1 00:00:00,000 --> 00:00:23,600 Vale, pues, hoy vamos a ver la siguiente técnica que es la electroforesis. 2 00:00:23,600 --> 00:00:43,440 Vale, pues, esta técnica es un poco más compleja que la cromatografía que hemos visto, 3 00:00:43,440 --> 00:00:44,440 ¿vale? 4 00:00:44,440 --> 00:00:50,000 Si os acordáis habíamos visto, bueno, que primero teníamos que extraer las proteínas 5 00:00:50,000 --> 00:00:56,800 de nuestras células y las tres formas que teníamos de extraer las proteínas y una 6 00:00:56,800 --> 00:01:01,240 vez extraídas las proteínas, pues, lo que hacíamos era, podíamos cuantificar el total 7 00:01:01,240 --> 00:01:08,120 de esas proteínas que teníamos tres métodos, teníamos el método de Lowry, el método 8 00:01:08,120 --> 00:01:13,880 de Bradford, estos dos métodos eran haciendo reaccionar las proteínas con otras sustancias 9 00:01:13,880 --> 00:01:20,040 y se formaba una sustancia coloreada que luego medíamos en el espectrofotómetro ultravioleta 10 00:01:20,040 --> 00:01:27,360 visible y si no también podíamos cuantificar las proteínas aprovechando que las proteínas 11 00:01:27,360 --> 00:01:34,560 absorben a una longitud de onda de 280 nanómetros y luego lo medíamos en el espectrofotómetro 12 00:01:34,560 --> 00:01:35,560 ultravioleta. 13 00:01:35,560 --> 00:01:42,160 Esta sería la cuantificación, cómo cuantificamos esa cantidad que tenemos de proteínas en 14 00:01:42,160 --> 00:01:48,520 la célula y una vez hecha la cuantificación podemos hacer una separación de las proteínas, 15 00:01:48,520 --> 00:01:55,600 un fraccionamiento y esa separación se puede hacer por tres métodos, por diálisis, por 16 00:01:55,600 --> 00:02:00,560 cromatografía y esta última técnica que vamos a ver es la electroforesis. 17 00:02:00,560 --> 00:02:06,680 Bueno, el otro día, ahora me estoy acordando que el otro día no vimos del todo la cromatografía 18 00:02:06,680 --> 00:02:12,360 en capa fina, que esta cromatografía no está en los apuntes pero bueno, yo creo que 19 00:02:12,360 --> 00:02:13,360 es importante. 20 00:02:13,360 --> 00:02:21,440 Entonces, el otro día vimos que teníamos tres tipos, no, cuatro tipos de cromatografía, 21 00:02:21,440 --> 00:02:30,040 una cromatografía, un segundo que voy a ponerla a estas, ¿os acordáis que en cromatografía 22 00:02:30,040 --> 00:02:36,240 teníamos una fase estacionaria que es todo esto de aquí en gris y teníamos una fase 23 00:02:36,240 --> 00:02:42,040 móvil, que la fase móvil era la que va a arrastrar a nuestra muestra, que es esto de 24 00:02:42,040 --> 00:02:49,440 aquí en negro en este caso, va a arrastrar a la muestra por toda la fase estacionaria. 25 00:02:49,440 --> 00:02:54,760 Entonces, dependiendo de las interacciones entre los componentes de nuestra muestra y 26 00:02:54,960 --> 00:03:02,040 la fase estacionaria, los componentes de nuestra muestra se van a quedar más o menos retenidos 27 00:03:02,040 --> 00:03:06,440 y van a salir antes o después, o más tarde. 28 00:03:06,440 --> 00:03:12,000 Si os acordáis, esta sería nuestra muestra en negro, pues aquí los componentes se van 29 00:03:12,000 --> 00:03:18,280 separando, separando, primero sale el componente de color rojo, después este gris y después 30 00:03:18,280 --> 00:03:19,280 este verde. 31 00:03:19,280 --> 00:03:24,160 Entonces, esto es una forma de separar los componentes de una muestra. 32 00:03:24,160 --> 00:03:31,120 Entonces, vimos que, bueno, acordaros de los nombres, fase estacionaria y fase móvil. 33 00:03:31,120 --> 00:03:42,600 Bueno, vimos que había cuatro tipos de cromatografía, que podía ser filtración en gel, intercambio 34 00:03:42,600 --> 00:03:47,680 iónico, afinidad y cromatografía en capa fina. 35 00:03:47,680 --> 00:03:56,800 Los tres primeros de aquí se hacen en columna y teníamos la cromatografía de filtración 36 00:03:56,800 --> 00:03:57,800 en gel. 37 00:03:57,800 --> 00:04:04,040 Si os acordáis, era esta en la que teníamos como fase estacionaria, que eran estas unas 38 00:04:04,040 --> 00:04:09,480 bolas de polímero que tienen unas oquedades, unos huecos, unos orificios. 39 00:04:09,480 --> 00:04:16,000 Entonces, nuestra muestra, dependiendo de su masa molecular, pues si son moléculas 40 00:04:16,000 --> 00:04:21,160 pequeñas se van a quedar retenidas aquí en nuestros huecos y las moléculas más grandes 41 00:04:21,160 --> 00:04:22,360 van a salir primero. 42 00:04:22,360 --> 00:04:28,280 Esta rojo, en rojo salen primeros, el huyen primero y las otras se van quedando ahí retenidas 43 00:04:28,280 --> 00:04:31,720 y al final acaban saliendo, pero salen más tarde. 44 00:04:31,720 --> 00:04:37,820 Esta es la cromatografía de filtración en gel, que nos sirve pues para eso, para separar 45 00:04:37,820 --> 00:04:40,560 moléculas de diferente masa molecular. 46 00:04:40,560 --> 00:04:44,360 Nos sirve también pues, por ejemplo, para purificar una proteína. 47 00:04:44,360 --> 00:04:48,840 Si tenemos una proteína en la que se nos ha quedado ahí algún reactivo, como esos 48 00:04:48,840 --> 00:04:54,680 reactivos tendrán menor masa molecular, pues se quedarán retenidos y saldrán más tarde. 49 00:04:54,680 --> 00:04:58,080 Esta es la de filtración en gel. 50 00:04:58,080 --> 00:05:02,800 Luego teníamos la cromatografía de intercambio iónico. 51 00:05:02,800 --> 00:05:10,440 Acordaros que en esta cromatografía lo que se separan a las proteínas por su carga. 52 00:05:10,760 --> 00:05:16,760 Entonces podemos tener la fase estacionaria, en este caso tiene carga positiva, esta es 53 00:05:16,760 --> 00:05:23,160 la fase estacionaria, las bolas estas en gris, podría ser positiva o puede ser también 54 00:05:23,160 --> 00:05:25,680 negativa, puede ser de los dos tipos. 55 00:05:25,680 --> 00:05:30,240 Una sería intercambio aniónico y en el otro caso sería intercambio cationico. 56 00:05:30,240 --> 00:05:38,360 Y esto de aquí, las bolas rojas y grises serían nuestra mezcla de proteínas. 57 00:05:38,360 --> 00:05:42,680 Las que tengan carga negativa, estas rojas, se van a quedar interaccionando con la fase 58 00:05:42,680 --> 00:05:49,440 estacionaria y las negras, que tienen carga positiva, van a eluir primero. 59 00:05:49,440 --> 00:05:57,440 Pues esta es otra forma de separar nuestras proteínas y acordaros que también nos basábamos 60 00:05:57,440 --> 00:06:06,200 en que dependiendo del punto isoléctrico de las proteínas, si estamos por debajo del 61 00:06:06,200 --> 00:06:14,880 punto isoléctrico, la carga de las proteínas va a ser positiva, por debajo del punto isoléctrico 62 00:06:14,880 --> 00:06:22,400 y si el pH está por encima del punto isoléctrico, la proteína tendrá carga negativa. 63 00:06:22,400 --> 00:06:31,080 Entonces tenemos filtración en gel, que es la separación por masa molecular, cromatografía 64 00:06:31,080 --> 00:06:37,600 de intercambio iónico, en la que se separan según su carga y por último teníamos la 65 00:06:37,600 --> 00:06:45,440 cromatografía de afinidad, que aquí esta cromatografía es muy específica y se utilizan 66 00:06:45,440 --> 00:06:52,160 por ejemplo enzimas para separar sustratos. 67 00:06:52,160 --> 00:07:00,400 Si como vimos ya que la reacción enzima-sustrato es una reacción muy específica, pues dependiendo 68 00:07:00,400 --> 00:07:08,120 del sustrato que tengamos se van a separar unas enzimas u otras. 