Por qué la célula deja de crecer? Decíamos antes en la

596
00:53:18,670 --> 00:53:23,489
diapositiva anterior que la célula entra en fase estacionaria por dos motivos. Una, porque ya no

597
00:53:23,489 --> 00:53:30,309
caben más y por tanto entra en confluencia y dos, porque se están agotando los reactivos, los

598
00:53:30,309 --> 00:53:36,449
nutrientes y se están acumulando demasiadas sustancias de desecho. Esto es lo que ocurre

599
00:53:36,449 --> 00:53:43,829
en la tercera etapa del desarrollo del crecimiento de células en monocapo.

600
00:53:43,829 --> 00:53:46,829
Es lo que llamamos la inhibición por contacto.

601
00:53:47,030 --> 00:53:48,750
¿Qué es la inhibición por contacto?

602
00:53:49,050 --> 00:53:52,530
La inhibición por contacto es el proceso que sufren las células,

603
00:53:53,349 --> 00:53:59,789
es el proceso fisiológico que sufren las células que crecen en monocapa in vitro,

604
00:53:59,789 --> 00:54:20,219
por el cual cuando ya se ha cubierto completamente toda la superficie disponible, las células unas a otras se envían, aquí abajo tenemos una placa completamente confluente y ya inhibida por contacto,

605
00:54:20,219 --> 00:54:40,360
Las células en este estado se envían señales inhibitorias unas a otras. Esta célula a esta célula y a esta célula y a esta célula. Unas células a otras se envían señales inhibitorias que detienen su proliferación.

606
00:54:40,360 --> 00:54:59,800
Y las células entran en una fase, digamos, como quiescente, como de reposo. ¿De acuerdo? Mantienen su metabolismo a mínimos porque ya no caben más células. Por tanto, la inhibición por contacto es la responsable de que las células entren en confluencia.

607
00:54:59,800 --> 00:55:31,400
Cuando hablamos de confluencia, cuando decimos que las células están confluentes, cuando han ocupado toda la superficie disponible de la placa del frasco de cultivo. ¿De acuerdo? ¿Se entiende? Bien. Aquí tenemos una pequeña animación que lo explica, aunque sea brevemente, que yo creo que se va a entender mejor.

608
00:55:31,400 --> 00:55:37,659
Cuando se introduce un pequeño número de células normales en una placa de Petri,

609
00:55:37,960 --> 00:55:50,219
empiezan a dividirse y a proliferar. A medida que las células entran en contacto con las otras

610
00:55:50,219 --> 00:55:55,179
células, disminuye su tasa de división. Este comportamiento es una consecuencia del proceso

611
00:55:55,179 --> 00:56:00,219
llamado inhibición por contacto. Cuando las células han llenado la superficie de la placa,

612
00:56:00,579 --> 00:56:05,480
la tasa de división celular disminuye aún más y se equilibra con la tasa de muerte celular,

613
00:56:05,480 --> 00:56:10,539
de manera que el número total de células permanece constante. A este estado se le llama

614
00:56:10,539 --> 00:56:19,739
de confluencia. La inhibición por contacto asegura que las células generen una capa de una sola

615
00:56:19,739 --> 00:56:28,860
célula de grosor, una monocapa. El comportamiento de las células cancerígenas es bastante diferente.

616
00:56:29,199 --> 00:56:33,940
Si se siembra una célula cancerígena entre células normales, todas las células proliferarán

617
00:56:33,940 --> 00:56:38,980
como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, cuando se llega a la confluencia, las células

618
00:56:38,980 --> 00:56:44,139
normales regularán su crecimiento, mientras que las células cancerosas continuarán dividiéndose

619
00:56:44,139 --> 00:56:53,389
de forma descontrolada, produciendo un grupo de células a menudo llamado foco. La inhibición por

620
00:56:53,389 --> 00:56:59,510
contacto se puede demostrar in vitro quitando células de una monocapa en confluencia. En este

621
00:56:59,510 --> 00:57:07,340
experimento, las células se eliminan raspando la monocapa con una aguja. Las células supervivientes

622
00:57:07,340 --> 00:57:12,840
de los márgenes de la herida hacen dos cosas. Empiezan a proliferar más rápidamente, puesto

623
00:57:12,840 --> 00:57:19,360
que ya no están completamente inhibidas por contacto y migran hacia el área vacía intentando

624
00:57:19,360 --> 00:57:42,860
llenarla. ¿Se entiende? Por tanto, implícitamente ya nos ha dicho que las células normales que

625
00:57:42,860 --> 00:57:49,519
crecen en monocapa sufren inhibición por contacto cuando llegan a confluencia. La inhibición por

626
00:57:49,519 --> 00:57:56,619
contacto es el proceso por el cual unas células a otras se señalizan inhibitoriamente, negativamente

627
00:57:56,619 --> 00:57:58,079
para que dejen de proliferar.

