1
00:00:00,000 --> 00:00:18,519
Bueno, pues el otro día ya empezamos a ver el tema 4, que es el tema de clonación de ácidos nucleicos.

2
00:00:19,440 --> 00:00:29,739
Y ya estuvimos viendo cómo es posible cortar el ADN y así estudiarlo más fácilmente.

3
00:00:30,640 --> 00:00:42,759
Antes, hasta los años 70, era muy difícil estudiar el ADN porque el ADN es una molécula muy grande, una gran longitud, entonces era muy complicado estudiarla.

4
00:00:42,759 --> 00:00:58,799
Pero ya en los años 70 se descubrieron las enzimas de restricción y con estas enzimas de restricción lo que se logra es cortar el ADN en zonas, en fragmentos determinados, que se denominan sitios de restricción.

5
00:00:58,799 --> 00:01:11,959
Y estas enzimas de restricción, también vimos el otro día que había más de un millar de enzimas de restricción y que cortan en zonas palindrómicas.

6
00:01:11,959 --> 00:01:28,459
Si os acordáis, las secuencias palindrómicas eran las que se leen igual en una cadena de 3' a 5', se lee igual que en la cadena contraria de 5' a 3'.

7
00:01:28,459 --> 00:01:40,560
Y vimos también que alguna de esas enzimas era la E. coli y que cada una de las enzimas corta en una zona determinada.

8
00:01:41,719 --> 00:01:51,620
También vimos que había dos tipos de cortes que daban lugar a los extremos romos y a los extremos cohesivos.

9
00:01:51,620 --> 00:02:09,580
Los extremos romos cuando se corta el ADN se corta en vertical y ahí no quedan bases desapareadas y en cambio cuando se producen extremos cohesivos ahí se quedan bases desapareadas.

10
00:02:09,580 --> 00:02:17,060
y esto es lo mejor para cuando luego nosotros queremos unir dos ADN que provienen de organismos diferentes

11
00:02:17,060 --> 00:02:22,919
pues si los extremos de estos ADN se han cortado con la misma enzima de restricción

12
00:02:22,919 --> 00:02:29,000
y además han generado extremos cohesivos pues es fácil que luego se puedan volver a unir estos dos ADN

13
00:02:29,000 --> 00:02:34,759
por eso se llaman también extremos cohesivos o pegajosos

14
00:02:34,759 --> 00:02:40,919
Y esto es para cortar el ADN

15
00:02:40,919 --> 00:02:46,840
Vimos también que hay unas enzimas con las que podemos unir fragmentos de ADN

16
00:02:46,840 --> 00:02:50,000
Y estas enzimas se llaman ligasas

17
00:02:50,000 --> 00:02:56,020
Y también vimos que dependiendo de si los extremos eran romos o cohesivos

18
00:02:56,020 --> 00:02:58,879
Pues la unión era de dos formas diferentes

19
00:03:01,219 --> 00:03:09,460
Vale, pues entonces hoy vamos a ver otra técnica de clonación de ADN que se llama hibridación.

20
00:03:12,090 --> 00:03:14,650
Bueno, pues vamos a ver en qué consiste la hibridación.

21
00:03:29,889 --> 00:03:31,210
¿Veis la pantalla, verdad?

22
00:03:41,169 --> 00:03:41,449
Sí.

23
00:03:42,069 --> 00:03:46,560
¿Veis la pantalla?

24
00:03:51,659 --> 00:03:53,340
Sí, pone hibridación.

25
00:03:53,719 --> 00:03:54,659
Sí, vale.

26
00:03:56,300 --> 00:03:59,240
Vale, pues vamos a ver qué es esto de hibridación.

27
00:04:00,199 --> 00:04:01,300
¿Cómo es esta técnica?

28
00:04:01,740 --> 00:04:10,639
Entonces, la hibridación se basa en dos fenómenos, en desnaturalización y renaturalización.

29
00:04:11,259 --> 00:04:20,759
Si os acordáis, la desnaturalización era la ruptura de los enlaces de hidrógeno entre las bases nitrogenadas.

30
00:04:21,240 --> 00:04:29,379
Entre adenina y timina, acordaros que hay dos puentes de hidrógeno, y entre citosina e inguanina hay tres puentes de hidrógeno.

31
00:04:29,379 --> 00:04:50,600
Pues la desnaturalización. Acordaos que hay varias formas de que se desnaturalice el ADN. Una de ellas, por ejemplo, es la temperatura. La desnaturalización lo que hace es romper esas uniones entre las bases nitrogenadas y entonces nos quedan las dos cadenas de ADN separadas.

32
00:04:50,600 --> 00:05:03,339
Y vimos también en el tema anterior que una vez que está desnaturalizado el ADN, se puede volver a renaturalizar. Es decir, estas dos cadenas se pueden volver a unir.

33
00:05:03,339 --> 00:05:07,439
Bueno, pues la hibridación se basa en este fenómeno

34
00:05:07,439 --> 00:05:14,620
Lo que pasa es que en vez de renaturalizarlo con la misma cadena de ADN

35
00:05:14,620 --> 00:05:25,100
Lo que se hace es añadir una cadena de ADN que sea complementaria a una de ellas, a una de estas cadenas de ADN

36
00:05:25,100 --> 00:05:41,360
Entonces, se puede, por un lado, hibridar. Hibridar significa que se va a unir la cadena que teníamos con una cadena nueva que le vamos a añadir.

37
00:05:41,639 --> 00:05:47,899
Hibridar significa que se forman los puentes de hidrógeno entre adenina, timina, citosina o anina.

38
00:05:47,899 --> 00:06:03,899
Y puede ser, podemos hibridar una cadena de ADN con otra cadena de ADN o podemos volver a formar una doble hélice con un segmento de ARN, hibridación de ADN con ARN.

39
00:06:03,899 --> 00:06:26,120
ARN. Entonces, la cuestión es que tenemos nuestro ADN, que sería esto de aquí en rojo y estos segmentos así en negro serían las bases nitrogenadas. Esta es nuestra secuencia de ADN.

40
00:06:26,120 --> 00:06:30,040
Con esta técnica, ¿qué pretendemos?

41
00:06:30,040 --> 00:06:39,800
Pues queremos saber, por ejemplo, si esta secuencia de ADN tiene adenina, timina, adenina, adenina, citosina, citosina, guanina, guanina, adenina

42
00:06:39,800 --> 00:06:45,360
Queremos identificar cuál es la secuencia de nuestro ADN

43
00:06:45,360 --> 00:06:52,920
Lo que hacemos es separamos las dos cadenas de ADN, o sea, desnaturalizamos nuestro ADN

44
00:06:52,920 --> 00:07:03,939
Y luego lo que hacemos es añadir una secuencia de ADN que sea complementaria a la secuencia que estamos nosotros investigando.