69 00:07:08,120 --> 00:07:14,600 Por último vimos la cromatografía en capa fina, esta yo creo que ya la vimos un poco 70 00:07:14,600 --> 00:07:26,640 así al final y bueno vamos a repasarla también ahora un poquito más. 71 00:07:26,880 --> 00:07:31,960 Esta es la que es un poco diferente, esta cromatografía en capa fina se llama también 72 00:07:31,960 --> 00:07:39,880 TLC, por las siglas en inglés Thin Layer Chromatography, TLC, y entonces aquí también 73 00:07:39,880 --> 00:07:48,720 tenemos una fase estacionaria, aquí la fase estacionaria es una placa de gel de sílice 74 00:07:48,720 --> 00:07:58,400 y es un sólido que es polar, tiene grupos funcionales polares y esta sería la fase 75 00:07:58,400 --> 00:08:04,280 estacionaria y la fase móvil es una mezcla de disolventes. 76 00:08:04,280 --> 00:08:10,320 Lo que vamos a hacer es que esta fase móvil va a ascender, asciende por capilaridad a 77 00:08:10,320 --> 00:08:18,400 través de la fase estacionaria, va a arrastrar nuestra muestra y entonces la muestra dependiendo 78 00:08:18,400 --> 00:08:24,280 de si sus componentes son polares o apolares se van a quedar más o menos retenidos en 79 00:08:24,280 --> 00:08:28,160 la fase estacionaria. 80 00:08:28,160 --> 00:08:34,400 Entonces lo que hacemos es pinchar, se dice así pinchar, es decir, ponemos aquí una 81 00:08:34,400 --> 00:08:45,840 gota de nuestra muestra y introducimos, ponemos la gota en la placa de gel de sílice y introducimos 82 00:08:45,840 --> 00:08:52,200 esta placa en la cubeta que es esta de aquí, en esta cubeta. 83 00:08:52,200 --> 00:08:57,480 La fase móvil, el hluyente, va ascendiendo por capilaridad, asciende, asciende, no hay 84 00:08:57,480 --> 00:09:03,720 que dejarlo que suba hasta el final del todo, cuando llega hasta más o menos un centímetro 85 00:09:03,720 --> 00:09:12,080 se saca la placa de la cubeta y entonces lo que ocurre es que los componentes de nuestra 86 00:09:12,080 --> 00:09:21,000 muestra se han ido separando según su polaridad, los componentes más polares se van a quedar 87 00:09:21,000 --> 00:09:28,000 más retenidos en la placa, porque como la placa es polar pues se van a quedar más retenidos 88 00:09:28,000 --> 00:09:36,920 y los componentes no polares van a ascender y van a quedar más arriba de la placa. 89 00:09:36,920 --> 00:09:46,920 Entonces lo que se hace es medir el RF se llama, que se llama la relación de frentes 90 00:09:46,920 --> 00:09:53,320 y lo que se mide es la distancia que ha recorrido el analito, el componente de nuestra muestra 91 00:09:53,320 --> 00:10:00,480 pues por ejemplo sería de aquí, en este sería de aquí a aquí, este sería el A, 92 00:10:00,480 --> 00:10:05,920 esto es la distancia que ha recorrido este componente y lo dividiríamos entre la distancia 93 00:10:05,920 --> 00:10:12,240 que ha recorrido el disolvente que sería hasta aquí, entre esta distancia, entre D 94 00:10:12,240 --> 00:10:20,560 y eso nos va a dar la relación de frentes, es la distancia recorrida por el analito A 95 00:10:20,560 --> 00:10:27,680 por ejemplo partido de la distancia recorrida por la fase móvil, entonces este parámetro 96 00:10:27,680 --> 00:10:34,360 va a tomar valores entre 0 y 1, cuanto más cerca sea de 0 significa que el analito tiene 97 00:10:34,360 --> 00:10:40,680 más afinidad por la fase estacionaria, queda muy retenido y sin embargo cuanto más cercano 98 00:10:40,680 --> 00:10:47,360 a 1 sea el valor este de RF, el analito tiene más afinidad por la fase móvil y entonces 99 00:10:47,360 --> 00:10:56,560 queda poco retenido por la fase estacionaria, cuanto más cerca será el RF más próximo 100 00:10:56,560 --> 00:11:16,240 a 0 y cuanto más arriba quede RF más próximo a 1, vale y entonces se puede hacer dos tipos 101 00:11:16,240 --> 00:11:26,080 de medidas, una sería utilizar patrones, entonces por ejemplo se puede utilizar, imaginaros 102 00:11:26,080 --> 00:11:32,160 que queremos saber los aminoácidos que tiene la caseína, la caseína es una proteína que 103 00:11:32,160 --> 00:11:39,680 tiene varios aminoácidos, pues entonces lo que hacemos es pinchar la caseína, preparamos 104 00:11:39,680 --> 00:11:45,280 una disolución de caseína y la pinchamos y pinchamos por ejemplo aquí un aminoácido, 105 00:11:45,280 --> 00:11:51,120 pues no sé, por ejemplo la leucina y entonces hacemos la cromatografía, dejamos que pase 106 00:11:51,200 --> 00:11:58,320 la fase estacionaria, digo perdón, la fase móvil que ascienda por capilaridad, sacamos la placa, 107 00:11:58,320 --> 00:12:05,280 bueno luego habría que revelarla, se utiliza una disolución que se llama anidrina para ver los 108 00:12:05,280 --> 00:12:13,280 colores y lo que podríamos hacer es comparar, pues aquí como nosotros hemos puesto leucina y esta es 109 00:12:13,360 --> 00:12:22,480 nuestra muestra de caseína, pues podemos decir que la caseína contiene un aminoácido que es la 110 00:12:22,480 --> 00:12:31,160 leucina, entonces esto sería mediante comparación, una muestra que tiene varios aminoácidos y 111 00:12:31,160 --> 00:12:39,600 pinchamos pues uno de esos aminoácidos que creemos que está en nuestra muestra, comparamos y en este 112 00:12:39,600 --> 00:12:47,440 caso pues tendría leucina y otra forma de hacer las medidas es mediante el valor de RF, lo que os 113 00:12:47,440 --> 00:12:54,400 decía antes, pues medir por ejemplo aquí esta mancha pues sería, medimos esta distancia, la B y 114 00:12:54,400 --> 00:13:00,320 la dividimos entre la distancia que ha recorrido el disolvente que sería de aquí hasta aquí, hasta 115 00:13:00,320 --> 00:13:07,840 cuando hemos sacado la placa de nuestra cubeta, dividiríamos un valor que en este caso pues es por 116 00:13:07,840 --> 00:13:17,280 ejemplo 2,1 es este valor entre el valor de lo que ha recorrido el disolvente que es 2,8 y nos da 0,75 117 00:13:17,280 --> 00:13:24,880 entonces este valor de RF lo podemos comparar, pues si tenemos datos de este tipo de muestras se 118 00:13:24,880 --> 00:13:32,600 puede comparar y ver si nuestra muestra pues tiene este compuesto, entonces estas son dos formas de 119 00:13:32,680 --> 00:13:33,680 identificar. 120 00:13:36,880 --> 00:13:42,680 Bueno aquí simplemente os había puesto todas las aplicaciones que tiene la cromatografía 121 00:13:42,680 --> 00:13:50,720 capa fina, es una técnica muy sencilla pero que se utiliza mucho sobre todo en análisis presuntivos 122 00:13:50,720 --> 00:13:59,920 es decir simplemente para saber si una muestra tiene un compuesto o no, luego ya se hace en 123 00:13:59,920 --> 00:14:06,520 otra serie de análisis pero nos sirve para ir seleccionando y entonces pues se utiliza en 124 00:14:06,520 --> 00:14:13,360 control de la industria farmacéutica, control de calidad, controles de identidad y 125 00:14:13,360 --> 00:14:19,280 pureza, en medioambiente para análisis de aguas, de suelos, de residuos, en análisis de alimentos, 126 00:14:19,280 --> 00:14:27,520 análisis de aditivos, de pesticidas, en medicina forense, en aplicaciones clínicas por ejemplo en 127 00:14:27,520 --> 00:14:33,720 el control de dopaje, entonces es una técnica pues eso que es una técnica muy sencilla, rápida y 128 00:14:33,720 --> 00:14:39,800 en el que nos sirve es como un análisis presuntivo, a partir de estos datos ya se hacen otra serie de 129 00:14:39,800 --> 00:14:45,960 medidas, no podemos confirmar nada con esta técnica pero sí que podemos ir, nos ayuda a 130 00:14:45,960 --> 00:14:53,800 después qué técnica tenemos que elegir, cómo tenemos que seguir nuestro análisis, entonces bueno 131 00:14:53,800 --> 00:15:01,040 aquí hay un vídeo