1
00:00:00,000 --> 00:00:19,960
Bien, vamos a comenzar este vídeo explicativo sobre cómo resolver algunos de los ejercicios

2
00:00:19,960 --> 00:00:24,080
prácticos sobre MasterMix y sobre PCR.

3
00:00:24,080 --> 00:00:33,080
Entonces, en este primer ejercicio nos piden que queremos reproducir unas condiciones de

4
00:00:33,080 --> 00:00:34,080
una PCR.

5
00:00:34,080 --> 00:00:38,880
Imaginaos que hemos visto estas condiciones en un artículo científico y queremos intentar

6
00:00:38,880 --> 00:00:40,560
reproducirlo en nuestro laboratorio.

7
00:00:40,560 --> 00:00:46,520
Entonces, nos están diciendo que el volumen final de la mezcla de reacción en cada tubo

8
00:00:46,520 --> 00:00:48,880
es de 50 microlitros.

9
00:00:48,880 --> 00:00:55,720
La concentración final de cada reactivo nos la dan también, 2 milimolar, 400 micromolar,

10
00:00:55,720 --> 00:01:01,120
300 nanomolar para los primers y de la tag polimerasa en cada tubo habrá que poner 1

11
00:01:01,120 --> 00:01:03,320
con 5 unidades.

12
00:01:03,320 --> 00:01:09,440
Entonces, para poder realizar este experimento tenemos un kit comercial.

13
00:01:09,440 --> 00:01:16,480
Esto es muy típico, comprar todos los reactivos a la misma casa comercial y a partir del datasheet,

14
00:01:16,480 --> 00:01:21,680
la hoja de los datos, entonces nosotros extraemos toda esta información, es decir, el tampón

15
00:01:21,680 --> 00:01:28,960
de reacción, el buffer, esta zincopor, el crudo de magnesio a 25 milimolar, los DNTPs

16
00:01:28,960 --> 00:01:36,320
que nos dan están a 10 milimolar, los primers, que también los habremos comprado en alguna

17
00:01:36,320 --> 00:01:42,080
casa comercial, los hemos dejado a una concentración de 10 micromolar y la polimerasa que utilizamos,

18
00:01:42,080 --> 00:01:45,640
la tag polimerasa, la tenemos a 3 unidades microlitros.

19
00:01:46,360 --> 00:01:52,120
Esto sencillamente es las condiciones aquí arriba de lo que nosotros queremos conseguir

20
00:01:52,120 --> 00:01:58,120
en nuestra PCR y aquí es lo que tenemos en el laboratorio, el kit comercial, los reactivos.

21
00:01:58,120 --> 00:02:05,480
Pues nos piden que calculemos la cantidad de cada reactivo para la Mastermix, teniendo

22
00:02:05,480 --> 00:02:08,920
en cuenta que tenemos que hacer 14 PCRs.

23
00:02:08,920 --> 00:02:15,960
Imaginaos que nos piden que hagamos una PCR de un gen determinado en 14 muestras de pacientes,

24
00:02:15,960 --> 00:02:22,160
teniendo en cuenta que añadiremos 200 nanogramos del DNA molde de cada paciente y tenemos el

25
00:02:22,160 --> 00:02:28,600
DNA molde de cada paciente a esta concentración, 2 microgramos microlitros.

26
00:02:28,600 --> 00:02:36,880
Este es el enunciado de un ejercicio de Mastermix típico, ¿cómo resolverlo?

27
00:02:36,880 --> 00:02:41,880
Pues la idea es que tenemos que ir calculando la cantidad de cada reactivo, el volumen de

28
00:02:41,880 --> 00:02:46,360
cada reactivo que tenemos que ir añadiendo al tubo de la Mastermix.

29
00:02:46,360 --> 00:02:48,040
¿Cómo resolverlo?

30
00:02:48,040 --> 00:02:54,080
A mí me parece que la manera más sencilla es hacerlo y ordenar todos los datos en forma

31
00:02:54,080 --> 00:02:56,520
de tabla, algo así.

32
00:02:56,520 --> 00:02:57,520
¿De acuerdo?

33
00:02:57,520 --> 00:03:05,120
Entonces, en esta tabla de una tacada la vamos a ir rellenando con datos, bien los datos

34
00:03:05,160 --> 00:03:10,960
que nos dan el enunciado y bien los datos que vamos a ir calculando, ¿de acuerdo?

35
00:03:10,960 --> 00:03:15,760
Entonces, todos los resultados van a quedar de forma muy ordenada, muy visuales y a mí

36
00:03:15,760 --> 00:03:21,200
me parece que es una manera de hacerlo muy clara y que os va a permitir sobre todo no

37
00:03:21,200 --> 00:03:28,760
confundiros porque confundir datos de un reactivo con otro es muy fácil, ¿de acuerdo?

38
00:03:28,760 --> 00:03:34,280
Entonces, yo os recomiendo que hagáis una tabla de este estilo, en la cual tenemos

39
00:03:34,440 --> 00:03:40,240
todos los reactivos que vamos a necesitar, el buffer, las sales, el magnesio, DNTPs,

40
00:03:40,240 --> 00:03:46,240
el forward y el reverse, la tac polimeras y añadimos una fila para el DNA y la fila

41
00:03:46,240 --> 00:03:47,240
para el agua.

42
00:03:47,240 --> 00:03:53,840
Por supuesto, en el tubo de la PCR necesitamos agua, en una dilución acuosa.

43
00:03:53,840 --> 00:03:56,960
Pongo aquí también este dato para que no se nos olvide porque es muy importante, el

44
00:03:56,960 --> 00:04:03,160
volumen final de cada tubo nos dice que son 50 microlitros, es decir, después de añadir

45
00:04:03,160 --> 00:04:07,920
el buffer, todos los reactivos, el agua y el DNA, el volumen final de cada tubo de

46
00:04:07,920 --> 00:04:11,720
PCR tendría que ser 20 microlitros, ¿de acuerdo?