45
00:07:05,500 --> 00:07:08,199
Entonces, por ejemplo, a ver aquí, en esta.

46
00:07:08,620 --> 00:07:12,680
Imaginaros que queremos investigar si nuestro ADN tiene esta secuencia.

47
00:07:13,240 --> 00:07:16,199
A, T, G, C, G, A, C, T.

48
00:07:16,199 --> 00:07:33,420
Bueno, pues lo que hacemos es añadir una sonda, se llama, una sonda es una secuencia de un fragmento de ADN que va a ser complementaria a este fragmento de ADN que estamos nosotros investigando.

49
00:07:33,420 --> 00:07:44,180
Por lo tanto, si es complementaria, eso significa que vamos a tener una timina aquí, luego una adenina, porque la adenina es complementaria a la timina.

50
00:07:45,339 --> 00:07:54,279
Luego vamos a tener una citosina, una guanina, porque es complementaria a la citosina, otra citosina, timina, guanina, adenina.

51
00:07:54,279 --> 00:08:19,160
Entonces tenemos una secuencia de ADN, un fragmento de ADN que nosotros vamos a añadir a nuestro ADN y que si es complementaria a esta secuencia que estamos buscando pues se va a hibridar, es decir, se van a formar por aquí puentes de hidrógeno entre la citosina y la guanina, entre la adenina y la timina.

52
00:08:19,160 --> 00:08:22,680
se forman puentes de hidrógeno, es decir, se hibrida.

53
00:08:24,040 --> 00:08:27,279
Y ahora, ¿cómo sabemos si se ha hibridado?

54
00:08:27,399 --> 00:08:31,360
¿Cómo confirmamos que tenemos esta secuencia de ADN?

55
00:08:32,779 --> 00:08:37,320
Pues lo que hacemos es, esta sonda de ADN que añadimos,

56
00:08:37,320 --> 00:08:42,399
este ADN, este fragmento de ADN que es complementario en teoría

57
00:08:42,399 --> 00:08:45,820
al fragmento que nosotros estamos investigando,

58
00:08:45,820 --> 00:09:06,899
Este fragmento de ADN contiene un fluoróforo. Un fluoróforo es una molécula que va a emitir fluorescencia y así podemos identificar la secuencia de ADN.

59
00:09:06,899 --> 00:09:30,289
Voy a esperar a ver si pasa nada. Entonces, fluorocromos, se llaman fluoróforos o fluorocromos. Los fluoróforos son componentes de una molécula que hacen que ésta sea fluorescente.

60
00:09:30,789 --> 00:09:44,590
Es un grupo funcional de la molécula que absorberá energía de una longitud de onda específica y la volverá a emitir en otra determinada de mayor longitud de onda, es decir, de menor energía.

61
00:09:45,350 --> 00:10:01,990
Una sonda de ADN es un fragmento de ADN o alguna vez de ARN de pequeño tamaño, normalmente entre 100 y 1000 pares de bases, marcado mediante fluorocromos o marcado también radioactivamente,

62
00:10:02,929 --> 00:10:13,110
usado en biología molecular como herramienta para detectar la presencia de ADN o ARN y de secuencia complementaria parecida o igual.

63
00:10:13,110 --> 00:10:42,450
Vale, entonces tenemos nuestro ADN y queremos identificar a ver si este ADN tiene un fragmento determinado, pues adenina, timina, timina, adenina, adenina, citosina, guanina, pues lo que hacemos es añadir una sonda, esto es una sonda, o sea una sonda es una secuencia, un fragmento de ADN que es complementario a la cadena de ADN que nosotros queremos investigar.

64
00:10:42,450 --> 00:10:51,250
Y además esta sonda tiene una molécula que es un fluoróforo o fluorocromo, es decir, que va a emitir radiación.

65
00:10:56,340 --> 00:11:08,340
Entonces, esta capacidad de aparearse dos hebras de ADN complementarias es muy útil para detectar secuencias de ADN similares de dos especies diferentes o en el genoma de una misma especie.

66
00:11:08,340 --> 00:11:19,440
Es posible detectar un gen o una secuencia específica de ADN en presencia de otras muchas secuencias si se tiene la hebra de ADN complementario adecuada.

67
00:11:22,159 --> 00:11:32,299
Este ADN complementario se marca con radiactividad o con fluorocromos para poder revelar su presencia y una vez marcado se denomina sonda.

68
00:11:32,919 --> 00:11:35,100
Esto es lo que ya he explicado.

69
00:11:35,100 --> 00:11:59,190
Bueno, pues hay tres tipos de hibridación. El primer tipo es la transferencia Southern, transferencia Northern y la hibridación in situ. Se llama también Southern Blot, Blot en inglés es transferencia, o Northern Blot.

70
00:11:59,190 --> 00:12:03,769
Vamos a ver la transferencia Southern

71
00:12:03,769 --> 00:12:13,090
Esta técnica se llama Seed Southern porque la desarrolló Edwin Southern en 1975

72
00:12:13,090 --> 00:12:17,990
¿En qué consiste?

73
00:12:18,850 --> 00:12:22,529
Bueno, pues tiene varias etapas esta técnica

74
00:12:22,529 --> 00:12:26,450
Lo primero que tenemos que hacer es extraer la muestra de ADN

75
00:12:26,450 --> 00:12:46,289
Ya en el tema anterior ya vimos varias formas de extraer una muestra de ADN. Podría ser rompiendo la membrana plasmática o mediante enfriamiento rápido con nitrógeno. Había varias formas.

76
00:12:47,289 --> 00:12:53,710
Una vez que tenemos nuestra muestra de ADN, lo que hacemos es cortar ese ADN en fragmentos.

77
00:12:54,129 --> 00:13:03,389
¿Cómo cortamos ese ADN? Pues con las enzimas de restricción que vimos el otro día.

78
00:13:04,629 --> 00:13:11,330
Estas enzimas de restricción nos van a cortar determinados fragmentos de ADN.