del CSIC también, que creo que este nos lo puse el otro día, que es la 132 00:15:01,040 --> 00:15:10,600 cromatografía de en capa fina, a ver si quiero, bueno lo pongo desde aquí 133 00:15:23,800 --> 00:15:35,920 esta sería la mezcla, nuestra muestra, tenemos una mezcla de productos 134 00:15:40,360 --> 00:15:48,520 y ahora vamos a pinchar, esta sería la placa de gel de sílice y pinchamos, ponemos ahí una gota, habría que 135 00:15:48,520 --> 00:15:56,920 secar con el secador y se coloca en la fase móvil, que es una mezcla de disolventes y 136 00:15:56,920 --> 00:16:02,400 ahora va a ascender por capilaridad, la fase móvil y va a arrastrar a nuestra muestra 137 00:16:02,400 --> 00:16:20,040 y se van separando los componentes de nuestra muestra 138 00:16:20,040 --> 00:16:36,960 vale pues ahora ya se sacaría la placa, antes de que llegue al final se saca la placa y se miden 139 00:16:36,960 --> 00:16:47,520 los RF, aquí tendríamos pues estos en amarillo, bueno pues hasta aquí 140 00:16:50,040 --> 00:16:59,640 bien pues esto es de cromatografía, aquí os he puesto algún otro vídeo que también son interesantes 141 00:16:59,640 --> 00:17:06,760 para que veáis, en este explican un poco más en detalle en el laboratorio cómo se realiza la 142 00:17:06,760 --> 00:17:14,360 cromatografía en capa fina, esto cuando tengáis tiempo pues le echéis un vistacillo y luego en 143 00:17:14,360 --> 00:17:24,840 la página de biomodel de la que os he hablado alguna vez, vale bueno igual entramos y os explico 144 00:17:24,840 --> 00:17:30,240 un poco porque hay un laboratorio virtual en el que se puede hacer una cromatografía en capa fina 145 00:17:31,200 --> 00:17:33,040 a ver si voy a entrar 146 00:17:51,160 --> 00:17:54,120 entonces veis la pantalla verdad 147 00:17:54,120 --> 00:18:10,600 pues mirad aquí en esta página de biomodel hay este laboratorio y entonces tenéis aquí 148 00:18:10,600 --> 00:18:18,120 el 1 y el 2 es una muestra en la que tenéis que saber qué aminoácidos tiene y entonces aquí 149 00:18:18,120 --> 00:18:25,600 tenemos pues tenemos leucina, valina, glicina, arginina y triptófano entonces vamos pinchando 150 00:18:25,600 --> 00:18:35,440 con la pipeta, vamos cogiendo una cantidad de muestra y pinchamos aquí, bueno hay veces que 151 00:18:35,440 --> 00:18:42,720 esto cuesta un poco hacerlo, a ver hay que cogerle el truquillo 152 00:18:46,840 --> 00:18:54,800 ahí veis ponemos una gota y ahora esta pipeta la tiramos, nos aparece otra, bueno esto sería 153 00:18:54,800 --> 00:19:01,240 un capilar en realidad, ahora cogemos de la muestra 2 y pinchamos 154 00:19:01,240 --> 00:19:04,400 bueno otra vez 155 00:19:12,600 --> 00:19:16,040 no sé aquí es que hay que cogerle el truquillo 156 00:19:21,160 --> 00:19:23,360 vaya pues ahora no quiere salir 157 00:19:32,000 --> 00:19:34,040 bueno sería eso, ir pinchando 158 00:19:37,840 --> 00:19:50,240 ahora esta la tiramos a la basura y cogemos por ejemplo la leucina, cogemos leucina y pinchamos 159 00:19:50,240 --> 00:20:02,240 vale tiramos, bueno vamos a hacer solamente estas, estas serían las dos muestras y leucina 160 00:20:02,240 --> 00:20:08,360 pero vosotros lo podéis hacer con las otras también, le hacemos la cromatografía sería 161 00:20:08,360 --> 00:20:15,920 meter la placa y empieza a ascender la fase móvil, bueno aquí va muy rápido en la realidad 162 00:20:15,920 --> 00:20:24,600 no va tan rápido y entonces ahora tenemos que visualizar las manchas, se añade esta 163 00:20:24,600 --> 00:20:33,400 disolución que es en inibrina, creo que hay que ponerlo ahí, vale veis y entonces aquí 164 00:20:33,400 --> 00:20:41,280 tendríamos la muestra A que tiene estos aminoácidos y la muestra B pues estos otros y nosotros 165 00:20:41,280 --> 00:20:48,280 en la C hemos puesto leucina pues podemos confirmar que las muestras, tanto la muestra A como la muestra B 166 00:20:48,280 --> 00:20:56,280 tienen leucina porque han aparecido a la misma altura, el RF será igual, luego pues compararíamos 167 00:20:56,280 --> 00:21:01,280 si hubiéramos puesto valina, glicina, genina, triptófano pues compararíamos también si 168 00:21:01,280 --> 00:21:08,120 nos aparecen y entonces podemos decir pues la muestra A tiene leucina, valina, genina 169 00:21:08,120 --> 00:21:19,120 depende de las manchas que nos salgan aquí, entonces cuanto más polar sea nuestra muestra, nuestro aminoácido 170 00:21:19,120 --> 00:21:28,120 se va a quedar más cerca, se va a quedar más abajo porque como es polar pues va a reaccionar con la fase estacionaria 171 00:21:28,120 --> 00:21:37,120 que es polar también y cuanto menos polar va a quedar más arriba, veis por eso la leucina 172 00:21:37,120 --> 00:21:45,120 es un aminoácido que no es polar y por eso queda más arriba en la placa de cromatografía. 173 00:21:45,120 --> 00:21:52,120 En el caso de cromatografía en capa fina las separaciones por polaridad, vale acordaros que 174 00:21:52,120 --> 00:21:58,120 teníamos las otras tres tipos de cromatografía que eran cromatografía por filtración de gel 175 00:21:58,120 --> 00:22:05,120 que se separan las moléculas por masa molecular, cromatografía de intercambio iónico que se separan por su carga 176 00:22:05,120 --> 00:22:15,120 y cromatografía de afinidad, bueno pues aquí tenéis este laboratorio por si os apetece hacer algún día. 177 00:22:15,120 --> 00:22:25,120 Y ahora entonces nos vamos a meter ya con la electroforesis que es otra técnica de separación de proteínas 178 00:22:26,120 --> 00:22:34,120 Además de separar las proteínas se utiliza también para identificar. 179 00:22:36,120 --> 00:22:41,120 Aunque se trata de una técnica de separación no se utiliza solo para obtener una proteína pura 180 00:22:41,120 --> 00:22:46,120 sino para identificar las diferentes proteínas presentes en una muestra. 181 00:22:46,120 --> 00:22:55,120 Esta técnica es un poco más complicada parece a mí, pero bueno la intentaremos ver entre hoy y el próximo día 182 00:22:57,120 --> 00:23:01,120 a ver si logramos terminarlo. 183 00:23:01,120 --> 00:23:10,120 Entonces, ¿en qué consiste la electroforesis? Pues aquí tenéis esta frase, esta es la base de la electroforesis 184 00:23:10,120 --> 00:23:20,120 Entonces, como las biomoléculas tienen carga eléctrica, al someterlas a estas biomoléculas a un campo eléctrico 185 00:23:20,120 --> 00:23:28,120 pues podemos separarlas en función de la carga eléctrica que tengan vamos a separar estas biomoléculas. 