1 00:00:00,000 --> 00:00:16,600 Vale, pues continuamos con el tema de proteínas. Bien, vamos a repasar primero un poco lo que 2 00:00:46,600 --> 00:01:03,160 hemos visto ya, que son las estructuras de las proteínas. Bueno, me oís, ¿verdad? 3 00:01:03,160 --> 00:01:16,200 Sí, Susana. Gracias. Vale, como las proteínas están formadas 4 00:01:16,200 --> 00:01:24,240 por aminoácidos, la unión de esos aminoácidos da lugar, o sea, esos aminoácidos están 5 00:01:24,240 --> 00:01:31,240 unidos por enlaces peptídicos, son enlaces de amidas, y esas uniones de aminoácidos 6 00:01:31,240 --> 00:01:38,400 van a dar lugar a la estructura primaria. Ya vimos como si hay un cambio en algún aminoácido, 7 00:01:38,400 --> 00:01:43,840 esa estructura primaria va a cambiar y por lo tanto va a cambiar también la función 8 00:01:43,840 --> 00:01:50,920 de la proteína. Y esa estructura primaria es la que va a determinar cómo va a ser la 9 00:01:50,920 --> 00:01:56,600 estructura secundaria, ¿os acordáis de alfa hélice? La hélice de colágeno que era parecida 10 00:01:56,600 --> 00:02:02,640 al alfa hélice y la conformación beta. Y después estaba la estructura terciaria 11 00:02:02,640 --> 00:02:10,160 que se forma a partir de esta estructura secundaria, y de estructuras terciarias teníamos las proteínas 12 00:02:10,160 --> 00:02:17,960 filamentosas o fibrosas que están formadas por una única estructura secundaria. Y después 13 00:02:17,960 --> 00:02:25,360 teníamos las proteínas globulares que están formadas por varias de las estructuras secundarias, 14 00:02:25,360 --> 00:02:32,120 y las proteínas globulares son esféricas y en concreto vimos unas proteínas globulares 15 00:02:32,120 --> 00:02:38,800 que eran las enzimas, que son unas proteínas globulares muy importantes, ¿os acordáis 16 00:02:38,800 --> 00:02:44,160 que eran biocatalizadores? Porque catalizaban reacciones químicas que tienen lugar en la 17 00:02:44,160 --> 00:02:55,320 célula, y bueno, sin enzimas la vida no existiría. Y por último teníamos la estructura cuaternaria 18 00:02:55,320 --> 00:03:00,720 que dijimos también que no la tenían todas las proteínas, solamente algunas, y eran 19 00:03:00,720 --> 00:03:11,960 uniones de varios péptidos. Y después continuamos con, una vez que ya sabemos cómo están formadas 20 00:03:11,960 --> 00:03:18,560 las proteínas, también vimos cómo de la célula tenemos que extraer solamente la parte 21 00:03:18,560 --> 00:03:24,360 que sea que corresponda a las proteínas, porque en las células vamos a tener lípidos, 22 00:03:24,360 --> 00:03:31,600 vamos a tener hidratos de carbono, vamos a tener ácido nucleico, pues de esa célula 23 00:03:31,600 --> 00:03:40,480 tenemos que extraer lo que solamente sea proteínas. Y vimos cómo hacíamos esto, que se podía 24 00:03:40,480 --> 00:03:48,120 hacer por lisis celular, esto si os acordáis era por choque osmótico, lo que hacíamos 25 00:03:48,240 --> 00:03:58,560 era poner la célula en una disolución más diluida y entonces el agua penetra en la célula, 26 00:03:58,560 --> 00:04:09,960 la célula se hincha y se rompe la célula. Y después teníamos la destrucción mecánica, 27 00:04:09,960 --> 00:04:20,640 la destrucción mecánica que se hacía simplemente con un mortero con arena o se podía hacer 28 00:04:20,640 --> 00:04:31,520 también por sonicación, aplicando ultrasonidos a las células o con un molino de perlas de 29 00:04:31,520 --> 00:04:39,680 vidrio. Y por último teníamos la descongelación, que consistía en enfriar las células a menos 30 00:04:40,000 --> 00:04:47,960 196 grados con nitrógeno líquido y después subir a 25 grados centígrados muy rápido, 31 00:04:47,960 --> 00:04:58,200 de forma rápida y así también podemos obtener el extracto proteico. Y el último día vimos 32 00:04:58,200 --> 00:05:04,960 también cómo se cuantifica, nosotros ya tenemos el extracto proteico, pues vamos a ver ahora qué 33 00:05:04,960 --> 00:05:13,040 cantidad de proteínas tenemos en nuestra muestra. Y esto se podía hacer de tres formas, 34 00:05:13,040 --> 00:05:28,560 con tres técnicas diferentes. Vamos a ver aquí la cuantificación. Entonces había tres formas 35 00:05:28,560 --> 00:05:36,400 diferentes, una de ellas era, nos basábamos en que las propias proteínas absorben luz ultravioleta, 36 00:05:36,400 --> 00:05:43,560 pues bueno, hoy he añadido esta diapositiva para que veáis un poco cómo se hace. Aquí 37 00:05:43,560 --> 00:05:51,320 tendríamos una cubeta, esto se llama cubeta, este envase, esto sería una cubeta y aquí 38 00:05:51,320 --> 00:05:57,640 pondríamos nuestra disolución de proteína. Entonces aplicamos una radiación ultravioleta 39 00:05:57,640 --> 00:06:04,760 visible, dependiendo de la longitud de onda que necesitemos. O sea, aplicamos una radiación 40 00:06:04,760 --> 00:06:10,880 y las proteínas van a absorber parte de esa radiación y entonces vamos a detectar la 41 00:06:10,880 --> 00:06:18,240 radiación transmitida que va a ser menor. Y eso es lo que detectamos en el espectrofotómetro. 42 00:06:19,240 --> 00:06:24,840 Vale, entonces, si os acordáis el otro día lo que hacíamos era, bueno, por una parte 43 00:06:24,840 --> 00:06:35,680 el primer método, que es el método en el que se mide la absorbancia de las proteínas tal cual, 44 00:06:35,680 --> 00:06:47,200 las proteínas absorben a 280 nanómetros y medimos en el espectrofotómetro las proteínas directamente, 45 00:06:47,200 --> 00:06:52,640 simplemente disolviendo las proteínas se miden. Y luego teníamos los otros dos métodos que era 46 00:06:52,640 --> 00:07:02,120 el método de Lowry y el método de Bradford, el método de Lowry. En el método de Lowry lo que 47 00:07:02,120 --> 00:07:08,840 hacíamos era dos reacciones seguidas. En la primera reacción mezclábamos las proteínas con 48 00:07:08,840 --> 00:07:15,240 iones de cobre, el medio alcalino, y entonces se nos formaba este compuesto de aquí. El cobre se 49 00:07:15,240 --> 00:07:20,640 queda aquí en medio. Esta sería una cadena de proteína, otra cadena de proteína. El cobre se 50 00:07:20,640 --> 00:07:27,720 queda aquí en medio. Esta sería la primera reacción. Y la segunda reacción sería añadir el reactivo 51 00:07:27,720 --> 00:07:33,440 de Follin, que es este de aquí, el reactivo de Follin. Entonces, el reactivo de Follin reacciona 52 00:07:33,440 --> 00:07:42,560 con los OHs de los aminoácidos que tengan estos OHs. El reactivo de Follin se reduce y se forma 53 00:07:42,560 --> 00:07:51,240 un compuesto de color azul. Pues la idea es que nosotros preparamos distintas disoluciones de 54 00:07:51,240 --> 00:07:58,200 concentración conocida de proteínas. Aquí vamos a poner una concentración conocida de proteínas. 55 00:07:58,200 --> 00:08:06,600 Y hacemos esta reacción. Le añadimos el reactivo de Follin. Cuanto más color azul nos aparezca, 56 00:08:06,760 --> 00:08:14,640 esto significará que hay más cantidad de proteínas. Entonces, lo que hacemos es medir en el 57 00:08:14,640 --> 00:08:21,280 espectrofotómetro, medimos cuánto absorben todas estas proteínas que tenemos aquí en distintas 58 00:08:21,280 --> 00:08:29,720 concentraciones y realizamos la recta. La recta que sería, bueno, aquí este es el método de Bradford, 59 00:08:29,720 --> 00:08:35,320 pero lo que es la recta es lo mismo. Haríamos una recta en la que vamos representando la 60 00:08:35,320 --> 00:08:41,280 concentración de proteína conocida frente a la absorbancia que nos ha dado en el ultravioleta. 