79
00:13:11,330 --> 00:13:18,230
Ahora, una vez que tenemos estos fragmentos de ADN, pues lo que vamos a hacer es separar estos fragmentos

80
00:13:18,230 --> 00:13:26,490
¿Y cómo los separamos? Pues utilizamos la técnica de electroforesis en gel de agarosa

81
00:13:26,490 --> 00:13:30,330
Esta es la técnica que normalmente se utiliza para ADN

82
00:13:31,850 --> 00:13:37,690
Entonces, acordaros, en esta técnica lo que hacíamos era preparar un gel de agarosa

83
00:13:37,690 --> 00:13:49,090
y en el gel hacíamos una serie de pocillos y en estos pocillos insertábamos nuestra muestra, las muestras

84
00:13:49,090 --> 00:14:01,490
y además insertábamos en uno de ellos un patrón de ADN para después comparar con nuestras bandas de nuestra muestra

85
00:14:01,490 --> 00:14:18,250
Y acordaros, como el ADN tiene carga negativa, pues el ADN se va a mover, o sea, nosotros vamos a aplicar un campo eléctrico y el ADN se va a mover hacia la carga positiva.

86
00:14:18,250 --> 00:14:43,330
En este caso sería de aquí hacia aquí, hacia la carga positiva. Y como el gel de agarosa tiene unos agujerillos, pues las moléculas de ADN que sean más pequeñas van a pasar y van a aparecer abajo y en cambio las moléculas de los fragmentos de ADN más grandes, de mayor masa molecular, se van a quedar retenidos más arriba.

87
00:14:43,330 --> 00:14:48,570
Y así podemos separar los fragmentos de ADN de distinto tamaño.

88
00:14:50,190 --> 00:14:56,330
Bueno, pues ya tenemos extraído el ADN, cortado con enzimas de restricción y ya lo tenemos separado.

89
00:14:57,789 --> 00:15:05,970
Bueno, pues ahora lo que tenemos que hacer, ya tenemos nuestro gen con el ADN separado.

90
00:15:05,970 --> 00:15:19,190
Pues ahora acordaros que lo que teníamos en la hibridación consiste en primero desnaturalizar nuestro ADN, desnaturalizar, es decir, romper los enlaces de hidrógeno entre las dos cadenas.

91
00:15:20,070 --> 00:15:26,250
Bueno, pues en esta técnica la desnaturalización se lleva a cabo con hidróxido de sodio.

92
00:15:27,629 --> 00:15:33,970
Simplemente ponemos el gel en hidróxido de sodio y aquí se va a desnaturalizar el ADN.

93
00:15:37,600 --> 00:16:00,980
Ahora, el siguiente paso que vamos a hacer, pues va a ser transferir este ADN, aquí tenemos el gel de agarosa con nuestro ADN desnaturalizado, pues lo que vamos a hacer va a ser transferirlo a un filtro que es de nitrocelulosa, que sería esto de aquí.

94
00:16:00,980 --> 00:16:20,980
Entonces tenemos el ADN ya desnaturalizado, aquí ponemos una disolución tampón y lo que ocurre es que por capilaridad el ADN pasa a este filtro de nitrocerulosa, simplemente esto es para después poder analizarlo mejor.

95
00:16:20,980 --> 00:16:28,679
y aquí tenemos que poner una serie de papel secante, un peso, etc.

96
00:16:29,200 --> 00:16:37,720
Pero lo importante de aquí es esto, que ponemos el gel de agarosa y encima el filtro de nitrocelulosa

97
00:16:37,720 --> 00:16:41,779
y así pasa, el ADN pasa al filtro.

98
00:16:47,100 --> 00:16:52,600
Ahora, una vez que tenemos el ADN ya en el filtro de nitrocelulosa,

99
00:16:53,240 --> 00:16:55,259
lo que hacemos es añadirle la sonda.

100
00:16:55,679 --> 00:17:07,720
La sonda, es decir, unos fragmentos de ADN que son complementarios a la cadena que estamos nosotros buscando, que queremos detectar.

101
00:17:09,099 --> 00:17:19,859
Entonces añadimos esos fragmentos de ADN, si son complementarios a esa cadena, pues se van a hibridar, se van a unir a esa cadena, se van a formar puentes de hidrógeno.

102
00:17:19,859 --> 00:17:29,400
Pues este sería el paso 6, añadir una sonda y ver si los fragmentos de esa sonda se hibridan al ADN

103
00:17:29,400 --> 00:17:40,119
Bueno, pues ahora el siguiente paso lo que vamos a hacer va a ser lavar esa sonda

104
00:17:40,119 --> 00:17:47,940
y ver si la sonda se ha quedado hibridada a nuestro ADN

105
00:17:47,940 --> 00:18:09,819
Vamos a observar fluorescencia. Estos serían los fragmentos de ADN que queremos identificar y veis aquí que vemos esta sonda en verde que se ha quedado adherida y la sonda que no se haya hibridado la lavamos, la eliminamos.

106
00:18:09,819 --> 00:18:33,400
Vale, entonces bueno, pues además de, para lo que os he dicho, de caracterizar el ADN, de identificar secuencias, lo que podemos hacer es mapear sitios de restricción, esto ya es lo que os he dicho, identificar fragmentos de ADN que contienen un gen determinado,

107
00:18:33,400 --> 00:18:42,480
dentro de una mezcla de muchos fragmentos, podemos identificar genes que haya en distintas especies

108
00:18:42,480 --> 00:18:49,759
y también se utiliza para detectar reorganizaciones y duplicaciones en genes asociados a enfermedades genéticas,

109
00:18:49,880 --> 00:18:51,400
humanas y a cánceres.

110
00:18:53,559 --> 00:19:00,400
Entonces, esta sería la hibridación por la Southern Plot, la transferencia Southern.

111
00:19:00,400 --> 00:19:12,480
Aquí tenéis dos vídeos, si queréis en algún momento un poco de ayuda para entender esta técnica.

112
00:19:13,400 --> 00:19:22,039
Esa sería la transferencia Southern, que como os he dicho, el nombre viene del investigador que lo descubrió.

113
00:19:23,519 --> 00:19:27,799
Y ahora vamos a ver la transferencia Northern, la Northern Plot.

114
00:19:27,799 --> 00:19:33,220
Esta transferencia en orden se utiliza para ARN

115
00:19:33,220 --> 00:19:41,259
En este caso, como lo que queremos detectar es ARN y la molécula es más pequeña

116
00:19:41,259 --> 00:19:45,359
Pues el paso de fragmentación nos lo podemos saltar

117
00:19:45,359 --> 00:19:49,079
No se necesita fragmentar la cadena de ADN

118
00:19:49,079 --> 00:19:53,160
Y los siguientes pasos son iguales

119
00:19:53,160 --> 00:19:57,359
Una vez extraído el ARN se hace una electroforesis en gel de agarosa

120
00:19:57,359 --> 00:20:00,980
donde las moléculas se separan de mayor a menor tamaño.