628
00:57:58,940 --> 00:58:02,800
Las células tumorales, ya hemos dicho antes que todas las células tumorales

629
00:58:02,800 --> 00:58:08,659
forman líneas celulares inmortalizadas, no sufren inhibición por contacto.

630
00:58:08,840 --> 00:58:10,039
Y esta es una gran diferencia.

631
00:58:10,519 --> 00:58:13,380
Son células que crecen, crecen, crecen y aunque lleguen a confluencia

632
00:58:13,380 --> 00:58:18,940
siguen creciendo muchas veces formando pseudoestructuras tridimensionales

633
00:58:18,940 --> 00:58:22,880
parecidas a las que se han visto aquí en el vídeo.

634
00:58:22,880 --> 00:58:38,840
Pero estructuras pseudo tridimensionales que se les denominan focos, ¿de acuerdo? Independientemente de si son epiteliales, si son renales, pulmonares, da igual, ¿de acuerdo?

635
00:58:38,840 --> 00:59:02,760
Bien, pero el crecimiento en monocapa es una forma de crecimiento in vitro de la gran mayoría de las células, pero hay otras células que tienen otra forma de crecimiento, que son aquellas células que crecen en suspensión.

636
00:59:02,760 --> 00:59:20,019
Por ejemplo, las células hematológicas, los linfocitos, los neutrófilos que cultivamos in vitro, son células que crecen en suspensión. No se adhieren a ninguna superficie, ni a las paredes, ni al fondo de la placa. Crecen en suspensión.

637
00:59:20,019 --> 00:59:30,619
Las etapas de las células de los cultivos en suspensión también se lleva a cabo el crecimiento en tres etapas

638
00:59:30,619 --> 00:59:33,420
La primera es la adaptación al medio de cultivo

639
00:59:33,420 --> 00:59:37,599
Adaptación al medio de cultivo coincide con la fase de latencia de crecimiento

640
00:59:37,599 --> 00:59:40,639
Pero en este caso suele ser más rápida

641
00:59:40,639 --> 00:59:44,780
¿Por qué? Porque no se tienen que adherir, no se tienen que anclar

642
00:59:44,780 --> 00:59:58,039
Y muchas veces con 8 horas, 10, 12 horas como máximo es suficiente para que las células se adapten al nuevo medio de cultivo y al nuevo recipiente de cultivo.

643
00:59:59,159 --> 01:00:05,900
La segunda fase, una vez ya están adaptadas, coincide con la fase exponencial y es la proliferación en suspensión.

644
01:00:05,900 --> 01:00:31,539
Las células se dividen, se dividen en suspensión, de tal manera que a partir de un grupito de células que tenemos aquí, en este primer frasco, ya veremos que es un frasco de cultivo con aspas, rotatorio, de tal manera que estas aspas van girando continuamente, van girando para mantener un movimiento y un flujo continuo en el medio de cultivo.

645
01:00:31,539 --> 01:00:36,719
es un movimiento suave que impide que las células se peguen unas con otras, ¿de acuerdo?

646
01:00:37,179 --> 01:00:42,599
Daos cuenta que si estamos cultivando linfocitos, los linfocitos en el torrente sanguíneo están en continuo movimiento.

647
01:00:43,199 --> 01:00:48,519
Entonces, este tipo de cultivos en suspensión intenta imitar estas condiciones de cultivo,

648
01:00:49,139 --> 01:00:54,380
estas condiciones fisiológicas de movimiento, de flujo, ¿de acuerdo?

649
01:00:55,440 --> 01:00:59,079
Hasta cuando crecen, hasta que no caben más, entre comillas.

650
01:00:59,079 --> 01:01:22,079
Las células en suspensión no sufren inhibición por contacto, ¿de acuerdo? Ya que normalmente vamos a intentar evitar que contacten unas con otras. Sufren lo que llamamos un proceso de inhibición por densidad. Si os dais cuenta, aquí hay una gran diferencia entre estas células que fueron sembradas y estas células que llevan un tiempo creciendo, ¿de acuerdo?

651
01:01:22,079 --> 01:01:42,199
Entonces, ¿qué es la inhibición por densidad? Es un proceso parecido a la inhibición por contacto. Cuando hay una densidad, cuando se alcanza un umbral de densidad máximo, a partir de ese momento, unas células a otras empiezan a señalizarse de forma negativa para parar el crecimiento y dejan de crecer.

652
01:01:42,199 --> 01:01:43,380
¿de acuerdo?