186 00:23:28,120 --> 00:23:33,120 Entonces, la mayoría de las biomoléculas poseen una carga eléctrica 187 00:23:33,120 --> 00:23:39,120 como consecuencia se desplazan cuando se ven sometidas a un campo eléctrico 188 00:23:39,120 --> 00:23:44,120 por lo tanto vamos a someter a nuestras muestras a un campo eléctrico 189 00:23:44,120 --> 00:23:48,120 y estas muestras dependiendo de su carga se van a desplazar 190 00:23:48,120 --> 00:23:54,120 si tienen carga positiva pues se van a dirigir hacia el ánodo 191 00:23:54,120 --> 00:24:00,120 si tienen carga negativa se van a desplazar hacia el cátodo 192 00:24:00,120 --> 00:24:06,120 este sería el campo eléctrico, en el campo eléctrico tenemos un ánodo y un cátodo 193 00:24:06,120 --> 00:24:13,120 pues dependiendo de la carga de nuestras moléculas se van a desplazar hacia un lado o hacia el otro 194 00:24:13,120 --> 00:24:18,120 esto no lo tenéis en los apuntes, pero bueno, esto os lo explico porque yo creo que puede ayudaros 195 00:24:18,120 --> 00:24:23,120 Entonces, se van a desplazar por un lado eso, por la carga 196 00:24:23,120 --> 00:24:34,120 y por otro lado, por ejemplo en este caso, pues a mayor carga se van a quedar más retenidos 197 00:24:34,120 --> 00:24:46,120 Entonces, esto sería si las partículas, unas tienen carga positiva y otras tienen carga negativa 198 00:24:47,120 --> 00:24:54,120 Entonces, aquí os he puesto este dibujo porque esta sería la base de la electroforesis 199 00:24:54,120 --> 00:25:00,120 sería aplicar un campo eléctrico, es decir una carga negativa y una carga positiva 200 00:25:00,120 --> 00:25:07,120 nuestras muestras están en una disolución tampón, en unas cubetas 201 00:25:07,120 --> 00:25:13,120 y las muestras se tienen que aplicar en un soporte 202 00:25:13,120 --> 00:25:19,120 este sería el soporte, un sólido, que ahora veremos cómo es este soporte 203 00:25:19,120 --> 00:25:21,120 y aquí aplicaríamos nuestra muestra 204 00:25:21,120 --> 00:25:30,120 Entonces, acordaros de eso, es aplicar un campo eléctrico y separar las muestras según su carga 205 00:25:31,120 --> 00:25:35,120 Entonces, hay varios tipos de electroforesis 206 00:25:35,120 --> 00:25:39,120 esto tampoco lo tenéis, pero bueno, esto simplemente porque lo sepáis 207 00:25:39,120 --> 00:25:45,120 Tenemos medios de baja, depende de cómo sea el soporte donde coloquemos la muestra 208 00:25:45,120 --> 00:25:50,120 tenemos medios de baja fricción y medios de elevada fricción 209 00:25:51,120 --> 00:25:58,120 En los medios de baja fricción, pues la muestra se aplica aquí en el medio 210 00:25:58,120 --> 00:26:04,120 el soporte que tenemos es papel o acetato de celulosa 211 00:26:05,120 --> 00:26:09,120 Estas serían dos cubetas en las que tenemos dos disoluciones tampón 212 00:26:10,120 --> 00:26:13,120 y aplicaríamos el campo eléctrico 213 00:26:14,120 --> 00:26:18,120 Por lo tanto, en este caso la separación simplemente es por carga 214 00:26:18,120 --> 00:26:22,120 Las cargas negativas se van a dirigir hacia el polo positivo 215 00:26:22,120 --> 00:26:26,120 Las cargas positivas se van a dirigir hacia el polo negativo 216 00:26:27,120 --> 00:26:32,120 Estos son medios de baja fricción, en papel o en acetato de celulosa 217 00:26:33,120 --> 00:26:39,120 Y luego tenemos medios de elevada fricción, que estos son los que vamos a estudiar más 218 00:26:40,120 --> 00:26:42,120 Medios de elevada fricción, ¿en qué consisten? 219 00:26:42,120 --> 00:26:47,120 Pues que el soporte, que aquí teníamos o papel o acetato de celulosa 220 00:26:47,120 --> 00:26:51,120 pues en este caso lo que vamos a tener es un polímero 221 00:26:51,120 --> 00:26:55,120 un polímero que va a formar una red tridimensional 222 00:26:56,120 --> 00:27:01,120 Vamos a aplicar nuestra muestra por aquí por arriba, esta sería nuestra muestra 223 00:27:02,120 --> 00:27:08,120 y entonces la muestra se va a ir separando según su tamaño 224 00:27:08,120 --> 00:27:13,120 porque como aquí en este polímero vamos a tener huecos, vamos a tener orificios 225 00:27:13,120 --> 00:27:20,120 y entonces las moléculas de menor peso molecular van a pasar, van a salir antes 226 00:27:20,120 --> 00:27:24,120 y las de mayor peso molecular se van a quedar ahí retenidas 227 00:27:24,120 --> 00:27:28,120 Las tasas amarillas, que son mayores, se quedan retenidas arriba 228 00:27:30,120 --> 00:27:37,120 Entonces, tenemos dos tipos en estos medios de elevada fricción 229 00:27:38,120 --> 00:27:42,120 Tenemos gel de agarosa y gel de poliacrilamida 230 00:27:42,120 --> 00:27:49,120 Este es el que vamos a estudiar para proteínas, con el que se trabaja sobre todo para proteínas 231 00:27:49,120 --> 00:27:52,120 El gel de poliacrilamida 232 00:27:52,120 --> 00:27:59,120 Ahora no os preocupéis si no entendéis bien esto porque luego al final lo vais a entender 233 00:27:59,120 --> 00:28:05,120 Entonces, el soporte donde se coloca nuestra muestra es un gel 234 00:28:05,120 --> 00:28:11,120 Es el gel de poliacrilamida, en el que vamos a separar proteínas 235 00:28:12,120 --> 00:28:20,120 Bueno, aquí os he puesto que también hay modos de soporte que pueden ser en horizontal o en vertical 236 00:28:20,120 --> 00:28:25,120 En nuestro caso, con el gel de poliacrilamida sería este, en vertical 237 00:28:26,120 --> 00:28:35,120 Entonces, vamos a estudiar ya la electroforesis en gel de poliacrilamida 238 00:28:35,120 --> 00:28:39,120 Que también se llama SIPAGE, por las siglas en inglés 239 00:28:39,120 --> 00:28:43,120 Poliacrilamide Gel Electroforesis 240 00:28:43,120 --> 00:28:45,120 Bueno, como se dice en inglés 241 00:28:45,120 --> 00:28:54,120 Entonces, lo que vamos a hacer es separar las proteínas según su masa molecular 242 00:28:54,120 --> 00:28:57,120 Esto es importante, lo que os he dicho ya 243 00:28:57,120 --> 00:29:01,120 Vamos a hacer pasar a nuestras proteínas, que van a entrar aquí 244 00:29:01,120 --> 00:29:03,120 Por aquí entran nuestras proteínas 245 00:29:03,120 --> 00:29:06,120 Esto de aquí va a ser el gel 246 00:29:07,120 --> 00:29:09,120 Y nuestras proteínas entran por aquí 247 00:29:09,120 --> 00:29:15,120 Aplicamos una carga y se van a ir separando las proteínas según su masa molecular 248 00:29:15,120 --> 00:29:19,120 Las de mayor masa molecular van a quedar más arriba 249 00:29:19,120 --> 00:29:22,120 Y las de menor masa molecular más abajo 250 00:29:25,120 --> 00:29:31,120 Entonces, ¿cómo preparamos estos gels de poliacrilamida? 251 00:29:31,120 --> 00:29:37,120 Estos gels son unos gels porosos, o sea, tienen poros, tienen huecos 252 00:29:37,120 --> 00:29:42,120 Y esa porosidad de esos poros se puede regular 253 00:29:42,120 --> 00:29:45,120 Es el tamaño de poros y la cantidad 254 00:29:46,120 --> 00:29:56,120 Y ese gel lo vamos a preparar a partir de acrilamida 255 00:30:08,120 --> 00:30:13,120 Para la práctica de electroforesis en gel de poliacrilamida vamos a necesitar eso 256 00:30:13,120 --> 00:30:18,120 El soporte, que es el gel de poliacrilamida, por donde van a pasar nuestras muestras 257 00:30:19,120 --> 00:30:22,120 Vamos a necesitar una disolución tampón 258 00:30:22,120 --> 00:30:26,120 La disolución tampón es la que permite la conducción eléctrica 259 00:30:26,120 --> 00:30:30,120 Porque ya hemos dicho que vamos a aplicar un campo eléctrico 260 00:30:30,120 --> 00:30:34,120 Necesitamos nuestra muestra, que va a ser una mezcla de proteínas 261 00:30:34,120 --> 00:30:37,120 Y el campo eléctrico 262 00:30:38,120 --> 00:30:46,120 Entonces, vamos a ver las etapas para realizar esta electroforesis 263 00:30:49,120 --> 00:30:53,120 Entonces, las etapas para realizar esta electroforesis serían 264 00:30:53,120 --> 00:30:58,120 Primero, tenemos que preparar el soporte, que es el gel de poliacrilamida 265 00:30:58,120 --> 00:31:04,120 En segundo lugar, tenemos que preparar nuestra muestra de proteínas 266 00:31:04,120 --> 00:31:11,120 En tercer lugar, vamos a introducir esta muestra de proteínas en el gel de poliacrilamida 267 00:31:11,120 --> 00:31:15,120 En cuarto lugar, le aplicamos el campo eléctrico 268 00:31:15,120 --> 00:31:24,120 Y en quinto lugar, vamos a tener que teñir ese gel para ver cómo han corrido nuestras proteínas 269 00:31:24,120 --> 00:31:27,120 Cuáles han salido antes y cuáles después 270 00:31:27,120 --> 00:31:30,120 Bueno, pues vamos a ver todos estos pasos 271 00:31:30,120 --> 00:31:35,120 El primero sería la preparación del gel de poliacrilamida 272 00:31:35,120 --> 