1
00:00:00,880 --> 00:00:09,539
Bien, vamos a comenzar la explicación de la última parte del tema sobre la extracción y purificación de los ácidos nucleicos.

2
00:00:09,919 --> 00:00:26,019
Vamos a seguir este orden. Voy a hacer una pequeña introducción, bueno, introduciendo el tema y sobre todo de cara a centrar todas las fases del proceso de extracción, purificación de ácidos nucleicos,

3
00:00:26,019 --> 00:00:30,760
Algunos puntos que me parece que son importantes tenerlos en cuenta.

4
00:00:31,059 --> 00:00:35,560
Y ya entraremos apartado a apartado a las diferentes fases de todo este proceso.

5
00:00:36,179 --> 00:00:38,200
Pretratamiento, como el primero de ellos.

6
00:00:40,060 --> 00:00:43,759
La extracción, la fase de extracción, la fase de purificación.

7
00:00:44,439 --> 00:00:47,280
Una vez hemos realizado estas tres fases, como veremos ahora,

8
00:00:48,979 --> 00:00:53,539
veremos que todos estos procesos se pueden automatizar en los laboratorios actualmente.

9
00:00:53,539 --> 00:01:12,719
Y tendremos que hacer la cuarta fase. La cuarta fase es analizar si los ácidos nucleicos que hemos extraído y purificado son de buena o de mala calidad. Si son de buena calidad, tenemos la garantía de que las técnicas de biología molecular seguramente saldrán bien.

10
00:01:12,719 --> 00:01:22,980
Si los ácidos nucleicos son de mala calidad, seguramente no podremos cumplir ese requisito y las técnicas de biología molecular es posible que nos den errores.

11
00:01:23,780 --> 00:01:32,340
Y al final, en el último apartado, veremos algunas consideraciones sobre cómo almacenar los ácidos nucleicos que acabamos de purificar.

12
00:01:32,939 --> 00:01:34,459
¿De acuerdo? Pues vamos a por ello.

13
00:01:34,459 --> 00:01:42,980
Bien, la primera idea importante que tenemos que tener en cuenta es que los ácidos nucleicos se encuentran confinados

14
00:01:42,980 --> 00:01:45,760
Y esto es importante, ¿dónde? En el interior de las células

15
00:01:45,760 --> 00:01:52,120
Ya sea una célula procariota, este es un esquema de una célula procariota

16
00:01:52,120 --> 00:01:58,319
Sabemos que este material genético corresponde al cromosoma bacteriano, al DNA genómico

17
00:01:58,319 --> 00:02:23,240
Y los plásmidos se encuentran dentro de la célula y está la membrana plasmática por fuera, dependiendo de si son gran positivas o negativas. Hay una pared muy gruesa, están muy protegidos. ¿Por qué? Porque los ácidos nucleicos, especialmente el DNA, como ya sabemos que se encarga de almacenar la información genética, debe permanecer inalterado.

18
00:02:23,240 --> 00:02:38,120
En una célula eucariota animal se encuentra dentro del núcleo. Por tanto, si queremos acceder a los ácidos nucleicos tenemos que atravesar la membrana plasmática y la membrana nuclear.

19
00:02:38,120 --> 00:02:59,159
Pero la membrana nuclear, como bien sabéis, es una membrana doble, es una doble membrana. Pero si son células eucariotas vegetales, además de llegar al núcleo, por fuera también tenemos una pared, en este caso es de celulosa, que la han pintado de verde, que es muy gruesa, muy dura.

20
00:02:59,159 --> 00:03:09,759
Por tanto, de alguna manera, en todo el proceso de extracción y purificación, tenemos que acceder a los ácidos nucleicos que están tremendamente confinados dentro de la célula.

21
00:03:10,680 --> 00:03:18,139
Además de la membrana plasmática, que solo tienen todas las células, hay muchas células que por fuera tienen paredes.

22
00:03:18,139 --> 00:03:36,669
La pared puede ser, bien si son células prokaryotas, es decir, bacterias, la pared celular es de péptido glicano o péptido glucano.

23
00:03:36,669 --> 00:03:43,509
Si es de mureína, células prokaryotas

24
00:03:43,509 --> 00:03:50,030
Pero también hay células eukaryotas que tienen pared celular

25
00:03:50,030 --> 00:03:53,490
Por ejemplo, las de los hongos, además tienen quitina

26
00:03:53,490 --> 00:03:55,629
Junto con el glucano

27
00:03:55,629 --> 00:03:58,430
Son paredes que están por fuera de la membrana

28
00:03:58,430 --> 00:04:01,949
Que tenemos que romperlas para poder acceder a los ácidos nucleicos

29
00:04:01,949 --> 00:04:06,370
Y si es una célula vegetal, la pared es de celulosa

30
00:04:06,669 --> 00:04:31,509
Bien. Esto como primer hilo. De acuerdo. Bien. Para que nos quede claro, para que nos quede claro todo el proceso, fijaos, desde que nos llega al laboratorio una muestra, imaginaos que esto es una biopsia, pues una biopsia de un paciente, imaginaos que le están haciendo un análisis de una biopsia de un nódulo mamario a una paciente,

31
00:04:31,509 --> 00:04:35,629
y nos llega al laboratorio, en un frasquito, esta muestra.

32
00:04:36,250 --> 00:04:39,230
Bien, si yo de esta muestra quiero hacer un análisis genético,

33
00:04:40,269 --> 00:04:43,910
tengo que seguir una serie de fases, y siempre son las mismas fases.

34
00:04:45,209 --> 00:04:50,629
La primera fase es lo que llamamos un pretratamiento.

35
00:04:52,589 --> 00:04:54,870
¿En qué consiste?

36
00:04:56,250 --> 00:04:59,790
Independientemente del tipo de célula, del tipo de muestra que llegue,

37
00:04:59,790 --> 00:05:16,009
Si es un tejido fresco, como una biopsia. Si son cultivos celulares. Si es una muestra sanguínea. Si es una muestra de heces. Independientemente del tipo de muestra, cada muestra hay que hacerle un procesamiento previo, lo que llamamos un pretratamiento.

38
00:05:16,009 --> 00:05:24,589
El objetivo fundamental de este pretratamiento es obtener en un tubito del laboratorio

39
00:05:24,589 --> 00:05:33,250
una suspensión en la que tengamos todas las células de esa muestra en suspensión.

40
00:05:34,110 --> 00:05:42,560
Por tanto, el objetivo del pretratamiento es obtener una suspensión celular.

41
00:05:42,560 --> 00:05:55,920
Es decir, las células de ese tejido, de esa muestra, libres, ¿sí? Libres unas de otras y en el seno de un fluido.

42
00:05:57,019 --> 00:06:07,300
Bien, esta sería siempre la primera fase. Ya digo, dependiendo de la muestra que sea, esta fase y este proceso de pretratamiento es diferente.

43
00:06:07,300 --> 00:06:20,060
A partir de esta suspensión celular que hemos obtenido comienza la segunda fase. La segunda fase de lo que se trata es de la fase de extracción.

44
00:06:20,060 --> 00:06:53,350
Si bien en el pretratamiento muchas veces hay que hacer un proceso de disgregación, un proceso de disgregación en el cual vamos a disgregar las células para obtener la suspensión celular, en el proceso de extracción lo que vamos a hacer es un proceso de lisado o de lisis, de lisis celular.

45
00:06:53,350 --> 00:07:13,490
¿Esto qué significa? En la fase de extracción lo que vamos a hacer va a ser romper la pared y las membranas de estas células. De tal manera que ahora, después, el objetivo fundamental de la fase de extracción es obtener en nuestro tubito un lisado celular.

46
00:07:13,490 --> 00:07:26,500
¿Qué es el lisado celular? Pues el lisado celular no es ni más ni menos que el resultado de haber roto la pared y la membrana de las células

47
00:07:26,500 --> 00:07:32,779
Por tanto, aquí lo que vamos a tener es una mezcla heterogénea de todos los componentes del interior de la célula

48
00:07:32,779 --> 00:07:41,850
Entre ellos los ácidos nucleicos, aquí, pero también muchos otros componentes, muchísimos otros componentes

49
00:07:41,850 --> 00:08:01,860
A veces orgánulos, restos de membrana, núcleos enteros que no se han roto, proteínas, etc. De esta manera, una vez hemos acabado el proceso de extracción y tenemos un lisado celular, comienza la tercera fase.

50
00:08:01,860 --> 00:08:26,279
La tercera fase, ¿en qué consiste? Esta tercera fase consiste en la fase de purificación. ¿Qué hacemos en la purificación? En la purificación, como su nombre indica, lo que vamos a hacer va a ser de esta mezcla heterogénea quedarnos específicamente en nuestro tubito.

51
00:08:26,279 --> 00:08:34,259
ahora ya sí, separar los ácidos nucleicos del resto de componentes del lisado celular.

52
00:08:34,879 --> 00:08:41,159
De tal manera que aquí lo único que vamos a tener ahora ya son las moléculas de DNA o de RNA o de ácidos nucleicos

53
00:08:41,159 --> 00:08:48,860
liberadas, libres, de otros contaminantes, glúcidos, lípidos, proteínas, etc.

54
00:08:48,860 --> 00:08:55,919
De tal manera que aquí lo que obtenemos es lo que llamamos los ácidos nucleicos puros.

55
00:08:56,279 --> 00:09:12,950
¿Sí? Muy bien. Veremos que cada una de estas fases, el pretratamiento, la extracción, la purificación, tiene a su vez diferentes subfases y etapas. Esto lo iremos viendo ahora a lo largo del tema.

56
00:09:12,950 --> 00:09:44,009
Muy bien. Una vez ya hemos obtenido los ácidos nucleicos puros, ahora viene la cuarta fase. Y la cuarta fase es muy importante, que es la fase en la que vamos a evaluar la calidad de estos líneas, ¿sí?, para poder determinar si estos ácidos nucleicos puros que hemos extraído y purificado son de buena o de mala calidad.

57
00:09:44,009 --> 00:09:55,529
Esto es importante. Esto es muy importante. Y cuando hablamos de la calidad nos referimos a que vamos a medir y evaluar tres parámetros fundamentales.

58
00:09:56,269 --> 00:10:17,840
El primer parámetro es la integridad. ¿Qué es la integridad? La integridad nos da una idea de si este DNA, a lo largo de todo este proceso de pretratamiento, extracción y purificación, se ha degradado, se ha fragmentado, se ha estropeado.

59
00:10:17,840 --> 00:10:24,460
Entonces, en lugar de tener las moléculas de DNA, que sabemos que son muy grandes, las tenemos fragmentadas.

60
00:10:25,440 --> 00:10:28,059
El segundo parámetro es la pureza.

61
00:10:29,179 --> 00:10:42,519
En el proceso de purificación hemos intentado pescar de aquí, del lisado celular, hemos intentado pescar todos los ácidos nucleicos y separarlos del resto, que son contaminantes.

62
00:10:43,519 --> 00:10:47,620
El segundo parámetro de calidad es medir realmente la pureza.

63
00:10:47,840 --> 00:10:53,000
¿Hay contaminantes o no? Si hay contaminantes, ¿en qué concentración, en qué cantidad?

64
00:10:54,100 --> 00:11:10,019
Y por último, la concentración. ¿Por qué es importante medir la concentración? Es decir, ¿cuántos ácidos nucleicos tenemos en nuestro tubo de DNA purificado o RNA purificado?

65
00:11:10,019 --> 00:11:24,899
Es muy importante porque algunas de las técnicas de biología molecular requieren una cantidad mínima para que pueda llevarse a cabo. Entonces, hay que llegar a esa cantidad mínima para hacer una PCR, una secuenciación y una cloración.

66
00:11:24,899 --> 00:11:43,940
Bien, si todos estos parámetros nos dicen que son ácidos nucleicos de buena calidad, entonces ya la última fase que vendría, pero ya no de extracción y purificación, sino que ya la última fase que nos quedaría sería el almacenamiento.

67
00:11:43,940 --> 00:11:53,960
Estos ácidos nucleicos

68
00:11:53,960 --> 00:11:55,200
Hemos de almacenarlos

69
00:11:55,200 --> 00:11:56,299
Y esto es muy importante

70
00:11:56,299 --> 00:11:58,460
Porque si tengo unos ácidos nucleicos

71
00:11:58,460 --> 00:12:00,620
De una muestra muy valiosa

72
00:12:00,620 --> 00:12:03,440
Que tienen una integridad perfecta

73
00:12:03,440 --> 00:12:05,360
Son muy puros

74
00:12:05,360 --> 00:12:08,039
Y además a una concentración perfecta

75
00:12:08,039 --> 00:12:10,360
Pero los almaceno mal

76
00:12:10,360 --> 00:12:11,899
Y los guardo mal

77
00:12:11,899 --> 00:12:13,500
Cuando vaya a utilizarlos

78
00:12:13,500 --> 00:12:15,779
Quizás se me han degradado

79
00:12:15,779 --> 00:12:17,940
No por este proceso

80
00:12:17,940 --> 00:12:21,179
Sino porque no los he almacenado bien

81
00:12:21,980 --> 00:12:23,240
¿Entiende? Bien.

82
00:12:24,440 --> 00:12:26,980
Esta diapo es un pedelín, el resumen,

83
00:12:27,639 --> 00:12:30,960
el resumen de todo lo que vamos a ir viendo a lo largo de este tema.

84
00:12:31,440 --> 00:12:34,639
Entonces, de cada una de estas fases vamos a ver lo más importante,

85
00:12:35,000 --> 00:12:36,179
los conceptos más importantes.

86
00:12:36,700 --> 00:12:39,820
Entonces, vamos a comenzar con la fase de pretratamiento

87
00:12:39,820 --> 00:12:44,679
y cuál es el pretratamiento, el procesamiento previo

88
00:12:44,679 --> 00:12:48,100
de cada uno de los tipos de muestras

89
00:12:48,100 --> 00:12:54,279
que son más comunes en el laboratorio, sobre todo en el laboratorio clínico, pero en cualquier laboratorio.

90
00:12:54,740 --> 00:12:57,500
¿De acuerdo? Bien, pues vamos a comenzar.

91
00:12:59,240 --> 00:13:09,259
Perfecto. Como ya sabíamos y ya hemos estado diciendo, los ácidos nucleicos se pueden encontrar prácticamente en cualquier muestra biológica y la podemos extraer.

92
00:13:10,899 --> 00:13:16,799
Dependiendo de cuál sea esta muestra, se requiere un pretratamiento específico para esa muestra.

93
00:13:16,799 --> 00:13:40,419
¿Para qué? Porque el objetivo fundamental es obtener una suspensión celular. Las células de esa muestra, individuales unas de otras, ¿sí? Esto es una suspensión celular. Es una suspensión formada por células libres o pequeños agregados de células, pero que flotan dispersas en el seno del mundo. Normalmente una solución tamponadora de pinche.

94
00:13:40,419 --> 00:13:57,220
¿Sí? Bien. Las muestras más habituales que vamos a ir viendo suelen ser la muestra de sangre, sangre por venopunción. Es un tipo de muestra que se obtiene de forma muy fácil, no invasiva.

95
00:13:57,220 --> 00:14:06,980
A veces son cultivos celulares, tejidos, pero bien, tejidos tanto animales como vegetales que pueden ser frescos o embebidos en parafina.

96
00:14:07,679 --> 00:14:13,799
Estos los veremos, los dos tipos que nos pueden llegar al laboratorio y veremos algunas pinceladas de otro tipo de muestra.

97
00:14:13,980 --> 00:14:19,740
Por ejemplo, esputos o células de la mucosa oral, terias, levaduras, etc.

98
00:14:20,059 --> 00:14:25,580
Entonces, dependiendo del tipo de muestra que nos llegue al laboratorio, el pretratamiento es muy diferente.

99
00:14:25,580 --> 00:14:40,059
En cuanto a la sangre, es la muestra más habitual porque es muy fácil de obtener, no es invasiva. Fijaos, os he puesto aquí este esquema solamente para que veamos la complejidad. Entonces, en la sangre es que en realidad todos son contaminantes.

100
00:14:40,059 --> 00:14:57,139
Toda esta parte de aquí abajo son contaminantes que están en el plasma. El plasma es el 55% aproximadamente del contenido de la sangre y el 45% son las células o lo que llamamos elementos formes.

101
00:14:57,139 --> 00:15:13,899
Y de ellos, el 90% son los hematíes, eritrocitos. Para extraer y purificar DNA no nos interesan los eritrocitos. ¿Por qué? Porque los eritrocitos no tienen núcleo, no tienen DNA, lo perdieron en su proceso de maduración.

102
00:15:13,899 --> 00:15:30,200
Las plaquetas tampoco nos sirven porque en realidad no son células, son fragmentos celulares, fragmentos citoplasmáticos. La fase que nos interesa de todos los componentes de la sangre son los glucocitos, los glóbulos blancos. En concreto, va a ser posible monocitos y linfocitos.