61 00:08:41,280 --> 00:08:47,280 La otra concentración de proteína frente a la absorbancia. Otra concentración de proteína frente 62 00:08:47,280 --> 00:08:53,680 a la absorbancia. Y así hacemos la recta que la ajustamos por mínimos cuadrados. Hacemos esta 63 00:08:53,680 --> 00:09:01,640 recta y cuando midamos en el espectrofotómetro nuestra muestra, pues vamos a medir la absorbancia 64 00:09:01,640 --> 00:09:09,320 de nuestra muestra. Por ejemplo, si la absorbancia nos sale 0,3, vamos a interpolar en la recta y 65 00:09:09,320 --> 00:09:17,000 vamos a saber qué concentración tenemos de nuestra proteína. Entonces, en el método de Lowry, 66 00:09:17,000 --> 00:09:22,920 lo que os decía, se añade el reactivo de Follin y en el método de Bradford lo que se añade es 67 00:09:22,920 --> 00:09:30,840 un colorante que es el azul de coma sí, que este colorante es de color rojo y cuando se adhiere a 68 00:09:30,840 --> 00:09:40,240 la proteína cambia a color azul y cambia también el máximo de absorción que es de 465 a 595. 69 00:09:40,240 --> 00:09:48,000 Entonces, lo que haríamos sería eso, añadir a cada disolución de proteína de concentración 70 00:09:48,000 --> 00:09:54,960 conocida le añadimos reactivo, en este caso reactivo de Bradford. Vamos, añadimos reactivo 71 00:09:54,960 --> 00:10:01,480 de Bradford, cuanto más color azul se nos forme, más cantidad de proteína tenemos en nuestra muestra. 72 00:10:01,480 --> 00:10:07,720 Entonces, medimos en el espectrofotómetro ultravioleta visible, medimos la absorción de 73 00:10:07,720 --> 00:10:14,560 cada una de nuestras disoluciones patrón y luego medimos, o sea, hacemos la representación, 74 00:10:14,560 --> 00:10:22,960 medimos nuestra muestra, la absorbancia y la interpolamos y sacamos la cantidad de proteína. 75 00:10:22,960 --> 00:10:31,400 Entonces, el método de Bradford, esta sería nuestra proteína, le añadimos el azul de coma sí, 76 00:10:31,400 --> 00:10:39,920 preparamos varias disoluciones patrón de concentración conocida y la medimos en el espectrofotómetro. 77 00:10:41,920 --> 00:10:50,360 Bueno, no sé si esto queda clara la cuantificación, no sé si tenéis alguna duda de esto. 78 00:10:52,960 --> 00:10:55,960 Si no, pues, seguimos. 79 00:11:00,560 --> 00:11:08,960 Vale, pues entonces, eso sería la cuantificación de las proteínas, para saber cuánta proteína tenemos en total en nuestra muestra. 80 00:11:08,960 --> 00:11:16,760 Y ahora, una vez que ya tenemos la cantidad, que ya sabemos la cantidad de proteínas 81 00:11:16,760 --> 00:11:22,480 y tenemos las proteínas separadas del resto de componentes de la célula, 82 00:11:22,480 --> 00:11:27,480 lo que queremos hacer es purificar estas proteínas. 83 00:11:27,480 --> 00:11:36,080 Entonces, para purificar y separar estas proteínas, lo que tenemos son tres formas. 84 00:11:36,080 --> 00:11:39,480 Voy a volver a la, aquí la tenemos. 85 00:11:39,480 --> 00:11:46,480 Tenemos tres formas de separar y de purificar el extracto proteico que hemos obtenido. 86 00:11:46,480 --> 00:11:54,480 Una es la diálisis, otra forma es la cromatografía y la última sería la electroforesis. 87 00:11:54,480 --> 00:11:57,480 Pues vamos a empezar por la diálisis. 88 00:12:00,480 --> 00:12:09,480 Vale, pues la diálisis es un proceso en el que separamos las moléculas de una disolución 89 00:12:09,480 --> 00:12:16,480 y nos basamos en la diferencia de sus índices de difusión a través de una membrana semipermeable. 90 00:12:16,480 --> 00:12:27,480 Entonces, qué importante, pues separamos moléculas y a través de, nos basamos en la difusión de esas moléculas a través de una membrana semipermeable. 91 00:12:27,480 --> 00:12:40,480 Entonces, esta técnica se utiliza de forma habitual en el laboratorio y el principio es parecido al de la diálisis médica. 92 00:12:40,480 --> 00:12:51,480 Entonces, lo que tenemos es una disolución en la que vamos a tener nuestras moléculas. 93 00:12:51,480 --> 00:12:57,480 Las moléculas que van a tener diferente tamaño, diferente masa molecular. 94 00:12:57,480 --> 00:13:13,480 Y esta disolución de nuestras moléculas se introduce en un bolso o saco, que sería esto de aquí, un bolso semipermeable que suele ser de celulosa. 95 00:13:13,480 --> 00:13:19,480 Y este bolso semipermeable tiene unos poros. 96 00:13:20,480 --> 00:13:31,480 Entonces, este bolso se coloca en un envase en el que tenemos una disolución de concentración diferente, que sería esto de aquí azul. 97 00:13:31,480 --> 00:13:38,480 Puede ser una disolución que esté más concentrada o menos concentrada que la del interior. 98 00:13:39,480 --> 00:13:54,480 Si la disolución está menos concentrada, las moléculas pequeñas, estas de aquí verdes, van a pasar a través de los poros de la membrana y van a salir de esa membrana. 99 00:13:54,480 --> 00:13:58,480 Aquí tenemos ya todas las moléculas más pequeñas. 100 00:13:58,480 --> 00:14:17,480 Y en cambio, las moléculas más grandes, como podrían ser, por ejemplo, si tuviéramos proteínas o ácido nucleico o polisacáridos, las moléculas más grandes se van a quedar en el interior del saco o del bolso. 101 00:14:18,480 --> 00:14:27,480 Entonces, la dirección de las moléculas es hacia la disolución de concentración más baja. 102 00:14:27,480 --> 00:14:37,480 Por eso, en este caso, como en la parte de fuera tenemos una disolución de menor concentración, las moléculas más pequeñas salen hacia afuera. 103 00:14:38,480 --> 00:14:52,480 Entonces, una de las utilidades de la diálisis es para purificar las proteínas, para eliminar las sales de las proteínas, se utiliza esta técnica de diálisis. 104 00:14:52,480 --> 00:15:02,480 También tenemos otras técnicas que solamente las vamos a citar, que serían la ultrafiltración y la centrifugación. 105 00:15:02,480 --> 00:15:18,480 La centrifugación es hacer girar nuestra disolución a una velocidad muy alta y por la fuerza centrífuga el sólido precipita abajo de la disolución. 106 00:15:18,480 --> 00:15:26,480 Y luego la ultrafiltración es parecido a la diálisis, lo que pasa es que las membranas son de tamaño de poro muy, muy, muy reducido. 107 00:15:26,480 --> 00:15:31,480 Entonces, se necesita presión para que esas moléculas pequeñas salgan. 108 00:15:31,480 --> 00:15:37,480 O sea, que la ultrafiltración, aparte de que tiene baja la disolución, tiene baja la concentración. 109 00:15:37,480 --> 00:15:38,480 Sí. 110 00:15:38,480 --> 00:15:43,480 También, aparte, hay cambios de presión, dice usted. 111 00:15:43,480 --> 00:15:51,480 Sí, eso es. Como los poros son muy, muy pequeños, la ultrafiltración es una variedad de diálisis. 112 00:15:51,480 --> 00:15:56,480 Lo que pasa, entonces, es que la membrana semipermeable tiene unos poros muy, muy, muy pequeños. 113 00:15:56,480 --> 00:16:06,480 Entonces, para conseguir que esas moléculas pequeñas salgan de dentro, aparte de que por fuera tengamos una disolución menos concentrada, 114 00:16:06,480 --> 00:16:11,480 también hay que aplicar ahí presión para que salgan las moléculas más pequeñas. 115 00:16:11,480 --> 00:16:16,480 Porque los poros que hay aquí en la membrana semipermeable son muy, muy pequeños. 