00:31:39,120 Vamos a ver cómo preparamos este gel de poliacrilamida 273 00:31:39,120 --> 00:31:46,120 Hemos dicho que los gels de poliacrilamida actúan como tamices moleculares 274 00:31:46,120 --> 00:31:50,120 Lo que van a hacer es retardar el movimiento de las moléculas más grandes 275 00:31:50,120 --> 00:31:56,120 Como van a tener ahí unos poros, pues a las moléculas más grandes les va a costar más pasar 276 00:31:56,120 --> 00:32:02,120 Y en cambio, las más pequeñas van a pasar a través del gel con más facilidad 277 00:32:05,120 --> 00:32:10,120 Entonces, para preparar estos gels de poliacrilamida, si os fijáis 278 00:32:10,120 --> 00:32:16,120 Es una poli, o sea, muchas, muchas acrilamidas 279 00:32:16,120 --> 00:32:18,120 Entonces, lo que necesitamos es 280 00:32:18,120 --> 00:32:21,120 Para preparar este soporte necesitamos 281 00:32:22,120 --> 00:32:26,120 El monómero, que va a ser la acrilamida, que es este compuesto de aquí 282 00:32:26,120 --> 00:32:30,120 Esto se llama monómero, que es la acrilamida 283 00:32:30,120 --> 00:32:35,120 Pues lo que necesitamos es preparar la poli, o sea, muchas acrilamidas 284 00:32:35,120 --> 00:32:40,120 Lo que vamos a hacer es unir muchos monómeros, muchas acrilamidas 285 00:32:40,120 --> 00:32:42,120 Una con otra, una con otra 286 00:32:42,120 --> 00:32:45,120 Y al final se nos van a formar cadenas 287 00:32:45,120 --> 00:32:49,120 Esto en azul sería una cadena de poliacrilamida 288 00:32:49,120 --> 00:32:54,120 Esto de aquí en azul también sería otra cadena de poliacrilamida 289 00:32:54,120 --> 00:32:56,120 Formamos un polímero 290 00:32:56,120 --> 00:32:59,120 Vamos a unir muchos monómeros de estos 291 00:32:59,120 --> 00:33:05,120 Y se nos van a formar cadenas, o sea, uniones de acrilamidas 292 00:33:05,120 --> 00:33:09,120 Una con otra, una con otra, y se nos forma una cadena, otra cadena 293 00:33:09,120 --> 00:33:13,120 Y así se nos van a formar muchas cadenas de acrilamida 294 00:33:13,120 --> 00:33:17,120 ¿Y cómo formamos esta poliacrilamida? 295 00:33:17,120 --> 00:33:24,120 Pues lo que vamos a hacer es añadir un compuesto que es el persulfato amónico 296 00:33:24,120 --> 00:33:30,120 Que va a ser el que inicie esta reacción de polimerización 297 00:33:30,120 --> 00:33:34,120 ¿Y cómo va a iniciar el persulfato esta reacción? 298 00:33:34,120 --> 00:33:38,120 Pues lo que va a hacer va a ser romper este doble enlace 299 00:33:38,120 --> 00:33:43,120 Rompe este doble enlace, se nos generan aquí dos radicales 300 00:33:43,120 --> 00:33:48,120 Y así se van a poder unir una acrilamida con otra 301 00:33:48,120 --> 00:33:53,120 Aquí tendremos otra acrilamida que se habrá también generado radicales en su doble enlace 302 00:33:53,120 --> 00:33:57,120 Y se van uniendo unas con otras, unas con otras, unas con otras 303 00:33:57,120 --> 00:34:02,120 Hasta que se nos genera este polímero muchas acrilamidas 304 00:34:02,120 --> 00:34:09,120 Pero para que se dé en buenas condiciones esta reacción 305 00:34:09,120 --> 00:34:13,120 Necesitamos otro compuesto que es el TEMED 306 00:34:13,120 --> 00:34:17,120 Que este compuesto es el catalizador 307 00:34:17,120 --> 00:34:22,120 El catalizador va a ser el que acelere esta reacción de polimerización 308 00:34:22,120 --> 00:34:24,120 Porque si no es una reacción muy lenta 309 00:34:24,120 --> 00:34:28,120 Pues tenemos que añadir, por un lado, persulfato amónico 310 00:34:28,120 --> 00:34:32,120 Para que comience la reacción, para que este doble enlace se rompa 311 00:34:32,120 --> 00:34:36,120 Y luego tenemos que añadir un catalizador que es el TEMED 312 00:34:36,120 --> 00:34:40,120 Que lo que va a hacer va a ser acelerar la velocidad de polimerización 313 00:34:40,120 --> 00:34:46,120 Que se unan más rápidamente estas acrilamidas para formar la poliacrilamida 314 00:34:46,120 --> 00:34:51,120 Pero además necesitamos otro compuesto adicional 315 00:34:51,120 --> 00:34:55,120 Y ese compuesto adicional es la bisacrilamida 316 00:34:55,120 --> 00:34:59,120 ¿Y qué va a hacer esta bisacrilamida? 317 00:34:59,120 --> 00:35:04,120 Pues lo que va a hacer es, si os fijáis aquí que lo tenemos en rosa, la bisacrilamida 318 00:35:05,120 --> 00:35:09,120 La bisacrilamida va a unir unas cadenas con otras 319 00:35:09,120 --> 00:35:14,120 ¿Veis? Aquí está uniendo esta cadena de aquí, azul, con esta otra cadena de aquí 320 00:35:14,120 --> 00:35:18,120 Entonces va uniendo una cadena con otra 321 00:35:18,120 --> 00:35:23,120 Y se va a formar una poliacrilamida que se llama entrecruzada 322 00:35:23,120 --> 00:35:27,120 Es un polímero entrecruzado 323 00:35:27,120 --> 00:35:31,120 Porque se van uniendo unas cadenas con otras 324 00:35:31,120 --> 00:35:37,120 Y entonces lo que se nos van a generar van a ser poros, se nos van a generar huecos 325 00:35:37,120 --> 00:35:43,120 Si os fijáis aquí, tenemos aquí una cadena de poliacrilamida 326 00:35:43,120 --> 00:35:48,120 Aquí otra cadena de poliacrilamida y aquí otra cadena de poliacrilamida 327 00:35:48,120 --> 00:35:52,120 En este caso la bisacrilamida está aquí en color azul 328 00:35:52,120 --> 00:35:56,120 Pues la bisacrilamida une esta cadena con esta otra 329 00:35:56,120 --> 00:35:59,120 Y une esta cadena con esta otra 330 00:36:00,120 --> 00:36:05,120 Y acaba formando, acaba generando aquí un poro 331 00:36:05,120 --> 00:36:10,120 Entonces el gel al final va a tener poros, va a tener huecos 332 00:36:10,120 --> 00:36:17,120 Que dependiendo del tamaño del hueco van a pasar unas moléculas más grandes o menos 333 00:36:18,120 --> 00:36:22,120 Vale, entonces bueno 334 00:36:22,120 --> 00:36:26,120 Como resumen 335 00:36:26,120 --> 00:36:31,120 Bueno, como resumen no, aquí lo que tenemos que tener en cuenta 336 00:36:31,120 --> 00:36:37,120 Es que la acrilamida es un compuesto que es cancerígeno 337 00:36:37,120 --> 00:36:43,120 Vale, entonces si se trabaja un día con la acrilamida 338 00:36:43,120 --> 00:36:46,120 Pues bueno, no pasa nada por trabajar un día en el laboratorio 339 00:36:46,120 --> 00:36:49,120 Pero cuando ya la exposición es continua 340 00:36:49,120 --> 00:36:53,120 Pues el compuesto es cancerígeno 341 00:36:53,120 --> 00:36:58,120 Puede producir cáncer de piel, es teratógeno y es neurotóxico 342 00:36:58,120 --> 00:37:07,120 Por lo tanto siempre hay que manejarlo con guantes, en campana, con mascarilla si se puede 343 00:37:07,120 --> 00:37:12,120 Y lo único que sí que cuando ya se polimeriza 344 00:37:12,120 --> 00:37:16,120 Ya es inocua, la poliacrilamida ya es inocua 345 00:37:16,120 --> 00:37:21,120 Lo único que puede que igual quede alguna acrilamida por ahí que no se haya polimerizado 346 00:37:21,120 --> 00:37:26,120 Y entonces bueno, pues hay que tener, hay que seguir teniendo alguna precaución 347 00:37:26,120 --> 00:37:29,120 No tantas, pero sí que hay que tener alguna precaución 348 00:37:29,120 --> 00:37:33,120 Pero en principio la poliacrilamida es inocua 349 00:37:33,120 --> 00:37:37,120 El gel ya no es tóxico, no es cancerígeno 350 00:37:38,120 --> 00:37:43,120 Vale, entonces aquí lo único que he supuesto es que en algunos cosméticos 351 00:37:43,120 --> 00:37:48,120 Como geles fijadores de pelo pues llevan acrílicos de este tipo 352 00:37:50,120 --> 00:37:55,120 Bien, pues una cosa importante es que 353 00:37:55,120 --> 00:37:58,120 En función de la cantidad de acrilamida que pongamos 354 00:37:58,120 --> 00:38:02,120 Y de la cantidad de bisacrilamida