103
00:15:30,200 --> 00:15:46,139
¿De acuerdo? Entonces, el pretratamiento de la sangre tiene como objetivo fundamental el aislar y purificar el DNA de los leucocitos. Y se pueden hacer dos procedimientos, que los tenéis en los apuntes.

104
00:15:46,139 --> 00:15:47,919
esto solamente

105
00:15:47,919 --> 00:15:50,799
bien, para tener en cuenta

106
00:15:50,799 --> 00:15:53,000
que podamos obtener DNA de buena calidad

107
00:15:53,000 --> 00:15:54,500
bueno, yo hablo de DNA

108
00:15:54,500 --> 00:15:56,799
pero en realidad quiero decir extraer

109
00:15:56,799 --> 00:15:58,740
o purificar ácidos nucleicos en general

110
00:15:58,740 --> 00:16:00,700
¿de acuerdo? la sangre

111
00:16:00,700 --> 00:16:02,019
tiene que estar anticoagulada

112
00:16:02,019 --> 00:16:04,179
con cualquiera de los anticoagulantes

113
00:16:04,179 --> 00:16:06,440
EDTA, heparina o citrato

114
00:16:06,440 --> 00:16:09,919
y se debe realizar

115
00:16:09,919 --> 00:16:12,779
a las 24 horas siguientes de la extracción

116
00:16:12,779 --> 00:16:13,879
eso es importante

117
00:16:13,879 --> 00:16:31,120
Para que no se empiecen a deteriorar los leucocitos. Pero si no se pudiese realizar, se puede conservar hasta cinco días, tres como máximo. Pero vamos, si la muestra es muy valiosa, hasta cinco días en la nieve. ¿De acuerdo? Y después hacer todo el pretratamiento y todo lo que vamos a ver.

118
00:16:31,120 --> 00:16:49,799
Hay dos tipos de pretratamiento. El primer tipo de pretratamiento es, si tú me has dicho que la gran mayoría de las células que hay en la sangre son los hematíes, los eritrocitos, un hematíe para nosotros no es ni más ni menos que una membrana como si fuera una bolsa llena de hemoglobina.

119
00:16:49,799 --> 00:17:05,799
Y la hemoglobina es una proteína muy contaminante, muy contaminante porque es muy grande, tiene cuatro cadenas y además tiene átomos de hierro que van muy mal para las técnicas de biología molecular, nivel APCR, etc.

120
00:17:05,799 --> 00:17:22,220
Bien, pues el primer pretratamiento es, vamos a quitarnos de en medio los hematíes y los lisamos, rompemos los hematíes. Entonces, en este primer tipo de pretratamiento de sangre, lo que se hace es en cuatro pasos, ¿sí?

121
00:17:22,220 --> 00:17:27,099
Aquí lo primero que hacemos es lizar los hematitis. ¿Cómo? Con una solución de lisis.

122
00:17:27,720 --> 00:17:48,119
Ahora veremos la solución de lisis. La solución de lisis puede ser porque es una solución que lleva sales a muy baja concentración, de manera que el agua entra dentro de los eritrocitos y los revienta.

123
00:17:48,799 --> 00:17:49,880
Lisis osmótica.

124
00:17:50,619 --> 00:17:56,019
Y otras soluciones de lisis lo que llevan son detergentes, como por ejemplo el tritón, que lo tenemos aquí abajo.

125
00:17:57,119 --> 00:18:02,059
Entonces lo que hacen es desestabilizar la membrana con todos los detergentes y lisan la célula.

126
00:18:02,759 --> 00:18:07,500
Una vez hemos lisado las células, lo que tenemos en el tubo es una hemólisis.

127
00:18:07,859 --> 00:18:11,920
Tenemos en el tubo todo lleno de hemoglobina junto con las proteínas plasmáticas.

128
00:18:12,519 --> 00:18:14,680
Y lo que hacemos es centrifugar la muestra.

129
00:18:14,680 --> 00:18:30,920
De tal manera que ahora las partículas más gruesas, más grandes son los leucocitos y todos los leucocitos que tenemos pues van a ir migrando por la centrifugación al fondo del tubo y se van a quedar aquí formando un pellet o un sedimento.

130
00:18:30,920 --> 00:18:56,880
Lo único que tenemos que hacer después de centrifugar es eliminar todo el sobrenadante, tiramos y nos quedamos con el segmento y lo resuspendemos en un buffer determinado de tal manera que ahora tendremos en nuestro tubito, en el seno de esta solución tamponadora de pH, vamos a tener todos nuestros leucocitos, la suspensión celular que buscábamos.

131
00:18:56,880 --> 00:19:22,519
Es un proceso rápido y sencillo. Para algunas técnicas en concreto nos piden que obtengamos lo que se llaman los PBMCs, que son las células de sangre periférica pero que son mononucleadas, peripheral blood mononuclear cells en inglés.

132
00:19:22,519 --> 00:19:25,960
¿Cuáles son estas células mononucleadas?

133
00:19:26,339 --> 00:19:31,680
Estas células mononucleadas son fundamentalmente monocitos y linfocitos

134
00:19:31,680 --> 00:19:37,500
Neutrófilos, eosinófilos, vasófilos, que son los granulocitos

135
00:19:37,500 --> 00:19:39,599
No nos sirven porque tienen el núcleo bilobulado

136
00:19:39,599 --> 00:19:43,200
Y en el proceso es muy fácil que se rompan estos tallos

137
00:19:43,200 --> 00:19:48,960
Y entonces aislamos pequeños lóbulos que no tienen todo el material genético de las células

138
00:19:48,960 --> 00:20:12,700
Pero monocitos y linfocitos tienen un núcleo que no es lobulado. Para poder purificar de la sangre específicamente estos leucocitos, pongo aquí más o menos donde están, son estos los monocitos y los linfocitos, se hace un proceso que se llama centrifugación en gradiente de densidad.

139
00:20:12,700 --> 00:20:24,039
Es decir, que vamos a centrifugar, pero con un medio de separación que nos va a permitir obtener los PBMCs de forma selectiva.

140
00:20:24,299 --> 00:20:26,539
Este medio de separación tiene dos componentes.

141
00:20:27,559 --> 00:20:35,440
Por un lado, el ficol, que es un polisacárido muy denso, muy muy muy denso, y el diatrizodato sódico.

142
00:20:36,180 --> 00:20:42,099
Uno aporta la densidad, el ficol, y el otro la osmolaridad, el diatrizodato sódico.

143
00:20:42,099 --> 00:20:55,920
Cada uno tiene su función dentro del medio de separación. ¿Cuál es el procedimiento? Pues el procedimiento es muy sencillo. Cogemos un tubo de centrífuga y ponemos el medio de separación en la parte de abajo.

144
00:20:55,920 --> 00:21:16,099
Muy denso, como es muy denso, se va al fondo del tubo y después con mucho cuidado colocamos la sangre encima, dejándola resbalar por la pared y que se vaya depositando por encima del medio de separación sin que se mezclen, sin que se mezclen con mucho cuidado y así se forman dos fases.

145
00:21:16,839 --> 00:21:22,880
Bien, y lo que hacemos ahora es centrifugamos bastante rato y a baja velocidad.

146
00:21:23,839 --> 00:21:30,359
¿Qué es lo que ocurre? Al centrifugar todos los componentes que hay aquí van a ir atravesando el ficol, ¿sí?

147
00:21:30,980 --> 00:21:35,000
Y a cada uno de los componentes, al atravesar el ficol, le pasan cosas diferentes.

148
00:21:35,799 --> 00:21:41,890
El ficol en los hematíes facilita que se agreguen.

149
00:21:41,890 --> 00:22:06,430
Si los hematíes se agregan, ya no tenemos células pequeñitas, sino que tenemos agregados multiritrocitos de grandísimo tamaño. Podemos tener un montón de eritrocitos. Imaginaos estos agregados de eritrocitos, ¿dónde van? Exactamente, al fondo del tubo. ¿Por qué? Porque ahora ya son agregados de grandísimo tamaño, al fondo del tubo.

150
00:22:06,430 --> 00:22:19,589
Bien, ¿qué ocurre con los granulocitos? Los granulocitos tienen una mayor densidad que el ficol. Si tienen mayor densidad que el ficol, no lo pueden atravesar y se van a quedar encima del ficol, aquí.

151
00:22:19,589 --> 00:22:38,349
Los neutrófilos, por ejemplo, que vayan por aquí, por aquí, por aquí, cuando lleguen con el ficol no lo pueden atravesar porque son más densos. Se quedan ahí arriba. ¿Sí? Perdón, perdón, perdón. Me estoy equivocando con los linfocitos. Eso es. Los granulocitos también se van al fondo del tubo. Cierto. Que me he equivocado.

152
00:22:38,349 --> 00:22:53,329
Y son las células mononucleares las que no pueden atravesarlo porque tienen menor densidad. Eso es, eso es. Disculpa el despido. De tal manera que después de centrifugar tenemos cinco fases.

153
00:22:53,329 --> 00:23:00,430
Red blood cells, los eritrocitos al fondo del tubo, ya hemos dicho que formaban unos agregados de enorme tamaño

154
00:23:00,430 --> 00:23:10,430
Los granulocitos, eosinófilos, vasófilos y neutrófilos, justo por encima de los eritrocitos

155
00:23:10,430 --> 00:23:13,029
Pero atraviesan el ficol porque tienen mayor densidad

156
00:23:13,029 --> 00:23:15,390
A continuación, la capa de ficol

157
00:23:15,390 --> 00:23:22,190
Por encima, los pbmc, porque los pbmc tienen menos densidad, no pueden atravesar el ficol

158
00:23:22,190 --> 00:23:50,829
Y el plasma queda por encima, con todas sus proteínas plasmáticas. ¿Veis? Estas son imágenes reales de un ficol antes de centrifugar. Ya hemos puesto el ficol y hemos depositado la sangre formando estas dos fases. Lo ponemos a centrifugar y aquí se ven las células mononucleares, polimorfonucleares, que son los granulocitos, todo el medio de separación, las células mononucleares, que serían esta interfaz de aquí, y todo el plasma.

159
00:23:50,829 --> 00:24:03,210
¿De acuerdo? Lo único que tenemos que hacer ahora es retirar con cuidado el plasma y coger los PBMCs que estarían aquí. Y ya lo sabríamos. Lo resuspendemos y ya tenemos nuestra suspensión celular de PBMCs.

160
00:24:03,210 --> 00:24:21,210
Bien. Es un poquito lo que os digo. ¿De acuerdo? Bien. Otro tipo de muestra muy habitual en los laboratorios son fragmentos de tejido fresco. Por ejemplo, decíamos antes una biopsia.

161
00:24:21,210 --> 00:24:28,890
biopsia. El pretratamiento no es ni más ni menos que una disgregación. Vamos a disgregar

162
00:24:28,890 --> 00:24:34,950
este tejido para intentar liberar las células de aquí y sacarlas de aquí, porque todas

163
00:24:34,950 --> 00:24:39,309
las células en el tejido están dentro de una matriz extracelular. Esta disgregación

164
00:24:39,309 --> 00:24:45,769
puede ser mecánica, puede ser química, vamos a verlo ahora, para poder obtener una suspensión

165
00:24:45,769 --> 00:25:05,769
Bien, de momento nos quedamos aquí. Muy bien, el pretratamiento para tejidos frescos es lo que llamamos homogeneización. Hay que homogeneizar el tejido, que es un tratamiento bien mecánico o químico al que se somete el tejido para liberar y desintegrar las células que lo integra.

166
00:25:05,769 --> 00:25:19,349
Integra. ¿Cuánto tejido necesito? Pues depende, depende. Depende del tipo de tejido, del proceso que voy a utilizar para homogenizar y después el procedimiento posterior de extracción.

167
00:25:19,349 --> 00:25:29,049
Pero bueno, para tejidos animales y vegetales, no sé bien si vienen los apuntes o no, pero bueno, me parece que no es muy importante, pues se necesita más o menos cantidad.

168
00:25:29,430 --> 00:25:37,210
Tejidos vegetales, como tienen mucha pared, pues claro, necesitan mucha más cantidad de tejido de partida para obtener la misma cantidad de denier.

169
00:25:38,289 --> 00:25:42,130
Bien, un ejemplo es la homogenización mecánica.

170
00:25:42,130 --> 00:26:03,289
Además es una homogenización mecánica que actualmente se lleva de forma automatizada. Y se utilizan trituradores mecánicos. Por ejemplo, este es un ejemplo de esos trituradores mecánicos en los cuales se utilizan unas microsferas, unas bolitas, que pueden ser de látex, de plástico, de cristal, de metal, de un grosor diferente.

171
00:26:03,289 --> 00:26:07,210
Hay diferentes diámetros dependiendo de la dureza y la resistencia del tejido.

172
00:26:07,589 --> 00:26:13,289
No es lo mismo un tejido blando, tejido diposo, que un tejido cartilaginoso que tiene mucho colágeno.

173
00:26:14,670 --> 00:26:25,430
Entonces aquí meteríamos nuestro tejido con un buffer determinado y esto que parece una centrifuga lo único que hace es agitar hacia arriba y hacia abajo continuamente.

174
00:26:25,430 --> 00:26:27,009
Sí, sí, hacia arriba y hacia abajo.

175
00:26:27,349 --> 00:26:34,170
Tan fuerte que obliga a que las esferas choquen continuamente con el tejido y lo, digamos, trituran.

176
00:26:34,609 --> 00:26:36,490
Esto es una trituración mecánica.

177
00:26:37,670 --> 00:26:42,589
Luego lo que haríamos sería recoger todo este sobrenadante que tenemos las células.

178
00:26:43,009 --> 00:26:44,670
Ya no tendremos tejido, sino las células.

179
00:26:46,269 --> 00:26:48,490
Bueno, se puede hacer también de manera manual.

180
00:26:49,490 --> 00:26:51,609
Clásicamente se utilizaban estos morteros.

181
00:26:51,869 --> 00:26:53,130
Actualmente ya no se hace así.

182
00:26:53,130 --> 00:27:17,150
Y aunque lo, creo que está en los apuntes, lo que hacíamos era, lo que se hacía es una congelación rapidísima en nitrógeno líquido, de tal manera que coges el tejido y lo petrificas y después lo conviertes en polvo con el brazo del mortero y ya después añadirías una solución tamponadora para poder resuspender las células.

183
00:27:17,150 --> 00:27:23,549
También se utiliza mucho, en lugar de una homogenización mecánica, una química

184
00:27:23,549 --> 00:27:33,730
Para ello lo que hacemos es coger el tejido y lo incubamos a alta temperatura durante mucho tiempo

185
00:27:33,730 --> 00:27:40,069
Con una solución disigregadora que tiene detergentes y proteasas

186
00:27:40,069 --> 00:27:42,089
La que más se utiliza es la proteína Saka

187
00:27:42,089 --> 00:27:45,450
La veremos también más adelante

188
00:27:45,450 --> 00:27:55,269
La proteína saca es un enzima proteolítico que digiere las proteínas de la matriz extracelular de manera que libera las células de origen.

189
00:27:56,490 --> 00:28:03,210
Luego centrifugaríamos, recogemos el sobranante, que es donde tenemos nuestras células en suspensión.

190
00:28:03,509 --> 00:28:04,269
Bien.

191
00:28:04,269 --> 00:28:13,569
Otras veces, en lugar de quedarnos aquí en la suspensión celular

192
00:28:13,569 --> 00:28:19,430
Si hay poquitas células del tejido, a veces nos conviene ponerlas y cultivarlas

193
00:28:19,430 --> 00:28:22,089
Y hacer lo que llamamos un cultivo primario, si os acordáis

194
00:28:22,089 --> 00:28:25,349
Entonces, estas poquitas células del paciente

195
00:28:25,349 --> 00:28:29,789
Que las hemos desgregado de su tejido, de la biopsia

196
00:28:29,789 --> 00:28:32,009
Las vamos a expandir un litro

197
00:28:32,009 --> 00:28:54,809
Entonces, a veces al laboratorio, para que podamos extraer y purificar el DNA, nos dan una plaquita y de estas células que están en cultivo tenemos que extraer los ácidos nucleicos. El pretratamiento no es ni más ni menos que la recolección de las células. Vamos a coger estas células y ya depende de si es un cultivo en suspensión o un cultivo en monocapa.

198
00:28:54,809 --> 00:29:11,750
Si las células ya están en suspensión y están creciendo en suspensión, lo único que hago es centrifugar la muestra, ¿sí? Centrifugamos la muestra, se van todas las células al fondo del tubo, retiro el sobrenadante, ¿sí?

199
00:29:11,750 --> 00:29:22,890
Y lo que hago es, este pellet ahora lo resusprendo con un medio que a mí me interesa para tener finalmente la suspensión celular. Muy bien, muy fácil.