116 00:16:16,480 --> 00:16:18,480 No sé si te he respondido. 117 00:16:18,480 --> 00:16:20,480 Sí, sí, sí, gracias. 118 00:16:20,480 --> 00:16:21,480 Vale. 119 00:16:25,480 --> 00:16:28,480 Bueno, pues aquí tenéis una autoevaluación. 120 00:16:28,480 --> 00:16:34,480 En la página 21, que aquí no la he puesto, pero yo os la digo. 121 00:16:34,480 --> 00:16:40,480 En el proceso de diálisis, la mezcla a purificar se coloca en un bolso, 122 00:16:40,480 --> 00:16:45,480 o saco, y se introduce en una disolución de muy baja concentración, salina. 123 00:16:45,480 --> 00:16:48,480 ¿Qué ocurre con las proteínas en el proceso? 124 00:16:48,480 --> 00:16:51,480 Y entonces nos da dos respuestas. 125 00:16:51,480 --> 00:16:57,480 Una nos dice, no son capaces de atravesar la membrana, quedando retenidas en el interior del saco. 126 00:16:57,480 --> 00:17:04,480 Y la segunda es, salen difundidas al exterior, quedando en el interior del saco. 127 00:17:04,480 --> 00:17:11,480 Y la segunda es, salen difundidas al exterior, quedando otros residuos en el interior. 128 00:17:14,480 --> 00:17:16,480 A ver, pensadlo un poco. 129 00:17:23,480 --> 00:17:25,480 Vale, ¿sabríais cuál es? 130 00:17:27,480 --> 00:17:32,480 Las proteínas quedarían dentro, porque hablamos de que las partículas son las que van a salir 131 00:17:32,480 --> 00:17:36,480 y las proteínas son las que van a quedar adentro, porque son de mayor peso, ¿no? 132 00:17:36,480 --> 00:17:42,480 Eso es, como son más grandes, son de mayor masa molecular, las proteínas quedan dentro. 133 00:17:42,480 --> 00:17:47,480 Las proteínas, los ácidos nucleicos, los polisacláridos, las moléculas que son más pequeñas, 134 00:17:47,480 --> 00:17:53,480 salen al exterior, a la parte de la disolución más diluida. 135 00:17:54,480 --> 00:18:05,480 Bien, pues, otra de las técnicas que hemos visto para fraccionar o separar las proteínas 136 00:18:05,480 --> 00:18:09,480 que hemos aislado de nuestra célula es la cromatografía. 137 00:18:11,480 --> 00:18:14,480 Vale, pues, vamos a ver qué es la cromatografía. 138 00:18:24,480 --> 00:18:33,480 Bueno, pues, la cromatografía es el método con el que se denomina un conjunto de métodos analíticos 139 00:18:33,480 --> 00:18:36,480 para separar los componentes de una muestra. 140 00:18:36,480 --> 00:18:42,480 Entonces, mediante la cromatografía podemos separar análitos que sean muy parecidos entre sí 141 00:18:42,480 --> 00:18:45,480 en cuanto a sus propiedades físico-químicas. 142 00:18:45,480 --> 00:18:50,480 Por ejemplo, podemos separar mezclas de aminoácidos o mezclas de proteínas. 143 00:18:50,480 --> 00:18:54,480 También mezclas de ácidos grasos, pigmentos, pesticidas, ¿vale? 144 00:18:54,480 --> 00:19:00,480 Pero lo que nos interesa a nosotros es separar o aminoácidos o mezclas de proteínas. 145 00:19:02,480 --> 00:19:05,480 Pues, vamos a ver qué es la cromatografía. 146 00:19:05,480 --> 00:19:11,480 Bueno, ya hemos visto que se utiliza para separar y purificar proteínas. 147 00:19:12,480 --> 00:19:20,480 Bueno, pues, la primera vez que se utilizó la cromatografía se utilizó para separar pigmentos vegetales. 148 00:19:20,480 --> 00:19:31,480 Se utilizó un extracto de hojas y entonces lo hizo este científico, Schwedt, en 1903. 149 00:19:31,480 --> 00:19:44,480 Entonces, puso un extracto de hojas y lo hizo pasar a través de una fase que llamó fase estacionaria 150 00:19:44,480 --> 00:19:51,480 que sería esto de aquí en gris y esto de aquí en negro sería la muestra, la mezcla de pigmentos. 151 00:19:51,480 --> 00:19:56,480 Y entonces, ¿cómo hizo pasar esa muestra a través de esta fase estacionaria? 152 00:19:56,480 --> 00:19:59,480 Esta fase estacionaria sería un sólido. 153 00:19:59,480 --> 00:20:06,480 Pues, hizo pasar la muestra mediante una mezcla de disolventes. 154 00:20:06,480 --> 00:20:11,480 Entonces, la muestra fue pasando a través de, esto sería una columna, esto de aquí. 155 00:20:11,480 --> 00:20:24,480 La muestra va pasando a través de la fase estacionaria y los componentes de la muestra van reaccionando o uniéndose a la fase estacionaria. 156 00:20:24,480 --> 00:20:28,480 Van pasando unos más rápidos que otros. 157 00:20:28,480 --> 00:20:31,480 Si os fijáis aquí ya la muestra empieza a separarse. 158 00:20:31,480 --> 00:20:36,480 Aquí empieza ya un poquito el rojo, aquí una parte negra y aquí una verde. 159 00:20:36,480 --> 00:20:42,480 Entonces, la muestra según va pasando a través de la fase estacionaria se va separando 160 00:20:42,480 --> 00:20:52,480 y esa muestra, que en este caso sería una mezcla de, o sea, el extracto de hojas, se van separando sus pigmentos. 161 00:20:52,480 --> 00:21:02,480 Primero aparece el pigmento de color rojo, después aparecería el pigmento de color gris, negro y por último aparecería el pigmento de color verde. 162 00:21:02,480 --> 00:21:06,480 Por eso se dice que es una técnica de separación. 163 00:21:06,480 --> 00:21:11,480 Porque aquí tenemos nuestra muestra del extracto de hojas. 164 00:21:11,480 --> 00:21:16,480 Lo hacemos pasar a través de una fase estacionaria. 165 00:21:17,480 --> 00:21:24,480 Aquí tendríamos, bueno, puede ser un sólido, puede ser un líquido, puede ser un gas, pero en este caso imaginaos que esto es un sólido. 166 00:21:24,480 --> 00:21:35,480 Va pasando nuestra muestra y para que atraviese nuestra muestra a través de la fase estacionaria necesitamos una fase que se llama fase móvil. 167 00:21:35,480 --> 00:21:41,480 Y esta fase móvil es una mezcla de disolventes que vamos a añadir aquí. 168 00:21:41,480 --> 00:21:53,480 Y así, según los pigmentos se van adhiriendo un poco más, un poco menos a la fase estacionaria, pues se van separando. 169 00:21:53,480 --> 00:21:57,480 Y así podemos obtener los tres pigmentos separados. 170 00:21:57,480 --> 00:22:05,480 Este sería, así a grandes riesgos, lo que es el método de cromatografía. 171 00:22:06,480 --> 00:22:18,480 Cuando se descubrió que se obtenían pigmentos de diferentes colores, pues por eso se dice que el término cromatografía viene del griego. 172 00:22:18,480 --> 00:22:26,480 El color, el cromato significa color y de ahí viene cromatografía. 173 00:22:26,480 --> 00:22:31,480 Entonces lo importante es eso, que tenemos una fase estacionaria. 174 00:22:31,480 --> 00:22:36,480 Esto sí que lo tenéis que saber, una fase estacionaria y una fase móvil. 175 00:22:36,480 --> 00:22:42,480 Y esta fase móvil es la que va a arrastrar a la muestra a través de la fase estacionaria. 176 00:22:42,480 --> 00:22:49,480 Y que de esta forma vamos a obtener los componentes de nuestra muestra de forma separada. 177 00:22:52,480 --> 00:22:56,480 ¿Y en la fase estacionaria qué es? ¿Un líquido? 178 00:22:56,480 --> 00:23:04,480 La fase estacionaria es que puede ser un sólido, puede ser un líquido, sólido o líquido. 179 00:23:04,480 --> 00:23:10,480 Entonces la fase estacionaria, esto los que estudiéis análisis instrumental lo vais a ver con más detenimiento. 180 00:23:10,480 --> 00:23:18,480 Y ahora en las próximas, ahora vamos a ver algún tipo de cromatografía y ya vamos a ver algún ejemplo. 181 00:23:18,480 --> 00:23:20,480 Vale, gracias. 