121
00:20:02,279 --> 00:20:06,720
Luego se transfiere a un filtro de nitrocelulosa o a una membrana de nylon.

122
00:20:08,460 --> 00:20:10,420
Ahí se transfiere el ARN.

123
00:20:11,079 --> 00:20:19,039
El ARN en el filtro se hibrida con una sonda marcada específica de la secuencia que se quiere identificar.

124
00:20:20,359 --> 00:20:27,319
Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico que reconocerá la secuencia de ARN inmovilizada en el filtro

125
00:20:27,319 --> 00:20:32,079
a través del reconocimiento de secuencias complementarias de ácidos nucleicos.

126
00:20:35,140 --> 00:20:37,059
Bueno, aquí en este gráfico se ve bien.

127
00:20:37,319 --> 00:20:38,400
Tenemos nuestra muestra.

128
00:20:39,859 --> 00:20:42,799
Ya hemos visto que no hace falta cortar, no hace falta fragmentar.

129
00:20:43,539 --> 00:20:47,900
Extraemos el ARN y hacemos una electroforesis.

130
00:20:48,799 --> 00:20:51,900
El ARN se va a separar por tamaños.

131
00:20:52,700 --> 00:20:55,200
Este sería el gel de agarosa.

132
00:20:56,119 --> 00:20:58,940
Lo transferimos a la membrana de nitrocelulosa.

133
00:20:59,400 --> 00:21:11,559
Y aquí añadimos las ondas marcadas, las ondas marcadas que si son complementarias al ARN que tenemos, pues quedarán ahí fijadas, ¿vale?

134
00:21:11,559 --> 00:21:22,160
Se hibridan con las cadenas de ARN que tenemos aquí y después podemos visualizar el ARN que se ha quedado marcado.

135
00:21:23,480 --> 00:21:27,339
Veremos aquí pues estas tres franjas, estas tres bandas de ARN.

136
00:21:27,339 --> 00:21:45,480
Bueno, aquí tenéis otro vídeo. Entonces, esto sería la transferencia Southern y la Northern. En estas dos tenemos que extraer el ARN o el ADN en la Southern.

137
00:21:45,480 --> 00:22:14,180
Pues ahora vamos a ver el tercer tipo de hibridación, que es la hibridación in situ. Es decir, aquí no necesitamos extraer el ADN. Esta hibridación se realiza marcando directamente con sondas o tejidos de organismos sin que se necesite la extracción.

138
00:22:15,480 --> 00:22:38,440
Esta técnica se denomina FIS, que viene de Fluorescent In-Situ Hybridation, la técnica FIS, que usa sondas marcadas con fluorescencia para detectar la presencia de determinados fragmentos de ADN en cromosomas, haciendo que sean visibles bajo el microscopio de fluorescencia.

139
00:22:41,660 --> 00:22:44,640
Entonces, ¿cómo se lleva a cabo esta técnica?

140
00:22:44,819 --> 00:22:50,460
Pues bueno, el primer paso de la técnica consiste en la desnaturalización del ADN para separar la doble hélice.

141
00:22:51,160 --> 00:22:52,519
Esto sería igual.

142
00:22:53,680 --> 00:23:03,480
Ahora, en nuestra muestra desnaturalizada añadimos la sonda de interés, el fragmento de ADN marcado con un fluoróforo o fluorocromo.

143
00:23:03,480 --> 00:23:14,960
Ahora las ondas, si son complementarias a las regiones de ADN, hibridarán y después ya se tiñen los núcleos con un color de contraste.

144
00:23:15,819 --> 00:23:28,200
Entonces, de esta técnica simplemente saber que se utiliza sobre tejidos de organismos directamente, que no es necesaria la extracción.

145
00:23:28,200 --> 00:23:32,700
Y también saber que la más importante es la técnica FIS.

146
00:23:33,480 --> 00:23:41,859
Pero lo que es el procedimiento es prácticamente igual a los anteriores, a la SAUDE y a la NORMEN.

147
00:23:44,339 --> 00:23:47,819
Bueno, pues esta sería la hibridación, técnicas de hibridación.

148
00:23:48,819 --> 00:23:53,960
La siguiente técnica que tenéis en los apuntes es la secuenciación.

149
00:23:54,960 --> 00:24:04,460
Secuenciar significa conocer o determinar la secuencia de bases nitrogenadas que tenemos en nuestro ADN.

150
00:24:04,980 --> 00:24:12,359
Y secuenciar significa conocer uno a uno los nucleótidos que los forman y el orden en que aparecen en la cadena de ADN.

151
00:24:13,519 --> 00:24:31,859
Bueno, pues esta técnica es un poco, yo creo que es un poco más complicada de entender y yo creo que es mejor que veamos primero la PCR y ya el próximo día veremos lo que es la secuenciación, porque yo creo que la PCR es un poco más fácil de entender.

152
00:24:31,859 --> 00:24:38,240
Entonces, no sé si hay alguna duda de esta parte de hibridación

153
00:24:38,240 --> 00:24:50,660
Bueno, vosotros mirároslo y ya el próximo día, si tenéis alguna duda, ya lo repasamos

154
00:24:50,660 --> 00:24:55,539
Bueno, pues vamos a ver ahora otra técnica

155
00:24:55,539 --> 00:25:01,490
Que es la PCR, que seguramente os sonará

156
00:25:01,490 --> 00:25:08,740
La PCR, ¿vale?

157
00:25:08,740 --> 00:25:26,740
La PCR, las siglas vienen del inglés, Polymerase Chain Reaction, y significa reacción en cadena de la polimerasa.

158
00:25:26,740 --> 00:25:37,839
La polimerasa, seguro que os suena, como termina en asa, es una enzima, acordaros.

159
00:25:38,740 --> 00:25:44,500
de los nombres de las enzimas, cuando terminan en asa son enzimas.

160
00:25:44,920 --> 00:25:50,359
Bueno, pues vamos a ver un poco cómo es esta técnica.

161
00:25:52,200 --> 00:26:01,130
Bueno, pues esta técnica la descubrió este investigador, este científico,

162
00:26:01,130 --> 00:26:10,730
de la empresa, trabajaba en la empresa Cetrus, que se llama Carimulis, y la descubrió en 1985.