653
01:01:44,000 --> 01:01:46,360
entonces tendríamos así la fase de latencia

654
01:01:46,360 --> 01:01:48,920
la fase exponencial y aquí llegaríamos a la fase transita

655
01:01:48,920 --> 01:01:50,320
importante

656
01:01:50,320 --> 01:01:51,340
importante

657
01:01:51,340 --> 01:01:54,340
tiro para atrás

658
01:01:54,340 --> 01:01:57,019
tanto en el crecimiento

659
01:01:57,019 --> 01:01:57,719
en monocapa

660
01:01:57,719 --> 01:02:00,400
como en el crecimiento en suspensión

661
01:02:00,400 --> 01:02:03,000
hemos de intentar pasar las células

662
01:02:03,000 --> 01:02:04,940
antes de que lleguen a confluencia

663
01:02:04,940 --> 01:02:07,119
o a la densidad máxima

664
01:02:07,119 --> 01:02:08,360
hay que intentar evitar

665
01:02:08,360 --> 01:02:10,019
que atraviesen

666
01:02:10,019 --> 01:02:13,820
y entren en la fase estacionaria.

667
01:02:14,179 --> 01:02:17,800
Entrar en la fase estacionaria significa que van a poner en reposo

668
01:02:17,800 --> 01:02:22,139
todo su metabolismo y luego reactivarla es mucho más complicado.

669
01:02:22,719 --> 01:02:25,139
Por eso siempre vamos a intentar pasar las células

670
01:02:25,139 --> 01:02:27,659
y cambiarlas a otra placa nueva

671
01:02:27,659 --> 01:02:32,360
cuando estén aproximadamente al 80% de confluencia

672
01:02:32,360 --> 01:02:34,659
o al 80% de la densidad máxima.

673
01:02:36,239 --> 01:02:36,599
¿De acuerdo?

674
01:02:37,280 --> 01:02:38,360
Eso es importante.

675
01:02:38,719 --> 01:02:39,940
Se me había olvidado comentarlo.

676
01:02:40,019 --> 01:02:58,820
Muy bien, ya sabemos los tipos de cultivos que tenemos, ya hemos visto las fases de la curva de crecimiento de las células y las formas que tienen las células para poder crecer, bien si crecen en monocapa o bien si crecen en suspensión.

677
01:02:58,820 --> 01:03:14,440
¿De acuerdo? Ahora, ¿estas células cómo se comportan in vitro a lo largo del tiempo? Esto es lo que vamos a ver ahora en lo que llamamos el comportamiento vital tras sucesivos pases.

678
01:03:14,440 --> 01:03:21,340
Entonces, una línea celular primaria, por repasar lo que hemos comentado anteriormente

679
01:03:21,340 --> 01:03:27,539
Una línea celular primaria es un cultivo secundario que viene directamente de un cultivo primario

680
01:03:27,539 --> 01:03:31,940
El cual venía directamente de un órgano o de un tejido

681
01:03:31,940 --> 01:03:36,539
La línea celular primaria es aquella obtenida a partir del tejido del órgano

682
01:03:36,539 --> 01:03:39,579
Mediante un cultivo primario

683
01:03:39,579 --> 01:03:57,380
¿Os acordáis? Este cultivo primario lo hemos ido manteniendo in vitro hasta que en la placa solo nos ha quedado un tipo de célula. Es un cultivo ya celular, un cultivo de célula histotípico normalmente, un tipo celular.

684
01:03:57,380 --> 01:04:00,780
¿Cuánto tiempo lo podemos mantener in vitro?

685
01:04:01,079 --> 01:04:02,719
Pues ya hemos dicho que es un tiempo limitado

686
01:04:02,719 --> 01:04:06,539
Las células no están en su ambiente fisiológico y en la placa

687
01:04:06,539 --> 01:04:09,039
pues no pueden crecer ilimitadamente

688
01:04:09,039 --> 01:04:11,519
y entran en el proceso de senescencia

689
01:04:11,519 --> 01:04:15,280
Ya hemos comentado anteriormente que el proceso de senescencia

690
01:04:15,280 --> 01:04:21,960
sería algo parecido a un proceso de envejecimiento de las células

691
01:04:21,960 --> 01:04:26,159
La senescencia se define como la etapa vital

692
01:04:26,159 --> 01:04:29,639
en la que las células van perdiendo la capacidad de dividirse

693
01:04:29,639 --> 01:04:33,800
y al final ese cultivo acaba muriendo.

694
01:04:34,519 --> 01:04:38,860
Las células envejecen, paran de dividirse, paran de crecer,

695
01:04:39,000 --> 01:04:42,420
empiezan a crecer más despacio hasta que llega un momento que las células in vitro se mueren.

696
01:04:43,599 --> 01:04:47,300
¿Qué podemos hacer para que las células no entren en senescencia?

697
01:04:47,300 --> 01:04:49,139
¿O no lleguen a la senescencia?

698
01:04:49,780 --> 01:04:55,519
Pues en cada subcultivo, en cada pase, podemos ir congelando viales.

699
01:04:56,159 --> 01:05:10,039
Vamos a ver ahora. Es decir, imaginaos que podemos graficar ahora a lo largo del tiempo, aquí tenemos semanas y aquí tenemos el recuento acumulativo de células.

700
01:05:10,039 --> 01:05:28,059
¿Esto qué significa? Esta gráfica que significa que desde el momento cero, desde el primer día, el día cero, cuando ponemos en marcha el cultivo, obtenemos las células del órgano del tejido por disgregación y las ponemos in vitro y establecemos un cultivo primario.