47
00:04:11,720 --> 00:04:19,560
Bien, en esta tabla ya hay cuatro celdas que de entrada sin calcular nada ya sabemos lo

48
00:04:19,560 --> 00:04:23,720
que tenemos que poner, que son estas, el agua.

49
00:04:23,720 --> 00:04:30,360
Bueno, os cuento, primera columna es concentración inicial, esta concentración inicial es la

50
00:04:30,400 --> 00:04:37,240
concentración de cada reactivo en el kit comercial, la concentración final es la concentración

51
00:04:37,240 --> 00:04:46,600
de cada reactivo, pero ya en el tubo de PCR final, en el tubo de PCR, ¿de acuerdo?

52
00:04:46,600 --> 00:04:51,840
El volumen inicial es el volumen que yo voy a coger de cada reactivo, el volumen del kit

53
00:04:51,840 --> 00:04:57,280
comercial, es el volumen que voy a coger de cada reactivo del kit comercial y que voy

54
00:04:57,280 --> 00:05:03,360
a añadir al tubo de PCR, como si tuviera que hacer un único tubo de PCR, esto es lo

55
00:05:03,360 --> 00:05:10,440
primero que vamos a calcular y luego lo multiplicaremos por el número de tubos de PCR que tenemos

56
00:05:10,440 --> 00:05:11,440
que hacer.

57
00:05:11,440 --> 00:05:17,400
Os recuerdo, tiro para atrás, nos están pidiendo que calculemos la MasterMix para

58
00:05:17,400 --> 00:05:25,520
14 PCRs, es decir, para 14 muestras de pacientes, os recuerdo, como veíamos en clase, que a

59
00:05:25,640 --> 00:05:32,920
esos 14 tubos de PCR hay que añadirle 3, un tubo para el control positivo, un tubo

60
00:05:32,920 --> 00:05:39,000
para el control negativo y un tubo de más, ¿vale?, para, sobre todo, evitar los errores

61
00:05:39,000 --> 00:05:40,000
de pipeteo.

62
00:05:40,000 --> 00:05:45,960
Por tanto, no son 14 tubos, sino que la MasterMix tenemos que calcularla sobre 17 tubos, imagino

63
00:05:45,960 --> 00:05:49,680
que esto todo el mundo lo ve, ya lo comentamos en clase, ¿de acuerdo?

64
00:05:49,680 --> 00:05:55,500
Bien, pues decíamos que en esta tabla hay 4 celdas que ya sabemos lo que tenemos que

65
00:05:55,500 --> 00:05:56,500
poner.

66
00:05:56,500 --> 00:06:01,420
El agua, vamos, el agua no tiene concentración inicial ni concentración final, el agua

67
00:06:01,420 --> 00:06:02,420
es agua.

68
00:06:02,420 --> 00:06:08,540
Por tanto, os las he puesto sombreada porque aquí no tenemos que calcular nada, ¿de acuerdo?

69
00:06:08,540 --> 00:06:11,620
Ya veremos luego después por qué ponemos el agua.

70
00:06:11,620 --> 00:06:20,620
Del DNA, el DNA lo tengo que calcular en los volúmenes para un tubo, pero nunca ponemos

71
00:06:20,620 --> 00:06:26,140
el DNA en el MasterMix, por tanto, esta celda también está sombreada, aquí no tenemos

72
00:06:26,140 --> 00:06:28,260
que ponerlo, ¿de acuerdo?

73
00:06:28,260 --> 00:06:35,260
Y después del buffer, el buffer me lo van a dar en unidades de concentración, la concentración

74
00:06:35,260 --> 00:06:42,700
final del buffer siempre es 1x, es decir, no hay concentración, concentración 1, ¿de

75
00:06:42,700 --> 00:06:43,860
acuerdo?

76
00:06:43,860 --> 00:06:44,860
Muy bien.

77
00:06:45,780 --> 00:06:51,100
Vamos a cómo calculamos, cómo hacemos los cálculos.

78
00:06:51,100 --> 00:06:52,100
Fijaos.

79
00:06:52,100 --> 00:06:56,900
Lo primero que tenemos que hacer es identificar, fijaos que os he puesto aquí un código de

80
00:06:56,900 --> 00:06:59,500
colores por si se entiende mucho mejor.

81
00:06:59,500 --> 00:07:03,980
Hemos dicho que las dos primeras columnas, concentración inicial y concentración final,

82
00:07:03,980 --> 00:07:08,580
las vamos a rellenar a partir de la información del enunciado, ¿de acuerdo?

83
00:07:08,580 --> 00:07:13,860
En este sentido, en el enunciado, os he puesto aquí también con el mismo código de colores,

84
00:07:13,860 --> 00:07:19,620
fijaos, en azul las concentraciones finales, las que van a ir en la mezcla de reacción,

85
00:07:19,620 --> 00:07:26,380
la concentración del magnesio, de los DNTPs, de los primers, de la polimerasa, y las concentraciones

86
00:07:26,380 --> 00:07:31,900
iniciales son las concentraciones que me dice que tienen los reactivos en el kit comercial.

87
00:07:31,900 --> 00:07:38,020
Lo único que tengo que hacer es, en el enunciado, identificar cuáles son concentraciones iniciales,

88
00:07:38,020 --> 00:07:41,900
por ejemplo, las he puesto en rojo, y las concentraciones finales en azul, y rellenar

89
00:07:41,900 --> 00:07:42,900
la tabla.

90
00:07:42,900 --> 00:07:43,900
¿De acuerdo?

91
00:07:43,900 --> 00:07:44,900
Ya está rellenado.