182 00:23:20,480 --> 00:23:31,480 Entonces mirad, hay dos vídeos del CSIC que son igual un poco infantiles, pero para que os hagáis una idea. 183 00:23:31,480 --> 00:23:37,480 Aunque esto solo tiene música, o sea que no nos importa que no se escuche. 184 00:23:37,480 --> 00:23:40,480 A ver si lo pongo así. 185 00:23:51,480 --> 00:23:54,480 Pues no se escucha nada. 186 00:24:05,480 --> 00:24:08,480 Bueno, parece que no va, pero a ver si lo puedo poner. 187 00:24:16,480 --> 00:24:18,480 Aquí está. 188 00:24:21,480 --> 00:24:23,480 Vale, ¿lo veis? 189 00:24:24,480 --> 00:24:26,480 Ah, pero no se ve entero. 190 00:24:26,480 --> 00:24:28,480 Sí, sí se ve. 191 00:24:28,480 --> 00:24:32,480 Pero no se ve entero, ¿verdad? Se ve solo una parte. 192 00:24:36,480 --> 00:24:39,480 Bueno, lo pongo así en pequeño. 193 00:24:51,480 --> 00:24:56,480 Esa sería nuestra... Ay, no, perdón, que me he confundido. No quería poneros esta. 194 00:24:57,480 --> 00:24:59,480 A ver... 195 00:25:03,480 --> 00:25:05,480 Es esta. 196 00:25:06,480 --> 00:25:08,480 Vale, pues ya está. 197 00:25:08,480 --> 00:25:10,480 Bueno, pues ya está. 198 00:25:10,480 --> 00:25:12,480 Bueno, pues ya está. 199 00:25:12,480 --> 00:25:14,480 Bueno, pues ya está. 200 00:25:14,480 --> 00:25:16,480 Bueno, pues ya está. 201 00:25:16,480 --> 00:25:18,480 Bueno, pues ya está. 202 00:25:18,480 --> 00:25:20,480 Es esta. 203 00:25:44,480 --> 00:25:46,480 Vale, esta sí. 204 00:25:49,480 --> 00:25:52,480 Vale, si os fijáis, aquí está la fase estacionaria. 205 00:25:54,480 --> 00:25:56,480 Aquí tenemos nuestra muestra. 206 00:26:00,480 --> 00:26:04,480 Esta sería nuestra muestra, con toda la mezcla de componentes de la muestra. 207 00:26:06,480 --> 00:26:08,480 Bueno, pues ya está. 208 00:26:08,480 --> 00:26:10,480 Bueno, pues ya está. 209 00:26:10,480 --> 00:26:12,480 Bueno, pues ya está. 210 00:26:12,480 --> 00:26:14,480 Bueno, pues ya está. 211 00:26:14,480 --> 00:26:16,480 Bueno, pues ya está. 212 00:26:17,480 --> 00:26:25,480 Y ahora añadimos la fase móvil, que normalmente puede ser un gas o puede ser un líquido, una mezcla de disolventes. 213 00:26:25,480 --> 00:26:32,480 Entonces, según va pasando la muestra, se van separando los componentes de nuestra muestra. 214 00:26:33,480 --> 00:26:37,480 Vale, pues así podemos separar los componentes de una muestra. 215 00:26:39,480 --> 00:26:44,480 Bueno, pues vamos a volver a la presentación. 216 00:26:47,480 --> 00:26:50,480 Vale, entonces eso es importante. 217 00:26:50,480 --> 00:26:56,480 Es un mecanismo de separación de los componentes de una muestra. 218 00:26:57,480 --> 00:27:00,480 Vale, entonces eso es importante. 219 00:27:00,480 --> 00:27:08,480 Es un método de separación, la cromatografía, en la que tenemos una fase en reposo, que es la fase estacionaria, 220 00:27:08,480 --> 00:27:13,480 y otra que se mueve a través de esta fase estacionaria, que es la fase móvil. 221 00:27:13,480 --> 00:27:21,480 Y entonces las muestras, los componentes de la muestra, se separan porque van interaccionando con la fase estacionaria. 222 00:27:26,480 --> 00:27:28,480 Vale, entonces... 223 00:27:31,480 --> 00:27:38,480 Bueno, aquí esta es la gráfica que exponen aquí en el aula virtual, pero bueno, es lo mismo. 224 00:27:38,480 --> 00:27:45,480 Se introduce la muestra, aquí en este caso la columna dice que está rellenada de material sólido. 225 00:27:46,480 --> 00:27:56,480 Vale, y entonces el eluyente se llama a la mezcla de disolventes, que sería la fase móvil. 226 00:27:56,480 --> 00:28:03,480 Se introduce la muestra, se introduce la fase móvil, y los componentes se van separando. 227 00:28:04,480 --> 00:28:12,480 Entonces, el extracto crudo se aplica en la parte superior de la columna y va poco a poco entrando en la columna con la fase móvil. 228 00:28:12,480 --> 00:28:19,480 Cada proteína migrará a distinta velocidad según su grado de afinidad por la fase estacionaria. 229 00:28:19,480 --> 00:28:26,480 La fase móvil se hace pasar a la columna a través de una bomba peristática y un colector de fracciones 230 00:28:26,480 --> 00:28:30,480 que va a ir recogiendo el eluyente que sale de la columna. 231 00:28:30,480 --> 00:28:35,480 Vale, lo que sale de aquí se denomina eluyente. 232 00:28:36,480 --> 00:28:41,480 Este colector hace que el tubo vaya cambiando cada cierto número de gotas o de volumen. 233 00:28:43,480 --> 00:28:46,480 Vale, pues esta sería la idea de la cromatografía. 234 00:28:46,480 --> 00:28:49,480 Ahora vamos a ver qué tipos de cromatografía tenemos. 235 00:28:49,480 --> 00:28:56,480 Bueno, aquí os he puesto esta diapositiva simplemente para que veáis que hay dos tipos de cromatografía 236 00:28:56,480 --> 00:28:59,480 que son, fijaros qué diferencia. 237 00:28:59,480 --> 00:29:07,480 Esta sería la cromatografía en capa fina, que es simplemente una cubeta de vidrio y una placa. 238 00:29:07,480 --> 00:29:09,480 Esta sería la fase estacionaria. 239 00:29:09,480 --> 00:29:12,480 Luego lo vamos a ver con detalle. 240 00:29:12,480 --> 00:29:15,480 Y fijaros este otro tipo de cromatografía. 241 00:29:15,480 --> 00:29:17,480 Este es un cromatógrafo HPLC. 242 00:29:17,480 --> 00:29:22,480 Bueno, pues simplemente esta diapositiva os la he puesto para que veáis las diferencias. 243 00:29:22,480 --> 00:29:28,480 Las dos son cromatografías, pero las diferencias son considerables. 244 00:29:29,480 --> 00:29:32,480 Entonces vamos a ver los tipos de cromatografía. 245 00:29:32,480 --> 00:29:34,480 Bueno, esto también os lo he puesto. 246 00:29:34,480 --> 00:29:38,480 No lo tenéis en los apuntes, pero solamente os lo he puesto para que veáis. 247 00:29:38,480 --> 00:29:41,480 Lo mismo que tenemos cromatografía en capa fina. 248 00:29:41,480 --> 00:29:46,480 Y en la cromatografía en capa fina la fase móvil asciende. 249 00:29:46,480 --> 00:29:51,480 Y luego la cromatografía en columna la fase móvil desciende. 250 00:29:51,480 --> 00:29:55,480 Va desde arriba, la fase móvil va cayendo. 251 00:29:55,480 --> 00:29:58,480 Y el soporte que se utiliza es una columna. 252 00:29:58,480 --> 00:30:03,480 Y aquí en cambio el soporte es esta cubeta de vidrio y es un soporte plano. 253 00:30:04,480 --> 00:30:09,480 Bueno, pues vamos a ver ahora primero tres tipos de cromatografía en columna. 254 00:30:09,480 --> 00:30:18,480 Entonces tenemos, bueno, según el mecanismo físico-químico por el que se produce la separación de los analitos 255 00:30:18,480 --> 00:30:26,480 tenemos la cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad. 256 00:30:26,480 --> 00:30:30,480 Estas tres serían cromatografía en columna. 257 00:30:30,480 --> 00:30:34,480 Y luego tendríamos la cromatografía en capa fina. 258 00:30:34,480 --> 00:30:39,480 Esta es cromatografía en capa fina y aquí cromatografía en columna. 259 00:30:39,480 --> 00:30:45,480 Serían estas tres, filtración en gel, intercambio iónico y cromatografía de afinidad. 260 00:30:46,480 --> 00:30:49,480 Bueno, pues vamos a ver cada una de... 261 00:30:49,480 --> 00:30:54,480 Las tres primeras, perdone, las tres primeras cromatografías son en columna. 262 00:30:54,480 --> 00:30:55,480 Sí. 263 00:30:55,480 --> 00:30:56,480 ¿Verdad? 264 00:30:56,480 --> 00:30:57,480 Sí. 265 00:30:57,480 --> 00:30:58,480 Ok, vale. 266 00:30:58,480 --> 00:31:00,480 La cromatografía en columna. 