200
00:29:23,710 --> 00:29:37,049
Si están creciendo en monocapa, antes de centrifugar desde la plaquita donde están creciendo, si os acordáis, esto en el tema de cultivos celulares se ve, lo primero que tenemos que hacer es tripsinizar las células.

201
00:29:37,049 --> 00:29:42,309
y sinizar las células para despegarlas del fondo de la placa.

202
00:29:42,589 --> 00:29:45,589
Y una vez las hemos tripsinizado, seguimos el mismo proceso.

203
00:29:46,309 --> 00:29:48,910
Centrifugamos las células que se irán al fondo del tubo,

204
00:29:49,009 --> 00:29:52,970
retiramos el sobrenatante, añadimos una solución adecuada

205
00:29:52,970 --> 00:29:54,950
y ya tenemos nuestra suspensión.

206
00:29:57,430 --> 00:30:01,450
Esto es un poquito lo que muestran aquí los diferentes tipos de células

207
00:30:01,450 --> 00:30:03,970
y los diferentes tipos de procedimientos.

208
00:30:04,430 --> 00:30:07,269
Los tenéis aquí en la presentación, pero básicamente es como se ha hecho.

209
00:30:08,089 --> 00:30:08,410
¿De acuerdo?

210
00:30:08,490 --> 00:30:09,829
Bien

211
00:30:09,829 --> 00:30:12,710
Vaya, pero algunas veces

212
00:30:12,710 --> 00:30:13,609
Esos tejidos

213
00:30:13,609 --> 00:30:17,390
No nos vienen a nosotros directamente

214
00:30:17,390 --> 00:30:19,349
Es decir

215
00:30:19,349 --> 00:30:22,069
Tiro un poquito para atrás

216
00:30:22,069 --> 00:30:24,990
Este tejido

217
00:30:24,990 --> 00:30:27,750
Antes de llegar al laboratorio clínico

218
00:30:27,750 --> 00:30:29,970
Puede haber pasado por el laboratorio

219
00:30:29,970 --> 00:30:31,470
De anatomía patológica

220
00:30:31,470 --> 00:30:34,150
Entonces en el laboratorio de anatomía patológica

221
00:30:34,150 --> 00:30:36,750
Este tejido lo van a fijar

222
00:30:36,750 --> 00:30:38,410
Por lo tanto ya no es un tejido fresco

223
00:30:38,410 --> 00:30:50,410
Lo han fijado para intentar evitar que se pudra los fenómenos de putrefacción. Lo han metido en parafina para poder hacer cortes finísimos y poder estudiarlo al microscopio.

224
00:30:51,549 --> 00:31:01,369
Entonces nosotros a veces luego, por ejemplo, el oncólogo nos dice, bueno, tenéis que hacer un análisis genético para ver mutaciones en este tejido.

225
00:31:01,369 --> 00:31:07,470
Entonces, lo que nos manda a nosotros al laboratorio son varios cortes.

226
00:31:09,150 --> 00:31:22,549
Entonces, cuando un tejido está fijado en formol, el objetivo fundamental de esta fijación es preservar su arquitectura y la estructura de las células y evitar los fenómenos de putrefacción del tejido.

227
00:31:23,549 --> 00:31:30,430
Y para que se conserve bien y se pueda cortar, son incluidos en bloques de paracina, de cera líquida, que luego solidifica.

228
00:31:31,369 --> 00:31:38,730
Bien, se puede fijar por inyección, tal y como se ve aquí, por inmersión

229
00:31:38,730 --> 00:31:43,910
Pero bueno, una cosa que sí que tenemos que tener en cuenta, que es muy importante a tener en cuenta

230
00:31:43,910 --> 00:31:51,309
Es que la calidad de los ácidos nucleicos que vienen de estas muestras es mucho peor que el resto de muestras frescas

231
00:31:51,309 --> 00:31:54,869
¿Por qué? Porque la fijación deteriora los ácidos nucleicos

232
00:31:54,869 --> 00:32:06,789
Y para incluir en parafina, hemos de incubar la muestra durante mucho tiempo a elevadas temperaturas. Estamos hablando de 65 grados aproximadamente durante mucho tiempo.

233
00:32:07,569 --> 00:32:19,970
Entonces, el proceso para que podamos entender qué es lo que hacemos nosotros en el laboratorio, tenemos que intentar entender qué es lo que hacen los de anatomía patológica en el laboratorio para fijar e incluir en parafina.

234
00:32:20,950 --> 00:32:30,829
Fijaos, cuando llega el tejido, lo que hacen es la fijación, que puede ser por perfusión o por inmersión, en formol normalmente.

235
00:32:31,589 --> 00:32:37,009
Después de un tiempo determinado, según sus protocolos, lo que hacen es deshidratar el tejido.

236
00:32:37,670 --> 00:32:43,849
Lo deshidratan. El tejido está lleno de agua. El 70% del contenido de la célula es agua.

237
00:32:43,849 --> 00:32:52,190
Entonces lo que van haciendo para deshidratar es cambiar el agua de las células y del tejido por etanol

238
00:32:52,190 --> 00:33:00,269
Y para eso incuban y hacen varios lavados, 3 de 10 minutos, en diferentes soluciones

239
00:33:00,269 --> 00:33:07,789
Con etanol, alcohol, cada vez de graduación mayor, hasta que llegan a etanol 100%

240
00:33:07,789 --> 00:33:12,029
Esto lo que permite es que el agua que hay en las células se intercambie

241
00:33:12,029 --> 00:33:15,849
Se diluya, se intercambia con el etanol

242
00:33:15,849 --> 00:33:22,369
De tal manera que ahora, como fuera, hay muchísimo más etanol que agua

243
00:33:22,369 --> 00:33:26,910
El agua del tejido sale y entra dentro de las células etanol

244
00:33:26,910 --> 00:33:30,930
Eso mismo ocurre aquí, ocurre aquí

245
00:33:30,930 --> 00:33:34,769
Y cuando estamos en etanol 100%, el tejido está deshidratado

246
00:33:34,769 --> 00:33:37,430
Ya no hay agua dentro de las células

247
00:33:37,430 --> 00:33:38,829
Lo que hay es etanol puro

248
00:33:38,829 --> 00:34:01,710
Y lo que hacemos ahora es incubar con un líquido intermedio, lo que llamamos un transicional. Por ejemplo, el xileno, el xilol o el butanol, que es otro alcohol de etanol, que después de estos lavados, el etanol es cambiado, sustituido por el xilol, xileno o por el butanol, que también se utiliza mucho.

249
00:34:01,710 --> 00:34:28,949
El butanol. ¿Y esto qué gracia tiene? ¿Por qué no nos vale el etanol? Porque el xilol y el butanol son diluyentes de la parafina. Entonces, ahora lo metemos en una estufa a unos 60 grados y lo que hacemos ahora son diferentes lavados en el que ponemos el tejido que está repleto de xilol y butanol, lo metemos dentro de parafina líquida.

250
00:34:28,949 --> 00:34:48,269
Lavados largos, una hora, una hora, dos horas, de tal manera que ahora como la parafina se diluye en el xilol, donde hay xilol o butanol, entra la parafina y todo el tejido queda embebido, todas las células por dentro ya no tienen xilol.

251
00:34:48,269 --> 00:35:06,769
Donde había agua, pusimos etanol. Donde había etanol, lo cambiamos por xilolbutanol. Y ahora, donde había etanol, xilolbutanol, tenemos cera. Parafina. Perfecto. Tenemos las células repletas hasta arriba de parafina.

252
00:35:06,769 --> 00:35:25,909
Y lo único que hacemos es meter el tejido embebido en parafina en un encastre, ¿sí? Que es como una especie de molde, más o menos, y ya dejamos solidificar, ¿sí? Lo dejamos solidificar y obtenemos nuestro bloque de parafina listo para poder ser corta.

253
00:35:25,909 --> 00:35:38,389
Bien, esto es un ejemplo de un bloque de parafina con diferentes tejidos, uno, dos, tres, que los han embebido, aquí tenemos el molde y después de solidificar aquí lo tenemos.

254
00:35:38,389 --> 00:35:50,730
Y lo que hacemos es con estos bloques, lo metemos aquí en un microtomo y le vamos dando a la manivela. Por cada vuelta de la manivela, esto es como si fuera un émbolo que sube y baja.

255
00:35:50,730 --> 00:36:16,789
Cada vez que sube y baja, aquí tenemos una cuchilla, esta parte de aquí. Cuando baja, realiza un corte del grosor que nosotros le indicamos aquí. 10 micras, 5 micras, 20 micras. Cada giro que da, baja, hace el corte y cuando vuelve a subir, esto sale hacia afuera, lo que le hayamos puesto aquí. 10 micras, 20 micras. Y volvemos a hacer otro corte, y otro corte, y otro corte.

256
00:36:16,789 --> 00:36:31,949
Bien, cuando pedimos una muestra para hacer un análisis genético desde el laboratorio de biología molecular, nos mandan cuatro o cinco cortes de estos, de los cuales tenemos que extraer y purificar el lémina.

257
00:36:31,949 --> 00:36:43,949
Bien, perfecto. Pues entonces, una vez nos han llegado esos cortes, el proceso que tenemos que realizar es el proceso inverso a lo que han hecho en anatomía patológica.

258
00:36:44,949 --> 00:36:54,969
Tenemos el tejido dividido en parafina. Lo primero que hacemos es meterlo a 60 grados para que toda la parafina del tejido se vuelva líquida, se licúe.

259
00:36:54,969 --> 00:37:04,769
Y lo que hacemos ahora es intercambiar y cambiar la parafina por xilol o putanol, haciendo varios lavados.

260
00:37:05,449 --> 00:37:13,030
Después hacemos la serie de etanoles, pero no para deshidratar. En este caso ahora sería para rehidratar.

261
00:37:14,110 --> 00:37:16,210
¿Sí? Rehidratar. Y vamos para atrás.

262
00:37:20,340 --> 00:37:26,920
Y una vez ya tenemos rehidratada la muestra, ahora ya sí, a partir de aquí, podemos deshidratar las células

263
00:37:26,920 --> 00:37:29,659
para tener una suspensión celular.

264
00:37:30,800 --> 00:37:32,099
¿De acuerdo? Bien.

265
00:37:33,039 --> 00:37:35,500
Bueno, aquí os pongo en la presentación un poco el protocolo,

266
00:37:35,880 --> 00:37:37,260
pero básicamente es esto.

267
00:37:37,820 --> 00:37:38,480
¿De acuerdo? Pues acabo.

268
00:37:39,079 --> 00:37:42,360
¿Qué otras muestras biológicas nos pueden llegar al laboratorio?

269
00:37:42,539 --> 00:37:46,420
Por ejemplo, cultivos de bacterias y levaduras del Laboratorio de Microbiología.

270
00:37:46,420 --> 00:37:52,420
Esta es una placa de Agar-Levin con estas colonias muy características verde metalizadas

271
00:37:53,019 --> 00:37:54,719
que son de Escherichia coli.

272
00:37:54,719 --> 00:38:05,639
Pues nada, aquí lo único que tenemos que hacer es coger estas células, estas colonias que están en la célula y hacer una suspensión celular como en un tampón de resuspensión de suspensión.

273
00:38:06,099 --> 00:38:17,119
Bien, y entonces si es un cultivo líquido, pues aquí tendríamos nuestros tubos y aquí tendríamos todas las bacterias, pues jugamos como si fuera un cultivo de células en suspensión.

274
00:38:17,440 --> 00:38:24,059
Serían al fondo del tubo, retiro el niño de cultivo, el sobrenadante, etcétera, como hemos visto antes.

275
00:38:24,719 --> 00:38:34,519
Y si es en un medio sólido, lo que hacemos es recogemos una colonia y la resuspendemos en un tubo en el que tenemos un medio de resuspensión.

276
00:38:34,519 --> 00:38:36,019
Y aquí la resuspendemos.

277
00:38:37,280 --> 00:38:39,519
Y ya lo tenemos. Es sencillo.

278
00:38:40,440 --> 00:38:42,340
Células de la mucosa oral, lo mismo.

279
00:38:43,219 --> 00:38:50,960
Cogemos, centrifugamos la suspensión celular y a veces hay soluciones y kits comerciales que lo hacen en un único paso.

280
00:38:52,260 --> 00:38:53,219
¿Sí? Bien.

281
00:38:53,219 --> 00:38:56,659
se pueden utilizar este tipo de cepillitos

282
00:38:56,659 --> 00:38:58,539
a veces en prácticas

283
00:38:58,539 --> 00:39:00,420
del laboratorio

284
00:39:00,420 --> 00:39:02,659
lo hacemos con los estudiantes para rascar

285
00:39:02,659 --> 00:39:04,559
las mejillas por la parte interior

286
00:39:04,559 --> 00:39:06,699
y así poder coger más células

287
00:39:06,699 --> 00:39:07,880
y más cantidad de ADN

288
00:39:07,880 --> 00:39:10,980
si es una muestra

289
00:39:10,980 --> 00:39:12,400
de esputo por ejemplo de un paciente

290
00:39:12,400 --> 00:39:14,739
que tiene neumonía hay que fluidificar

291
00:39:14,739 --> 00:39:16,380
porque tiene una elevada

292
00:39:16,380 --> 00:39:17,980
cantidad de mucosidad

293
00:39:17,980 --> 00:39:20,300
ya sabéis que se utiliza un agente

294
00:39:20,300 --> 00:39:22,320
mucolítico como es la N-acetil

295
00:39:22,320 --> 00:39:30,679
cisteína, en la disolución de citrato sódico, la acetilcisteína está en todos los jarabes

296
00:39:30,679 --> 00:39:38,119
mucolíticos para descongestionar cuando tenemos un catarro fuerte. Pues hacemos un primer

297
00:39:38,119 --> 00:39:44,039
tratamiento del esputo para fluidificar la muestra y después de ahí extraemos las células.

298
00:39:44,039 --> 00:39:59,579
¿Sí? Bien, pues entonces os recuerdo, independientemente de cuál era la muestra de partida, ¿sí? Sangre, todas las que hemos estado viendo, hemos realizado un pretratamiento, ¿sí?

299
00:39:59,579 --> 00:40:06,739
Y en este pretratamiento, el resultado final ha sido obtener una suspensión celular.

300
00:40:07,239 --> 00:40:14,840
Aquí, en un tubito, en el seno de un fluido, vendría ahora la fase de extracción, que es la segunda parte.

301
00:40:16,039 --> 00:40:21,179
Bien, el proceso de extracción consiste en la obtención del lisado celular.

302
00:40:21,539 --> 00:40:27,119
Por tanto, a las células vamos a romper las paredes y las membranas para obtener un lisado,

303
00:40:27,119 --> 00:40:39,880
que es una mezcla, ni más ni menos, que a partir de esta suspensión celular vamos a obtener en nuestro tubo una mezcla heterogénea de todos los componentes intracelulares,

304
00:40:40,199 --> 00:40:51,539
desde núcleos completos, orgánicos completos, restos de membranas, proteínas, glúcidos, y por aquí entre medias tendremos las hebras de nuestros ácidos nucleicos.

305
00:40:52,019 --> 00:40:56,940
¿Sí? Bien. Ya vendrá después la fase de purificación.

306
00:40:57,119 --> 00:41:04,900
Bien, para poder romper las células, los tejidos y extraer los ácidos nucleicos del interior de la célula

307
00:41:04,900 --> 00:41:06,380
tenemos muchos métodos

308
00:41:06,380 --> 00:41:13,380
Hay métodos mecánicos, por ejemplo, por sonicación con ondas de radiofrecuencia, de elevada energía

309
00:41:13,380 --> 00:41:17,880
que lo que hacen es que rompen al chocar las ondas, que son ondas físicas

310
00:41:17,880 --> 00:41:20,019
al chocar con la membrana, la rompen

311
00:41:20,019 --> 00:41:22,519
podemos utilizar detergentes

312
00:41:22,519 --> 00:41:25,059
o hacerlas pasar a alta presión

313
00:41:25,059 --> 00:41:27,280
por un espacio pequeño, capilar muy estrecho

314
00:41:27,280 --> 00:41:29,360
de tal manera que la membrana no resiste

315
00:41:29,360 --> 00:41:30,260
y se rompe

316
00:41:30,260 --> 00:41:32,059
o por zigzagueamiento

317
00:41:32,059 --> 00:41:35,099
el short cells

318
00:41:35,099 --> 00:41:36,880
es esto, utilizar un émbolo

319
00:41:36,880 --> 00:41:38,739
que va dando vueltas

320
00:41:38,739 --> 00:41:41,059
de tal manera que el espacio que queda entre la pared

321
00:41:41,059 --> 00:41:42,360
y el émbolo es muy estrecho

322
00:41:42,360 --> 00:41:43,639
muy parecido a este método

323
00:41:43,639 --> 00:41:46,940
y entonces las células tienen que quedarse aquí aplastadas

324
00:41:46,940 --> 00:41:47,659
y reventar

325
00:41:47,659 --> 00:41:51,019
Métodos mecánicos, métodos más químicos

326
00:41:51,019 --> 00:41:53,559
Eso ya depende del método

327
00:41:53,559 --> 00:41:55,559
Vamos a ver los que más se utilizan

328
00:41:55,559 --> 00:41:55,780
¿Sí?