que pongamos 355 00:38:02,120 --> 00:38:07,120 Se van a quedar las cadenas más o menos entrecruzadas 356 00:38:08,120 --> 00:38:15,120 Vale, entonces en función de la concentración de acrilamida se obtienen entramados más o menos densos 357 00:38:15,120 --> 00:38:22,120 Mientras que la cantidad de bisacrilamida condiciona el grado de entrecruzamiento de las cadenas 358 00:38:22,120 --> 00:38:28,120 Ambos componentes determinan las características del gel, es decir, su resistencia mecánica 359 00:38:28,120 --> 00:38:34,120 Su fragilidad, su elasticidad, el grado de reticulación, el tamaño de poro 360 00:38:35,120 --> 00:38:43,120 Entonces, el tamaño de poro viene determinado por la concentración total de monómeros 361 00:38:43,120 --> 00:38:50,120 Entonces, el gel se define por, el reticulado es el tanto por ciento, T se llama 362 00:38:50,120 --> 00:38:56,120 Que es la concentración total de monómeros de acrilamida y bisacrilamida en relación peso-volumen 363 00:38:56,120 --> 00:39:02,120 Y la dureza, que viene dada por la relación de la cantidad de bisacrilamida al total de monómeros 364 00:39:03,120 --> 00:39:08,120 Vale, entonces dependiendo de eso, de las cantidades de acrilamida y bisacrilamida 365 00:39:08,120 --> 00:39:14,120 Pues vamos a poder obtener un buen resultado o no 366 00:39:14,120 --> 00:39:19,120 En este caso fijaros que tenemos un 3% de acrilamida 367 00:39:19,120 --> 00:39:26,120 Pues fijaros, bueno, así van a aparecer los resultados, van a aparecernos así como rayas 368 00:39:27,120 --> 00:39:32,120 Vale, entonces, en el caso del 3% de acrilamida, pues aquí no se ha separado 369 00:39:32,120 --> 00:39:35,120 Nuestra muestra se ha separado un poco, pero aquí no vamos a poder ver nada 370 00:39:36,120 --> 00:39:41,120 Si ponemos un 6% de acrilamida, pues ya empieza a separarse un poquito más 371 00:39:41,120 --> 00:39:44,120 Pero estas muestras de aquí no se han separado bien 372 00:39:44,120 --> 00:39:50,120 Aquí en el 9% pues ya se ha separado mejor y en el 12% pues también se va 373 00:39:50,120 --> 00:39:58,120 Ya se ve que las proteínas se han separado, ya podemos ver todas las proteínas separadas 374 00:39:58,120 --> 00:40:04,120 En este caso no vemos nada y en este caso se nos quedan ahí algunas proteínas que no se han separado 375 00:40:04,120 --> 00:40:13,120 Por eso es importante elegir la proporción de acrilamida y de bisacrilamida en el gel 376 00:40:15,120 --> 00:40:19,120 Vale, bueno, pues aquí os he puesto lo que es el TEMED y el Persulfato 377 00:40:19,120 --> 00:40:27,120 Generan los radicales para iniciar la sesión que prosigue en cadena hasta formar el hidrogel 378 00:40:27,120 --> 00:40:31,120 El Persulfato actúa como iniciador, esto ya es lo que os he dicho antes 379 00:40:31,120 --> 00:40:38,120 Y el TEMED actúa como catalizador y lo único que tiene que estar a pH básico 380 00:40:39,120 --> 00:40:47,120 Y dependiendo también de la concentración de ambos, así será la velocidad de polimerización 381 00:40:47,120 --> 00:40:56,120 Como el TEMED es el catalizador, dependiendo de la concentración, así será la velocidad de polimerización 382 00:41:01,120 --> 00:41:05,120 Bien, pues seguimos con el gel de poliacrilamida 383 00:41:05,120 --> 00:41:09,120 Todavía no nos hemos metido con la muestra, todavía seguimos con el gel 384 00:41:09,120 --> 00:41:17,120 Entonces, hay dos tipos de gels con los que se puede trabajar 385 00:41:17,120 --> 00:41:30,120 Se puede trabajar un gel que sea sencillo, que sea un gel único 386 00:41:35,120 --> 00:41:45,120 O en el caso de la electroforesis, el gel de poliacrilamida, se suele trabajar con gels que tienen dos partes 387 00:41:45,120 --> 00:41:59,120 Estos gels están divididos, por un lado, en un gel que se llama o gel de carga o gel concentrador o acumulador o de compactación 388 00:41:59,120 --> 00:42:02,120 Yo lo he visto de todas estas formas 389 00:42:02,120 --> 00:42:08,120 Y un gel de resolución o lo he visto también como separador 390 00:42:08,120 --> 00:42:17,120 En el caso del documento que tenéis en el aula virtual, lo llaman gel de carga y gel de resolución 391 00:42:17,120 --> 00:42:25,120 Pero lo podéis ver así también, o separador, o en este caso concentrador o acumulador o de compactación 392 00:42:26,120 --> 00:42:30,120 Entonces, imaginaros eso, que el gel lo vamos a dividir en dos 393 00:42:32,120 --> 00:42:38,120 El gel concentrador, mirad aquí lo tenéis, veis aquí lo tenéis como gel acumulador 394 00:42:38,120 --> 00:42:41,120 Que sería este de aquí en beige clarito o en amarillo 395 00:42:41,120 --> 00:42:48,120 El gel este, el gel de carga o gel concentrador 396 00:42:48,120 --> 00:42:57,120 Pues lo que va a hacer es que todas nuestras proteínas, nosotros vamos a meter las proteínas por aquí, por unos pocillos que vamos a hacer 397 00:42:57,120 --> 00:43:06,120 Entonces lo que va a hacer el gel concentrador es que todas las proteínas empiecen a separarse a la misma vez 398 00:43:06,120 --> 00:43:10,120 Entonces las proteínas, nosotros vamos a introducir por aquí nuestras proteínas 399 00:43:10,120 --> 00:43:17,120 Y el gel concentrador lo que va a hacer es que todas las proteínas comiencen aquí a separarse 400 00:43:17,120 --> 00:43:21,120 Y las proteínas van a pasar, atraviesan el gel concentrador 401 00:43:21,120 --> 00:43:27,120 Y a partir de aquí ya empiezan a separarse las proteínas según su masa molecular 402 00:43:27,120 --> 00:43:30,120 Se van a separar en el gel separador 403 00:43:32,120 --> 00:43:40,120 Entonces, para preparar estos dos geles lo que hacemos es poner diferentes cantidades de acrilamida y de bisacrilamida 404 00:43:40,120 --> 00:43:50,120 Por ejemplo, el gel separador va a tener mayor cantidad de acrilamida, va a tener mayor BH y el tamaño de poro es menor 405 00:43:50,120 --> 00:43:57,120 Entonces nosotros vamos a introducir por aquí nuestras proteínas en esto que se llama unos pocillos 406 00:43:57,120 --> 00:44:03,120 Vamos a introducir nuestras proteínas, vamos a aplicar el campo eléctrico 407 00:44:03,120 --> 00:44:09,120 Y esas proteínas se van a ir separando según su masa molecular 408 00:44:11,120 --> 00:44:20,120 Yo sé que esto es un poquito complicado de entender, pero yo creo que poco a poco lo vais a ir viendo 409 00:44:20,120 --> 00:44:27,120 Entonces aquí tendríamos la muestra y aquí es cuando empiezan a separarse 410 00:44:27,120 --> 00:44:32,120 Empieza a separarse nuestra muestra en el gel de resolución o concentrador 411 00:44:32,120 --> 00:44:37,120 Entonces tenemos el gel de carga, evita que las proteínas se dispersen en el gel 412 00:44:37,120 --> 00:44:50,120 Y provoca que todas las proteínas de la muestra se alineen en una fina banda que entra al mismo tiempo y a la misma velocidad en el gel separador 413 00:44:50,120 --> 00:44:53,120 Y se encuentra a BH 6,8 414 00:44:53,120 --> 00:45:00,120 Esto es para que todas comiencen a separarse a la vez 415 00:45:01,120 --> 00:45:06,120 Y luego el gel de resolución, aquí es donde tiene lugar la separación de las proteínas 416 00:45:06,120 --> 00:45:11,120 El porcentaje de acrilamida aquí es mayor, por tanto el tamaño de poro es menor 417 00:45:11,120 --> 00:45:16,120 Haciendo que las proteínas de mayor masa molecular se muevan más lentamente 418 00:45:16,120 --> 00:45:20,120 Este gel realiza la separación a un pH de 8,8 419 00:45:20,120 --> 00:45:30,120 Entonces, importante para cuando se trabaja en el