267 00:31:00,480 --> 00:31:05,480 Entonces, vamos a ver primero la cromatografía de filtración en gel. 268 00:31:05,480 --> 00:31:10,480 También hay veces que se denomina de exclusión molecular. 269 00:31:10,480 --> 00:31:17,480 No sé si en la presentación igual encontráis que alguna vez he puesto exclusión molecular, ¿vale? 270 00:31:17,480 --> 00:31:20,480 Pero es lo mismo, filtración en gel o exclusión molecular. 271 00:31:21,480 --> 00:31:29,480 Bueno, pues en esta cromatografía lo que vamos a tener es una fase estacionaria 272 00:31:29,480 --> 00:31:32,480 que serían estas bolas de aquí de color amarillo. 273 00:31:32,480 --> 00:31:35,480 Esta sería la fase estacionaria. 274 00:31:35,480 --> 00:31:39,480 Y la fase estacionaria está formada por polímeros. 275 00:31:39,480 --> 00:31:42,480 Esto sería un polímero, ¿vale? 276 00:31:42,480 --> 00:31:45,480 Que tiene unas oquedades, unos huecos. 277 00:31:45,480 --> 00:31:48,480 Si os fijáis aquí, esto de aquí blanco, ¿vale? 278 00:31:48,480 --> 00:31:56,480 Los polímeros son así como bolas esféricas que tienen unos huecos y que son porosos. 279 00:31:56,480 --> 00:32:05,480 Y entonces, las moléculas más pequeñas se van a ir quedando retenidas en esos huecos. 280 00:32:05,480 --> 00:32:10,480 Nuestra muestra va a ser esta, la que tiene estos puntos rojos y estos puntos amarillos. 281 00:32:11,480 --> 00:32:14,480 Vamos a pasar nuestra muestra con la fase móvil 282 00:32:14,480 --> 00:32:21,480 y los componentes más pequeños de masa molecular de nuestra muestra 283 00:32:21,480 --> 00:32:28,480 se van a ir quedando retenidos en esos huecos, en esos poros de nuestra fase estacionaria. 284 00:32:28,480 --> 00:32:33,480 Y en cambio, las moléculas más grandes, las rojas, van a pasar primero, ¿vale? 285 00:32:33,480 --> 00:32:38,480 Se dice van a eluir primero, eluir. 286 00:32:38,480 --> 00:32:44,480 Entonces, os leo lo que pone aquí, que es lo que os he dicho yo. 287 00:32:44,480 --> 00:32:50,480 Las moléculas pequeñas penetran en los pequeños conductos que presentan las bolas de gel, 288 00:32:50,480 --> 00:32:54,480 donde la velocidad de flujo de disolvente es menor. 289 00:32:54,480 --> 00:32:59,480 Las moléculas grandes, incapaces de penetrar en los pequeños conductos de las bolas de gel, 290 00:32:59,480 --> 00:33:05,480 se mueven entre ellas, donde la velocidad de flujo de disolvente es superior. 291 00:33:05,480 --> 00:33:11,480 Como consecuencia, las moléculas de mayor masa molecular son eluidas, ¿vale? 292 00:33:11,480 --> 00:33:15,480 Eluir antes que las de menor peso molecular. 293 00:33:15,480 --> 00:33:21,480 Entonces, esta técnica de cromatografía de filtración de gel 294 00:33:21,480 --> 00:33:27,480 nos sirve para separar moléculas en función de su masa molecular. 295 00:33:28,480 --> 00:33:36,480 Entonces, una de las aplicaciones sería esa, sería la determinación de masas moleculares. 296 00:33:36,480 --> 00:33:42,480 Y otra de las aplicaciones sería purificar las proteínas. 297 00:33:42,480 --> 00:33:48,480 Si tenemos una proteína que está impurificada con algún tipo de sal, 298 00:33:48,480 --> 00:33:53,480 con algún compuesto de tamaño más pequeño, 299 00:33:53,480 --> 00:33:59,480 los compuestos de tamaño más pequeño se van a quedar retenidos en los poros 300 00:33:59,480 --> 00:34:04,480 y, en cambio, las proteínas van a salir primero porque son de mayor masa molecular. 301 00:34:07,480 --> 00:34:15,480 Entonces, nos sirve eso para determinar masas moleculares o para purificar proteínas. 302 00:34:15,480 --> 00:34:18,480 Vamos a ver este vídeo. 303 00:34:23,480 --> 00:34:52,480 ¿Vale? Esto sería la columna, la columna que tiene estos, esto de aquí, 304 00:34:53,480 --> 00:35:01,480 serían las esferas de polímero, la fase estacionaria sería. 305 00:35:01,480 --> 00:35:06,480 Y veis que tiene por aquí unos huecos, pues ahora vamos a ver como en estos huecos 306 00:35:06,480 --> 00:35:10,480 se nos van a ir quedando las partículas más pequeñas. 307 00:35:16,480 --> 00:35:17,480 ¿Veis? 308 00:35:18,480 --> 00:35:22,480 Y, en cambio, las más grandes salen, eluyen primero. 309 00:35:22,480 --> 00:35:28,480 Las partículas se van quedando en los huecos y salen otra vez. 310 00:35:28,480 --> 00:35:30,480 Se introducen en los huecos y salen. 311 00:35:30,480 --> 00:35:35,480 Eso hace que vayan más despacio y, por lo tanto, podemos separar. 312 00:35:35,480 --> 00:35:43,480 Salen primero las moléculas de mayor tamaño y, al final, van saliendo las moléculas de menor tamaño. 313 00:35:43,480 --> 00:35:51,480 Eso sería la filtración en gel. 314 00:35:56,480 --> 00:35:58,480 O exclusión molecular. 315 00:35:59,480 --> 00:36:08,480 Y aquí en los apuntes tenéis, en una página, la página de Biomodel. 316 00:36:13,480 --> 00:36:14,480 ¿Vale? 317 00:36:14,480 --> 00:36:43,480 Vale, aquí tenéis en esta página de Biomodel, que ya lo hemos visto otras veces, 318 00:36:43,480 --> 00:36:49,480 desde la Universidad de Alcalá de Henares han hecho esta simulación. 319 00:36:49,480 --> 00:36:51,480 Y, bueno, nos cuentan lo mismo, ¿no? 320 00:36:51,480 --> 00:36:53,480 El principio de la separación es el siguiente. 321 00:36:53,480 --> 00:36:59,480 El material que llena la columna, que es la fase estacionaria, es un gel o una resina. 322 00:36:59,480 --> 00:37:05,480 Está formado por partículas con poros de un cierto intervalo de tamaños. 323 00:37:05,480 --> 00:37:11,480 Las moléculas mayores que los poros no pueden entrar en ellos, por lo que pasan de largo, 324 00:37:11,480 --> 00:37:17,480 y avanzan por la columna, eluyen con mayor rapidez que las de tamaño menor, 325 00:37:17,480 --> 00:37:22,480 que pueden entrar en los poros y así realizan un recorrido mayor, 326 00:37:22,480 --> 00:37:26,480 progresando más lentamente a lo largo de la columna. 327 00:37:26,480 --> 00:37:32,480 En una cromatografía en columna lo habitual es recoger fracciones del líquido que sale o eluye 328 00:37:32,480 --> 00:37:39,480 para analizarlas individualmente y así trazar el perfil de elución de la cromatografía. 329 00:37:40,480 --> 00:37:43,480 Bueno, pues vamos a ver cómo lo ponen aquí. 330 00:37:48,480 --> 00:37:51,480 Ahí estaríamos introduciendo la muestra. 331 00:37:54,480 --> 00:38:01,480 La muestra va pasando y aquí tenemos, pues, estas serían moléculas pequeñas 332 00:38:01,480 --> 00:38:04,480 que se han quedado dentro de los poros. 333 00:38:04,480 --> 00:38:06,480 A ver si lo pongo más grande. 334 00:38:10,480 --> 00:38:15,480 Y las moléculas más grandes, pues, pasan primero, eluyen primero. 335 00:38:18,480 --> 00:38:22,480 ¿Veis esto? Aquí esta sería la columna, la fase estacionaria, 336 00:38:22,480 --> 00:38:28,480 y cómo vamos a ir recogiendo las distintas muestras dependiendo de la masa molecular. 337 00:38:29,480 --> 00:38:36,480 Entonces tenemos, bueno, aquí lo que nos sale solo es la concentración y el número de moléculas. 338 00:38:36,480 --> 00:38:43,480 Pues hay una molécula con esta concentración, y así nos saldría este perfil. 339 00:38:43,480 --> 00:38:46,480 Bueno, este es el perfil de la molécula. 340 00:38:46,480 --> 00:38:49,480 Y aquí tenemos, pues, el número de moléculas. 341 00:38:49,480 --> 00:38:51,480 Bueno, esta se ha entendido. 342 00:38:59,480 --> 00:39:02,480 Bueno, pues vamos a ver qué tal está la presentación. 