329
00:41:56,579 --> 00:41:56,840
Bien

330
00:41:56,840 --> 00:42:00,360
El proceso de extracción implica

331
00:42:00,360 --> 00:42:02,760
Dos etapas

332
00:42:02,760 --> 00:42:04,780
O dos cosas que se pueden hacer a la vez

333
00:42:04,780 --> 00:42:05,820
Y son muy importantes

334
00:42:05,820 --> 00:42:08,019
Por un lado, como hemos dicho, la lisis celular

335
00:42:08,019 --> 00:42:10,380
Para liberar los ácidos nucleicos

336
00:42:10,380 --> 00:42:11,880
Hay que romper la pared

337
00:42:11,880 --> 00:42:13,780
Si es que tienen pared, esas células

338
00:42:13,780 --> 00:42:14,719
Y la membrana

339
00:42:14,719 --> 00:42:17,539
Pero en segundo lugar, hay que inhibir

340
00:42:17,539 --> 00:42:39,099
Inactivas las nucleasas. Es decir, las DNAs y RNAs. Las DNAs son enzimas nucleasas que fragmentan una molécula de DNA. Cogen cualquier molécula de DNA y la empiezan a fragmentar. De tal manera que cuando analicemos la integridad, si hay DNAs, habrá fragmentos de DNA. Trozos. DNA trocea.

341
00:42:39,099 --> 00:42:44,800
Y las RNAs es lo mismo, pero específicamente de las moléculas que son de RNA.

342
00:42:46,539 --> 00:42:57,280
Bien, pues de alguna manera tenemos que llevar a cabo todos los procesos a la hora, a la vez que rompemos las células, intentar inactivar estas nucleasas que están en todos lados.

343
00:42:57,719 --> 00:43:03,800
Las células tienen nucleasas en su interior y sobre todo las RNAs además son muy resistentes.

344
00:43:03,800 --> 00:43:12,500
sistemas. Bien. Esto lo conseguimos incubando la suspensión celular con una solución de

345
00:43:12,500 --> 00:43:18,719
lisis. ¿Qué es esto de una solución de lisis? Una solución con diferentes componentes que

346
00:43:18,719 --> 00:43:24,519
me van a permitir lisar las células e inactivar las nucleasas. ¿Sí? Las células que tienen

347
00:43:24,519 --> 00:43:28,039
pared vegetal, pues a veces, además de incubar con solución de lisis, habrá que hacer alguna

348
00:43:28,039 --> 00:43:36,900
cosa más que lo que veremos después. ¿De acuerdo? Bien. ¿Cuáles son los componentes

349
00:43:36,900 --> 00:43:42,639
de la solución de lisis? Este apartado es muy importante. Podéis poner aquí un asterisco

350
00:43:42,639 --> 00:43:49,239
y poner al lado muy importante. Probabilidad de preguntarlo de una manera o de otra. El

351
00:43:49,239 --> 00:43:56,639
examen estaría en torno al 100%. Por tanto, es muy importante. Primer componente de toda

352
00:43:56,639 --> 00:43:58,800
solución de elixir, toda la solución de elixir

353
00:43:58,800 --> 00:44:00,920
lleva detergentes, primer componente

354
00:44:00,920 --> 00:44:02,920
los detergentes es el componente

355
00:44:02,920 --> 00:44:03,460
principal

356
00:44:03,460 --> 00:44:06,960
el detergente desestabiliza la membrana

357
00:44:06,960 --> 00:44:09,239
desestructura la membrana

358
00:44:09,239 --> 00:44:10,360
esa es su función

359
00:44:10,360 --> 00:44:12,559
de tal manera que una célula

360
00:44:12,559 --> 00:44:14,739
una membrana en presencia

361
00:44:14,739 --> 00:44:16,860
de un detergente se desestabiliza y se rompe

362
00:44:16,860 --> 00:44:18,900
tal cual

363
00:44:18,900 --> 00:44:20,860
el detergente

364
00:44:20,860 --> 00:44:22,420
que más se utiliza es el SDS

365
00:44:22,420 --> 00:44:24,679
por supuesto no hay que saberse

366
00:44:24,679 --> 00:44:27,880
la fórmula química ni la estructura química.

367
00:44:28,340 --> 00:44:32,300
El dodecil sulfato sódico es el detergente que más se utiliza

368
00:44:32,300 --> 00:44:37,440
para muestras humanas animales, células eucariotas animales,

369
00:44:37,440 --> 00:44:41,539
y se suele utilizar en combinación con EDTA.

370
00:44:43,500 --> 00:44:45,039
Detergentes más EDTA.

371
00:44:46,880 --> 00:44:49,840
Hay otros detergentes que también se pueden utilizar

372
00:44:49,840 --> 00:44:51,800
como el tritón X100 o el TUM20,

373
00:44:52,059 --> 00:44:54,139
pero vamos, el que más se utiliza es el SDS.

374
00:44:54,139 --> 00:44:56,980
¿Qué es lo que hacen los detergentes?

375
00:44:57,019 --> 00:45:00,239
Los detergentes tienen una estructura muy parecida a los fosfolípidos de la membrana

376
00:45:00,239 --> 00:45:03,960
Y lo que hacen es que se meten dentro de la estructura de la membrana

377
00:45:03,960 --> 00:45:06,099
Pero claro, no es un fosfolípido

378
00:45:06,099 --> 00:45:08,219
De tal manera que la desestabiliza

379
00:45:08,219 --> 00:45:10,519
Entonces por aquí, por este punto es más frágil

380
00:45:10,519 --> 00:45:12,440
Pero por aquí también, por aquí también

381
00:45:12,440 --> 00:45:16,679
Y de tal manera que al final por aquí, por aquí y por aquí se rompe

382
00:45:16,679 --> 00:45:18,639
Se rompe, se desestabiliza

383
00:45:18,639 --> 00:45:21,619
Esa es la función principal

384
00:45:21,619 --> 00:45:28,119
Segundo componente, ya hemos dicho que además del detergente lo vamos a acompañar de EDTA

385
00:45:28,119 --> 00:45:32,000
El EDTA es un agente quelante de cationes divalentes

386
00:45:32,000 --> 00:45:37,420
Tiene esta estructura, fijaos, esta parte de aquí, todos estos átomos de aquí forman un plano

387
00:45:37,420 --> 00:45:42,599
Y luego tiene un brazo por la parte de arriba y un brazo por la parte de abajo

388
00:45:42,599 --> 00:45:48,039
Y es aquí en este centro donde van a absorber

389
00:45:48,039 --> 00:46:01,059
Cuando decimos agente quelante significa que del medio donde estén, en la disolución en la que estén, van a absorber y a retirar, en este caso, cationes divalentes.

390
00:46:01,059 --> 00:46:09,039
y aquí lo que esto es que las aquí lo atraen del medio y aquí lo atrapa atrapa en este caso

391
00:46:09,039 --> 00:46:19,039
que aquí no es viva lente pues tenemos el calcio el magnesio el manganeso el hierro

392
00:46:21,019 --> 00:46:26,280
donde hay una molécula de dta como hay alguno de estos iones desaparece del mundo porque lo

393
00:46:26,280 --> 00:46:34,639
atrapa. ¿Por qué ponemos EDTA? Porque el EDTA absorbe magnesio del medio de la solución

394
00:46:34,639 --> 00:46:41,699
de lisis. Esto es muy importante porque las DNAs necesitan magnesio. Si yo pongo EDTA,

395
00:46:42,119 --> 00:46:48,519
el EDTA absorbe el magnesio y las DNAs no pueden actuar. Por tanto, en la solución

396
00:46:48,519 --> 00:46:56,260
de lisis, si pongo EDTA, al mismo tiempo que el detergente rompe y lisa la célula, el

397
00:46:56,260 --> 00:47:03,480
BDTA inactiva las adeniasas y por tanto, aunque haya adeniasas, no pueden actuar porque les falta el magnesio.

398
00:47:04,360 --> 00:47:06,079
Entonces no fragmentan el delito.

399
00:47:07,179 --> 00:47:07,579
Muy bien.

400
00:47:08,119 --> 00:47:10,260
Tercer componente, proteasas.

401
00:47:10,699 --> 00:47:23,880
Dependiendo de cómo sean, si sobre todo son tejidos, si son tejidos frescos, es obligatorio poner proteasas para poder digerir las proteínas de la matriz extracelular, especialmente el colágeno.

402
00:47:23,880 --> 00:47:25,599
Las células están embebidas.

403
00:47:26,260 --> 00:47:34,679
en vivo, dentro de la matriz extracelular, pues esto ayuda mucho a que las células se rompan.

404
00:47:35,420 --> 00:47:44,139
Y en la suspensión celular lo que hace es que estas proteasas digieren las proteínas de la membrana.

405
00:47:45,980 --> 00:47:49,360
Todas las membranas celulares tienen proteínas.

406
00:47:49,539 --> 00:47:54,820
Si digerimos las proteínas, también de alguna manera estamos desestabilizando la membrana.

407
00:47:56,260 --> 00:48:14,239
Las que más se utilizan, las proteasas que más se utilizan son, como ya hemos visto, la proteína SAKA, ¿sí? Pero también hay otras, por ejemplo, la tripsina, que ya la conocemos también, la quimiotripsina, la pepsina, etcétera, etcétera. La que más se usa es la proteína SAKA.

408
00:48:14,239 --> 00:48:34,820
Y podemos añadir o no, por ejemplo, agentes caotrópicos. ¿Qué son los agentes caotrópicos? Son agentes, compuestos químicos, que cuando los ponemos en una solución crean el caos. ¿Y eso qué significa? Son moléculas especializadas en desnaturalizar, desestructurar macromoléculas.

409
00:48:34,820 --> 00:48:37,000
uno en concreto

410
00:48:37,000 --> 00:48:38,139
que hay que conocerlo

411
00:48:38,139 --> 00:48:40,280
es el isotiocianato de guanidinio

412
00:48:40,280 --> 00:48:43,199
que desestabiliza

413
00:48:43,199 --> 00:48:45,019
específicamente las RNAs

414
00:48:45,019 --> 00:48:46,559
las RNAs

415
00:48:46,559 --> 00:48:48,980
entonces, si yo quiero inactivar

416
00:48:48,980 --> 00:48:50,000
las RNAs

417
00:48:50,000 --> 00:48:53,099
porque quiero purificar RNA

418
00:48:53,099 --> 00:48:55,880
pondré isotiocianato de guanidinio

419
00:48:55,880 --> 00:48:58,059
en la solución de Mises

420
00:48:58,059 --> 00:48:59,260
¿de acuerdo?

421
00:49:00,059 --> 00:49:00,619
bien

422
00:49:00,619 --> 00:49:04,039
esto es en general

423
00:49:04,039 --> 00:49:13,940
Son los componentes en general. Luego, dependiendo del tipo de muestra, pues hay que añadir diferentes mezclas de detergentes y algún componente más.

424
00:49:13,940 --> 00:49:38,570
¿De acuerdo? De tal manera que podéis hacer como ejercicio, como ejercicio, pensar cuál es la composición, ¿sí? ¿Cuál sería la composición de la delisis buffer, solución delisis, si yo quiero específicamente extraer y purificar de las células el DNA?

425
00:49:38,570 --> 00:49:42,989
¿Y cuál sería la composición si lo que quiero es extraer y purificar?

426
00:49:44,170 --> 00:49:45,449
Específicamente es el de RNA.

427
00:49:46,289 --> 00:49:48,889
Solo DNA, solo RNA.

428
00:49:50,090 --> 00:49:53,150
Lo podéis hacer como ejercicio y ya lo corregimos.

429
00:49:53,690 --> 00:49:53,909
¿De acuerdo?

430
00:49:54,690 --> 00:49:55,010
Bien.

431
00:49:55,369 --> 00:50:01,570
Pero la solución del ISIS, además, si son células que tienen pare celular, hay que hacer un tratamiento aparte.

432
00:50:03,309 --> 00:50:05,309
Se puede hacer un tratamiento enzimático.

433
00:50:05,309 --> 00:50:19,170
Es decir, añadimos enzimas que lo que hacen, bien la lisocima o la liticasa, que son las que más se utilizan, la lisocima degrada la pared, pero específicamente las bacterias granpositivas, el péptido glicano.

434
00:50:19,829 --> 00:50:28,670
Y la liticasa para células vegetales de levaduras y de hongos, es decir, para células eucariotas que tienen el paracelular.

435
00:50:28,670 --> 00:50:30,250
tratamiento enzimático

436
00:50:30,250 --> 00:50:32,550
incubo con estos enzimas durante un tiempo

437
00:50:32,550 --> 00:50:34,869
y rompe la pared celular

438
00:50:34,869 --> 00:50:36,130
y entonces después

439
00:50:36,130 --> 00:50:38,429
las pongo con la solución de lisis

440
00:50:38,429 --> 00:50:39,769
para que se rompan las membranas

441
00:50:39,769 --> 00:50:42,269
pero también puedo hacer un tratamiento

442
00:50:42,269 --> 00:50:43,210
mecánico

443
00:50:43,210 --> 00:50:46,469
y hay de muchos tipos, por ejemplo puedo

444
00:50:46,469 --> 00:50:49,150
llevar a ebullición

445
00:50:49,150 --> 00:50:50,789
en agua destilada las células

446
00:50:50,789 --> 00:50:52,389
de manera que la pared

447
00:50:52,389 --> 00:50:53,969
se rompe

448
00:50:53,969 --> 00:50:56,090
o por sonicación, ondas

449
00:50:56,090 --> 00:51:10,670
de alta radiofrecuencia, de alta energía, o ciclos de congelación-descongelación, congelación-descongelación, de tal manera que al cabo de unos cuantos ciclos, literalmente se resquebraja la pared y se rompe.

450
00:51:10,670 --> 00:51:31,929
O puede hacer un tratamiento con Cetab. El plúmulo de cetiltrimetilamonio es, muchas veces sustituimos el SDS por este detergente fuerte. Es muy fuerte, es tan fuerte que es capaz no solo de desestabilizar las membranas, sino también de romper las paredes.

451
00:51:31,929 --> 00:51:45,070
¿Sí? Bueno, esto facilita, por ejemplo, la rotura de los polisacáridos y derivados polifenólicos que están dentro de algunas de las partes. ¿De acuerdo? Bien.

452
00:51:45,070 --> 00:51:49,389
¿Cómo verificamos si la lisis ha sido completa?

453
00:51:49,769 --> 00:51:52,670
Pues porque en el tubo tiene que haber una solución homogénea

454
00:51:52,670 --> 00:51:54,789
No debe haber grumos

455
00:51:54,789 --> 00:51:56,030
Y esto se ve muy bien

456
00:51:56,030 --> 00:51:57,909
Cuando lo miras al trasluz

457
00:51:57,909 --> 00:52:05,030
Si hay grumos en el tubo

458
00:52:05,030 --> 00:52:06,590
Se ve turbio

459
00:52:06,590 --> 00:52:08,710
Si la mezcla se ve turbia

460
00:52:08,710 --> 00:52:11,789
Es porque hay grumos y partículas en suspensión

461
00:52:11,789 --> 00:52:14,170
Entonces la lisis ha sido incompleta

462
00:52:14,170 --> 00:52:36,659
Habría que repetir la lisis. ¿De acuerdo? Y bien, un componente más que hay que añadir en la solución de lisis, cuando queremos extraer específicamente DNA, añadimos RNAs para cargarnos y para romper el RNA, porque quiero extraer DNA.

463
00:52:36,659 --> 00:52:55,000
Pero si yo lo que quiero extraer es el RNA, puedo añadir deneasa, normalmente deneasa 1. Entonces, dentro de la solución del ISIS, además, puedo añadir deneasas y RNAsas, que son las nucleasas contrarias del ácido nucleico que yo quiero extraer y purificar.

464
00:52:55,000 --> 00:53:17,400
¿De acuerdo? Bien. Muy bien. Perfecto. Yo tenía mi suspensión celular, he utilizado diferentes procedimientos y ahora lo que he obtenido es un lisado celular, todos los componentes de la célula, aquí una mezcla muy muy muy heterogénea, comienza el proceso de purificación.

465
00:53:17,400 --> 00:53:39,170
Es decir, el proceso por el cual de esta mezcla heterogénea que hemos llamado lisado celular, de aquí vamos a extraer y purificar específicamente estos ácidos nucleicos y los vamos a separar del resto de componentes, proteínas, orgánulos, de bricelular, resto de orgánulos.