163
00:26:12,710 --> 00:26:23,930
Este investigador era un hombre un poco excéntrico y, bueno, cuentan que, bueno, a él le dieron el premio Nobel en 1993

164
00:26:23,930 --> 00:26:34,390
por haber descubierto esta técnica, pero debía ser un nombre un poco extraño porque le invitaron a una conferencia en Sevilla

165
00:26:34,390 --> 00:26:45,390
después de haber recibido el premio Nobel en el 93 y en vez de hablar de la PCR se puso a hablar del SIDA

166
00:26:45,390 --> 00:26:50,569
y de otras historias que no tenían que ver con la PCR.

167
00:26:52,329 --> 00:26:53,529
Pero bueno, aparte de esto,

168
00:26:54,230 --> 00:26:57,809
Kari Mullis fue el descubridor de esta técnica, de la PCR.

169
00:26:59,910 --> 00:27:01,930
Bueno, ¿en qué consiste esta técnica?

170
00:27:02,930 --> 00:27:06,289
O mejor dicho, ¿cuál es el objetivo de esta técnica?

171
00:27:06,650 --> 00:27:13,970
Lo que queremos es obtener muchas miles de copias

172
00:27:13,970 --> 00:27:23,210
de un fragmento de adn entonces tenemos y bueno partiendo esto es importante

173
00:27:23,210 --> 00:27:29,329
partiendo de una pequeña muestra entonces el fragmento imagen aquí

174
00:27:29,329 --> 00:27:35,450
tenemos nuestro adn en la doble cadena la doble que dice por lo que queremos

175
00:27:35,450 --> 00:27:43,849
es hacer de este fragmento que está en verde queremos obtener miles de copias y

176
00:27:43,849 --> 00:27:47,950
Y poder después identificar este fragmento.

177
00:27:50,809 --> 00:27:58,250
Entonces, para ello, para esto, se necesitan unas enzimas que se llaman ADN polimerasas.

178
00:27:59,230 --> 00:28:01,589
Y en eso se basa esta técnica.

179
00:28:02,690 --> 00:28:06,569
Tenemos, repito otra vez, tenemos nuestra muestra, una pequeña muestra.

180
00:28:06,569 --> 00:28:12,829
Una pequeña muestra que puede ser, por ejemplo, cuando se ha cometido un crimen,

181
00:28:12,829 --> 00:28:28,769
una pequeñísima muestra de sangre y a partir de esa pequeñísima muestra extraer el ADN y de ese ADN amplificar un fragmento de ese ADN

182
00:28:28,769 --> 00:28:41,470
y de ese fragmento de ADN hacer miles de copias y así poder luego hacer un análisis y detectar ese fragmento de ADN con seguridad.

183
00:28:42,829 --> 00:29:01,170
Si os acordáis con el COVID, la técnica de la PCR es muy fiable porque aunque tengamos muy poca carga de virus, si da positivo es totalmente fiable.

184
00:29:01,170 --> 00:29:13,329
No es como las pruebas de antígenos que hacemos nosotros en casa, que son más sencillas y que esas solamente nos podemos fiar cuando ya tenemos alta carga viral.

185
00:29:13,750 --> 00:29:25,250
Pero si tenemos muy poca carga viral, la PCR es muy fiable porque como hacemos muchas copias de ese fragmento, pues es muy fiable.

186
00:29:25,970 --> 00:29:30,829
Bueno, este sería el objetivo de esta técnica.

187
00:29:31,170 --> 00:29:37,609
Vamos a ver cómo se obtiene este fragmento y cómo se hacen tantas copias.

188
00:29:41,750 --> 00:29:52,069
Pues esta técnica, o sea, para realizar esta técnica se llevan a cabo tres etapas, se realizan tres etapas.

189
00:29:53,390 --> 00:29:58,789
Desnaturalización, la segunda es alineamiento y la tercera es elongación.

190
00:29:58,789 --> 00:30:09,309
Y ahora, estas etapas se repiten cíclicamente entre 20 y 40 veces.

191
00:30:10,950 --> 00:30:15,630
Vamos a ver qué es esto y ahora ya veréis cómo lo vais a entender.

192
00:30:18,259 --> 00:30:24,339
Primera etapa. Pues la primera etapa es la, hemos dicho, la desnaturalización.

193
00:30:24,339 --> 00:30:33,160
Es decir, desnaturalización significa romper los puentes de hidrógeno entre las dos cadenas de ADN.

194
00:30:34,440 --> 00:30:43,359
Pues entonces, aquí tenemos las dos cadenas, la 5'-3' y la 3'-5', esto sería una doble hélice.

195
00:30:43,359 --> 00:31:00,539
Pues con la desnaturalización rompemos, separamos esas dos cadenas y esta etapa se lleva a cabo a 94 grados, es decir, con temperatura, con calor, hacemos la desnaturalización.

196
00:31:00,539 --> 00:31:14,519
Si os acordáis, en la técnica de antes, en la hibridación, lo que hacemos es desnaturalizar también, pero si os acordáis, lo hacíamos con hidróxido de sodio. Bueno, pues aquí desnaturalizamos con temperatura.

197
00:31:14,519 --> 00:31:22,460
Ahora, aquí es importante, a mayor cantidad de guanina y citosina que tengamos

198
00:31:22,460 --> 00:31:25,980
pues se va a necesitar algo más de temperatura

199
00:31:25,980 --> 00:31:31,140
porque si os acordáis entre guanina y citosina hay tres puentes de hidrógeno

200
00:31:31,140 --> 00:31:33,299
por lo tanto nos va a costar más separar

201
00:31:33,299 --> 00:31:38,059
si hay más guanina y citosina nos va a costar más separar esas dos cadenas

202
00:31:38,059 --> 00:31:44,180
Bien, esta sería la primera etapa, ya tenemos las cadenas separadas

203
00:31:44,180 --> 00:31:49,059
Ahora, la segunda etapa se llama alineamiento

204
00:31:49,059 --> 00:31:56,960
Lo que se hace en esta etapa es bajar la temperatura entre 50 y 60, y 75 grados centígrados

205
00:31:56,960 --> 00:32:00,700
En esta etapa, ¿qué vamos a hacer?

206
00:32:01,579 --> 00:32:06,799
Pues lo que vamos a hacer va a ser añadir dos primers o cebadores

207
00:32:06,799 --> 00:32:27,460
Si os acordáis, en la etapa de replicación, os acordáis que había una enzima, la ARN primasa, que lo que hacía era poner un primer en las cadenas de ADN para que luego la ADN polimerasa pudiera ir copiando.