92
00:07:44,900 --> 00:07:45,900
Eso os dais cuenta.

93
00:07:45,900 --> 00:07:52,620
Entonces, las concentraciones iniciales de todos los reactivos en el kit comercial, menos

94
00:07:52,620 --> 00:07:57,180
el DNA, que ya lo he purificado y lo he cuantificado yo, ¿de acuerdo?

95
00:07:57,180 --> 00:08:00,060
Pues serían todas estas, ¿de acuerdo?

96
00:08:00,060 --> 00:08:05,460
Sencillamente, lo único que he hecho ha sido copiar los datos del enunciado y las concentraciones

97
00:08:05,460 --> 00:08:11,220
finales que me piden de cada reactivo en la mezcla de reacción, también las he copiado.

98
00:08:11,220 --> 00:08:13,420
¿De acuerdo?

99
00:08:13,420 --> 00:08:16,260
Muy bien.

100
00:08:16,260 --> 00:08:20,540
Para calcular el volumen inicial, es decir, el volumen de cada reactivo en el tubo de

101
00:08:20,540 --> 00:08:24,780
PCR, lo vamos a hacer de tres maneras diferentes.

102
00:08:24,780 --> 00:08:26,580
¿De acuerdo?

103
00:08:26,580 --> 00:08:30,060
Entonces, el buffer.

104
00:08:30,060 --> 00:08:32,460
El buffer me lo dan en unidades de concentración.

105
00:08:32,460 --> 00:08:39,660
Lugar de 5 por significa que en el buffer del kit comercial está 5 veces concentrado.

106
00:08:39,660 --> 00:08:42,140
Esto es como el suavizante de la lavadora.

107
00:08:42,140 --> 00:08:43,700
Suavizante concentrado.

108
00:08:43,700 --> 00:08:47,060
De tal manera que si yo lo quiero utilizar, lo tengo que diluir.

109
00:08:47,060 --> 00:08:49,900
¿De acuerdo?

110
00:08:49,900 --> 00:08:52,820
1 por significa que el buffer ya no está diluido.

111
00:08:52,820 --> 00:08:57,340
Por tanto, si lo tengo 5 veces concentrada, lo tengo que diluir.

112
00:08:57,340 --> 00:08:58,340
¿Cuántas veces?

113
00:08:58,340 --> 00:08:59,340
Pues 5 veces.

114
00:08:59,740 --> 00:09:06,260
Si en lugar de 5 por fuera 10 por, pues tendría que hacer una dilución 1-10, 10 veces diluido,

115
00:09:06,260 --> 00:09:09,100
para que pueda funcionar bien el buffer.

116
00:09:09,100 --> 00:09:14,340
Para hacernos una idea, y que sea más sencillo, yo puedo utilizar esta fórmula que os pongo

117
00:09:14,340 --> 00:09:15,340
aquí.

118
00:09:15,340 --> 00:09:20,260
La fórmula que dice que el volumen inicial de buffer, utilizando unidades de concentración,

119
00:09:20,260 --> 00:09:26,620
¿de acuerdo?, es ni más ni menos que el volumen final del tubo, 50 microlitros que

120
00:09:26,620 --> 00:09:29,660
lo tenemos aquí, partido por el factor de concentración.

121
00:09:29,660 --> 00:09:32,420
En este caso el factor de concentración es 5.

122
00:09:32,420 --> 00:09:33,420
5 veces concentrado.

123
00:09:33,420 --> 00:09:42,340
Muy bien, los siguientes 4 reactivos los vamos a calcular siguiendo esta fórmula.

124
00:09:42,340 --> 00:09:43,420
¿Por qué?

125
00:09:43,420 --> 00:09:49,620
Porque si os dais cuenta me dan unidades de concentración y unidades de concentración.

126
00:09:49,620 --> 00:09:50,620
Inicial y final.

127
00:09:50,620 --> 00:09:56,220
Milimolar, milimolar, milimolar, micromolar, micromolar, nanomolar.

128
00:09:56,220 --> 00:10:00,860
Estas son moles litro, son unidades de concentración.

129
00:10:00,860 --> 00:10:05,980
Estos 4 reactivos los vamos a calcular con esta fórmula.

130
00:10:05,980 --> 00:10:11,300
Esta es una fórmula típica para resolver problemas de diluciones en química de toda

131
00:10:11,300 --> 00:10:12,300
la vida.

132
00:10:12,300 --> 00:10:16,020
Concentración inicial por volumen inicial es igual a concentración final por volumen

133
00:10:16,020 --> 00:10:17,020
final.

134
00:10:17,020 --> 00:10:18,020
¿De acuerdo?

135
00:10:18,020 --> 00:10:22,740
Sencillamente, como quiero calcular el volumen inicial, lo único que hago es en esta ecuación,

136
00:10:22,740 --> 00:10:27,980
ecuación sencilla de primer grado, despejo el volumen inicial.

137
00:10:27,980 --> 00:10:32,980
Y el volumen inicial es concentración final por volumen final dividido entre concentración

138
00:10:32,980 --> 00:10:33,980
inicial.

139
00:10:33,980 --> 00:10:35,380
¿De acuerdo?

140
00:10:35,380 --> 00:10:41,340
Estos 4 reactivos para calcular el volumen inicial podemos utilizar esta fórmula.

141
00:10:41,340 --> 00:10:44,580
¿Por qué puedo utilizar esta fórmula?

142
00:10:44,580 --> 00:10:46,500
Porque tengo concentración y concentración.

143
00:10:46,500 --> 00:10:48,660
¿Qué ocurre con la polimerasi del DNA?

144
00:10:48,660 --> 00:10:56,380
Si os dais cuenta, aquí tengo unidades de concentración, unidades microlitro, microgramos

145
00:10:56,380 --> 00:10:59,900
microlitro, pero aquí me piden cantidad.