466
00:53:39,170 --> 00:53:52,309
Importante, importante, todos los métodos de purificación se basan en mayor o menor medida en las propiedades físico-químicas de los ácidos nucleicos, que ya las hemos estudiado.

467
00:53:52,309 --> 00:54:00,650
¿De acuerdo? Muy bien. Aquí las tenemos. Ya sabemos que son diácidos, elevada viscosidad, etc.

468
00:54:00,650 --> 00:54:14,429
En base a estas propiedades, que son únicas de los ácidos nucleicos y las diferencian de proteínas, glúcidos, lípidos, en base a estas propiedades se han ideado diferentes métodos de publicación, que son los que vamos a ver.

469
00:54:15,449 --> 00:54:24,849
Este orden está un poquito diferente al orden que sigue en los apuntes, pero están todos los métodos.

470
00:54:25,230 --> 00:54:29,849
Todos estos son métodos que se utilizan mucho en los laboratorios y los vamos a ir viendo uno.

471
00:54:30,650 --> 00:54:51,190
Bien. Purificación con solventes orgánicos. ¿En qué se basan? En que dentro del lisado celular hay algunos componentes que son apolares, hidrófobos, y entonces se diluyen muy bien en solventes orgánicos, digamos como oleosos, tipo como si fueran lipídicos.

472
00:54:51,190 --> 00:55:10,269
Y otros componentes que se llevan muy bien y se disuelven muy bien en solventes acuosos, porque son polares, porque son hidrosolubles. Genial. Pues en base a esta característica, yo puedo separar algunos componentes de otros, los acuosos y los orgánicos.

473
00:55:10,269 --> 00:55:17,670
Entonces, se basa en la distinta solubilidad de los componentes del lisado en solventes orgánicos y acuosos.

474
00:55:18,469 --> 00:55:27,909
El procedimiento tiene varias fases, pero la primera fase es eliminar los compuestos que son solubles en solventes orgánicos.

475
00:55:28,329 --> 00:55:32,849
Los ácidos nucleicos son solubles en solventes acuosos.

476
00:55:33,969 --> 00:55:36,269
Aquí, por ejemplo, las proteínas.

477
00:55:38,269 --> 00:55:39,429
¡Uf! Es una gran mayoría.

478
00:55:40,269 --> 00:55:46,969
Y una vez hemos eliminado todos estos componentes, estas fases las vamos a ver una única vez,

479
00:55:47,090 --> 00:55:50,929
porque son las tres fases que siempre se realizan en todos los métodos al final.

480
00:55:51,590 --> 00:55:55,929
Precipitamos el DNA, lavamos el DNA y resuspendemos el DNA.

481
00:55:56,829 --> 00:55:57,429
Lo vamos a ver.

482
00:55:57,949 --> 00:56:00,829
Bien, lo pongo aquí en este esquema.

483
00:56:01,469 --> 00:56:05,309
Nosotros del lisado celular lo que hacemos es añadir una mezcla.

484
00:56:05,309 --> 00:56:27,110
El lisado celular es una solución acuosa, porque tiene un bafo. Esta es la solución acuosa. Y lo que hacemos es añadir una fase orgánica que no se llevan bien, que no se mezclan. Forman dos fases. Es como el agua y el aceite. Por mucho que yo los mezcle, nunca jamás se van a disolver uno en el otro.

485
00:56:27,110 --> 00:56:36,889
Y entonces, esta fase orgánica es una mezcla de fenol, cloroformo y ácido isoamínico, tres componentes de naturaleza orgánica polar.

486
00:56:37,889 --> 00:56:48,210
Lo añado, ¿sí? Se forma una fase superior, una fase inferior y lo que hago ahora es un vórtex, un vórtex de una excitación muy fuerte,

487
00:56:48,530 --> 00:56:53,570
de tal manera que se van a mezclar una fase con la otra y todos los componentes unos con otros.

488
00:56:53,570 --> 00:57:06,010
De tal manera que todos los componentes que están aquí, que sean orgánicos, al mezclarse con la fase superior, van a sentirse atraídos por la fase orgánica y por los componentes orgánicos.

489
00:57:06,570 --> 00:57:14,250
Y lo que hago ahora, si yo esto cojo el tubo después de agitarlo tanto y lo dejo de forma pasiva, como el aceite y el agua se separan.

490
00:57:14,949 --> 00:57:20,570
Lo que hacemos nosotros es, para acelerar el proceso, lo que hacemos es una centrifugación.

491
00:57:21,530 --> 00:57:25,369
Antifugamos a una determinada velocidad y vuelven a formarse las dos fases.

492
00:57:26,170 --> 00:57:34,030
Abajo quedará la fase orgánica con todos los componentes orgánicos y arriba la fase acuosa.

493
00:57:34,510 --> 00:57:38,289
En esa fase acuosa, entre otros componentes, estarán los ácidos nucleótidos.

494
00:57:39,190 --> 00:57:46,530
Lo que hago ahora es, recojo la fase acuosa intentándonos llevar a la fase orgánica y la pongo en un tubo limpio.

495
00:57:46,530 --> 00:58:00,530
Bien, ya he separado los solventes orgánicos de los acuosos. Era la primera fase, si os acordáis. Y ahora, bien, la precipitación del DNA, el lavado y la suspensión.

496
00:58:00,530 --> 00:58:16,429
¿Qué es lo que hacemos ahora? Claro, aquí yo tengo las fibras de DNA que estarán por aquí, de RNA que son grandes, pero hay glúcidos, hay aminoácidos, hay sal y minerales. Todos esos son contaminantes y también se llevan muy bien con el agua.

497
00:58:16,429 --> 00:58:33,789
Lo que hago ahora es que como las moléculas más grandes son las de ácidos nucleicos, pongo una serie de condiciones físico-químicas en el tubo que hacen que las moléculas de ADN agreguen unas con otras y se vayan al fondo. Eso es lo que llamamos precipitar el ADN.

498
00:58:33,789 --> 00:58:48,130
¿Cómo lo conseguimos? Añadiendo una sal fuerte, elevada concentración de acetato sódico y un alcohol frío, etanol 100%, isopropanol, cualquiera de ellos.

499
00:58:48,130 --> 00:59:06,570
Esta mezcla hace que las moléculas de DNA formen ovillos, ovillos fibilares que se ven muy bien, fijaos que se ven aquí muy bien, ovillos fibilares de gran tamaño y lo que hago ahora es centrifugar y al centrifugar estos ovillos se van al fondo líquido.

500
00:59:06,570 --> 00:59:30,940
Nada, lo que tengo que hacer ahora es, retiro el sobrenadante y en este sobrenadante van el resto de componentes del lisado de la fase acusa. Glúcidos, aminoácidos, nucleótidos sueltos, sales minerales, etc. Los he eliminado en este sobrenadante.

501
00:59:30,940 --> 00:59:47,940
Y lo que hago ahora es lavo el DNA. Este DNA que al precipitar puede haber atrapado sales minerales, que es lo más habitual, o algún otro componente, añado etanol 70 para lavarlo. Lo mezclo muy bien para retirar todas las sales minerales.

502
00:59:47,940 --> 00:59:56,159
minerales, vuelvo a centrifugar, vuelve a quedarse en el fondo del tubo, retiro esto

503
00:59:56,159 --> 01:00:07,239
de aquí con toda la suciedad que se ha lavado y última fase, resuspendo. Resuspender el

504
01:00:07,239 --> 01:00:15,159
DNA en un tampón adecuado, tampón T, el tampón O, agua bidestilada, lo resuspendería

505
01:00:15,159 --> 01:00:31,460
Y ya tendría, como vemos aquí, nuestros ácidos nucleicos purificados. Tampón T es un tampón que lleva tris, que mantiene el pH constante y lleva RTA. De ahí el nombre TE. RTA para inhibir las nucleasas, las DNAs es especial.

506
01:00:31,460 --> 01:00:33,340
ya ves

507
01:00:33,340 --> 01:00:35,860
un primer método

508
01:00:35,860 --> 01:00:37,380
sencillo, es largo

509
01:00:37,380 --> 01:00:39,380
pero fácil

510
01:00:39,380 --> 01:00:40,360
el siguiente método

511
01:00:40,360 --> 01:00:43,139
bueno, esto normalmente se lleva a cabo

512
01:00:43,139 --> 01:00:45,440
ya no hace falta poner fenol

513
01:00:45,440 --> 01:00:46,960
cloroform, isoamílico

514
01:00:46,960 --> 01:00:50,019
en concentraciones creo que eran 25-24-1

515
01:00:50,019 --> 01:00:50,639
o algo así

516
01:00:50,639 --> 01:00:53,179
sino que ya venden reactivos

517
01:00:53,179 --> 01:00:54,300
el trizol, por ejemplo

518
01:00:54,300 --> 01:00:56,460
que ya lleva la mezcla orgánica

519
01:00:56,460 --> 01:00:57,719
que ponemos al disal

520
01:00:57,719 --> 01:00:59,519
y lo hace todo más fácil

521
01:00:59,519 --> 01:01:03,449
Bien

522
01:01:03,449 --> 01:01:06,929
El segundo método es la precipitación

523
01:01:06,929 --> 01:01:07,889
Con sales

524
01:01:07,889 --> 01:01:09,550
¿En qué se basa?

525
01:01:10,170 --> 01:01:11,230
Se llama el saltino

526
01:01:11,230 --> 01:01:14,489
En que a elevadísimas concentraciones salinas

527
01:01:14,489 --> 01:01:16,969
Las proteínas agregan y precipitan

528
01:01:16,969 --> 01:01:18,809
Solo las proteínas, el DNA no

529
01:01:18,809 --> 01:01:20,349
Bien

530
01:01:20,349 --> 01:01:22,690
¿En qué se basa este procedimiento?

531
01:01:22,690 --> 01:01:24,449
Este procedimiento entonces tiene también cuatro fases

532
01:01:24,449 --> 01:01:26,409
Ya veis que estas fases son las mismas que las anteriores

533
01:01:26,409 --> 01:01:28,190
La diferencia es la primera

534
01:01:28,190 --> 01:01:29,789
Lo primero que vamos a hacer es

535
01:01:29,789 --> 01:01:41,190
Coger el lisado celular, ponerle una elevada concentración de sales para que precipite las proteínas y luego precipitamos el DNA, lavamos y resuspendemos. Esto siempre es igual.

536
01:01:41,190 --> 01:02:04,219
Bien, este método se utiliza mucho para muestras de sangre, sangre anticoagulada, a la cual lo que vamos a hacer es, como ya hemos visto antes, por ejemplo, el método de lisis de eritrocitos. Se rompen los eritrocitos, nos quedamos con todos los glucocitos, añadimos fase de extracción la solución de lisis, tendríamos nuestro lisaoce.

537
01:02:04,219 --> 01:02:17,679
Perfecto. ¿Qué es lo que hacemos ahora? Añadimos una solución precipitante de proteínas, ¿sí? Esta solución precipitante de proteínas tiene una elevada concentración de sales, ¿sí?

538
01:02:17,679 --> 01:02:26,679
Entonces, inmediatamente todas las proteínas que tenemos aquí empiezan a agregar unas con otras, unas con otras, unas con otras.

539
01:02:26,960 --> 01:02:34,920
¿Por qué se utiliza mucho muestra de sangre? Porque el plasma está lleno de proteínas, albuminas, globulinas, inmunoglobulinas, todas precipitan.

540
01:02:34,920 --> 01:02:38,619
Si yo centro el jugo después, todas las proteínas se vienen al fondo del tubo.

541
01:02:39,099 --> 01:02:46,340
Lo único que tengo que hacer ahora es, recojo esta fase de aquí, que es una fase acuosa, y la pongo en un tubo nuevo.

542
01:02:46,340 --> 01:03:09,920
Entonces, a partir de ahora, lo que hago es, esas tres fases, precipitamos el DNA, lavamos el DNA y lo resuspendemos. En este caso, se puede añadir una mezcla de isopropanol, frío, o etanol 96 con acetato sódico otra vez, se forman los ovidos de DNA, centrifugo y todo el DNA va al fondo del tubo.

543
01:03:09,920 --> 01:03:27,360
¿Sí? Retiro todo el sobrenadante, resustendo y la hago con etanol 70 este pellet, vuelvo a centrifugar, retiro el sobrenadante y ya lo único que tendría que hacer es resustender el pellet.

544
01:03:27,659 --> 01:03:32,780
Ya tendría el mismo. ¿Sí? Un método también bastante sencillo.

545
01:03:32,780 --> 01:03:39,769
Bien, el tercer y cuarto método son cromatografías.

546
01:03:39,769 --> 01:04:03,329
Las cromatografías, como aquí un poquito lo veréis, esto se ve en TGL, la cromatografía es una técnica de separación en la cual se va a utilizar una fase o matriz, una fase estacionaria, también se llama matriz, como su nombre indica, es una serie de componentes que no se mueven y a través de ella vamos a hacer pasar una fase móvil.

547
01:04:03,329 --> 01:04:11,449
La fase móvil es la que tiene los componentes que yo quiero separar. Por tanto, para nosotros la fase móvil es el lisado celular.

548
01:04:11,449 --> 01:04:16,989
hay dos tipos de cromatografía que utilizamos

549
01:04:16,989 --> 01:04:18,869
suelen ser cromatografías en columnas

550
01:04:18,869 --> 01:04:20,710
que utilizan este tipo de columnas

551
01:04:20,710 --> 01:04:22,690
donde por la parte de arriba podemos ir

552
01:04:22,690 --> 01:04:24,469
añadiendo un montón de soluciones

553
01:04:24,469 --> 01:04:26,429
y aquí en medio tenemos nuevamente

554
01:04:26,429 --> 01:04:28,949
las matrices cromatográficas

555
01:04:28,949 --> 01:04:29,929
o fase estacionaria

556
01:04:29,929 --> 01:04:32,590
que está formada normalmente por esferas

557
01:04:32,590 --> 01:04:34,230
de diferente naturaleza

558
01:04:34,230 --> 01:04:36,750
esferas de látex, de vidrio, etc

559
01:04:36,750 --> 01:04:38,690
¿sí? bien

560
01:04:38,690 --> 01:04:40,269
a través

561
01:04:40,269 --> 01:04:42,829
de esta columna cromatográfica

562
01:04:42,829 --> 01:04:44,070
donde está la fase estacionaria

563
01:04:44,070 --> 01:04:46,650
vamos a añadir nuestra fase móvil

564
01:04:46,650 --> 01:04:47,429
que es el lisado

565
01:04:47,429 --> 01:04:48,710
de manera que

566
01:04:48,710 --> 01:04:51,510
dependiendo de las características

567
01:04:51,510 --> 01:04:53,889
fisicoquímicas de la fase estacionaria

568
01:04:53,889 --> 01:04:55,690
unos componentes

569
01:04:55,690 --> 01:04:57,769
del lisado quedan

570
01:04:57,769 --> 01:04:59,889
retenidos

571
01:04:59,889 --> 01:05:01,630
y el resto de componentes

572
01:05:01,630 --> 01:05:04,050
atraviesan y se van por la parte de abajo

573
01:05:04,050 --> 01:05:04,809
¿sí?

574
01:05:05,630 --> 01:05:07,670
entonces, esto no es ni más

575
01:05:07,670 --> 01:05:09,449
el fundamento no es ni más ni menos que

576
01:05:09,449 --> 01:05:12,590
idear una fase estacionaria que permita

577
01:05:12,590 --> 01:05:14,449
retener los ácidos nucleicos

578
01:05:14,449 --> 01:05:16,010
y que el resto de componentes pase

579
01:05:16,010 --> 01:05:17,869
luego ya

580
01:05:17,869 --> 01:05:20,670
al final de todo, cuando han pasado todos los componentes

581
01:05:20,670 --> 01:05:22,309
lo que hacemos es eluir

582
01:05:22,309 --> 01:05:23,829
eluimos el DNA

583
01:05:23,829 --> 01:05:25,010
para que se suelte

584
01:05:25,010 --> 01:05:27,070
bien

585
01:05:27,070 --> 01:05:28,929
en este caso

586
01:05:28,929 --> 01:05:31,130
en este caso

587
01:05:31,130 --> 01:05:34,690
en la cromatografía de intercambio iónico

588
01:05:34,690 --> 01:05:36,510
se fundamenta en que

589
01:05:36,510 --> 01:05:37,809
la fase sólida

590
01:05:37,809 --> 01:05:41,309
las fases estacionarias son bolitas que están cargadas positivamente.

591
01:05:42,610 --> 01:05:44,530
He puesto grupos químicos positivos.

592
01:05:44,630 --> 01:05:48,030
De tal manera que van a estar cubiertas por moléculas

593
01:05:48,030 --> 01:05:50,829
y van a traer moléculas con carga negativa.

594
01:05:51,510 --> 01:05:54,389
Pero no es lo mismo moléculas que tienen poquita carga negativa

595
01:05:54,389 --> 01:05:56,750
que moléculas que tienen mucha carga negativa.