208
00:32:27,460 --> 00:32:30,420
pues en realidad esto es lo mismo

209
00:32:30,420 --> 00:32:33,200
lo que pasa que aquí lo que hacemos es

210
00:32:33,200 --> 00:32:35,980
nosotros añadimos dos primers

211
00:32:35,980 --> 00:32:39,079
porque tiene que ir uno en cada cadena

212
00:32:39,079 --> 00:32:42,619
y estos primers se sintetizan

213
00:32:42,619 --> 00:32:44,279
en el laboratorio

214
00:32:44,279 --> 00:32:48,400
y estos primers lo que van a hacer es

215
00:32:48,400 --> 00:32:52,220
delimitar el fragmento

216
00:32:52,220 --> 00:32:53,680
que queremos ampliar

217
00:32:53,680 --> 00:32:57,460
aquí hay este en rojo sería un primer

218
00:32:57,460 --> 00:33:01,640
un primer, acordaros, es una secuencia de nucleótidos

219
00:33:01,640 --> 00:33:04,599
y esto otra secuencia de nucleótidos

220
00:33:04,599 --> 00:33:08,019
que son complementarios, este es a una cadena

221
00:33:08,019 --> 00:33:12,720
y este primer es complementario a esta otra cadena

222
00:33:12,720 --> 00:33:17,980
pues estos dos primers van a ser los que delimiten

223
00:33:17,980 --> 00:33:21,319
el fragmento que vamos a ampliar

224
00:33:21,319 --> 00:33:27,720
¿Os acordáis? Aquí tenemos este fragmento en verde, es el que queremos ampliar

225
00:33:27,720 --> 00:33:34,400
Pues este fragmento lo delimitan los primers que vamos a añadir, primers o cebadores

226
00:33:34,400 --> 00:33:38,339
Y esta etapa es la etapa de alineamiento

227
00:33:38,339 --> 00:33:50,029
Y los primers se hibridan, es decir, se unen a las dos cadenas, a cada una de las cadenas

228
00:33:50,029 --> 00:33:56,730
se unen, es decir, se forman puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas de la cadena

229
00:33:56,730 --> 00:33:59,910
y las bases nitrogenadas del primer.

230
00:34:01,190 --> 00:34:03,930
Bueno, pues esta sería la etapa de alineamiento.

231
00:34:04,890 --> 00:34:07,509
Y nos queda la última etapa, que es la tercera.

232
00:34:07,509 --> 00:34:13,510
En esta etapa se vuelve a subir otra vez la temperatura a 70-80 grados centígrados.

233
00:34:15,190 --> 00:34:18,969
Entonces, en la primera, en la desnaturalización, calentamos a 94.

234
00:34:18,969 --> 00:34:41,929
Para que se unan los primers, para que se hibriden, bajamos a 50-65 grados centígrados y ahora es la etapa de elongación. Elongación significa que encima la ADN polimerasa va a ir copiando las cadenas del fragmento.

235
00:34:41,929 --> 00:34:49,949
La ADN polimerasa empieza a copiar esta cadena por aquí y esta otra cadena la copia hacia acá

236
00:34:49,949 --> 00:34:54,690
Si tenemos aquí una adenina pues va a copiar y va a poner una timina

237
00:34:54,690 --> 00:35:01,369
Guanina, citosina, timina, adenina y así va copiando

238
00:35:01,369 --> 00:35:05,690
Va copiando toda la cadena por este lado y va copiando esta cadena también

239
00:35:05,690 --> 00:35:09,309
Si os acordáis de la replicación es parecida

240
00:35:09,309 --> 00:35:17,510
la replicación, teníamos el primer y luego lo que era la elongación, la copia de las

241
00:35:17,510 --> 00:35:25,820
dos cadenas. En este gráfico se pueden ver las tres etapas. Tenemos la doble hélice,

242
00:35:26,739 --> 00:35:33,159
subimos la temperatura, esto es temperatura y esto es tiempo. Aumentamos la temperatura

243
00:35:33,159 --> 00:35:41,579
a en torno de 94 grados, se desnaturaliza el ADN. Bajamos la temperatura entre 50-65

244
00:35:41,579 --> 00:35:51,460
grados, se hibridan los primers o cebadores. Subimos otra vez la temperatura en torno a

245
00:35:51,460 --> 00:36:00,300
70 grados y la ADN polimerasa comienza a copiar. Pues entonces, este sería el primer

246
00:36:00,300 --> 00:36:08,579
ciclo. Entonces, en el primer ciclo vamos a obtener cuatro cadenas de ADN. Veis aquí

247
00:36:08,579 --> 00:36:17,960
la roja, azul, roja y azul. En el primer ciclo vamos a obtener cuatro cadenas de ADN y el

248
00:36:17,960 --> 00:36:26,579
aumento, este ciclo se va a repetir, como os he dicho antes, entre 20 y 40 veces. En

249
00:36:26,579 --> 00:36:32,659
el primer ciclo, cuatro cadenas. Repetimos otra vez el ciclo, desnaturalización, alineamiento,

250
00:36:32,659 --> 00:36:38,480
extensión, pues ahora se van a duplicar cada una de las dos cadenas y por lo tanto vamos

251
00:36:38,480 --> 00:36:44,659
a obtener de esta cadena 2, de esta cadena 2, de esta cadena 2 y de esta cadena 2, pues

252
00:36:44,659 --> 00:36:52,179
en el ciclo 2 vamos a obtener 8 cadenas, en el ciclo 3, como es exponencial, 16 cadenas,

253
00:36:53,000 --> 00:37:01,400
en el ciclo 4, 32 cadenas y así se va haciendo copias del fragmento de ADN que nosotros queremos

254
00:37:01,400 --> 00:37:13,050
copiar. Ahora, vamos a ver, aunque ya hemos visto un poco lo que es, qué componentes

255
00:37:13,050 --> 00:37:19,630
se necesitan para la PCR, vamos a verlas un poquito más en profundidad. Por un lado

256
00:37:19,630 --> 00:37:27,429
necesitamos el ADN que queremos copiar, esto es evidente, necesitamos el ADN. Por otro

257
00:37:27,429 --> 00:37:37,050
necesitamos la una una adn polimerasa esta adn polimerasa la que se utiliza en

258
00:37:37,050 --> 00:37:44,190
la actualidad es la tac polimerasa no lo he puesto aquí no sólo tenéis en los

259
00:37:44,190 --> 00:37:49,989
apuntes la que se utiliza es la tac polimerasa al principio cuando se

260
00:37:49,989 --> 00:37:59,429
empezó a utilizar esta técnica, se utilizaba la enzima de la E. coli, pero el problema

261
00:37:59,429 --> 00:38:07,889
era que esta enzima no aguantaba temperaturas, cambios de temperatura, y entonces había

262
00:38:07,889 --> 00:38:18,630
que ir volviendo a poner otra vez, a ir cambiando la enzima. En cambio aquí con la TAC polimerasa,

263
00:38:18,630 --> 00:38:42,730
TAC viene de Cermus Aquaticus. Cermus, o sea que es una polimerasa que aguanta, resiste, vamos, quiero decir, la bacteria resiste a los cambios de temperatura. Bien, pues esta sería la ADN polimerasa que se obtiene de la bacteria de la TAC polimerasa.