146
00:10:59,900 --> 00:11:04,980
No me están diciendo una concentración final en realidad, aunque lo pongamos en esta columna,

147
00:11:04,980 --> 00:11:07,980
esto no son unidades de concentración, sino cantidad.

148
00:11:07,980 --> 00:11:12,300
Es decir, tú tienes la polimerasa a 3 unidades microlitro, pero quiero que me pongas una

149
00:11:12,300 --> 00:11:13,700
con 5 unidades.

150
00:11:13,700 --> 00:11:14,700
Eso es cantidad.

151
00:11:14,700 --> 00:11:15,700
¿En qué volumen?

152
00:11:15,740 --> 00:11:16,740
¿En qué volumen?

153
00:11:16,740 --> 00:11:17,740
Pues en el volumen final.

154
00:11:17,740 --> 00:11:18,740
Perfecto.

155
00:11:18,740 --> 00:11:22,260
Y del DNA quiero que me pongas en cada tubo 200 nanogramos.

156
00:11:22,260 --> 00:11:23,260
Eso es cantidad.

157
00:11:23,260 --> 00:11:24,260
¿De acuerdo?

158
00:11:24,260 --> 00:11:28,780
Entonces hay que calcular qué volumen tengo que coger de polimerasa y de DNA para llevarme

159
00:11:28,780 --> 00:11:31,700
esta cantidad de reactivos.

160
00:11:31,700 --> 00:11:36,300
Aquí son concentraciones, pero aquí son cantidad de reactivos.

161
00:11:36,300 --> 00:11:42,940
Para calcular el volumen inicial de estos 2 reactivos, lo más sencillo a mí me parece

162
00:11:42,940 --> 00:11:46,500
que es utilizar una regla de 3.

163
00:11:46,500 --> 00:11:50,220
Ya sabemos que cuando tenemos una relación de dos variables, si os acordáis, podemos

164
00:11:50,220 --> 00:11:53,380
establecer directamente ya una regla de 3.

165
00:11:53,380 --> 00:11:59,060
Aquí me dicen que tengo 3 unidades por microlitro, entonces el número de unidades por número

166
00:11:59,060 --> 00:12:02,780
de microgramos es el DNA en un microlitro.

167
00:12:02,780 --> 00:12:09,540
Entonces, si tengo tantas unidades en un microlitro de volumen, ¿cuántas unidades tendré en

168
00:12:09,540 --> 00:12:10,540
X?

169
00:12:10,540 --> 00:12:11,540
¿De acuerdo?

170
00:12:12,460 --> 00:12:13,460
¿Se entiende?

171
00:12:13,460 --> 00:12:18,020
Bien, pues vamos a irlos calculando uno a uno.

172
00:12:18,020 --> 00:12:19,020
Vamos a empezar por el buffer.

173
00:12:19,020 --> 00:12:23,220
El buffer hemos dicho que lo calculamos con esta fórmula sencillita.

174
00:12:23,220 --> 00:12:24,220
¿De acuerdo?

175
00:12:24,220 --> 00:12:27,980
Entonces el volumen inicial es volumen final por el factor de concentración.

176
00:12:27,980 --> 00:12:34,900
Volumen final, ya me han dicho en la PCR que son 50 microlitros entre el factor de concentración

177
00:12:34,900 --> 00:12:40,420
que es 5, está 5 veces concentrado, pues 50 entre 5, 5 microlitros.

178
00:12:40,420 --> 00:12:41,420
Ya lo he calculado.

179
00:12:41,420 --> 00:12:44,140
¿Cuánto tengo que poner en un tubo de PCR de buffer?

180
00:12:44,140 --> 00:12:47,780
5 microlitros, perfecto.

181
00:12:47,780 --> 00:12:48,780
Vamos al resto.

182
00:12:48,780 --> 00:12:54,820
Clóbulo de magnesio, hemos dicho que vamos a utilizar esta fórmula, ¿de acuerdo?

183
00:12:54,820 --> 00:12:58,900
Volumen inicial es igual a concentración final por volumen final entre la concentración

184
00:12:58,900 --> 00:12:59,900
inicial.

185
00:12:59,900 --> 00:13:03,460
Lo único que hacemos es sustituir los términos.

186
00:13:04,460 --> 00:13:10,620
La primera que tenemos, volumen inicial es igual a concentración final, 2 milimolar,

187
00:13:10,620 --> 00:13:15,100
por 50 microlitros partido por 25 milimolar.

188
00:13:15,100 --> 00:13:22,100
Importante, importante, las dos concentraciones, inicial y final, tienen que estar en las mismas

189
00:13:22,100 --> 00:13:23,100
unidades.

190
00:13:23,100 --> 00:13:27,900
En este caso coincide, por casualidad, que es la misma, milimolar y milimolar.

191
00:13:27,900 --> 00:13:28,900
¿Por qué?

192
00:13:28,900 --> 00:13:36,540
Porque necesito que una en el numerador, otra en el denominador, ambas concentraciones

193
00:13:36,540 --> 00:13:41,060
se eliminen para que me quede como unidad los microlitros, ¿de acuerdo?

194
00:13:41,060 --> 00:13:47,340
Haciendo este cálculo, 2 por 50 son 100 entre 25, 4 microlitros.

195
00:13:47,340 --> 00:13:50,980
¿Cuánto tengo que poner en un tubo de clóbulo de magnesio?

196
00:13:50,980 --> 00:13:52,900
4 microlitros, ¿de acuerdo?

197
00:13:52,900 --> 00:13:54,660
Lo mismo haríamos con los DNTPs.

198
00:13:55,660 --> 00:14:01,220
Ah, en este caso, ojo, los DNTPs están en milimolar y en micromolar.