596
01:05:57,489 --> 01:05:59,389
Estas se van a unir con una determinada fuerza

597
01:05:59,389 --> 01:06:01,670
y estas se van a unir con elevadísima fuerza.

598
01:06:02,510 --> 01:06:07,409
Bien, ¿cuáles son las moléculas más negativas de la célula?

599
01:06:07,809 --> 01:06:09,070
Los ácidos nucleicos.

600
01:06:09,650 --> 01:06:15,570
También hay que cuando yo, a través de la columna, pase el lisado, los ácidos nucleicos quedan anclados a las columnas.

601
01:06:16,590 --> 01:06:21,610
Es importante tener en cuenta que esta unión electrostática por cargas es reversible.

602
01:06:22,750 --> 01:06:28,670
También hay que yo, en un momento determinado, puedo obligar a que estos DNAs o moléculas muy, muy, muy negativas,

603
01:06:28,670 --> 01:06:33,670
en un momento determinado, esta unión se rompa y se suelta.

604
01:06:34,449 --> 01:06:35,869
¿De acuerdo? Para poderlo recuperar.

605
01:06:35,869 --> 01:06:54,309
Pues este es el fundamento. El procedimiento es, dependiendo del pH y de la concentración de sales, la salinidad, la columna cromatográfica la vamos a cargar y vamos a permitir que se unan unos componentes o que se unan otros componentes.

606
01:06:54,309 --> 01:07:06,989
¿De acuerdo? Bien, pues primero hacemos pasar un buffer, una solución, la disolución del lisado, que está en un tampón de baja salinidad y pH neutro.

607
01:07:07,429 --> 01:07:18,929
A estas concentraciones todo lo que tenga carga negativa queda unido, de tal manera que aquí lo que vamos a eliminar es todo lo que tenga carga positiva o carga cero neutra.

608
01:07:18,929 --> 01:07:41,389
Todos estos componentes positivos o neutros salen de la columna y no los hemos quitado. Y lo que hacemos ahora, el segundo paso, es ir añadiendo tampones de lavado, soluciones tampón, de concentración salina cada vez mayor y de pH también mayor.

609
01:07:41,389 --> 01:07:48,230
¿De acuerdo? De tal manera que todas aquellas moléculas con poquita carga negativa se van soltando, se van soltando.

610
01:07:48,650 --> 01:07:54,329
Solamente van a quedar adheridas y pegadas las moléculas de DNA, que son tremendamente negativas.

611
01:07:55,210 --> 01:08:01,590
El último paso es, después de haber realizado todos estos lavados, cada vez a concentración salina superior,

612
01:08:02,269 --> 01:08:08,969
el último paso es eluir la ilusión del DNA con tampón de máxima salinidad y pH máximo.

613
01:08:08,969 --> 01:08:24,970
¿De acuerdo? Y ya eluye solamente el DNA, que es lo que ha quedado unido. ¿De acuerdo? Entonces, de tal manera que nosotros añadimos el lisado celular, todo lo que es positivo ya eluye, ¿sí?

614
01:08:24,970 --> 01:08:46,649
De tal manera que después vamos a ir haciendo lavados con baja concentración de sales, salinidad media y de tal manera que se van a ir soltando y van a ir pasando y vamos a ir recolectando componentes de pequeña carga negativa con más carga negativa o con elevadísima carga negativa al final.

615
01:08:46,649 --> 01:08:59,390
¿De acuerdo? De esta manera podemos llegar a eluir diferentes tipos de ácidos nucleicos. El mensajero que eluye antes que el ribosómico y antes que el líquido. ¿De acuerdo?

616
01:08:59,390 --> 01:09:14,350
Bueno, esto sencillamente para que veáis qué grupos químicos tiene, si esto es la superficie de las bolitas de vidrio, pues hay un pequeño espaciador.

617
01:09:14,470 --> 01:09:18,369
Esta es la molécula que tiene la carga positiva, que atrae al niño.

618
01:09:21,369 --> 01:09:23,050
Pues esta es la cromatografía de intercambio.

619
01:09:23,789 --> 01:09:29,090
La cromatografía de absorción es muy parecida, pero aquí no jugamos con las cargas.

620
01:09:29,090 --> 01:09:51,989
Lo que jugamos se basa en la capacidad de absorción, absorción con D, de adherir, no de absorber con B, de unirse, adherirse los ácidos nucleicos al vidrio. Esto es algo al óxido de sílice, es algo propio de la sílice, ¿vale? Siempre y cuando haya sales caotrópicas.

621
01:09:51,989 --> 01:10:21,470
Vamos a ver esto, fijaos, imaginaos que esto es la superficie de la bolita, que es una bolita de óxido de sílice que tiene esta estructura, esta estructura química, el óxido de sílice es polar, de tal manera que normalmente estas bolitas, si yo cojo la bolita y la meto en un tubo con agua, se forma a su alrededor, porque es una molécula polar, atrae moléculas de agua que forman toda una capa que llamamos desolvatación o hidratación alrededor, ¿sí?

622
01:10:21,470 --> 01:10:40,770
Perfecto. Muy bien. Por su parte, el DNA también. El DNA a través de los grupos fosfatos, si os acordáis, que el esqueleto azúcar-fosfato que tiene carga negativa, también interacciona formando puentes de hidrógeno con moléculas de agua. Bien. Es decir, el DNA en solución acuosa también tiene una capa de hidratación y solvación.

623
01:10:40,770 --> 01:10:59,989
¿Qué ocurre si yo pongo una bolita de sílice que está recubierta de agua, con el DNA también recubierto en su capa de solvatación? No pueden interaccionar. ¿Por qué? Porque agua y agua están cubiertos por agua. No pueden interaccionar, no quedan ateridos, no son ateridos.

624
01:10:59,989 --> 01:11:19,430
Para que esto ocurra, entren. ¿Veis? No pueden interaccionar porque es agua y agua. Resbalan. No se pueden unir. La única manera de que la bolita y el DNA se puedan unir es retirar todas estas moléculas de agua. ¿Cómo? Amigo, añadiendo una sal caotrópica.

625
01:11:19,430 --> 01:11:37,510
Las sales caotrópicas, que ya conocemos el isotiocianato de guanidinio, que es este de aquí, perdón, perdón, perdón, es este de aquí abajo, el isotiocianato es este. Ya veis que los agentes caotrópicos, algunos tienen efecto estabilizante y otros desestabilizante, que son los que nos interesan en estos métodos.

626
01:11:37,510 --> 01:12:00,430
El isotiocinato tiene una capacidad desestabilizante brutal. Es de los que más. Es una serie o como una escala de este buen señor que ideó de estas sales caotrópicas. Cuando yo pongo una sal caotrópica, ¿por qué crea el caos alrededor? ¿Por qué desestabiliza macromoléculas? ¿Por qué absorben las moléculas de agua? Las absorbe.

627
01:12:00,430 --> 01:12:14,529
Si yo cojo las bolitas en la cromatografía, añado una sal cautrófica, tanto el DNA como la superficie del sílice pierden sus moléculas de agua y aquí se crea un ambiente hidrofóbico donde no hay agua.

628
01:12:14,529 --> 01:12:35,090
Como aquí no hay agua, esto automáticamente hace que el sílice y el DNA se adhieran, se peguen uno a otro y ya quedaría pegado. Formando una especie de puentes de hidrógeno, también pueden ser puentes con cationes de sodio.

629
01:12:35,090 --> 01:12:53,970
Entonces, la purificación, la cromatografía, la absorción, se basa en la absorción y desorción, porque es un proceso reversible, de los ácidos nucleicos en presencia de sales caotrópicas para crear un entorno hidrofóbico alrededor del denier.

630
01:12:53,970 --> 01:13:10,130
De tal manera que yo tengo el lisado celular, el lisado celular lo voy a hacer pasar por esta columnita donde aquí tengo las bolitas, en esta parte de aquí tengo las bolitas, en presencia de una sal caotrópica, pasarán todos los componentes y quedará adherido el DNA.

631
01:13:10,130 --> 01:13:25,329
Cuando yo quiera que se suelte el DNA, lo que hago en este caso es añadir una solución de hidratación para que se vuelva a formar la capa de suelatación y se separen automáticamente DNA y bolitas.

632
01:13:25,329 --> 01:13:33,770
Añadimos el lisado, centrifugamos para favorecer que pasen

633
01:13:33,770 --> 01:13:39,590
Las moléculas de DNA quedan adheridas porque hemos puesto una salcada trópica

634
01:13:39,590 --> 01:13:41,189
Y luego ya hacemos diferentes lavados

635
01:13:41,189 --> 01:13:46,069
Y lo último es un tampón de hidratación, tampón TI o agua bidestilada

636
01:13:46,069 --> 01:13:48,470
Que permite la ilusión del DNA y lo recoge

637
01:13:48,470 --> 01:13:57,819
Pues bien, la purificación mediante esferas magnéticas es muy parecida a la anterior

638
01:13:57,819 --> 01:14:15,279
Lo que hemos visto que ocurre con la sílice en presencia de sales caotrópicas también ocurre si las esferas son metálicas. Entonces utilizamos microsferas magnéticas en presencia de sales caotrópicas. Es el mismo proceso. ¿En qué se diferencia? ¿O por qué lo utilizamos?

639
01:14:15,279 --> 01:14:25,180
Porque al ser microesferas magnéticas, yo con un imán puedo magnetizarlas y el proceso lo puedo automatizar.

640
01:14:25,420 --> 01:14:26,479
¿Veis? Aquí hay aparatos.

641
01:14:26,859 --> 01:14:28,520
Y todo el proceso de los lavados.

642
01:14:28,720 --> 01:14:33,119
Si os dais cuenta, yo no lo hago en una columna, sino que lo hago en unos pocillos.

643
01:14:33,680 --> 01:14:40,380
Añado al lisador celular estas esferas magnéticas, pongo una sal caotrópica y el DNA se une a las esferas.

644
01:14:40,899 --> 01:14:43,520
¿Que yo quiero hacer lavados y tal y cual? Pongo el imán.

645
01:14:43,520 --> 01:14:48,819
Todas las esferas con el DNA quedan atraídas y quedan inmovilizadas

646
01:14:48,819 --> 01:14:53,159
Retiro el sobrenadante, pongo soluciones de lavado

647
01:14:53,159 --> 01:14:56,500
Esto lo hago siempre que quiera inmovilizar el DNA

648
01:14:56,500 --> 01:14:59,260
Pongo limón, quito limón, pongo limón, quito limón

649
01:14:59,260 --> 01:15:00,659
Hago un lavado, hago otro lavado

650
01:15:00,659 --> 01:15:04,260
Cuando me interesa, añado una solución de hidratación

651
01:15:04,260 --> 01:15:05,880
Se suelta el DNA y lo recojo

652
01:15:05,880 --> 01:15:09,399
Lo bueno de esto es que se puede automatizar

653
01:15:09,399 --> 01:15:11,180
Fijaos, utilizan este tipo de plaquitas

654
01:15:11,180 --> 01:15:13,420
y entre cada cuatro

655
01:15:13,420 --> 01:15:15,399
pocillos de estos

656
01:15:15,399 --> 01:15:17,520
aquí abajo tenemos el imán

657
01:15:17,520 --> 01:15:19,060
un imán, si os dais cuenta

658
01:15:19,060 --> 01:15:20,300
aquí no hemos puesto el imán

659
01:15:20,300 --> 01:15:22,100
y están todas las bolitas por aquí

660
01:15:22,100 --> 01:15:24,680
en cuanto pongo el imán

661
01:15:24,680 --> 01:15:26,659
todas las bolitas se vienen para acá

662
01:15:26,659 --> 01:15:28,439
si pongo una salcaotrópica

663
01:15:28,439 --> 01:15:29,659
a estas esferas

664
01:15:29,659 --> 01:15:32,239
aquí, visto lateral

665
01:15:32,239 --> 01:15:33,760
pongo el imán

666
01:15:33,760 --> 01:15:36,920
y aquí tengo todas las microsferas

667
01:15:36,920 --> 01:15:37,739
puedo hacer lavar

668
01:15:37,739 --> 01:15:39,579
y esto me permite automatizar

669
01:15:39,579 --> 01:15:45,819
Y por último tenemos la ultrafiltración

670
01:15:45,819 --> 01:15:50,359
La fundamentación es, ni más ni menos, que es una retención por tamaño

671
01:15:50,359 --> 01:15:57,760
Utilizamos ultrafiltros a través de los cuales vamos a obligar y vamos a pasar todo el lisado celular

672
01:15:57,760 --> 01:16:03,699
De manera que los componentes más pequeños lo van a atravesar y los más grandes que detenemos

673
01:16:03,699 --> 01:16:09,779
esto se utiliza mucho

674
01:16:09,779 --> 01:16:12,279
para productos de PCR

675
01:16:12,279 --> 01:16:13,819
cuando hacemos una PCR

676
01:16:13,819 --> 01:16:15,619
y tenemos los amplicones

677
01:16:15,619 --> 01:16:16,819
y los queremos

678
01:16:16,819 --> 01:16:19,420
amplicones porque es de

679
01:16:19,420 --> 01:16:22,020
después de haber amplificado un fragmento

680
01:16:22,020 --> 01:16:23,920
y los queremos separar del resto

681
01:16:23,920 --> 01:16:25,819
de componentes, utilizamos

682
01:16:25,819 --> 01:16:26,819
la ultracultración

683
01:16:26,819 --> 01:16:28,199
¿de acuerdo?

684
01:16:29,680 --> 01:16:31,680
bien, pues aquí tenéis

685
01:16:31,680 --> 01:16:33,420
el procedimiento, pero es muy sencillo

686
01:16:33,420 --> 01:16:39,420
Utilizan filtros de poro muy pequeñito, de manera que el DNA jamás lo va a poder atravesar.

687
01:16:40,420 --> 01:16:48,359
Pongo todos los componentes, solamente las moléculas de DNA quedan atrapadas, el resto de componentes después de centrifugar lo atraviesan

688
01:16:48,359 --> 01:16:53,439
y cuando yo quiera añado aquí un buffer de rehidratación y recojo las moléculas de DNA.

689
01:16:55,359 --> 01:17:02,800
Bien, hay algunas consideraciones especiales cuando realmente lo que queremos extraer y purificar son moléculas de RNA.

690
01:17:03,420 --> 01:17:08,000
El gran problema de las moléculas de RNA, si recordamos, es que son monocatenarias

691
01:17:08,000 --> 01:17:13,899
y a nivel experimental en el laboratorio son tremendamente termolábiles.

692
01:17:15,039 --> 01:17:22,720
Eso significa que se degradan con muchísima facilidad a temperatura ambiente, incluso a 4 grados.

693
01:17:23,500 --> 01:17:31,699
Esto hace que todo el proceso, especialmente tengamos que tener mucho cuidado con el gran enemigo del RNA,

694
01:17:31,699 --> 01:17:45,699
que son las erremiasas. De alguna manera hay que intentar inactivarlas, ya sabemos, poniendo isotiocianato de guanidinio, que ya lo hemos visto, ponerlo en la solución del ISIS y trabajar siempre a temperaturas bajas.

695
01:17:46,520 --> 01:17:59,739
Es todo el proceso que hemos visto de pretratamiento. Desde la muestra biológica, la fase de extracción para obtener el lisado celular y toda la fase de purificación debe realizarse a temperaturas bajas.

696
01:17:59,739 --> 01:18:11,520
En hielo o en condiciones que mantengan inactivadas las RNAs, al menos parcialmente, por trabajar a temperaturas bajas.

697
01:18:12,739 --> 01:18:27,659
Además, hay que intentar trabajar en cabina de flujo laminar, cabina de bioseguridad, para asegurar un ambiente lo más estéril posible para que no se contaminen reactivos y la muestra con RNAs.

698
01:18:27,659 --> 01:18:44,659
Tenemos hernias en las manos, hay hernias en las superficies en las que trabajamos, por eso siempre hay que trabajar con guantes. Al trabajar con hernia, estas consideraciones son muy importantes. Por tanto, trabajar con guantes sería la primera y trabajar en cabina de bioseguridad.

699
01:18:44,659 --> 01:18:49,899
o seguridad. Antes de ponernos a trabajar durante el proceso y después del proceso

700
01:18:49,899 --> 01:18:56,439
que impermueve las superficies, hay que utilizar todo el material fungible que esté certificado

701
01:18:56,439 --> 01:19:05,840
que es libre de RNAsas, lo que llaman en inglés RNAs free. Esto se ve muy bien en el paquete

702
01:19:05,840 --> 01:19:10,140
de las puntas de las pipetas, las pipetas, los tubos de prendor. Hemos de asegurarnos

703
01:19:10,140 --> 01:19:12,340
que todo el material fungible que utilicemos

704
01:19:12,340 --> 01:19:14,199
sea y esté certificado

705
01:19:14,199 --> 01:19:15,699
por casas comerciales

706
01:19:15,699 --> 01:19:16,680
RNAs free.