264
00:38:42,730 --> 00:38:50,730
Ahora, vamos a necesitar también unos primers, en concreto dos, dos primers

265
00:38:50,730 --> 00:38:54,869
Uno para una cadena y el otro para la otra cadena

266
00:38:54,869 --> 00:39:00,869
Estos primers, acordaros, delimitan el fragmento que se va a amplificar

267
00:39:00,869 --> 00:39:06,309
También vamos a necesitar una serie de nucleótidos

268
00:39:06,309 --> 00:39:11,150
Porque la ADN polimerasa va a ir copiando el fragmento

269
00:39:11,150 --> 00:39:21,550
Pero claro, necesita de nucleótidos para ir poniendo nucleótidos, que acordaros, los nucleótidos tienen el grupo fosfato, el azúcar y la base nitrogenada.

270
00:39:22,349 --> 00:39:33,909
Así que vamos a necesitar un nucleótido que tenga adenina, otro nucleótido que tenga aquí como base nitrogenada timina, otro que tenga citosina y otro que tenga guanina.

271
00:39:33,909 --> 00:39:40,909
Y así la TAC polimerasa va a ir cogiendo estos nucleótidos y va a ir copiando la cadena.

272
00:39:44,239 --> 00:39:50,000
Además también vamos a necesitar cationes magnesio.

273
00:39:51,059 --> 00:39:53,099
¿Y estas cationes para qué nos van a servir?

274
00:39:53,719 --> 00:39:59,260
Pues nos van a servir como estimulantes de la enzima.

275
00:39:59,260 --> 00:40:09,599
Para acordaros que las enzimas, había algunas enzimas que necesitaban de un cofactor

276
00:40:09,599 --> 00:40:21,239
Pues esta enzima necesita de cationes de magnesio 2+, que provienen de una disolución de cloruro de magnesio

277
00:40:21,239 --> 00:40:25,699
Estos cationes van a estimular a la enzima TAC polimerasa

278
00:40:25,699 --> 00:40:48,449
Y por último vamos a necesitar también que estos componentes estén en una disolución buffer o tampón, una disolución tampón para que no haya cambios de pH y con los cambios de pH acordaros que las enzimas se podían degradar.

279
00:40:48,449 --> 00:40:59,670
porque las enzimas son proteínas que con cambios de pH se pueden degradar, pues necesitamos trabajar con que los componentes se encuentren en una disolución tampón.

280
00:41:01,800 --> 00:41:09,800
Bueno, pues ya tenemos todos los componentes, esto sería un ependorf, aquí es donde vamos a poner todos los componentes

281
00:41:09,800 --> 00:41:23,980
Y ahora, ¿qué hacemos para repetir? Hemos dicho que repetíamos los ciclos de desnaturalización, alineamiento y elongación, se repiten entre 20 y 40 veces.

282
00:41:23,980 --> 00:41:31,119
Bueno, pues para repetir estos ciclos lo que utilizamos es un termociclador

283
00:41:31,119 --> 00:41:35,920
Que es un aparato de este tipo

284
00:41:35,920 --> 00:41:43,019
Aquí, no se ve muy bien, pero aquí pondríamos los ependors

285
00:41:43,019 --> 00:41:46,179
Que son así muy pequeñitos

286
00:41:46,179 --> 00:41:49,420
Aquí pondremos toda la serie de ependors

287
00:41:49,420 --> 00:41:53,179
Y aquí lo que hacemos es programar el ciclo

288
00:41:53,179 --> 00:42:06,380
Porque, bueno, generalmente se trabaja con los cambios de temperatura que hemos visto, pero se pueden hacer otras programaciones diferentes.

289
00:42:07,519 --> 00:42:19,599
Bueno, pues esto se llama termociclador. Es el aparato donde se hace la PCR y es el aparato donde se pueden hacer los cambios de temperatura.

290
00:42:19,599 --> 00:42:31,369
Pues esta sería la CR

291
00:42:31,369 --> 00:42:35,750
Profe, una pregunta con respecto a lo del termociclador

292
00:42:35,750 --> 00:42:39,630
En función de lo que nosotros queramos conseguir

293
00:42:39,630 --> 00:42:43,690
¿Será el tiempo que le vamos a poner en el termociclador?

294
00:42:46,309 --> 00:42:48,369
¿Los ciclos te refieres?

295
00:42:48,369 --> 00:42:50,409
Es que el tiempo depende de...

296
00:42:50,409 --> 00:42:52,230
Sí, depende también

297
00:42:52,230 --> 00:42:55,190
Pues si tenemos muy poca cantidad de muestra

298
00:42:55,190 --> 00:42:57,909
pues pondremos más ciclos

299
00:42:57,909 --> 00:43:00,070
sí, más ciclos

300
00:43:00,070 --> 00:43:03,070
en cambio si a lo mejor con 20 ciclos

301
00:43:03,070 --> 00:43:05,190
si tenemos suficiente cantidad de muestra

302
00:43:05,190 --> 00:43:07,289
a lo mejor con 20 ciclos ya nos vale

303
00:43:07,289 --> 00:43:10,550
y por lo tanto el tiempo va a depender

304
00:43:10,550 --> 00:43:12,369
de cuántos ciclos pongamos

305
00:43:12,369 --> 00:43:14,409
no sé si te he respondido

306
00:43:14,409 --> 00:43:17,190
sí, eso era lo que quería saber

307
00:43:17,190 --> 00:43:18,550
si había algo exacto

308
00:43:18,550 --> 00:43:20,769
o en función de lo que yo quiero encontrar

309
00:43:20,769 --> 00:43:22,730
o cuánta cantidad quiero conseguir

310
00:43:22,730 --> 00:43:26,789
es la cantidad de ciclos que voy a ponerle a...

311
00:43:26,789 --> 00:43:30,590
Eso, en función de la muestra que tengas,

312
00:43:30,690 --> 00:43:33,110
en función también de la seguridad

313
00:43:33,110 --> 00:43:37,510
con la que quieras luego determinar tu muestra,

314
00:43:37,750 --> 00:43:39,969
el ADN que has amplificado.