laboratorio 420 00:45:30,120 --> 00:45:34,120 Cuando se preparan estos gels, lo que se hace es 421 00:45:34,120 --> 00:45:38,120 Se disuelve la acrilamida con la bisacrilamida 422 00:45:38,120 --> 00:45:43,120 Y seguidamente se añade el témet y el persulfato 423 00:45:43,120 --> 00:45:50,120 Una vez que añadimos el témet y el persulfato ya tenemos que preparar el gel 424 00:45:50,120 --> 00:45:55,120 Porque ya va a empezar a polimerizar la poliacrilamida 425 00:45:55,120 --> 00:46:01,120 Por una parte hay que tener en cuenta que hay que evitar la presencia de oxígeno 426 00:46:01,120 --> 00:46:06,120 Porque el oxígeno inhibe la polimerización 427 00:46:06,120 --> 00:46:10,120 Inhibe que se forme la poliacrilamida 428 00:46:11,120 --> 00:46:15,120 Por lo tanto la mezcla de polimerización debe desgasificarse a vacío 429 00:46:15,120 --> 00:46:19,120 Que además esto impide la formación de burbujas 430 00:46:19,120 --> 00:46:22,120 Que estas burbujas alteran el campo eléctrico 431 00:46:22,120 --> 00:46:27,120 Y por otro lado en el laboratorio también necesitamos una temperatura óptima de polimerización 432 00:46:27,120 --> 00:46:29,120 Que es de 25 a 30 grados 433 00:46:29,120 --> 00:46:33,120 Y a esta temperatura el proceso ocurre en pocos minutos 434 00:46:33,120 --> 00:46:36,120 Aunque conviene dejarlo transcurrir más tiempo 435 00:46:40,120 --> 00:46:44,120 Por otro lado en el laboratorio, esto ya lo hemos comentado antes 436 00:46:44,120 --> 00:46:46,120 Los monómeros son neurotóxicos 437 00:46:46,120 --> 00:46:51,120 Por lo que deben manejarse en campana extractora, con guantes y mascarillas 438 00:46:51,120 --> 00:46:55,120 Bien, esto está repetido, no me había dado cuenta 439 00:46:55,120 --> 00:47:01,120 Dice aquí luego la toxicidad se reduce al mínimo una vez que ya sea polimerizado 440 00:47:01,120 --> 00:47:06,120 Pero bueno, es mejor continuar trabajando con guantes 441 00:47:06,120 --> 00:47:08,120 Mirad, aquí podéis ver 442 00:47:08,120 --> 00:47:12,120 Bueno, no sé si se ve bien, luego lo enseño mejor 443 00:47:12,120 --> 00:47:17,120 Bien, pues entonces esto sería lo que es la preparación del gel 444 00:47:17,120 --> 00:47:21,120 Es decir, necesitamos acrilamida 445 00:47:21,120 --> 00:47:25,120 Vamos a polimerizar esta acrilamida 446 00:47:25,120 --> 00:47:32,120 Para polimerizar esta poliacrilamida lo que necesitamos es el persulfato 447 00:47:33,120 --> 00:47:38,120 El persulfato que es el iniciador y el TEMED que es el catalizador 448 00:47:38,120 --> 00:47:44,120 Vamos a generar una poliacrilamida, es decir, muchas cadenas de acrilamida 449 00:47:44,120 --> 00:47:50,120 Y estas cadenas de poliacrilamida las tenemos que unir unas a otras 450 00:47:50,120 --> 00:47:53,120 ¿Cómo las unimos? Pues con bisacrilamida 451 00:47:53,120 --> 00:47:57,120 Se nos van a generar unos huecos, unos poros 452 00:47:57,120 --> 00:48:01,120 Por los que luego van a pasar nuestras moléculas 453 00:48:02,120 --> 00:48:07,120 Entonces, vamos a preparar un gel en dos partes 454 00:48:07,120 --> 00:48:12,120 Un gel, la parte de arriba va a ser el gel concentrador 455 00:48:12,120 --> 00:48:18,120 Que nos sirve para que todas las proteínas comiencen a separarse a la vez, al mismo tiempo 456 00:48:18,120 --> 00:48:29,120 Y el gel separador, que aquí es donde se separan nuestras proteínas en función de su masa molecular 457 00:48:29,120 --> 00:48:32,120 Bien, pues ahora vamos a ver, ya tenemos el gel hecho 458 00:48:32,120 --> 00:48:35,120 Vamos a ver cómo preparamos nuestra muestra 459 00:48:35,120 --> 00:48:42,120 Nuestra muestra que la vamos a adicionar por aquí en estos huecos que se llaman pocillos 460 00:48:45,120 --> 00:48:51,120 Bueno, pues nuestra muestra, hay dos formas de hacer el análisis 461 00:48:51,120 --> 00:48:57,120 La muestra se puede introducir en condiciones nativas 462 00:48:57,120 --> 00:48:59,120 Esto es en inglés 463 00:48:59,120 --> 00:49:04,120 O sea, sin desnaturalizar, en condiciones nativas 464 00:49:04,120 --> 00:49:09,120 O sea, las proteínas mantienen su estructura tridimensional 465 00:49:09,120 --> 00:49:17,120 Y lo que se suele hacer en la electroforesis de gel de poliacrilamida 466 00:49:17,120 --> 00:49:21,120 Se suele trabajar en condiciones desnaturalizantes 467 00:49:22,120 --> 00:49:27,120 ¿Cómo hacemos que nuestra proteína se desnaturalice? 468 00:49:27,120 --> 00:49:33,120 ¿Os acordáis que desnaturalizar era que se rompían los enlaces? 469 00:49:33,120 --> 00:49:40,120 Pues los puentes de hidrógeno, los enlaces por fuerzas electrostáticas 470 00:49:40,120 --> 00:49:44,120 Los enlaces de isufuro, esos enlaces se rompían 471 00:49:44,120 --> 00:49:50,120 Y entonces la proteína pierde sus estructuras, su estructura terciaria, su estructura secundaria 472 00:49:50,120 --> 00:49:55,120 La proteína se queda con solo su estructura primaria, es decir, la unión de aminoácidos 473 00:49:55,120 --> 00:49:59,120 ¿Cómo hacemos que desnaturalice esta proteína? 474 00:49:59,120 --> 00:50:08,120 Lo que hacemos es añadir un compuesto que se llama SDS, que es el dodefil sulfonato de sodio 475 00:50:08,120 --> 00:50:16,120 Este compuesto es un detergente y lo que va a hacer es eso, es desnaturalizar nuestra proteína 476 00:50:16,120 --> 00:50:21,120 Es decir, va a romper estos enlaces que mantenían la estructura terciaria 477 00:50:21,120 --> 00:50:28,120 Rompe estos enlaces y nuestra proteína se nos queda con solo la estructura primaria 478 00:50:28,120 --> 00:50:32,120 Pero además de eso, ¿qué hace el SDS? 479 00:50:32,120 --> 00:50:35,120 El dodefil sulfonato de sodio 480 00:50:35,120 --> 00:50:43,120 Pues lo que va a hacer va a ser aportar carga negativa a toda la cadena de proteínas 481 00:50:44,120 --> 00:50:54,120 Entonces, la proteína tenga la carga que tenga, si añadimos el SDS se va a quedar cargada negativamente 482 00:50:54,120 --> 00:50:58,120 Todas las cadenas de proteínas negativamente 483 00:50:58,120 --> 00:51:02,120 ¿Y qué es lo que vamos a conseguir con esto? 484 00:51:02,120 --> 00:51:10,120 Pues lo que vamos a conseguir es que cuando pongamos a nuestras proteínas en el campo eléctrico 485 00:51:10,120 --> 00:51:16,120 Cuando apliquemos el campo eléctrico, como todas las proteínas van a tener carga negativa 486 00:51:16,120 --> 00:51:21,120 Pues todas las proteínas se van a dirigir hacia el polo positivo 487 00:51:21,120 --> 00:51:31,120 Todas se van a mover hacia el polo positivo, pero se van a separar solamente según su masa molecular 488 00:51:31,120 --> 00:51:35,120 Porque todas tienen la misma carga, todas tienen carga negativa 489 00:51:35,120 --> 00:51:39,120 Pero se van a separar según su masa molecular 490 00:51:40,120 --> 00:51:42,120 Bueno, aquí está puesto lo mismo 491 00:51:42,120 --> 00:51:49,120 Como resultado la proteína adquiere una carga global negativa y directamente proporcional a su tamaño 492 00:51:49,120 --> 00:51:54,120 De modo que la cantidad de SDS que interacciona con la proteína es constante 493 00:51:54,120 --> 00:52:01,120 Esto nos garantiza una separación proporcional a la masa molecular de la proteína 494 00:52:02,120 --> 00:52:12,120 Como esta se encuentra desnaturalizada, la interacción con el polímero de acrilamida será mayor cuanto mayor sea la masa molecular 495 00:52:12,120 --> 00:52:22,120 El resultado global es que la velocidad de desplazamiento de la proteína en el campo eléctrico es inversamente proporcional a la masa molecular 