707
01:19:17,720 --> 01:19:20,079
La solución del ISIS debe contener

708
01:19:20,079 --> 01:19:21,699
un agente caotrópico

709
01:19:21,699 --> 01:19:23,960
que inactive las RNAs

710
01:19:23,960 --> 01:19:25,340
y esto es esencial.

711
01:19:25,979 --> 01:19:28,199
Ya hemos visto cuál era, que era el isotiocianato

712
01:19:28,199 --> 01:19:30,140
de guanidinio, que es el cellón

713
01:19:30,140 --> 01:19:32,199
y el isotiocianato de guanidinio

714
01:19:32,199 --> 01:19:34,659
inhibe específicamente las RNAs.

715
01:19:35,260 --> 01:19:35,720
Y además,

716
01:19:36,119 --> 01:19:38,000
todos los reactivos y el agua

717
01:19:38,000 --> 01:19:39,979
destilada que utilicemos deben

718
01:19:39,979 --> 01:19:41,920
estar también certificados libres de

719
01:19:41,920 --> 01:19:43,779
RNAs. Para esto nosotros

720
01:19:43,779 --> 01:19:46,079
podemos tratar

721
01:19:46,079 --> 01:19:48,479
el agua y algunos de los reactivos

722
01:19:48,479 --> 01:19:52,319
en diferentes tratamientos

723
01:19:52,319 --> 01:19:54,300
elevada concentración de hidróxido

724
01:19:54,300 --> 01:19:56,260
de sodio, por ejemplo

725
01:19:56,260 --> 01:19:58,079
y o

726
01:19:58,079 --> 01:19:59,539
elevadísima temperatura.

727
01:20:00,100 --> 01:20:00,220
¿De acuerdo?

728
01:20:01,399 --> 01:20:04,340
Aún así las RNAs son tremendamente

729
01:20:04,340 --> 01:20:06,079
resistentes, muy, muy resistentes.

730
01:20:07,439 --> 01:20:08,039
¿De acuerdo?

731
01:20:08,520 --> 01:20:08,819
Bien.

732
01:20:09,979 --> 01:20:24,239
Todo este proceso de extracción y purificación se puede automatizar y actualmente existen aparatos, un equipamiento específico en los laboratorios de biología molecular que muchas de estas fases se pueden automatizar.

733
01:20:24,239 --> 01:20:48,239
¿Sí? Esto implica o garantiza que obtenemos ácidos nucleicos altamente purificados, minimizando la contaminación. ¿Por qué? Porque metemos la muestra en el aparato, si es una biopsia, por ejemplo, la metemos en el aparato, el aparato tiene todos los reactivos en un ambiente tremendamente controlado y nos saca en un tubito nuestros ácidos nucleicos ya purificados.

734
01:20:48,239 --> 01:21:06,500
Evita también la contaminación cruzada, es decir, al aparato le podemos meter las muestras de 15 pacientes y en ningún momento se va a contaminar una muestra con otra, porque trabajan en canales diferentes.

735
01:21:06,500 --> 01:21:25,500
¿De acuerdo? Y además aporta una gran rapidez. Yo puedo meter las muestras por la noche, por la tarde antes de cuando ya acaba la jornada, lo dejo y lo programo toda la noche y al día siguiente, por la mañana, obtengo de todas las muestras que tenía el DNA purificado o el RNA purificado.

736
01:21:25,500 --> 01:21:36,060
¿De acuerdo? Hay diferentes métodos. Aquí en las diapositivas tenéis algunos. No es muy importante cómo funcionan, pero muchos de ellos funcionan con partículas magnéticas.

737
01:21:38,060 --> 01:21:48,739
Ya hemos visto la cromatografía de absorción, pero con partículas magnéticas, lo que nos permite aglutinar en un momento determinado las partículas con el DNA, etc.

738
01:21:48,739 --> 01:22:00,380
Y otros basados en cromatografía de absorción, en la cual en las columnas se pone una bomba de vacío que hace que todo el lisado a través de las bolitas pase más rápido, etc.

739
01:22:01,399 --> 01:22:15,500
Os dejo aquí también, por si os viene bien, para que os hagáis una idea de la automatización de estos procesos, algunos links de YouTube los tenéis en la presentación por si queréis echarle un vistacito y así os hacéis una idea de cómo funciona este proceso de automatización.

740
01:22:15,500 --> 01:22:32,500
¿De acuerdo? Bien. Perfecto. Nos llegó una muestra al laboratorio. Después de una primera fase de pretratamiento, extracción y una última fase de purificación, teóricamente tenemos en un tubito los ácidos núcleicos puros.

741
01:22:32,500 --> 01:22:40,880
puros. Perfecto. La última fase es evaluar la calidad. Unos ácidos nucleicos de buena

742
01:22:40,880 --> 01:22:46,199
calidad significan buenos resultados en cualquier técnica de biología molecular. Por eso es

743
01:22:46,199 --> 01:22:52,380
muy importante evaluar la calidad de los ácidos nucleicos con estos tres parámetros. A final

744
01:22:52,380 --> 01:22:58,840
de tema vamos a ver cuatro pinceladas de cómo se deben almacenar. Bien. Cuando hablamos

745
01:22:58,840 --> 01:23:04,579
de la calidad de los ácidos nucleicos nos referimos a evaluar tres parámetros. El primer

746
01:23:04,579 --> 01:23:13,159
parámetro es la integridad. Cuando decimos integridad queremos decir el tamaño. Si el

747
01:23:13,159 --> 01:23:18,680
tamaño final de las moléculas de DNA o de RNA es el que tenía el original. Entonces

748
01:23:18,680 --> 01:23:28,630
hablamos de tamaño, vamos a estudiarlo y si ha habido o no degradación. Si ha habido

749
01:23:28,630 --> 01:23:34,229
o no degradación. Perfecto. ¿Cómo lo miramos? Esto lo estudiamos en el laboratorio haciendo

750
01:23:34,229 --> 01:23:48,039
un gel de agarosa y corriendo por electroforesis una pequeña cantidad, un pequeño volumen

751
01:23:48,039 --> 01:23:57,800
del ácido nucleico que acabamos de purificar. ¿De acuerdo? Bien. El segundo parámetro,

752
01:23:57,800 --> 01:24:28,539
Ahora lo iremos viendo poco a poco. El segundo parámetro es la pureza. La pureza hace referencia a si hay o no contaminantes. Esto es importante. Si yo estoy purificando específicamente DNA, el DNA de la muestra del paciente, el RNA es un contaminante, igual que las proteínas, y lo tengo que eliminar. No me vale.

753
01:24:28,539 --> 01:24:44,680
Si yo estoy purificando RNA, el DNA es un contaminante. Entonces, la medida de la pureza nos va a decir si hay, además del ácido nucleico que queremos aislar, extraer y purificar, si hay además otros componentes que son contaminantes.

754
01:24:44,680 --> 01:25:05,420
Para poderlo medir, medimos cocientes de absorbancias, ¿sí? Y son dos cocientes. Los pongo aquí ya para que los tengamos. Es el cociente absorbancia 2,60 y absorbancia 2,80.

755
01:25:05,420 --> 01:25:10,760
y nos dice, nos da la idea de cuántos ácidos nucleicos tenemos

756
01:25:10,760 --> 01:25:14,979
respecto de las proteínas y fenoles que hayamos podido arrastrar.

757
01:25:15,720 --> 01:25:15,920
Bien.

758
01:25:16,600 --> 01:25:22,640
Y el cociente A260 es A230

759
01:25:22,640 --> 01:25:27,640
y nos da una idea de cuántos ácidos nucleicos tenemos

760
01:25:27,640 --> 01:25:30,119
respecto de moléculas de pequeño tamaño,

761
01:25:30,260 --> 01:25:33,920
glúcidos, aminoácidos, algunas sales minerales, etc.

762
01:25:34,659 --> 01:25:36,659
Si la integridad es buena,

763
01:25:36,979 --> 01:25:56,109
Si la pureza es buena, entonces vamos al tercer parámetro. El tercer parámetro es la concentración. Y para calcular la concentración, ¿cuánto DNA tengo? Solamente necesito una absorbancia, la absorbancia 260.

764
01:25:56,109 --> 01:26:11,510
Con el valor de esta absorbancia de la muestra y una fórmula, que ahora la veremos, vamos a obtener el resultado de la concentración en nanogramos por microlitro.

765
01:26:15,399 --> 01:26:25,000
Bien, si estos tres parámetros, integridad, pureza y concentración, son buenos, significa que el DNA es de buena calidad y por tanto puedo seguir adelante.

766
01:26:25,000 --> 01:26:49,060
Si estos parámetros no son buenos, no dan buenos resultados, significa que el DNA no es de buena calidad y entonces quizá vale la pena que no continúe adelante porque las técnicas de biología molecular no saldrán bien, ¿de acuerdo? Tendría que volver a extraer y purificar o ya iremos viendo, por ejemplo, si hay contaminantes, qué cosas puedo hacer para intentar recuperar esa muestra, ¿de acuerdo?

767
01:26:49,060 --> 01:26:53,560
Bien, pues vamos a ver uno a uno estos parámetros de calidad.

768
01:26:53,960 --> 01:26:55,920
El primero de ellos es la integridad.

769
01:26:56,500 --> 01:27:05,979
La integridad nos indica si los ácidos nucleicos que hemos purificado conservan su tamaño original o si se han fragmentado.

770
01:27:06,539 --> 01:27:10,020
¿Veis? Esta molécula, si se ha fragmentado, se ha degradado.

771
01:27:11,399 --> 01:27:15,859
Ya hemos dicho que esto lo vamos a mirar haciendo un gel de electroforesis

772
01:27:15,859 --> 01:27:25,859
y observando una pequeña alícuota, unos microlitros, de la muestra del DNA o RNA purificado.

773
01:27:26,420 --> 01:27:34,760
Entonces, cuando miramos la integridad, importante, hemos de conocer cada tipo de ácido nucleico,

774
01:27:35,220 --> 01:27:37,060
qué patrón de bandas nos da.

775
01:27:38,260 --> 01:27:39,119
Vamos con el primero.

776
01:27:39,119 --> 01:27:57,640
El DNA genómico son moléculas gigantescas, enormes, son tan enormes, tan grandes, tienen tal cantidad, el tamaño es tan grande, que cuando yo cargo el pocillo con las muestras, que serían aquí el pocillo 2, 3 y 4,

777
01:27:57,640 --> 01:28:01,600
aquí lo que hemos cargado es un marcador de peso moleculares

778
01:28:01,600 --> 01:28:03,859
ya veremos más adelante por qué lo cargo

779
01:28:03,859 --> 01:28:06,539
son tan grandes estas moléculas

780
01:28:06,539 --> 01:28:09,460
que apenas avanzan en el gel

781
01:28:09,460 --> 01:28:11,960
tienen que atravesar poros muy pequeñitos

782
01:28:11,960 --> 01:28:15,399
son moléculas tan grandes que apenas avanzan

783
01:28:15,399 --> 01:28:20,279
¿cómo se ve un DNA genómico de buena integridad?

784
01:28:20,699 --> 01:28:21,800
pues es la muestra dos

785
01:28:21,800 --> 01:28:24,699
se tendría que observar una única banda

786
01:28:24,699 --> 01:28:27,020
en la parte superior del gel

787
01:28:27,640 --> 01:28:32,380
Y el resto del gel, como veis aquí, sin bandas.

788
01:28:33,399 --> 01:28:35,779
Esta muestra 2 tiene muy buena calidad.

789
01:28:36,020 --> 01:28:37,340
¿Qué ha pasado en la muestra 4?

790
01:28:38,140 --> 01:28:39,880
Este DNA se ha fragmentado.

791
01:28:41,439 --> 01:28:54,479
Y entonces, todo el DNA que se ha fragmentado, ahora obtenemos de forma aleatoria fragmentitos pequeños, unos más grandes, otros más pequeños, fragmentitos pequeños, que son los fragmentos de degradación.

792
01:28:54,479 --> 01:29:15,100
Cuando todo esto que lo tengo en la muestra lo pongo a correr y cargo el pocillo, lo que veo es esta parte de aquí, esta sombra de aquí. Aquí estarían las moléculas más grandes que no se han degradado, pero la gran mayoría, si os dais cuenta, forma lo que llamamos un smear, una sombra.

793
01:29:15,100 --> 01:29:22,359
Lo vemos aquí, continua, que está formada por multitud de fragmentos de todos los tamaños.

794
01:29:22,479 --> 01:29:27,539
Unos muy pequeños que emigrarán aquí abajo, otros de tamaño mediano, otros ya más grandes.

795
01:29:28,640 --> 01:29:35,600
Esta muestra, la muestra del carril 4, no nos vale. La integridad es malísima. Habría que desecharla.

796
01:29:36,460 --> 01:29:43,199
En el carril 3 hay una muestra del mineral genómico, pero que está parcialmente degradada.

797
01:29:43,199 --> 01:29:55,779
La gran mayoría de moléculas están aquí arriba y conservan su tamaño y ha habido un poquito de degradación, pero casi nada. ¿Por qué? Porque la gran mayoría son moléculas todavía muy grandes. ¿De acuerdo?

798
01:29:55,779 --> 01:30:05,779
Bien, pues este es el patrón que se tendría que ver cuando lo que estamos corriendo en el gel de agarosa es un, o hemos extraído un DNA genómico.

799
01:30:07,199 --> 01:30:15,220
Cuando es un DNA plasmídico, los plasmidos, se tiene que ver un patrón, el patrón normal son tres bandas.

800
01:30:15,899 --> 01:30:22,760
Tres bandas que están formadas por una banda inferior, ya veis que están aquí en la parte superior del gel.

801
01:30:22,760 --> 01:30:37,760
Aquí están los pocillos, aquí hemos cargado las muestras, luego hemos puesto las cargas, positiva abajo, como ya sabéis, negativa arriba. Cuando ha ocurrido la electroforesis se tendrían que ver tres válvulas. ¿A qué corresponde?

802
01:30:37,760 --> 01:30:50,640
Esta es la estructura nativa del plásmido. Ya sabemos que los plásmidos son moléculas bicatenarias, pero circulares.

803
01:30:50,640 --> 01:31:03,819
Entonces, la manera en la que suelen estar en la célula no es así de forma relajada que se llama, es decir, estiradas. Esta es la forma relajada.

804
01:31:03,819 --> 01:31:07,119
normalmente cuando están en la célula

805
01:31:07,119 --> 01:31:09,100
los plámidos, la célula prokaryota

806
01:31:09,100 --> 01:31:10,739
los plámidos están

807
01:31:10,739 --> 01:31:12,079
súper enrollados

808
01:31:12,079 --> 01:31:15,159
así, formando este tipo

809
01:31:15,159 --> 01:31:16,079
de estructuras

810
01:31:16,079 --> 01:31:20,689
súper enrolladas como si fuera un churrillo

811
01:31:20,689 --> 01:31:22,590
el mismo se plega sobre sí mismo

812
01:31:22,590 --> 01:31:24,470
la gran mayoría de los plasmidos

813
01:31:24,470 --> 01:31:26,390
en la célula están así, por tanto

814
01:31:26,390 --> 01:31:28,210
esta banda es la estructura nativa

815
01:31:28,210 --> 01:31:29,430
esta es la estructura nativa

816
01:31:29,430 --> 01:31:30,409
así como

817
01:31:30,409 --> 01:31:33,750
digamos como haciéndose un churrillo

818
01:31:33,750 --> 01:31:36,050
súper enrollado, como si fuera el cable de un teléfono

819
01:31:36,050 --> 01:31:37,670
antiguo, si os acordáis

820
01:31:37,670 --> 01:31:40,289
ya veis que la banda es mucho más intensa

821
01:31:40,289 --> 01:31:43,909
luego, por encima, se tiene que ver

822
01:31:43,909 --> 01:31:46,149
una segunda banda, que es la estructura relajada

823
01:31:46,149 --> 01:31:47,909
que sería esta de aquí

824
01:31:47,909 --> 01:31:48,750
¿de acuerdo?

825
01:31:49,890 --> 01:31:51,630
y un poquito más arriba

826
01:31:51,630 --> 01:31:53,850
serían dímeros, es decir, son súper

827
01:31:53,850 --> 01:31:56,170
estructuras formadas por la asociación

828
01:31:56,170 --> 01:31:58,369
¿sí? de un plásmido

829
01:31:58,369 --> 01:32:01,550
con otro plásmido

830
01:32:01,550 --> 01:32:03,130
¿sí?

831
01:32:03,750 --> 01:32:11,210
Entonces, esta superestructura superenrollada, claro, pesa el doble y por tanto migra mucho menos, porque es de mucho mayor tamaño.