701
01:05:28,059 --> 01:05:45,440
Esto ya lo sabemos. Estas células normalmente van a sufrir un periodo de latencia largo, que son semanas de cultivo, aquí son 7 días, no nos confundamos, no son 24 horas, son 7 días, es una semana.

702
01:05:45,440 --> 01:06:00,219
A lo largo de la primera semana, hasta que se empieza a reactivar y empiezan a crecer las células, pues pasa tiempo. Pero llega un momento en el que esas células ahora ya entran como en sus fases exponenciales. Empiezan a crecer.

703
01:06:00,219 --> 01:06:03,639
Cuando llegan a la primera confluencia

704
01:06:03,639 --> 01:06:05,039
Hacemos el primer pase

705
01:06:05,039 --> 01:06:06,760
Aquí hacemos el primer pase

706
01:06:06,760 --> 01:06:09,019
Las cambiamos

707
01:06:09,019 --> 01:06:10,800
De plaquita

708
01:06:10,800 --> 01:06:12,159
Y siguen creciendo

709
01:06:12,159 --> 01:06:13,840
Y aquí haríamos

710
01:06:13,840 --> 01:06:15,840
El segundo pase

711
01:06:15,840 --> 01:06:19,099
El segundo pase

712
01:06:19,099 --> 01:06:21,019
¿Sí?

713
01:06:22,579 --> 01:06:23,579
Siguen creciendo

714
01:06:23,579 --> 01:06:25,940
Daos cuenta que aquí es el recuento acumulativo

715
01:06:25,940 --> 01:06:27,179
¿Eso qué significa?

716
01:06:27,940 --> 01:06:31,280
El recuento acumulativo significa que si yo partía de 10 millones de células

717
01:06:31,280 --> 01:06:34,380
aquí a día 0

718
01:06:34,380 --> 01:06:37,860
pues en el primer pase igual obtengo el doble

719
01:06:37,860 --> 01:06:39,320
20 millones de células

720
01:06:39,320 --> 01:06:41,599
esas 20 millones de células

721
01:06:41,599 --> 01:06:45,019
hago el primer pase y las pongo en dos plaquitas

722
01:06:45,019 --> 01:06:46,940
10 millones y 10 millones

723
01:06:46,940 --> 01:06:49,019
cuando llegan a confluencia

724
01:06:49,019 --> 01:06:51,260
tendré 20 millones y 20 millones

725
01:06:51,260 --> 01:06:55,179
por tanto el número de células acumulativos son 40 millones

726
01:06:55,179 --> 01:06:57,539
vuelvo a hacer el segundo pase

727
01:06:57,539 --> 01:07:00,260
de las cuatro placas

728
01:07:00,260 --> 01:07:02,420
de las dos placas, ahora paso

729
01:07:02,420 --> 01:07:04,420
a cuatro. Y así cada vez

730
01:07:04,420 --> 01:07:05,340
en cada pase

731
01:07:05,340 --> 01:07:08,320
voy obteniendo mayor

732
01:07:08,320 --> 01:07:10,400
número de células. Hasta que

733
01:07:10,400 --> 01:07:12,179
llega un momento que después del tercer, cuarto,

734
01:07:12,340 --> 01:07:14,260
quinto pase, obtenemos ya

735
01:07:14,260 --> 01:07:16,559
si os acordáis, la línea celular primaria.

736
01:07:16,800 --> 01:07:18,380
La línea celular primaria es

737
01:07:18,380 --> 01:07:20,420
aquella en la que mayoritariamente

738
01:07:21,039 --> 01:07:22,360
vamos a tener

739
01:07:22,360 --> 01:07:23,820
un único tipo de células.

740
01:07:25,079 --> 01:07:25,920
Estas células

741
01:07:25,920 --> 01:07:28,400
son las que decimos que con el tiempo

742
01:07:28,400 --> 01:07:29,619
van a entrar en senescencia.

743
01:07:30,260 --> 01:07:56,420
Ojo, y esto es importante, no confundir esta gráfica donde lo que estamos viendo es desde el principio hasta que estas células entran en senescencia y se mueren después de no sé cuántas semanas en cultivo y meses, no confundir esta gráfica donde vemos el recuento acumulativo con la gráfica, la curva de crecimiento exponencial, ¿sí?