343 00:39:02,480 --> 00:39:03,480 ¿Veis? 344 00:39:03,480 --> 00:39:04,480 ¿Veis? 345 00:39:04,480 --> 00:39:05,480 ¿Veis? 346 00:39:05,480 --> 00:39:06,480 ¿Veis? 347 00:39:06,480 --> 00:39:07,480 ¿Veis? 348 00:39:07,480 --> 00:39:08,480 ¿Veis? 349 00:39:08,480 --> 00:39:09,480 ¿Veis? 350 00:39:09,480 --> 00:39:10,480 ¿Veis? 351 00:39:10,480 --> 00:39:11,480 ¿Veis? 352 00:39:11,480 --> 00:39:12,480 ¿Veis? 353 00:39:12,480 --> 00:39:13,480 ¿Veis? 354 00:39:13,480 --> 00:39:14,480 ¿Veis? 355 00:39:14,480 --> 00:39:15,480 ¿Veis? 356 00:39:15,480 --> 00:39:16,480 ¿Veis? 357 00:39:16,480 --> 00:39:17,480 ¿Veis? 358 00:39:17,480 --> 00:39:18,480 ¿Veis? 359 00:39:19,480 --> 00:39:20,480 Sí. 360 00:39:20,480 --> 00:39:21,480 Sí, es fácil, ¿no? 361 00:39:21,480 --> 00:39:22,480 Ahí está. 362 00:39:31,480 --> 00:39:32,480 Vale. 363 00:39:32,480 --> 00:39:39,480 Pues ahora la siguiente que vamos a ver es la cromatografía de intercambio iónico. 364 00:39:39,480 --> 00:39:50,480 En esta cromatografía la separación de las muestras va a ser según la carga neta de las proteínas. 365 00:39:50,480 --> 00:39:53,480 Bueno, aquí he supuesto esto que sería una columna. 366 00:39:53,480 --> 00:39:57,480 Esto lo tenéis en el aula virtual, en el documento. 367 00:39:57,480 --> 00:40:01,480 Entonces, vamos a separar las proteínas según su carga. 368 00:40:01,480 --> 00:40:05,480 ¿Y cómo podemos modificar la carga de una proteína? 369 00:40:05,480 --> 00:40:13,480 ¿Os acordáis que veíamos que las proteínas, dependiendo del pH, tenían carga positiva o negativa? 370 00:40:13,480 --> 00:40:19,480 Y que luego también había un valor de pH en el que las proteínas tenían carga cero. 371 00:40:19,480 --> 00:40:22,480 ¿Os acordáis que se llamaba el punto isoeléctrico? 372 00:40:22,480 --> 00:40:34,480 Bueno, pues si disolvemos a nuestra proteína en una disolución tampón de pH inferior al punto isoeléctrico, 373 00:40:34,480 --> 00:40:39,480 esa proteína va a estar cargada positivamente. 374 00:40:39,480 --> 00:40:50,480 Y si disolviéramos a la proteína a un pH mayor que el punto isoeléctrico, pues esa proteína estaría cargada negativamente. 375 00:40:50,480 --> 00:41:01,480 Entonces, nosotros en esta cromatografía vamos a tener una fase estacionaria que sería esto de aquí, gris. 376 00:41:01,480 --> 00:41:07,480 Que está cargada positivamente. Esto sería la fase estacionaria. 377 00:41:07,480 --> 00:41:19,480 Y esto de aquí, los puntos rojos que están cargados negativamente y los puntos grises que están cargados positivamente serían nuestras proteínas. 378 00:41:19,480 --> 00:41:29,480 Entonces, las proteínas que tengan carga negativa, las rojas, se van a quedar adheridas a nuestra fase estacionaria. 379 00:41:29,480 --> 00:41:37,480 Y en cambio, las proteínas que tengan carga positiva van a salir de la columna, van a eluir primero. 380 00:41:37,480 --> 00:41:42,480 Esto es cromatografía de intercambio iónico. 381 00:41:42,480 --> 00:41:52,480 Entonces, las partículas cargadas negativamente se unen a la matriz sólida cargada positivamente y son retenidas. 382 00:41:52,480 --> 00:42:01,480 Y las partículas cargadas positivamente son rechazadas por la matriz sólida cargada positivamente y son eluidas. 383 00:42:01,480 --> 00:42:09,480 La elución de las partículas cargadas negativamente, vale, esto lo vamos a leer y ahora os lo explico. 384 00:42:09,480 --> 00:42:21,480 La elución de las partículas cargadas negativamente se consigue cambiando el pH del disolvente hasta igualarlo a su punto isoeléctrico o hasta invertir su carga positiva. 385 00:42:21,480 --> 00:42:23,480 Es decir, su carga neta. 386 00:42:23,480 --> 00:42:27,480 Bueno, vamos a ver qué significa este párrafo. 387 00:42:27,480 --> 00:42:35,480 Nosotros hemos introducido nuestra muestra que tiene proteínas con carga negativa y positiva. 388 00:42:35,480 --> 00:42:47,480 Pasamos nuestra muestra, nuestras proteínas y salen todas las proteínas positivas, eluyen todas las que tienen carga positiva. 389 00:42:47,480 --> 00:42:53,480 Las proteínas negativas, las de color rojo, se quedan ahí adheridas a nuestra fase estacionaria. 390 00:42:53,480 --> 00:43:00,480 Pero claro, nosotros esta columna la vamos a querer utilizar más tarde para otro experimento. 391 00:43:00,480 --> 00:43:07,480 Entonces, ¿cómo hacemos que estas proteínas que están aquí cargadas negativamente, 392 00:43:07,480 --> 00:43:15,480 cómo hacemos que estas proteínas eluyan, cómo hacemos que estas proteínas salgan de la columna y se nos quede la fase estacionaria limpia? 393 00:43:15,480 --> 00:43:21,480 Lo que hacemos es introducir una disolución, tampón, de un pH diferente. 394 00:43:21,480 --> 00:43:29,480 Hacemos que nuestras proteínas que tienen carga negativa al cambiar el pH cambien a carga positiva 395 00:43:29,480 --> 00:43:36,480 y entonces se van a separar de la fase estacionaria y van a eluir, van a salir. 396 00:43:36,480 --> 00:43:38,480 No sé, ¿entendéis esto? 397 00:43:38,480 --> 00:43:40,480 Quizás es un poco complicado. 398 00:43:41,480 --> 00:43:47,480 Yo me quedé un poco perdida en la parte cuando usted estaba hablando de cómo cambiamos lo de la carga, 399 00:43:47,480 --> 00:43:57,480 de que ahí al pH aumentamos el punto isoeléctrico, en esa parte que anteriormente a eso me quedé perdida. 400 00:43:57,480 --> 00:44:03,480 Entonces, lo que pasa es que usted continuó y no la quise interrumpir. 401 00:44:04,480 --> 00:44:08,480 Vale, pero ¿os acordáis cuando vimos las proteínas? 402 00:44:08,480 --> 00:44:14,480 ¿Os acordáis que las proteínas tenían un pH en el cual tenían carga neta cero? 403 00:44:14,480 --> 00:44:16,480 ¿Os acordáis? 404 00:44:16,480 --> 00:44:24,480 Y entonces, si el pH es menor que ese punto isoeléctrico donde la carga neta es cero, 405 00:44:24,480 --> 00:44:27,480 las proteínas se cargan positivamente. 406 00:44:27,480 --> 00:44:33,480 Y si el pH es mayor que ese punto isoeléctrico, las proteínas se cargan negativamente. 407 00:44:37,480 --> 00:44:42,480 A ver si tengo la presentación. 408 00:44:42,480 --> 00:44:54,480 Bueno, quedaros con eso, que dependiendo del pH, si os miráis la primera parte de la presentación de proteínas, 409 00:44:54,480 --> 00:45:00,480 la del primer día, la parte 1, ahí veréis que las proteínas, dependiendo del pH, 410 00:45:00,480 --> 00:45:08,480 si a pH más bajo que el punto isoeléctrico, las proteínas se van a cargar positivamente. 411 00:45:08,480 --> 00:45:15,480 Y a pH mayor que el punto isoeléctrico, las proteínas se van a cargar negativamente. 412 00:45:15,480 --> 00:45:23,480 Entonces, si nosotros tenemos aquí, hemos pasado la muestra y han salido ya las proteínas con carga positiva. 413 00:45:23,480 --> 00:45:27,480 Imaginaos que aquí ya no tenemos proteínas con carga positiva. 414 00:45:27,480 --> 00:45:33,480 Solo nos quedan las proteínas con carga negativa que están adheridas a la fase estacionaria. 415 00:45:33,480 --> 00:45:37,480 ¿Cómo separamos estas proteínas que tienen carga negativa? 416 00:45:37,480 --> 00:45:40,480 Pues lo que hacemos es cambiar el pH. 417 00:45:40,480 --> 00:45:47,480 Y si cambiamos el pH, estas proteínas van a cambiar a carga positiva. 418 00:45:47,480 --> 00:45:55,480 Y entonces ya no van a interaccionar con la fase estacionaria y van a eluir. 