832
01:32:11,789 --> 01:32:21,710
Bien, esta muestra es de un DNA plasmídico, hay que conocer el patrón de bandas, es un DNA plasmídico en la que vemos sus tres bandas.

833
01:32:21,869 --> 01:32:26,550
Y hay que conocer, en segundo lugar, cuál es el patrón normal. Este es el patrón normal.

834
01:32:27,409 --> 01:32:29,090
Sin embargo, ¿qué ha pasado en esta muestra?

835
01:32:30,050 --> 01:32:33,510
Se ha degradado y aquí no observamos la banda.

836
01:32:33,750 --> 01:32:35,250
Significa que hay degradación parcial.

837
01:32:35,649 --> 01:32:39,930
Cuando hay degradación prácticamente total, perdemos las dos bandas superiores.

838
01:32:39,930 --> 01:32:41,470
Aquí no hay y aquí tampoco.

839
01:32:41,729 --> 01:32:44,489
Y esta banda se ve muchísimo más degradada.

840
01:32:45,810 --> 01:32:46,170
¿De acuerdo?

841
01:32:47,369 --> 01:32:49,689
Bien, con esta muestra seguiríamos adelante.

842
01:32:49,949 --> 01:32:54,489
Esta habría que ver si es muy valiosa o no, pero con esta no podemos seguir adelante.

843
01:32:54,489 --> 01:32:56,689
porque no nos va a salir

844
01:32:56,689 --> 01:32:58,529
la técnica que utilicemos de dilución

845
01:32:58,529 --> 01:32:59,930
bien

846
01:32:59,930 --> 01:33:01,569
si es una muestra de RNA

847
01:33:01,569 --> 01:33:04,630
lo que vamos a ver son

848
01:33:04,630 --> 01:33:06,390
los dos RNA ribosómicos

849
01:33:06,390 --> 01:33:07,710
que son los más abundantes

850
01:33:07,710 --> 01:33:09,149
y los de mayor tamaño

851
01:33:09,149 --> 01:33:12,109
si es una célula cariota, el 28S y el 13S

852
01:33:12,109 --> 01:33:15,430
formando dos grandes bandas

853
01:33:15,430 --> 01:33:18,810
y han de cumplir

854
01:33:18,810 --> 01:33:19,909
dos características

855
01:33:19,909 --> 01:33:22,149
uno, cuando es una muestra de RNA

856
01:33:22,149 --> 01:33:23,729
hay que fijarse en dos parámetros

857
01:33:23,729 --> 01:33:52,829
1. ¿Aparecen dos bandas? Por ejemplo, en esta muestra, sí. Perfecto. Y ahora vemos. Segunda característica. La banda superior, la de 28S, tiene que ser el doble de gruesa y el doble de intensa que la de abajo. ¿Eso se cumple en esta muestra? Sí. Perfecto. Esta muestra está genial. ¿Y en esta muestra? También. ¿Tiene dos bandas? Sí. ¿La de arriba es el doble de gruesa y doble de intensa que la de abajo? Sí. Pues también.

858
01:33:52,829 --> 01:34:14,170
¿Cuál es la diferencia entre esta y esta? Que aquí han cargado más cantidad. Este RNA está mucho más concentrado que este de aquí. ¿De acuerdo? Bien. Se puede observar una banda inferior. Si hay mucho RNA, se puede observar. Y pertenece a los RNA ribosómicos pequeños y al RNA de transferencia.

859
01:34:14,930 --> 01:34:18,789
¿Qué ha pasado en la muestra 2? Todo el RNA está degradado.

860
01:34:19,310 --> 01:34:25,329
No se observan ninguna de las dos bandas que se tendrían que observar y lo que se observa es nuevamente toda una sombra.

861
01:34:25,689 --> 01:34:28,909
Este RNA está completamente degradado.

862
01:34:29,270 --> 01:34:35,930
Bien, pues este es el primer parámetro que evaluamos para ver cómo está la calidad de nuestros ácidos nucleóticos.

863
01:34:36,609 --> 01:34:40,189
Si la integridad es buena, entonces miramos la pureza.

864
01:34:40,189 --> 01:34:55,590
La pureza ya hemos dicho que es, vamos a medir si hay o no hay posibilidad de contaminar. Para ello utilizamos un aparato que es un espectrofotómetro que mide cuatro absorbancias.

865
01:34:55,590 --> 01:35:06,789
La absorbancia 320, la absorbancia 260, la absorbancia 280 y la absorbancia 230.

866
01:35:07,569 --> 01:35:16,310
Bien, cada una de estas absorbancias nos da idea de un componente o de un posible contaminante.

867
01:35:16,470 --> 01:35:21,590
¿Por qué? Porque cada contaminante absorbe luz de una longitud de onda determinada.

868
01:35:21,590 --> 01:35:42,729
Por ejemplo, y esto ya lo sabemos, es una de las características físico-químicas de los ácidos nucleicos, los ácidos nucleicos absorben específicamente la luz a 260 nanómetros, pero las proteínas y los fenoles absorben luz de 280 nanómetros.

869
01:35:42,729 --> 01:35:58,130
¿De acuerdo? Bien. Por tanto, aquí tenemos los ácidos nucleicos. 280 lo absorben las proteínas y los fenoles. ¿Cuándo tendremos fenoles? Cuando hemos purificado por solventes orgánicos.

870
01:35:58,130 --> 01:36:15,670
230 es la absorbancia de moléculas de pequeño tamaño. Por ejemplo, glúcidos, aminoácidos, algunas sales minerales, ¿de acuerdo? Bien.

871
01:36:15,670 --> 01:36:23,829
Y la 320 es una longitud de onda que es absorbida por partículas de gran tamaño.

872
01:36:25,869 --> 01:36:29,130
Entonces, ¿qué partículas estas son de gran tamaño?

873
01:36:30,130 --> 01:36:37,130
Estas partículas de gran tamaño pueden ser por gánulos que hemos arrastrado, restos de membrana, o sea, partículas en suspensión.

874
01:36:38,130 --> 01:36:39,649
Entonces veríamos un aspecto tuve.

875
01:36:40,670 --> 01:36:40,949
Bien.

876
01:36:40,949 --> 01:36:45,649
El aparato nos da el valor de estas cuatro absorbancias

877
01:36:45,649 --> 01:36:49,329
Y lo que tenemos que hacer nosotros es calcular los dos cocientes

878
01:36:49,329 --> 01:36:51,090
Dos cocientes

879
01:36:51,090 --> 01:36:53,989
El primer cociente, bueno, lo primero que hacemos siempre

880
01:36:53,989 --> 01:36:56,210
Y esto lo vamos a trabajar en los problemas

881
01:36:56,210 --> 01:36:58,510
Lo primero que hacemos siempre es

882
01:36:58,510 --> 01:37:00,989
A cada una de estas absorbancias

883
01:37:00,989 --> 01:37:03,010
260, 280, 230

884
01:37:03,010 --> 01:37:07,630
Le tenemos que restar el valor de 320

885
01:37:07,630 --> 01:37:20,189
Entonces, haremos absorbancia 260 menos absorbancia 320, y así obtenemos lo que podríamos llamar una absorbancia 260 corregida, vamos a llamar prima.

886
01:37:21,210 --> 01:37:30,670
Una absorbancia 280 prima corregida y una absorbancia 230 también corregida, prima.

887
01:37:32,029 --> 01:37:36,850
Es con estas tres absorbancias con las que vamos a calcular dos cocientes.

888
01:37:36,850 --> 01:37:43,770
Primer cociente, el cociente 260-280, como aquí prima y prima, porque son los valores corregidos.

889
01:37:44,869 --> 01:37:54,470
Bien, este cociente nos da una idea de cuántos ácidos nucleicos tenemos, absorbancia de 260, respecto de las proteínas y los fenoles.

890
01:37:55,470 --> 01:38:06,109
Si hemos purificado ADN, el valor, para que consideremos un cociente normal, tendría que estar entre 1,7 y 2.

891
01:38:06,850 --> 01:38:28,130
Si es ARN, varía un poquito. 1,8 y 2. ¿Sí? Bien. ¿Qué ocurre si el cociente, el valor del cociente es menor? Si el valor del cociente es menor, significa que hay, si este valor es menor, es porque el denominador es demasiado grande.

892
01:38:28,130 --> 01:38:34,189
Entonces hay contaminación por proteínas y fenoles.

893
01:38:35,310 --> 01:38:39,729
¿Y qué podemos hacer? ¿Tiramos ya la muestra? No.

894
01:38:40,829 --> 01:38:47,689
Podemos hacer un tratamiento con proteasas y luego purificar por un método diferente al de los fenoles.

895
01:38:48,250 --> 01:38:50,329
Y volvemos a medir el cociente.

896
01:38:51,050 --> 01:38:54,989
Seguramente se habrá limpiado de las proteínas.

897
01:38:54,989 --> 01:39:15,989
Pero si el valor es mayor, significa que el numerador es demasiado grande. Tengo un exceso de ácidos nucleicos. Si he purificado DNA, significa que he arrastrado RNA. Pero si he purificado RNA, significa que he arrastrado DNA.

898
01:39:15,989 --> 01:39:29,550
¿Qué puedo hacer? Pues tratar con RNAsas para quitarme la de en medio o tratar con DNAsas para quitarme el DNA de en medio y entonces volver a purificar, por otro método.

899
01:39:30,069 --> 01:39:45,409
Bien, pues este es el primer cociente. El segundo cociente es el cociente 260 corregido, 230 corregido. Es decir, cuántos ácidos nucleicos tenemos respecto de posibles contaminantes de pequeños.

900
01:39:45,989 --> 01:39:50,090
Su valor del cociente tendría que estar entre 1,5 y 2,2.

901
01:39:51,369 --> 01:39:56,789
Nuevamente, un valor superior significa que hay un exceso de ácidos nucleicos.

902
01:39:57,149 --> 01:39:59,829
Y habría que ver, ocurre lo mismo que aquí.

903
01:40:00,430 --> 01:40:04,029
Si es DNA o RNA, para hacer un tratamiento con DNA y RNA.

904
01:40:04,390 --> 01:40:13,729
Pero si el valor es menor de 1,5, significa que hay, en la purificación de arrastrados, sobre todo, sales minerales.

905
01:40:14,369 --> 01:40:15,670
¿Qué tendría que hacer?

906
01:40:15,989 --> 01:40:25,829
¿Qué puedo hacer si el valor es menor? Pues tengo que lavar otra vez el DNA, precipitar el DNA y volverlo a purificar.

907
01:40:25,829 --> 01:40:35,529
¿De acuerdo? Bien. Imaginemos que el DNA tiene buena integridad, tiene buena pureza. Perfecto.

908
01:40:36,789 --> 01:40:45,850
Pues entonces, fijaos, aquí sencillamente para que veáis, en una extracción donde no se ha utilizado fenoles,

909
01:40:45,850 --> 01:41:02,449
Fijaos que el pico de absorbancia está justo en 260. Esta absorbancia pertenece a los ácidos nucleicos. Pero si se nos ha contaminado con fenol, este pico se desplaza hacia acá. ¿Por qué? Porque los fenoles absorben hacia 280.

910
01:41:02,449 --> 01:41:19,520
Entonces, el cociente 260-280 aquí es el correcto, pero el cociente 260-280, si os dais cuenta, ahora es mucho menor.

911
01:41:20,079 --> 01:41:22,420
¿De acuerdo? ¿Se entiende? Bien.

912
01:41:22,979 --> 01:41:26,319
Bueno, esto es una manera gráfica, pues si se entiende mejor lo he puesto aquí.

913
01:41:26,439 --> 01:41:27,140
¿De acuerdo? Bien.

914
01:41:27,859 --> 01:41:30,300
El tercer parámetro de calidad es la concentración.

915
01:41:30,300 --> 01:41:54,659
Para calcular la concentración solo necesitamos la absorbancia 260, siempre la corregida, ¿de acuerdo? Y lo calculamos con esta fórmula. Es decir, la concentración de los ácidos nucleicos, os la escribo aquí por si es más sencillo, es igual a la absorbancia 260 corregida.

916
01:41:54,659 --> 01:42:15,199
Ya veis aquí, 260 menos 320. Perfecto. Por el factor de dilución, normalmente el DNA, para poder medir las absorbancias, se diluye. Pues por ese factor de dilución, si he hecho una dilución en 1,4, lo he diluido 4 veces, pues aquí sería 4. Por lo que llamamos un factor de conversión.

917
01:42:15,199 --> 01:42:35,039
Y el factor de conversión es siempre el mismo. Y este factor de conversión depende del tipo de ácido nucleico que hayamos purificado. Si es un DNA de doble cadena, doble strand DNA, es diferente a si es un DNA de cadena sencilla o si es un RNA.

918
01:42:35,039 --> 01:42:55,260
En el caso del DNA doble cadena es 50 nanogramos por microlitro. En el caso del DNA de cadena sencilla es 40 nanogramos por microlitro. En el caso del RNA son 33 nanogramos por microlitro.

919
01:42:55,260 --> 01:43:02,520
Uno de estos valores es el que iría, porque esto es una constante, en el factor de conversión

920
01:43:02,520 --> 01:43:04,180
¿De acuerdo?

921
01:43:04,899 --> 01:43:12,420
Entonces, con esta fórmula obtenemos la concentración de los ácidos nucleicos en nanogramos por microlitro

922
01:43:12,420 --> 01:43:15,840
Esto actualmente también se hace de forma automatizada

923
01:43:15,840 --> 01:43:17,840
Os dejo aquí un par de vídeos

924
01:43:17,840 --> 01:43:24,800
No se utiliza un espectrofotómetro normal, sino un espectrofotómetro que se llama nanodrop

925
01:43:24,800 --> 01:43:46,579
Bueno, y aquí tenéis algunos vídeos, pues, de curiosidad para saber cómo funcionan, ¿de acuerdo? Bien, ya hemos dicho, una buena calidad, unos buenos, unos parámetros de calidad que son buenos, nos aseguran una buena funcionalidad del DNA y, por tanto, buenos resultados, buenos resultados en las técnicas de biología móvil.

926
01:43:46,579 --> 01:43:51,539
Una vez hemos extraído y purificado los ácidos nucleicos

927
01:43:51,539 --> 01:43:54,340
Hemos medido su calidad, ya hay que almacenarlos

928
01:43:54,340 --> 01:43:55,899
Y esto es muy importante

929
01:43:55,899 --> 01:44:02,680
El almacenamiento nos asegura que el DNA se mantiene inalterado

930
01:44:02,680 --> 01:44:06,039
Entonces las condiciones para mantener la integridad

931
01:44:06,039 --> 01:44:08,119
De gran peligro es que se degrada el DNA

932
01:44:08,119 --> 01:44:12,699
Vamos a utilizar, por un lado, criotubos de cierre hermético

933
01:44:12,699 --> 01:44:14,020
Muy importante

934
01:44:14,020 --> 01:44:16,340
Y además que sean libres de nucleasas

935
01:44:16,340 --> 01:44:37,020
2. Se almacenan en frío. Entonces, el DNA, que es muy termoestable, si el DNA lo vamos a utilizar pronto, por ejemplo, la semana que viene, lo podemos almacenar a 4 grados. Para almacenarlo a largo plazo, entonces habría que congelarlo, pero en el congelador normal, a menos 20.

936
01:44:37,920 --> 01:44:48,380
Si es un RNA que vamos a utilizar pronto, lo tenemos que almacenar siempre congelado, porque es mucho más termodábil.

937
01:44:49,159 --> 01:44:55,319
Y si lo vamos a almacenar para mucho tiempo, hay que almacenarlo en un ultracongelador a menos 80 grados centígrados.

938
01:44:55,640 --> 01:44:56,640
Y esto es muy importante.

939
01:44:58,140 --> 01:44:58,859
¿De acuerdo?

940
01:45:00,899 --> 01:45:06,460
Y después hemos de asegurar la trazabilidad de las muestras, porque estas muestras yo las voy a guardar en un congelador

941
01:45:06,460 --> 01:45:12,199
y entonces esto ya hay programas de gestión que a cada una de las muestras de cada paciente

942
01:45:12,199 --> 01:45:16,819
le ponen etiqueta con un sistema de identificación, etcétera, etcétera, etcétera.

943
01:45:17,180 --> 01:45:18,380
Pero esto también es muy importante.

944
01:45:19,739 --> 01:45:23,399
Muy bien, pues a modo de resumen, en este tema hemos visto todas las fases

945
01:45:23,399 --> 01:45:26,819
para poder llevar a cabo una extracción y una purificación

946
01:45:26,819 --> 01:45:29,899
desde una muestra que nos llega al laboratorio

947
01:45:29,899 --> 01:45:35,020
hasta la evaluación de la calidad del ácido nucleico extraído y purificado

948
01:45:35,020 --> 01:45:40,119
y su almacenamiento para futuras técnicas de biología molécula.