744
01:07:56,420 --> 01:08:04,300
la curva de crecimiento en cada pase, es decir, en cada pase que yo voy haciendo, las células van

745
01:08:04,300 --> 01:08:11,219
experimentando un crecimiento que sigue esta curva, es decir, estas primeras células, cuando yo he hecho

746
01:08:11,219 --> 01:08:18,619
este primer pase y las vuelvo a poner en la plaquita, en este segundo pase, estas células, aquí en este

747
01:08:18,619 --> 01:08:25,880
punto, las células que están en una nueva placa, empiezan una fase de latencia que se tienen que

748
01:08:25,880 --> 01:08:31,859
adaptar tendrán una fase exponencial y al final entrarán en una fase estacionaria ya hemos dicho

749
01:08:31,859 --> 01:08:37,560
que antes de que entre en la fase estacionaria aquí vamos a realizar el subcultivo es decir

750
01:08:37,560 --> 01:08:45,920
haríamos el tercer subcultivo aquí una vez hecho el tercer subcultivo el tercer pase estas células

751
01:08:45,920 --> 01:08:51,600
las voy a volver a poner en una nueva plaquita y en este punto estas células se tienen que volver

752
01:08:51,600 --> 01:08:52,939
a adaptar al cultivo

753
01:08:52,939 --> 01:08:55,420
y por tanto comienzan de nuevo

754
01:08:55,420 --> 01:08:57,539
una nueva curva con su

755
01:08:57,539 --> 01:08:59,720
fase exponencial, su fase

756
01:08:59,720 --> 01:09:01,640
de latencia exponencial y fase estacionaria

757
01:09:01,640 --> 01:09:03,000
y así en cada fase.

758
01:09:04,119 --> 01:09:04,699
¿Se entiende?

759
01:09:05,979 --> 01:09:07,359
Una vez obtenido

760
01:09:07,359 --> 01:09:09,119
la línea celular primaria,

761
01:09:09,579 --> 01:09:11,380
esta línea celular primaria, hemos dicho que tiene

762
01:09:11,380 --> 01:09:13,500
dura un tiempo limitado

763
01:09:13,500 --> 01:09:15,500
y con el tiempo entra en

764
01:09:15,500 --> 01:09:16,520
senescencia.

765
01:09:17,380 --> 01:09:19,119
Es decir, estas células

766
01:09:19,119 --> 01:09:21,180
entran en senescencia.

767
01:09:21,600 --> 01:09:27,640
Llega un momento, hay un punto de inflexión, un punto en el tiempo que depende del tipo de células que son,

768
01:09:27,739 --> 01:09:33,539
si son fibroblastos, si son células epiteliales, en el que estas células dejan de crecer,

769
01:09:34,439 --> 01:09:37,439
paran su crecimiento y empezamos a perder células.

770
01:09:37,619 --> 01:09:39,340
Es decir, las células empiezan a morir.

771
01:09:40,640 --> 01:09:40,920
¿De acuerdo?

772
01:09:41,720 --> 01:09:47,159
¿Qué es lo que podemos hacer para que las células no entren en senescencia, no llegaran a senescencia?

773
01:09:47,159 --> 01:09:53,060
Lo que se suele hacer es, en cada uno de estos pases, dividir las células en dos.

774
01:09:54,319 --> 01:10:03,359
Unas células, la mitad de las células, se siembran en una nueva plaquita para que sigan creciendo, que serían estas.

775
01:10:03,979 --> 01:10:07,399
Son las células que voy a poner en el segundo pase.

776
01:10:07,720 --> 01:10:12,520
Y la otra mitad la vamos a utilizar para congelar un vial.

777
01:10:12,520 --> 01:10:19,939
Es decir, en un tubito, lo que llamamos un criotubo, voy a congelar esas células

778
01:10:19,939 --> 01:10:23,140
Y las voy a mantener ya congeladas a menos 80

779
01:10:23,140 --> 01:10:25,180
Estos procedimientos ya los veremos

780
01:10:25,180 --> 01:10:29,680
Entonces estas células que están a menos 80 lo importante es poner que son de pase 1

781
01:10:29,680 --> 01:10:30,939
Es decir, son muy jóvenes

782
01:10:30,939 --> 01:10:35,939
Cuando yo tenga que hacer el segundo pase haré lo mismo

783
01:10:35,939 --> 01:10:38,340
Estas células las voy a dividir en dos

784
01:10:38,340 --> 01:10:54,800
Por un lado, sembraré una placa nueva y continuaré el crecimiento, que son estas, que van a ir a pase 3, y la otra mitad de las células congelaré nuevamente otro vial.

785
01:10:54,800 --> 01:10:56,840
¿se entiende?

786
01:10:57,579 --> 01:10:59,279
entonces de esta manera

787
01:10:59,279 --> 01:11:01,579
a ver, esto es una caricatura

788
01:11:01,579 --> 01:11:03,579
en este vial pondré que son

789
01:11:03,579 --> 01:11:05,520
jóvenes todavía pero oye

790
01:11:05,520 --> 01:11:07,279
son de pase 2, ya no son de pase 1

791
01:11:07,279 --> 01:11:09,439
estas son todavía más jóvenes y tienen

792
01:11:09,439 --> 01:11:10,699
más vitalidad que estas

793
01:11:10,699 --> 01:11:12,880
en realidad esto

794
01:11:12,880 --> 01:11:15,319
no se hace con un criotubo

795
01:11:15,319 --> 01:11:17,460
y una placa, lo que se

796
01:11:17,460 --> 01:11:19,239
hace a partir del pase 2 es

797
01:11:19,239 --> 01:11:21,359
una expansión y utilizamos

798
01:11:21,359 --> 01:11:23,239
placas muy grandes y de cada

799
01:11:23,239 --> 01:11:28,399
placa, en lugar de utilizar, sembramos una placa muy grande