199
00:14:01,220 --> 00:14:04,260
Tengo que pasar todo a las mismas unidades.

200
00:14:04,260 --> 00:14:08,220
Yo lo que he hecho ha sido pasar los micromolar a milimolar.

201
00:14:08,220 --> 00:14:12,300
Los 400 micromolar son 0,4 milimolar.

202
00:14:12,300 --> 00:14:17,860
Los milimolar y milimolar se eliminan y ya he calculado el volumen de DNTPs.

203
00:14:17,860 --> 00:14:18,860
Muy bien.

204
00:14:18,860 --> 00:14:20,460
Y con los primers hago lo mismo.

205
00:14:20,460 --> 00:14:23,180
En este caso es nanomolar y micromolar.

206
00:14:23,180 --> 00:14:25,380
He pasado nanomolar a micromolar.

207
00:14:25,380 --> 00:14:26,380
Podéis hacerlo al revés.

208
00:14:26,380 --> 00:14:28,500
El resultado es el mismo.

209
00:14:28,500 --> 00:14:31,700
Micromolar y micromolar se eliminan y ya tengo el volumen.

210
00:14:31,700 --> 00:14:35,660
Lo único que hago ahora es rellenar la tabla otra vez.

211
00:14:35,660 --> 00:14:39,620
Ya tenemos 4 microlitros, 2 microlitros, 1,5 y 1,5.

212
00:14:39,620 --> 00:14:45,500
Ojo, los primers hay que poner los dos de forma individual normalmente.

213
00:14:45,500 --> 00:14:51,740
Si se trata ahora de la polimerasa y del DNA, hemos dicho que los vamos a calcular siguiendo

214
00:14:52,060 --> 00:14:53,580
esta regla de 3.

215
00:14:53,580 --> 00:14:54,580
Muy sencillito.

216
00:14:54,580 --> 00:15:01,780
Por tanto, en la tag polimerasa me dicen que en el kit comercial mi tag polimerasa tengo

217
00:15:01,780 --> 00:15:07,660
3 unidades por cada microlitro y yo necesito 1,5 unidades.

218
00:15:07,660 --> 00:15:09,300
Pues ¿qué volumen necesitaré?

219
00:15:09,300 --> 00:15:10,300
X.

220
00:15:10,300 --> 00:15:11,300
¿De acuerdo?

221
00:15:11,300 --> 00:15:16,460
Pues X es igual a 1,5 por un microlitro entre 3.

222
00:15:16,460 --> 00:15:21,860
Nuevamente unidades y unidades se elimina y el resultado son 0,5 microlitros.

223
00:15:21,860 --> 00:15:23,500
¿De acuerdo?

224
00:15:23,500 --> 00:15:24,500
Muy bien.

225
00:15:24,500 --> 00:15:28,140
De la misma manera calculamos el volumen de DNA.

226
00:15:28,140 --> 00:15:30,100
2 microgramos en cada microlitro.

227
00:15:30,100 --> 00:15:35,780
Pues si yo necesito 0,2 microgramos, ojo, nuevamente tienen que estar en las mismas

228
00:15:35,780 --> 00:15:36,780
unidades.

229
00:15:36,780 --> 00:15:39,820
200 nanogramos son 0,2 microgramos.

230
00:15:39,820 --> 00:15:42,420
¿En qué volumen?

231
00:15:42,420 --> 00:15:47,220
Repetimos la operación y nos sale que de DNA tendría que poner 0,1 microlitros.

232
00:15:47,220 --> 00:15:50,940
¿De acuerdo?

233
00:15:50,940 --> 00:15:52,380
Es así de sencillo.

234
00:15:52,380 --> 00:15:54,380
Y nuevamente rellenamos la taza.

235
00:15:54,380 --> 00:15:55,380
¿De acuerdo?

236
00:15:55,380 --> 00:15:56,820
¿Nos falta algún reactivo?

237
00:15:56,820 --> 00:15:57,820
Sí.

238
00:15:57,820 --> 00:15:58,820
El agua.

239
00:15:58,820 --> 00:16:02,860
Daos cuenta que si sumamos todo esto, todos estos volúmenes, que son los volúmenes de

240
00:16:02,860 --> 00:16:06,020
reactivos, no nos da 50.

241
00:16:06,020 --> 00:16:09,260
Entonces hemos de rellenar el resto del volumen con agua.

242
00:16:09,260 --> 00:16:11,140
¿Cómo lo calculamos?

243
00:16:11,140 --> 00:16:16,500
Pues el volumen de agua, volumen inicial de agua, será el volumen final, 50, menos la

244
00:16:16,500 --> 00:16:18,260
suma de todos los reactivos.

245
00:16:18,260 --> 00:16:24,820
Es decir, 50 microlitros menos la suma del volumen de todos los reactivos, como tenemos

246
00:16:24,820 --> 00:16:25,820
aquí.

247
00:16:25,820 --> 00:16:30,260
Y esto, si yo no me he equivocado, da 35,4.

248
00:16:30,260 --> 00:16:37,140
Por tanto, de agua a cada tubo de PCR tendríamos que añadir 35,4 microlitros.

249
00:16:37,140 --> 00:16:39,140
¿De acuerdo?

250
00:16:39,140 --> 00:16:40,700
Muy bien.

251
00:16:41,260 --> 00:16:46,980
Acabamos de calcular el volumen de cada reactivo que tendríamos que poner en un tubo.

252
00:16:46,980 --> 00:16:54,780
Pero ya sabemos que nosotros hacemos una mastermix, no hacemos tubo a tubo de PCR, sino que hacemos

253
00:16:54,780 --> 00:17:03,420
una mastermix con todos los reactivos, insisto, menos el DNA, y luego repartimos el volumen,

254
00:17:03,420 --> 00:17:08,660
un volumen concreto en todos los tubos, un volumen concreto de la mastermix.