419 00:45:55,480 --> 00:46:07,480 Si acaso en la presentación, el próximo día os meto aquí lo que es lo del punto isoeléctrico y así lo vais a entender mejor. 420 00:46:07,480 --> 00:46:13,480 Vale, pues esta sería la cromatografía de intercambio iónico. 421 00:46:14,480 --> 00:46:19,480 La fase estacionaria está formada por polímeros que pueden ser sintéticos o naturales. 422 00:46:19,480 --> 00:46:26,480 Y esta fase estacionaria, dependiendo si la carga de la fase estacionaria es positiva o negativa, 423 00:46:26,480 --> 00:46:34,480 se llama cromatografía de intercambio aniónico, cuando la fase estacionaria tiene carga positiva. 424 00:46:34,480 --> 00:46:41,480 Y cromatografía de intercambio catiónico, cuando la fase estacionaria tiene carga negativa. 425 00:46:43,480 --> 00:46:48,480 Bien, pues lo que os digo, ya el próximo día pongo aquí lo del punto isoeléctrico. 426 00:46:48,480 --> 00:46:51,480 Y yo creo, de todas formas, mirároslo. 427 00:46:51,480 --> 00:46:54,480 Y yo creo que el próximo día ya lo vais a entender mejor. 428 00:46:56,480 --> 00:47:02,480 Y ya nos quedaría, bueno, aquí os he puesto lo del punto isoeléctrico. 429 00:47:02,480 --> 00:47:07,480 A pH mayor que el punto isoeléctrico, la proteína tiene carga negativa. 430 00:47:07,480 --> 00:47:12,480 Y a pH menor que el punto isoeléctrico, la proteína tiene carga positiva. 431 00:47:12,480 --> 00:47:14,480 Las proteínas tienen carga positiva. 432 00:47:14,480 --> 00:47:22,480 Entonces, si modificamos el pH de nuestra disolución, pues vamos a hacer que las proteínas tengan una carga u otra. 433 00:47:24,480 --> 00:47:34,480 Aquí os he puesto este vídeo para ver un poquito, porque es un poco complicado, pero para ver un poquito esto. 434 00:47:38,480 --> 00:47:42,480 Está en inglés. 435 00:47:53,480 --> 00:47:57,480 Vale, vamos a ver a partir del minuto 3. 436 00:48:08,480 --> 00:48:12,480 Bueno, aquí nos habla de los aminoácidos. 437 00:48:12,480 --> 00:48:17,480 Veis que los aminoácidos, lo mismo, la carga puede ser positiva o negativa. 438 00:48:18,480 --> 00:48:23,480 Este sería el punto isoeléctrico, donde tenemos el mismo número de cargas positivas que negativas. 439 00:48:23,480 --> 00:48:29,480 A pH por debajo del punto isoeléctrico, la proteína o el aminoácido tienen carga positiva. 440 00:48:29,480 --> 00:48:32,480 Y a pH por encima tienen carga negativa. 441 00:48:32,480 --> 00:48:41,480 Entonces, aquí lo que nos cuentan es que tenemos tres proteínas, cuyo punto isoeléctrico, el punto isoeléctrico ponen pHI. 442 00:48:41,480 --> 00:48:45,480 Entonces, el punto isoeléctrico en esta proteína, el punto isoeléctrico es 3. 443 00:48:45,480 --> 00:48:49,480 Esta proteína es 7 y esta proteína, el punto isoeléctrico es 9. 444 00:48:49,480 --> 00:48:54,480 Y tenemos una disolución, tampón, que se llama buffer también en inglés. 445 00:48:54,480 --> 00:48:58,480 Una disolución tampón es una disolución que no se modifica. 446 00:48:58,480 --> 00:49:05,480 Una disolución tampón es una disolución que no se modifica su pH aunque añadamos ácidos o bases. 447 00:49:05,480 --> 00:49:11,480 Entonces, estas proteínas las tenemos disueltas en una disolución de pH 5. 448 00:49:11,480 --> 00:49:26,480 Bueno, pues la proteína esta que tiene un punto isoeléctrico menor que el pH, pues tendrá carga negativa. 449 00:49:26,480 --> 00:49:33,480 Esta también, el punto isoeléctrico es mayor que el pH, tiene carga positiva. 450 00:49:33,480 --> 00:49:36,480 Y esta también tiene carga positiva. 451 00:49:36,480 --> 00:49:42,480 Entonces, esta sería la fase móvil con nuestra muestra y esta sería la columna. 452 00:49:42,480 --> 00:49:45,480 Esta sería la fase estacionaria. 453 00:49:45,480 --> 00:49:48,480 Y, bueno, aquí es un poquito jaleo la fase estacionaria. 454 00:49:48,480 --> 00:49:53,480 Quedaros con estas bolas de color azul, o sea, la fase estacionaria sería positiva. 455 00:49:53,480 --> 00:49:58,480 Y por aquí van pasando nuestras proteínas, por las que tenían carga... 456 00:50:00,480 --> 00:50:04,480 No, perdón, quedaros con que la fase estacionaria es negativa. 457 00:50:07,480 --> 00:50:10,480 Quedaros con que la fase estacionaria es negativa. 458 00:50:10,480 --> 00:50:17,480 Y entonces, las proteínas con carga positiva se van a quedar adheridas a la fase estacionaria. 459 00:50:17,480 --> 00:50:21,480 Y las proteínas con carga positiva van a eluir primero. 460 00:50:21,480 --> 00:50:26,480 Esta tiene carga positiva, pues eluye primero. 461 00:50:30,480 --> 00:50:32,480 A ver, creo que lo he dicho al revés. 462 00:50:33,480 --> 00:50:41,480 La fase estacionaria tiene carga negativa y entonces las proteínas con carga positiva se van a quedar adheridas. 463 00:50:41,480 --> 00:50:45,480 Y las proteínas con carga negativa van a salir las primeras. 464 00:50:46,480 --> 00:50:51,480 Vale, entonces este vídeo es un poco complicado, pero simplemente para que vierais eso. 465 00:51:00,480 --> 00:51:06,480 Vale, entonces esta cromatografía de intercambio iónico se utiliza para separar compuestos pequeños, 466 00:51:06,480 --> 00:51:12,480 como mezclas de aminoácidos, pequeños péptidos, para oligonucleótidos, 467 00:51:12,480 --> 00:51:21,480 o para eliminar también impurezas de reactivos o cationes metálicos de disoluciones tampón y de disolventes. 468 00:51:21,480 --> 00:51:28,480 Entonces la cromatografía de intercambio iónico sirve para separar compuestos pequeños. 469 00:51:30,480 --> 00:51:34,480 Y por último vamos a ver la cromatografía de afinidad. 470 00:51:35,480 --> 00:51:45,480 En la cromatografía de afinidad tenemos una fase estacionaria que tiene una sustancia que se denomina ligando 471 00:51:45,480 --> 00:51:49,480 y con esta sustancia la proteína va a interaccionar. 472 00:51:49,480 --> 00:51:58,480 Entonces aquí la fase estacionaria está dibujada en amarillo y vamos a añadir una mezcla de proteínas 473 00:51:58,480 --> 00:52:02,480 que serían estos puntos azules, los verdes y los rojos. 474 00:52:02,480 --> 00:52:09,480 Pues solamente hay una serie de proteínas que interaccionan con esta fase estacionaria. 475 00:52:09,480 --> 00:52:17,480 Entonces esta cromatografía, este tipo de cromatografía es muy específica. 476 00:52:17,480 --> 00:52:25,480 ¿Por qué? Porque ¿os acordáis cuando vimos las enzimas que reaccionaban solo con un tipo de sustrato? 477 00:52:25,480 --> 00:52:30,480 Pues entonces aquí lo que podemos tener es una serie de enzimas 478 00:52:33,480 --> 00:52:36,480 y aquí le podemos estar añadiendo varios sustratos 479 00:52:36,480 --> 00:52:43,480 y podemos estar viendo que solamente hay un tipo de sustrato que va a reaccionar con esa enzima. 480 00:52:43,480 --> 00:52:59,480 Entonces la cromatografía de afinidad tenemos una sustancia que se llama ligando en la fase estacionaria 481 00:52:59,480 --> 00:53:02,480 y añadiríamos nuestra mezcla. 482 00:53:02,480 --> 00:53:10,480 Pues solamente hay una serie de proteínas que reaccionan específicamente con esa fase estacionaria. 483 00:53:14,480 --> 00:53:22,480 Entonces para luego, como antes, para dejar la columna limpia y que se pueda volver a utilizar otra vez 484 00:53:22,480 --> 00:53:29,480 lo que se hace es pasar una disolución rica en un compuesto que también sea afín a ese ligando 485 00:53:29,480 --> 00:53:34,480 y así desplaza a la proteína que se nos había quedado ahí unida. 