800
01:11:28,399 --> 01:11:32,279
y en lugar de congelar un vial, congelamos 10 viales

801
01:11:32,279 --> 01:11:35,439
de pase 1, es decir, por 10

802
01:11:35,439 --> 01:11:40,239
en el segundo pase hacemos lo mismo y volvemos a congelar otros

803
01:11:40,239 --> 01:11:44,340
10 viales, de tal manera que así pase a pase

804
01:11:44,340 --> 01:11:48,359
yo voy a poder ir estudiando las células con las

805
01:11:48,359 --> 01:11:52,619
placas que voy pasando y al mismo tiempo

806
01:11:52,619 --> 01:12:01,279
voy acumulando viales. Cuando llegue y haya hecho 15 pases, en realidad tendré 150 viales congelados.

807
01:12:02,340 --> 01:12:06,479
Estas células llegarán a un momento que lleguen a senescencia. Cuando la placa que yo he ido

808
01:12:06,479 --> 01:12:14,359
manteniendo pase tras pase llegue al final y entre en senescencia, esta placa la tiro

809
01:12:14,359 --> 01:12:30,779
Y descongelo un vial. De tal manera que al descongelar un vial ya no necesito otra vez volver al órgano, volver al tejido, establecer un cultivo primario y comenzar todo de cero.

810
01:12:31,920 --> 01:12:41,460
No sé si me explico. ¿Se entiende? Muy bien. Este es el comportamiento normal de una línea celular primaria.

811
01:12:41,460 --> 01:12:55,460
Con el tiempo obtenemos la línea celular primaria, vamos haciendo pases, vamos utilizando las células que necesitamos para los experimentos y el resto las vamos congelando hasta que llega un momento que entran en senescencia.

812
01:12:55,460 --> 01:13:17,119
Cuando esas células entran en senescencia, tiro esas células, porque se están muriendo, y descongelo un vial nuevo. ¿Sí? Bien. Pero hay otra manera de intentar que no entren en senescencia, y es convertir esta línea celular primaria, ¿sí? En una línea celular, perdón.

813
01:13:17,119 --> 01:13:35,119
Bueno, aquí tenéis un ejemplo. Los pongo aquí. Esto es un cultivo primario de osteoblastos. Los osteoblastos son las células formadoras de hueso. Osteoblastos muy bonitos. Fijaos qué forma fusiforme tienen. Y esto es un cultivo de esos osteoblastos que ya han llegado a su inocencia.

814
01:13:35,119 --> 01:13:39,220
Fijaos, la morfología es tremendamente fea, horrible

815
01:13:39,220 --> 01:13:41,859
Veis estas partículas, esto es lo que llamamos el detritus celular

816
01:13:41,859 --> 01:13:45,680
Son restos celulares, restos citoplasmáticos de células que van muriendo

817
01:13:45,680 --> 01:13:47,399
Este cultivo está envejecido

818
01:13:47,399 --> 01:13:50,720
Este cultivo, los resultados que se pueden obtener con este cultivo

819
01:13:50,720 --> 01:13:54,020
Son malos siempre y están muy sesgados

820
01:13:54,020 --> 01:13:55,239
¿De acuerdo?

821
01:13:55,239 --> 01:13:57,920
Por tanto, cuando observamos que nuestro cultivo primario

822
01:13:57,920 --> 01:14:03,060
Nuestra línea celular primaria empieza a tener signos de envejecimiento

823
01:14:03,060 --> 01:14:16,920
lo mejor que podemos hacer es tirarla, tirar esta placa y descongelar un nuevo vial para establecer un nuevo cultivo, en este caso de línea celular primaria, ¿de acuerdo?

824
01:14:17,760 --> 01:14:29,819
Bien, pero podemos intentar transformar esta línea celular primaria, para evitar que entre en senescencia, podemos intentar inmortalizarla.

825
01:14:29,819 --> 01:14:37,800
Si esta línea celular primaria yo consiguiese inmortalizarla o transformarla

826
01:14:37,800 --> 01:14:42,720
Pasaría a ser una línea celular continua, transformada o inmortalizada

827
01:14:42,720 --> 01:14:47,060
De tal manera que ya no necesitaría congelar las células

828
01:14:47,060 --> 01:14:52,720
Las células ya no entrarían en senescencia, sino que serían células transformadas e inmortales

829
01:14:52,720 --> 01:14:55,699
¿Cómo lo conseguimos?