496 00:52:22,120 --> 00:52:26,120 Entonces tenemos aquí nuestra mezcla de proteínas 497 00:52:27,120 --> 00:52:33,120 Y esto serían las cadenas de polímero que está entrecruzado y que tiene poros, que tiene huecos 498 00:52:33,120 --> 00:52:39,120 Si aplicamos el campo eléctrico, pues todas las proteínas se van a dirigir hacia el polo positivo 499 00:52:39,120 --> 00:52:42,120 Que estará el polo positivo aquí abajo 500 00:52:42,120 --> 00:52:45,120 Y se van a separar según su masa molecular 501 00:52:45,120 --> 00:52:48,120 Estas amarillas que son más grandes se quedan retenidas 502 00:52:49,120 --> 00:52:54,120 Y estas lilas moradas, pues como son más pequeñas, van a ir atravesando los poros 503 00:52:54,120 --> 00:53:02,120 Van atravesando los poros hasta que, hasta el final, van a aparecer al final, abajo, más abajo 504 00:53:04,120 --> 00:53:15,120 Bueno, pues como resumen, la SDS-PAGE, la estroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, donde se dice sulfonato de sodio 505 00:53:15,120 --> 00:53:22,120 Es muy utilizada porque la gran mayoría de las proteínas son solubles en el SDS 506 00:53:22,120 --> 00:53:29,120 Porque todos los complejos SDS-proteína tienen carga negativa y migran, por tanto, en el mismo sentido 507 00:53:29,120 --> 00:53:36,120 Porque su densidad de carga es muy elevada, por lo que su velocidad de migración también lo es 508 00:53:36,120 --> 00:53:38,120 Y las estroforesis son muy rápidas 509 00:53:38,120 --> 00:53:44,120 Porque la separación depende sólo de un parámetro físico-químico como es sólo la masa molecular 510 00:53:44,120 --> 00:53:46,120 Y esto se puede calcular 511 00:53:46,120 --> 00:53:51,120 Y porque los complejos SDS-proteína se tiñen fácilmente 512 00:53:51,120 --> 00:53:55,120 Vamos a ver luego qué es esto de tiñir 513 00:53:57,120 --> 00:54:03,120 Bueno, aquí os he puesto un poco cómo se colocan las... 514 00:54:03,120 --> 00:54:07,120 El gel se coloca entre dos placas de vidrio 515 00:54:08,120 --> 00:54:13,120 Y una vez que tenemos el gel entre esas dos placas de vidrio 516 00:54:13,120 --> 00:54:18,120 Lo que se hace es generar aquí arriba unos huecos, unos pocillos 517 00:54:18,120 --> 00:54:23,120 Con un aparato que se llama un peine 518 00:54:23,120 --> 00:54:30,120 Antes de que polimerice por completo, se hacen aquí como unos agujerillos, unos pocillos 519 00:54:30,120 --> 00:54:35,120 Y por estos pocillos es por donde vamos a introducir nuestra muestra 520 00:54:37,120 --> 00:54:42,120 Vale, esto yo creo que lo mejor será ver un vídeo 521 00:54:42,120 --> 00:54:47,120 Que yo creo que ya lo... Bueno, ahora os digo cuál es el vídeo por si queréis verlo en casa 522 00:54:47,120 --> 00:54:49,120 Pero si no, el próximo día lo vemos 523 00:54:49,120 --> 00:54:51,120 Para que veáis un poco cómo es la práctica 524 00:54:51,120 --> 00:54:53,120 Para que os hagáis una idea cómo es el gel 525 00:54:53,120 --> 00:54:56,120 Cómo se introducen las muestras 526 00:54:56,120 --> 00:55:01,120 Porque si no así, en teoría, es un poco complicado que lo entendáis 527 00:55:02,120 --> 00:55:08,120 Bueno, aquí estaría la explicación de cuando aplicamos el campo eléctrico 528 00:55:08,120 --> 00:55:13,120 Cómo las proteínas, como tienen carga negativa, se van a dirigir al cátodo 529 00:55:13,120 --> 00:55:17,120 Y cómo se van separando aquí las proteínas 530 00:55:17,120 --> 00:55:21,120 Las proteínas se van añadiendo aquí en esta serie de pocillos 531 00:55:21,120 --> 00:55:26,120 Y una vez que hemos aplicado el campo eléctrico 532 00:55:26,120 --> 00:55:30,120 Lo tenemos ahí durante... Pues depende del tipo que sea 533 00:55:30,120 --> 00:55:32,120 Pero media hora, una hora 534 00:55:32,120 --> 00:55:35,120 Se separan los dos cristales en los que tenemos el gel 535 00:55:35,120 --> 00:55:37,120 Y ese gel lo tenemos que teñir 536 00:55:37,120 --> 00:55:40,120 Porque no vamos a ver nada 537 00:55:40,120 --> 00:55:43,120 No vamos a ver nuestras proteínas 538 00:55:43,120 --> 00:55:45,120 Las tenemos que teñir 539 00:55:45,120 --> 00:55:48,120 Y se utiliza este compuesto, el azul de comasi 540 00:55:48,120 --> 00:55:50,120 Que tiñe el gel 541 00:55:50,120 --> 00:55:53,120 Tiñe todo el gel, tiñe a nuestras proteínas 542 00:55:54,120 --> 00:55:58,120 Bien, pues este sería el... 543 00:55:58,120 --> 00:56:00,120 Cómo nos quedaría el gel 544 00:56:00,120 --> 00:56:03,120 Veis que nos aparecen así estas rayitas 545 00:56:03,120 --> 00:56:05,120 En color azul 546 00:56:05,120 --> 00:56:10,120 Y lo que tenemos que, en uno de estos pocillos de los que os he hablado antes 547 00:56:10,120 --> 00:56:14,120 Además de en cada uno poner nuestras proteínas 548 00:56:14,120 --> 00:56:16,120 Las que queremos determinar 549 00:56:16,120 --> 00:56:22,120 En uno de ellos vamos a poner una mezcla de proteínas 550 00:56:22,120 --> 00:56:25,120 Que nos va a servir de referencia 551 00:56:25,120 --> 00:56:28,120 De esta mezcla de proteínas ya sabemos 552 00:56:28,120 --> 00:56:30,120 Que RF tenemos 553 00:56:30,120 --> 00:56:35,120 Que distancia recorren cada una de nuestras proteínas de esta mezcla 554 00:56:35,120 --> 00:56:37,120 Y entonces lo que vamos a hacer va a ser 555 00:56:37,120 --> 00:56:39,120 Representar 556 00:56:41,120 --> 00:56:43,120 Vamos a representar 557 00:56:44,120 --> 00:56:46,120 Estos serían los puntos azules 558 00:56:46,120 --> 00:56:48,120 Serían nuestras proteínas, patrón 559 00:56:48,120 --> 00:56:50,120 Las que conocemos 560 00:56:50,120 --> 00:56:52,120 Su masa molecular 561 00:56:52,120 --> 00:56:54,120 Y conocemos la distancia que recorren 562 00:56:54,120 --> 00:56:56,120 Conocemos su RF 563 00:56:56,120 --> 00:57:01,120 Pues representamos todas esas proteínas que conocemos 564 00:57:01,120 --> 00:57:03,120 De nuestra muestra de referencia 565 00:57:03,120 --> 00:57:05,120 Hacemos la representación 566 00:57:05,120 --> 00:57:07,120 Bueno, se representa el logaritmo de la masa molecular 567 00:57:07,120 --> 00:57:09,120 Frente al RF 568 00:57:10,120 --> 00:57:13,120 Y a partir de la ecuación de la recta 569 00:57:13,120 --> 00:57:15,120 Lo que vamos a poder determinar es 570 00:57:15,120 --> 00:57:18,120 Nuestra muestra desconocida 571 00:57:18,120 --> 00:57:20,120 Nuestra muestra desconocida 572 00:57:20,120 --> 00:57:22,120 Hacemos la electroforesis 573 00:57:22,120 --> 00:57:24,120 Medimos el RF 574 00:57:24,120 --> 00:57:28,120 El RF es la distancia que recorre nuestra muestra 575 00:57:28,120 --> 00:57:31,120 A partir de la distancia que recorre el disolvente 576 00:57:31,120 --> 00:57:34,120 Pues vamos a medir el RF de nuestra muestra desconocida 577 00:57:34,120 --> 00:57:37,120 Lo metemos en la ecuación de la recta 578 00:57:37,120 --> 00:57:41,120 Y podemos sacar la masa molecular de nuestra muestra 579 00:57:42,120 --> 00:57:46,120 Vale, pues entonces, como son ya las 7 menos 25 580 00:57:46,120 --> 00:57:51,120 Yo creo que el próximo día os voy a poner el vídeo 581 00:57:51,120 --> 00:57:54,120 Para que veáis un poco como se trabaja en el laboratorio 582 00:57:54,120 --> 00:57:59,120 Y luego ya os vuelvo a repetir un resumen de esta presentación 583 00:57:59,120 --> 00:58:03,120 Porque lo que os digo, yo creo que así es un poco complicado 584 00:58:03,120 --> 00:58:05,120 Ver la teoría 585 00:58:05,120 --> 00:58:10,120 Y yo creo que os va a ser más útil ver el vídeo 586 00:58:10,120 --> 00:58:13,120 Vale, pues voy a parar la grabación