486 00:53:34,480 --> 00:53:40,480 De este modo se expulsa la proteína de interés de la fase estacionaria que saldrá por el fondo de la columna 487 00:53:40,480 --> 00:53:44,480 más tarde que el resto de proteínas que formaban la mezcla inicial. 488 00:53:44,480 --> 00:53:49,480 Entonces este tipo de cromatografía es de gran especificidad 489 00:53:49,480 --> 00:53:54,480 y podemos detectar reacciones, como os decía, enzima-sustrato 490 00:53:54,480 --> 00:54:00,480 también podemos detectar reacciones hormona-receptor o antígeno-anticuerpo. 491 00:54:00,480 --> 00:54:05,480 Esto de antígeno y anticuerpo ya veremos más adelante lo que es. 492 00:54:05,480 --> 00:54:09,480 Entonces es una cromatografía muy específica. 493 00:54:10,480 --> 00:54:31,480 Vale, pues vamos a ver. En la página esta de Biomodel también viene la cromatografía de afinidad. 494 00:54:32,480 --> 00:54:41,480 Esta resina de afinidad solo interaccionará con moléculas, en este caso circulares. 495 00:54:41,480 --> 00:54:47,480 Estamos metiendo ahí nuestra disolución. 496 00:54:47,480 --> 00:54:53,480 Entonces el principio de la separación es la interacción específica entre moléculas 497 00:54:53,480 --> 00:54:58,480 de uno de los componentes de la muestra y moléculas unidas al soporte. 498 00:54:58,480 --> 00:55:03,480 La fase estacionaria es un gel o resina de afinidad que rellena la columna. 499 00:55:07,480 --> 00:55:12,480 Esta especificidad o afinidad procede de una complementariedad a escala molecular 500 00:55:12,480 --> 00:55:16,480 en la que participan fuerzas de enlace débiles del tipo Van der Waals, 501 00:55:16,480 --> 00:55:21,480 enlaces de hidrógeno, hidrofobicidad, interacciones iónicas. 502 00:55:21,480 --> 00:55:30,480 Ejemplos clásicos son las interacciones encima-sustrato o antígeno-anticuerpo o ligando-receptor. 503 00:55:30,480 --> 00:55:36,480 En el ejemplo mostrado en la película esto se simboliza con la forma circular o no de las moléculas 504 00:55:36,480 --> 00:55:39,480 y de los huecos existentes en la resina. 505 00:55:39,480 --> 00:55:46,480 Las moléculas que han quedado retenidas en la columna debido a su afinidad por la fase estacionaria 506 00:55:46,480 --> 00:55:53,480 se liberan mediante un cambio del medio, el huyente, a condiciones en las que la interacción se debilite. 507 00:55:53,480 --> 00:55:59,480 Generalmente se cambia el pH, lo que afecta al estado de ionización de las biomoléculas 508 00:55:59,480 --> 00:56:04,480 o se modifica la fuerza iónica mediante concentración de sales. 509 00:56:16,480 --> 00:56:36,480 Se carga la muestra que tendrá todas estas partículas y solamente las que tienen forma redonda en este caso 510 00:56:36,480 --> 00:56:42,480 son las que van a quedar unidas a la fase estacionaria. 511 00:56:42,480 --> 00:56:49,480 Entonces va saliendo el resto de partículas y al final salen las circulares. 512 00:56:59,480 --> 00:57:01,480 Aquí ya salen las circulares. 513 00:57:12,480 --> 00:57:24,480 Entonces, cromatografía en columna, tres tipos. 514 00:57:24,480 --> 00:57:31,480 Filtración en gel, lo que hacemos es separar nuestras proteínas en función de su masa molecular. 515 00:57:31,480 --> 00:57:38,480 Tenemos un gel que tiene poros, es un polímero que tiene una serie de poros. 516 00:57:38,480 --> 00:57:48,480 Las moléculas de menor tamaño se van a introducir en esos poros y van a salir las últimas, van a eluir las últimas. 517 00:57:48,480 --> 00:57:52,480 Después tenemos la cromatografía de intercambio iónico. 518 00:57:52,480 --> 00:57:59,480 En esta lo que tenemos la fase estacionaria puede estar cargada o positivamente o negativamente. 519 00:57:59,480 --> 00:58:07,480 Si la fase estacionaria está cargada positivamente, cuando nosotros introduzcamos nuestra mezcla de proteínas 520 00:58:07,480 --> 00:58:14,480 las proteínas con carga negativa se van a quedar adheridas a la fase estacionaria. 521 00:58:14,480 --> 00:58:20,480 En la fase estacionaria positiva las proteínas con carga negativa se quedan adheridas. 522 00:58:20,480 --> 00:58:24,480 Y por último tenemos la cromatografía de afinidad. 523 00:58:24,480 --> 00:58:30,480 La cromatografía de afinidad nos basamos en una reacción que es una reacción específica. 524 00:58:30,480 --> 00:58:33,480 Una reacción, por ejemplo, enzima-sustrato. 525 00:58:33,480 --> 00:58:38,480 ¿Os acordáis que vimos que las enzimas solamente interaccionaban con un tipo de sustratos? 526 00:58:38,480 --> 00:58:41,480 O una reacción antígeno-anticuerpo. 527 00:58:41,480 --> 00:58:49,480 Es una reacción muy específica y el resto de proteínas se van a eluir primero, van a salir primero. 528 00:58:49,480 --> 00:58:52,480 Pues estas serían las tres cromatografías en columna. 529 00:58:52,480 --> 00:58:59,480 Y luego quería comentaros también la cromatografía en capa fina. 530 00:58:59,480 --> 00:59:03,480 Pero igual esta la dejamos. Bueno, son menos 25, vamos a verla un poquito. 531 00:59:03,480 --> 00:59:12,480 Bueno, aquí en el aula virtual también nos cuentan cómo estos procesos están ya muy automatizados 532 00:59:12,480 --> 00:59:19,480 y ahora se utilizan cromatógrafos HPLC, que por sus siglas en inglés es 533 00:59:19,480 --> 00:59:22,480 cromatografía líquida de alta eficacia. 534 00:59:22,480 --> 00:59:28,480 High Performance Liquid Chromatography. 535 00:59:28,480 --> 00:59:34,480 Y aquí ya se utilizan bombas de alta presión, columnas con materiales muy específicos 536 00:59:34,480 --> 00:59:37,480 que soportan altas presiones. 537 00:59:37,480 --> 00:59:47,480 Y se utilizan este tipo de sistemas para aumentar la velocidad de la cromatografía. 538 00:59:50,480 --> 00:59:56,480 Bueno, aquí tenéis una autoevaluación y luego esta sería la cromatografía en capa fina 539 00:59:56,480 --> 01:00:03,480 Está no bien explicada en los apuntes, pero sí que quería que la vierais un poco. 540 01:00:03,480 --> 01:00:09,480 En la cromatografía en capa fina, lo que os decía antes, la fase móvil, que es una mezcla de disolventes 541 01:00:09,480 --> 01:00:16,480 se pone aquí, esto es una cubeta de cristal, pues se pone en la parte inferior de la columna. 542 01:00:16,480 --> 01:00:19,480 Y esto de aquí sería la fase estacionaria. 543 01:00:19,480 --> 01:00:25,480 La fase estacionaria es un sólido, es una placa de gel de sílice. 544 01:00:25,480 --> 01:00:29,480 Y esta placa de gel de sílice es polar. 545 01:00:29,480 --> 01:00:40,480 Entonces lo que se hace es que la fase móvil va ascendiendo por capilaridad a través de la fase estacionaria. 546 01:00:40,480 --> 01:00:47,480 Y entonces nosotros, se dice pinchar, pondríamos aquí una gota de nuestra muestra 547 01:00:47,480 --> 01:00:53,480 y dejamos que la fase móvil vaya ascendiendo a través de la fase estacionaria. 548 01:00:53,480 --> 01:01:02,480 Pues, por diferencias de polaridad de nuestra muestra, se van a ir separando los componentes de nuestra muestra. 549 01:01:02,480 --> 01:01:09,480 Los más polares van a quedar en la parte inferior y los más apolares van a quedar en la parte superior. 550 01:01:10,480 --> 01:01:15,480 El próximo día ya os lo explico con más detalle. 551 01:01:18,480 --> 01:01:22,480 Voy a detener la grabación ahora.