830
01:14:56,579 --> 01:14:58,739
Esto lo podemos conseguir de muchas maneras

831
01:14:58,739 --> 01:15:08,359
De hecho, nosotros directamente ya podemos trabajar en el laboratorio con líneas celulares continuas, líneas celulares inmortalizadas o transformadas.

832
01:15:09,380 --> 01:15:27,359
La definición de una línea celular inmortalizada es aquella línea obtenida a partir de un cultivo primario, del cual se generó una línea celular primaria y la vamos a mantener en el cultivo un tiempo ilimitado.

833
01:15:27,359 --> 01:15:50,539
Para que esto pueda realizarse solo hay dos caminos. Uno, partir de entrada de células inmortales. Las células inmortales son las células tumorales. Esas células normalmente a partir de un cultivo primario obtenemos directamente, en lugar de una línea celular primaria, obtenemos una línea celular inmortalizada porque son células tumorales.

834
01:15:50,539 --> 01:15:53,640
pero la otra manera es

835
01:15:53,640 --> 01:15:57,020
a partir de una línea celular primaria

836
01:15:57,020 --> 01:16:00,739
intentar inmortalizarla y convertirla en células inmortales

837
01:16:00,739 --> 01:16:04,760
estas líneas inmortales transformadas

838
01:16:04,760 --> 01:16:06,640
estas células transformadas tienen

839
01:16:06,640 --> 01:16:09,680
cinco características fundamentales que hay que saberles

840
01:16:09,680 --> 01:16:10,800
especiales

841
01:16:10,800 --> 01:16:15,000
estas características son digamos exclusivas de las células transformadas

842
01:16:15,000 --> 01:16:16,920
de las líneas celulares continuas

843
01:16:16,920 --> 01:16:18,720
crecimiento indefinido

844
01:16:18,720 --> 01:16:20,859
nunca van a dejar de crecer

845
01:16:20,859 --> 01:16:22,880
aunque lleguen a confluencia

846
01:16:22,880 --> 01:16:24,680
no son dependientes de anclaje

847
01:16:24,680 --> 01:16:27,039
y esto es importante, lo hemos visto en la animación de antes

848
01:16:27,039 --> 01:16:29,380
las células tumorales no tienen inhibición

849
01:16:29,380 --> 01:16:30,460
por contacto

850
01:16:30,460 --> 01:16:33,180
no entran en confluencia

851
01:16:33,180 --> 01:16:35,619
les da igual, no son dependientes de anclaje

852
01:16:35,619 --> 01:16:37,500
eso significa, y esto es muy importante

853
01:16:37,500 --> 01:16:39,539
que no entran en anoiquis

854
01:16:39,539 --> 01:16:41,420
aunque sean células epiteliales

855
01:16:42,140 --> 01:16:43,640
que en el tumor

856
01:16:43,640 --> 01:16:45,319
tienen que estar ancladas in vitro

857
01:16:45,319 --> 01:16:47,180
no sufren anoiquis

858
01:16:47,180 --> 01:16:55,189
Aunque lleguen a confluencia no sufren inhibición por contacto, por tanto nunca entran en confluencia

859
01:16:55,189 --> 01:17:01,329
Además tienen capacidad invasiva, esto significa que pueden invadir tejidos

860
01:17:01,329 --> 01:17:12,970
Si yo cojo estas células y las implanto ahora, por ejemplo, haciendo un xenograf, un injerto subcutáneo en un animal de proliferación

861
01:17:12,970 --> 01:17:17,210
invaden el tejido subcutáneo y forman una masa tumoral

862
01:17:17,210 --> 01:17:21,710
¿De acuerdo? Aunque no sea su ambiente, aunque sean células humanas y lo he hecho en ratón

863
01:17:21,710 --> 01:17:26,229
Eso es capacidad invasiva, pueden invadir tejidos

864
01:17:26,229 --> 01:17:33,590
Y además suelen ser células que acumulan muchas anomalías genéticas y aberraciones cromosómicas

865
01:17:33,590 --> 01:17:34,590
Y les da igual

866
01:17:34,590 --> 01:17:40,239
¿De acuerdo? ¿Cómo podemos transformar una línea celular primaria?

867
01:17:40,239 --> 01:17:44,659
¿Qué métodos tenemos para inducir en estas líneas la inmortalización?

868
01:17:44,939 --> 01:17:46,340
¿Cómo las podemos transformar?