255
00:17:08,660 --> 00:17:13,540
Lo único que tengo que hacer ahora para calcular qué volumen de cada reactivo tengo que añadir

256
00:17:13,540 --> 00:17:18,940
al tubo de la mastermix, lo único que tengo que hacer es multiplicar cada uno de estos

257
00:17:18,940 --> 00:17:23,700
volúmenes iniciales por el número de tubos, 17.

258
00:17:23,700 --> 00:17:29,580
Si hago esto, pues me salen estos volúmenes, ¿de acuerdo?

259
00:17:29,580 --> 00:17:35,140
Ya he calculado todos los volúmenes de reactivos de forma individual que tengo que añadir

260
00:17:35,140 --> 00:17:37,540
en el tubo de la mastermix.

261
00:17:37,540 --> 00:17:42,140
A nivel experimental, desde un punto de vista experimental, se van añadiendo siempre al

262
00:17:42,140 --> 00:17:47,860
tubo los reactivos de mayor volumen hasta los reactivos de menor volumen.

263
00:17:47,860 --> 00:17:55,180
Entonces primero añado el agua, luego añado el buffer, el magnesio, los DNTPs, cada uno

264
00:17:55,180 --> 00:17:59,260
de los primers y luego la polimerasa, es el último reactivo que añadimos.

265
00:17:59,260 --> 00:18:01,420
Claro, ¿por qué hacemos una mastermix?

266
00:18:01,420 --> 00:18:08,740
Ahora lo veis, fijaos, si yo tengo que añadir 0,5 microlitros de la polimerasa, es más

267
00:18:08,740 --> 00:18:15,420
fácil que cometa un error de pipeteo, así tengo que añadir 8,5 microlitros, porque

268
00:18:15,420 --> 00:18:23,580
no es lo mismo añadir 0,6 microlitros o 0,4 en cada tubo que añadir 8,6 u 8,4 en un tubo

269
00:18:23,580 --> 00:18:24,580
de mastermix.

270
00:18:24,580 --> 00:18:28,460
El error es muchísimo menor, se diluye, ¿de acuerdo?

271
00:18:28,460 --> 00:18:29,460
¿Cuántas veces?

272
00:18:29,500 --> 00:18:32,540
17 veces, ¿de acuerdo?

273
00:18:32,540 --> 00:18:39,620
Entonces así ya tendríamos, bueno, ya tendríamos calculado los volúmenes de cada reactivo que

274
00:18:39,620 --> 00:18:41,420
tengo que poner en la mastermix.

275
00:18:41,420 --> 00:18:47,500
Lo único que haría ahora es calcular qué volumen de mastermix tengo que poner en cada

276
00:18:47,500 --> 00:18:55,260
uno de los 17 tubos de PCR, y eso es muy sencillo, es añadir, ¿cuál es el volumen final?

277
00:18:56,260 --> 00:19:03,220
menos el DNA, que es 0,1, a cada tubo añadiría 49,9 microlitros de mastermix, y cuando ya

278
00:19:03,220 --> 00:19:08,700
tengo la mastermix repartida en los 17 tubos, añado ya de forma individual, eso sí, el

279
00:19:08,700 --> 00:19:12,220
DNA, 0,1 microlitro de DNA a cada tubo.

280
00:19:12,220 --> 00:19:13,220
¿De acuerdo?

281
00:19:13,220 --> 00:19:20,380
Muy bien, pues este ejercicio 1 ya estaría resuelto, de una forma muy sencilla, muy fácil

282
00:19:20,380 --> 00:19:22,620
y utilizando prácticamente 3 formulitas.

283
00:19:23,380 --> 00:19:30,940
Bien, el segundo ejercicio que nos piden, es uno de los ejercicios del libro, nos dice

284
00:19:30,940 --> 00:19:37,180
que se analizan 6 muestras de PCR, imaginaos que de la muestra 2 a la muestra 6 son las

285
00:19:37,180 --> 00:19:40,900
PCR que hemos hecho a las muestras de 6 pacientes.

286
00:19:40,900 --> 00:19:46,140
La PCR se realiza con cebadores específicos que amplifican un fragmento de 250 pares

287
00:19:46,140 --> 00:19:47,140
de bases.

288
00:19:47,140 --> 00:19:52,940
Entonces si venimos al marcador de pesos moleculares, 200, 300, esta debe ser la banda

289
00:19:52,940 --> 00:20:00,900
específica que yo quiero amplificar en el DNA del paciente, pues del gen de interés

290
00:20:00,900 --> 00:20:01,900
que quiero analizar.

291
00:20:01,900 --> 00:20:08,180
Pero nos están diciendo que es una PCR múltiple, porque junto con estos cebadores específicos

292
00:20:08,180 --> 00:20:14,620
hemos añadido primers para un control positivo, de la beta globina, y amplifica un fragmento

293
00:20:14,620 --> 00:20:16,540
de 400 pares de bases.

294
00:20:16,540 --> 00:20:25,940
Si nos vamos a nuestro marcador de pesos moleculares, 400 pares de bases, esta debe de ser la banda

295
00:20:25,940 --> 00:20:26,940
del control positivo.

296
00:20:26,940 --> 00:20:33,220
Dice que finalizada la reacción, hemos corrido este gel de electroforesis, junto con el marcador

297
00:20:33,220 --> 00:20:39,420
de pesos moleculares, y nos piden que indiquemos el resultado de cada muestra, individualmente

298
00:20:39,420 --> 00:20:42,980
y que apazanemos, por supuesto, la respuesta.

299
00:20:43,340 --> 00:20:48,420
Entonces, como es una PCR múltiple, lo primero en que me tengo que fijar es en el control

300
00:20:48,420 --> 00:20:49,420
positivo.