869
01:17:46,340 --> 01:17:49,239
fundamentalmente tenemos tres métodos

870
01:17:49,239 --> 01:17:51,520
a ver, esto es muy sencillo

871
01:17:51,520 --> 01:17:55,539
de lo que se trata es de coger la línea celular primaria

872
01:17:55,539 --> 01:17:56,939
e inducirle mutaciones

873
01:17:56,939 --> 01:18:00,460
esas mutaciones se pueden hacer clásicamente

874
01:18:00,460 --> 01:18:01,340
se han hecho al azar

875
01:18:01,340 --> 01:18:02,619
mutaciones al azar

876
01:18:02,619 --> 01:18:05,260
de tal manera que la gran mayoría de las células mutadas

877
01:18:05,260 --> 01:18:05,939
se van a morir

878
01:18:05,939 --> 01:18:08,560
las que vienen de la línea celular primaria

879
01:18:08,560 --> 01:18:10,800
pero muchas otras por casualidad

880
01:18:10,800 --> 01:18:12,159
a lo mejor muta un gen

881
01:18:12,159 --> 01:18:16,039
que hace que se vuelvan inmortales

882
01:18:16,039 --> 01:18:19,739
esto se ha conseguido clásicamente con métodos físicos

883
01:18:19,739 --> 01:18:20,220
¿qué se hacía?

884
01:18:20,319 --> 01:18:22,319
se radiaba con radiación gamma

885
01:18:22,319 --> 01:18:23,659
o con rayos X

886
01:18:23,659 --> 01:18:25,800
o con luz ultravioleta

887
01:18:25,800 --> 01:18:27,239
sobre todo luz ultravioleta

888
01:18:27,239 --> 01:18:28,500
se irradiaban las células

889
01:18:28,500 --> 01:18:32,300
entonces la luz ultravioleta es un carcinógeno brutal

890
01:18:32,300 --> 01:18:35,899
y esto lo sabemos por la incidencia de melanoma

891
01:18:35,899 --> 01:18:38,439
entonces se inducían

892
01:18:38,439 --> 01:18:42,760
se exponían a radiación ultravioleta

893
01:18:42,760 --> 01:18:45,239
se inducían de forma masiva

894
01:18:45,239 --> 01:18:51,000
mutaciones espontáneas y la célula que conseguía sobrevivir muchas veces se inmortalizaba.

895
01:18:52,060 --> 01:18:59,319
Se pueden utilizar carcinógenos, sustancias químicas que producen tumores. Están en

896
01:18:59,319 --> 01:19:04,399
la base de muchos tipos de, por ejemplo, la nicotina, del tabaco. Tiene carcinógenos

897
01:19:04,399 --> 01:19:10,479
a expuertas. Podemos coger esas sustancias químicas carcinogénicas, el bromuro de tibio

898
01:19:10,479 --> 01:19:14,659
que utilizamos para los geles de agarosa, son carcinógenos.

899
01:19:15,060 --> 01:19:18,520
Podemos poner estos carcinógenos a determinada concentración

900
01:19:18,520 --> 01:19:25,399
de tal manera que puedan producir también de forma espontánea mutaciones en genes clave.

901
01:19:26,460 --> 01:19:31,079
Pero el método más fino, digamos, son los métodos genéticos.

902
01:19:31,079 --> 01:19:39,159
Y es que desde hace ya bastantes décadas se vio que la introducción de una parte del genoma del virus SV40

903
01:19:39,159 --> 01:19:41,300
No se sabe muy bien por qué

904
01:19:41,300 --> 01:19:43,880
Produce la inmortalización de las células

905
01:19:43,880 --> 01:19:45,760
Entonces, ¿qué es lo que se hace?

906
01:19:46,060 --> 01:19:48,060
Se coge esa región del genoma

907
01:19:48,060 --> 01:19:50,640
Que se tiene clonada en un vector

908
01:19:50,640 --> 01:19:53,000
En un vector de expresión

909
01:19:53,000 --> 01:19:54,479
Se coge toda esa zona

910
01:19:54,479 --> 01:19:56,680
En un vector de expresión

911
01:19:56,680 --> 01:19:58,420
Y se introduce en las células

912
01:19:58,420 --> 01:19:59,399
¿Sí?

913
01:20:00,020 --> 01:20:02,279
Entonces estas células introducen el gen

914
01:20:02,279 --> 01:20:03,840
Al azar

915
01:20:03,840 --> 01:20:05,539
Teóricamente al azar

916
01:20:05,539 --> 01:20:07,060
En uno de los cromosomas

917
01:20:07,060 --> 01:20:12,359
de tal manera que se produce una serie de alteraciones genéticas dirigidas por ese genoma viral

918
01:20:12,359 --> 01:20:18,810
que hace que esta célula se transforme en una célula inmortalizada, ¿de acuerdo?

919
01:20:19,710 --> 01:20:23,590
Bueno, pues en esta primera parte hemos visto, en esta primera parte de la unidad,

920
01:20:24,229 --> 01:20:29,149
hemos visto qué tipos de cultivos tenemos, cultivos de órganos, cultivos de esplantes,

921
01:20:29,689 --> 01:20:33,909
cultivos de células que pueden ser histotípicos u organotípicos,

922
01:20:33,909 --> 01:20:50,909
Cómo se comportan las células in vitro, la curva de crecimiento, cómo hay células que crecen en monocapa, otras en suspensión y cómo se comportan las líneas celulares primarias a lo largo del tiempo y cómo podemos transformarlas en líneas inmortalizadas.