301
00:20:49,420 --> 00:20:50,420
¿De acuerdo?

302
00:20:50,420 --> 00:20:52,540
¿Dónde está la banda del control positivo?

303
00:20:52,540 --> 00:20:55,340
Pues la banda del control positivo es esta.

304
00:20:55,340 --> 00:21:01,340
Por tanto, lo primero que hago es, en todas las muestras, me fijo en esta región.

305
00:21:01,340 --> 00:21:02,980
¿Por qué?

306
00:21:02,980 --> 00:21:06,620
Porque es la región donde tiene que aparecer la banda del control positivo.

307
00:21:06,620 --> 00:21:08,180
Este es el primer paso.

308
00:21:08,180 --> 00:21:10,220
¿De acuerdo?

309
00:21:10,220 --> 00:21:11,220
Bien.

310
00:21:11,460 --> 00:21:13,420
¿Qué indica el control positivo?

311
00:21:13,420 --> 00:21:16,620
Si observo banda, la PCR es fiable.

312
00:21:16,620 --> 00:21:19,340
Si no observo banda, la PCR no es fiable.

313
00:21:19,340 --> 00:21:24,500
Por tanto, si os dais cuenta, solo hay tres de las seis muestras que van a ser fiables.

314
00:21:24,500 --> 00:21:31,620
De tal manera que ya de entrada, yo podría decir, mira, de esta no me fío, de esta no

315
00:21:31,620 --> 00:21:36,100
me fío, de esta tampoco me fío, ¿por qué?

316
00:21:36,100 --> 00:21:42,300
Porque no amplifica el control positivo y de esta no me fío tampoco.

317
00:21:42,300 --> 00:21:50,420
Ahora vamos a analizar en detalle estas tres, la 2, la 3 y la 6, ¿me explico?

318
00:21:50,420 --> 00:21:51,420
Muy bien.

319
00:21:51,420 --> 00:21:52,420
Vamos con la primera.

320
00:21:52,420 --> 00:21:53,420
La muestra 2.

321
00:21:53,420 --> 00:21:54,420
¿Es una PCR fiable?

322
00:21:54,420 --> 00:21:56,460
Sí, porque tiene banda de control positivo.

323
00:21:56,460 --> 00:21:57,460
Muy bien.

324
00:21:57,460 --> 00:21:58,460
¿Cuál es el resultado?

325
00:21:58,460 --> 00:22:00,740
¿Tiene la banda específica?

326
00:22:00,740 --> 00:22:08,620
Sí, el paciente 1 que hemos corrido en el carril 2 es un paciente positivo, ¿de acuerdo?

327
00:22:08,620 --> 00:22:13,900
No sabemos muy bien a qué gen es, pero bueno, es positivo, es una PCR.

328
00:22:13,900 --> 00:22:19,620
Diríamos, la muestra del paciente 1 es una muestra, la PCR es fiable y ha salido positiva.

329
00:22:19,620 --> 00:22:22,500
¿Sí?

330
00:22:22,500 --> 00:22:27,580
Vamos al 6, el ejemplo opuesto.

331
00:22:27,580 --> 00:22:28,580
El ejemplo opuesto.

332
00:22:28,580 --> 00:22:30,580
¿Es una PCR fiable?

333
00:22:30,580 --> 00:22:31,580
Sí.

334
00:22:31,580 --> 00:22:32,580
¿Me creo los resultados?

335
00:22:32,580 --> 00:22:33,580
Sí.

336
00:22:33,580 --> 00:22:34,580
¿Qué ha pasado?

337
00:22:34,580 --> 00:22:35,580
No hay banda.

338
00:22:35,580 --> 00:22:39,180
Por tanto, el paciente 6 es un paciente negativo, ¿de acuerdo?

339
00:22:39,180 --> 00:22:41,380
Y lo informaríamos al facultativo.

340
00:22:41,380 --> 00:22:46,180
Este paciente es negativo, en realidad es el paciente 5, aunque esté en el carril 6.

341
00:22:46,180 --> 00:22:48,460
¿El paciente 3?

342
00:22:48,460 --> 00:22:51,980
Pues el paciente 3 es positivo también.

343
00:22:51,980 --> 00:22:54,740
Ay, ¿y esta banda de aquí qué es?

344
00:22:54,900 --> 00:23:01,740
Bueno, pues esta banda de aquí, cuando aparece en una PCR una banda por debajo de la banda

345
00:23:01,740 --> 00:23:07,420
de 100 pares de bases, esto de aquí son dimeros de primers, es decir, los primers han hibridado

346
00:23:07,420 --> 00:23:15,860
unos con otros y forman una banda, normalmente entre 50-75 pares de bases, ¿de acuerdo?

347
00:23:15,860 --> 00:23:19,820
Y siempre aparece eso, por debajo de 100 pares de bases.

348
00:23:19,820 --> 00:23:24,260
Es una banda, si miráis las soluciones del libro, nos dicen que habría que descartarla

349
00:23:24,260 --> 00:23:25,260
o repetirla.

350
00:23:25,260 --> 00:23:31,900
En la práctica, en la clínica, esta muestra se da por buena, porque es muy fácil que

351
00:23:31,900 --> 00:23:36,180
los primers formen dimeros y en el gel de electroforesis los veamos como una banda tenue

352
00:23:36,180 --> 00:23:37,180
al fondo.

353
00:23:37,180 --> 00:23:41,820
Esto no es inespecificidad, esta banda no es inespecífica, ¿de acuerdo?

354
00:23:41,820 --> 00:23:46,780
Es sencillamente que los primers forman dimeros y se ven aquí abajo.

355
00:23:46,780 --> 00:23:50,860
Por tanto, aunque teóricamente habría que repetirla, en la práctica nunca se repite

356
00:23:50,860 --> 00:23:51,860
y se da por buena.

357
00:23:52,020 --> 00:23:56,580
Por tanto, el paciente 2, que hemos corrido su muestra en el carril 3, nos da una PCR

358
00:23:56,580 --> 00:24:03,740
fiable y además es positivo para el gen que estamos analizando.

359
00:24:03,740 --> 00:24:04,740
¿De acuerdo?

360
00:24:04,740 --> 00:24:08,420
¿Qué podríamos decir en el, por ejemplo, el paciente 5, que es muy fácil también?

361
00:24:08,420 --> 00:24:09,420
¡Uy!

362
00:24:09,420 --> 00:24:10,420
No ha amplificado nada.

363
00:24:10,420 --> 00:24:15,940
Esta, por supuesto, hay que repetirla, pero ¿qué puede haber pasado?

364
00:24:15,940 --> 00:24:21,180
Seguramente hemos puesto la Mastermix en todos los tubos, luego hemos ido añadiendo, hemos

365
00:24:21,180 --> 00:24:26,540
ido añadiendo los DNAs individualmente en cada tubo y como normalmente tenemos muchas

366
00:24:26,540 --> 00:24:30,860
muestras en este paciente, es posible que se nos haya olvidado poner el DNA, porque

367
00:24:30,860 --> 00:24:32,540
ha salido como un control negativo.

368
00:24:32,540 --> 00:24:38,100
Entonces, esta habría que repetirla, el paciente 4, carril 5, habría que repetirla asegurándonos

369
00:24:38,100 --> 00:24:39,100
de poner DNA.

370
00:24:39,100 --> 00:24:41,860
¿De acuerdo?

371
00:24:41,860 --> 00:24:45,300
El paciente 4, bueno, pues tenemos bandas inespecíficas.

372
00:24:45,300 --> 00:24:48,980
Esta no es fiable, ni mucho menos, habría que repetirla, pero como hay tantas bandas

373
00:24:48,980 --> 00:24:56,260
inespecíficas y ni siquiera el control positivo aparece, aquí hay que ir un poquito a un

374
00:24:56,260 --> 00:24:58,780
estamento superior, hay que analizar el DNA.

375
00:24:58,780 --> 00:25:03,860
Entonces, es posible que el DNA tenga contaminantes o inhibidores de la… habría que ver qué

376
00:25:03,860 --> 00:25:04,860
es lo que está pasando.

377
00:25:04,860 --> 00:25:11,080
Nuevamente, pues habría que volver a… habría que ver las absorbancias otra vez, cómo salen,

378
00:25:11,080 --> 00:25:15,380
si hay contaminantes, no hay contaminantes y es posible que hubiese o bien que tirar

379
00:25:15,380 --> 00:25:20,260
la muestra y volver a purificarla o a lo mejor purificarlo por otro método.

380
00:25:20,260 --> 00:25:21,980
¿De acuerdo?

381
00:25:21,980 --> 00:25:25,780
Y es algo parecido al 7.

382
00:25:25,780 --> 00:25:30,620
Sin embargo, el 7, fijaos, si os dais cuenta, el 7 es como el 3, pero no es fiable porque

383
00:25:30,620 --> 00:25:32,620
no ha amplificado el control positivo.

384
00:25:32,620 --> 00:25:34,100
Aquí en esta muestra ha pasado algo.

385
00:25:34,100 --> 00:25:37,940
La muestra del paciente 6, carril 7, algo ha pasado.

386
00:25:37,940 --> 00:25:41,780
Diríamos que es positiva porque tiene lavanda y además hay dímeros de primers que tampoco

387
00:25:41,780 --> 00:25:46,820
nos importan mucho, pero como no tiene control positivo, hay que repetirla.

388
00:25:46,820 --> 00:25:55,380
Por tanto, la muestra 2, la muestra 3, son positivos y son PCR fiables.

389
00:25:55,380 --> 00:26:01,660
La muestra 6 es negativo, un paciente negativo, bueno, sería el paciente 5, es un paciente

390
00:26:01,660 --> 00:26:04,700
negativo y es una PCR fiable.

391
00:26:04,700 --> 00:26:11,140
La PCR 5, del carril 5, esta hay que repetirla, asegurándonos de poner DNA.

392
00:26:11,180 --> 00:26:16,460
La del 4, la que se ha corrido aquí, la muestra del paciente 3, esta hay que analizar el DNA,

393
00:26:16,460 --> 00:26:17,460
a ver qué le pasa.

394
00:26:17,460 --> 00:26:23,460
Y la del 7 habría que repetirla, habría que repetirla a ver qué es lo que ha pasado

395
00:26:23,460 --> 00:26:24,460
con el control positivo.

396
00:26:24,460 --> 00:26:28,580
Si ya no sale otra vez el control positivo, entonces habría que ver cómo está suena.

397
00:26:28,580 --> 00:26:29,580
¿De acuerdo?

398
00:26:29,580 --> 00:26:30,580
Entonces, así.

399
00:26:30,580 --> 00:26:37,140
Brevemente ya hemos visto cómo se resuelven estos problemas de MasterMix y algún problema

400
00:26:37,140 --> 00:26:42,300
de estos de PCR, en este caso es un ejemplo de PCR múltiple.

401
00:26:42,300 --> 00:26:43,300
¿De acuerdo?

402
00:26:43,300 --> 00:26:50,020
Pues venga, con esto ya podéis resolver el resto de problemas de las hojas de ejercicio.

403
00:26:50,020 --> 00:26:53,020
Si tenéis alguna duda, pues me vais preguntando, ¿de acuerdo?

404
00:26:53,020 --> 00:26:53,540
Venga.