315
00:43:40,210 --> 00:43:42,010
Si necesitas una fiabilidad muy alta,

316
00:43:42,170 --> 00:43:43,929
pues tendrás que hacer más ciclos.

317
00:43:44,789 --> 00:43:48,409
Tendrás que repetir las tres etapas más veces

318
00:43:48,409 --> 00:43:50,630
y así puedes tener más seguridad.

319
00:43:52,730 --> 00:44:11,849
Una vez que tenemos ya esos fragmentos, ya miles de fragmentos de ese ADN, lo que queremos es saber si hemos fragmentado la secuencia que nosotros queríamos.

320
00:44:11,849 --> 00:44:20,329
porque a lo mejor hemos hecho copias de un fragmento que no es el que nosotros queríamos.

321
00:44:21,190 --> 00:44:25,429
Pues eso se comprueba haciendo una electroforesis en gel de agarosa.

322
00:44:26,929 --> 00:44:33,010
Entonces, bueno, lo mismo que antes, como el ADN tiene carga negativa al aplicar un campo eléctrico,

323
00:44:33,010 --> 00:44:41,070
el ADN se va a desplazar hacia el polo positivo y según el tamaño de ADN se va a desplazar más o menos.

324
00:44:41,849 --> 00:44:51,210
Pues así, de este modo, vamos a comprobar si hemos amplificado el fragmento que nosotros queríamos.

325
00:44:54,699 --> 00:44:56,820
Hacemos eso, la electroforesis.

326
00:44:58,079 --> 00:45:05,599
Normalmente se suele hacer en gel de agarosa, pero a veces también se utiliza el gel de poliacrilamida, que es el que vimos para proteínas.

327
00:45:07,219 --> 00:45:14,039
Esto sería lo que obtendríamos en el gel de agarosa, esto sería la secuencia patrón.

328
00:45:14,320 --> 00:45:19,940
Y esto sería cada una de nuestras muestras que estemos analizando.

329
00:45:23,519 --> 00:45:35,480
Bueno, aquí os he puesto un ejemplo, que esto será lo que hagamos en las prácticas para determinar si un maíz es transgénico, si un alimento tiene maíz transgénico.

330
00:45:35,480 --> 00:45:55,760
Y entonces se puede ver, esto ya lo explicaré, pero aquí se puede ver por ejemplo el maíz normal que serían los carriles el 3 y el 6 solamente tienen una banda y en cambio el 2, el 4, el 5 y el 7 tienen dos bandas.

331
00:45:55,760 --> 00:46:10,619
Aquí ya esto nos está indicando que hay un fragmento de ADN que es este de aquí, que es el que se corresponde a alimentos transgénicos, por lo tanto estas muestras, la 2, la 4, la 5 y la 7 son transgénicos.

332
00:46:10,619 --> 00:46:39,280
Esto es una de las aplicaciones de la PCR. Bueno, aquí estarían los pasos. Sería poner todos los componentes en nuestro Ependor, luego se ponen en el termociclador, se hace la PCR, se analiza por electroforesis y estas serían las secuencias en una PCR normal.

333
00:46:39,280 --> 00:46:55,070
¿Qué ventajas tiene la PCR? Bueno, ya hemos dicho que desde una muestra mínima a una muestra pequeña se puede amplificar y por lo tanto es una técnica muy sensible, tiene alta sensibilidad.

334
00:46:55,070 --> 00:47:01,670
Otra ventaja sería la automatización

335
00:47:01,670 --> 00:47:06,469
Y otra de las ventajas sería la sencillez

336
00:47:06,469 --> 00:47:11,230
Porque en realidad, fijaros que simplemente con tener los componentes

337
00:47:11,230 --> 00:47:18,809
Y el termociclador, que es un aparato más o menos sencillo

338
00:47:18,809 --> 00:47:21,590
Pues se hace fácil una PCR

339
00:47:21,590 --> 00:47:32,829
Simplemente es poner los ependors, programar la secuencia y lo único que luego hay que analizarlo por electroforesis en gel de agarosa.

340
00:47:35,110 --> 00:47:37,869
Ahora, ¿qué problema tiene la PCR importante?

341
00:47:38,510 --> 00:47:49,429
Pues que claro, como es tan sensible, como ya os digo, a partir de una muestra mínima podemos amplificar un fragmento de ese ADN, de esa muestra.

342
00:47:49,429 --> 00:48:04,409
Claro, si hay contaminación, pues es posible que amplifiquemos un fragmento de ADN que no sea el que nosotros queremos, que haya algún contaminante por ahí y estemos amplificando ADN falso.

343
00:48:05,409 --> 00:48:15,570
Por lo tanto, en la PCR hay que tener muchísimo cuidado, muchísima limpieza al hacer la PCR.

344
00:48:15,570 --> 00:48:30,909
Por otra parte, ¿qué es importante también en la PCR o qué otra limitación tiene la PCR normal? Pues que no se puede cuantificar, no podemos saber cuánto ADN estamos amplificando.

345
00:48:30,909 --> 00:48:58,389
Pues para eso tenemos la PCR a tiempo real o PCR cuantitativa. Tenemos que tener cuidado porque también hay otra PCR de transferencia inversa que a veces también se pone como, porque es transferencia en inglés es TR-PCR.

346
00:48:58,389 --> 00:49:22,030
Y entonces hay veces que se confunden. Aquí he puesto esta QPCR, ¿vale? Porque es cuantitativa. Q es del inglés, pero hay veces que también se pone TR, de tiempo real, aquí TR en pequeñito, que se puede confundir con la PCR de transferencia inversa, que se pone también a veces TR, pero bueno, simplemente porque lo sepáis.

347
00:49:22,030 --> 00:49:32,570
Pues esta PCR a tiempo real, como os digo, nos permite cuantificar, nos permite saber qué cantidad de ADN tenemos

348
00:49:32,570 --> 00:49:38,829
Y para esto se utilizan unas moléculas que son fluorescentes

349
00:49:38,829 --> 00:49:41,489
Acordaros que antes ya hemos visto los fluorocromos

350
00:49:41,489 --> 00:49:48,949
Estas moléculas cuando las excitamos con luz, pues absorben luz y emiten otra luz

351
00:49:48,949 --> 00:49:55,489
Y esa luz que emiten la podemos identificar, o sea, se puede detectar.

352
00:50:00,170 --> 00:50:08,750
Entonces, la cuantificación de la fluorescencia emitida durante cada ciclo de la PCR es proporcionar a la cantidad de ADN que se está amplificando.

353
00:50:09,769 --> 00:50:18,730
Para que sea válida esta técnica es necesario realizar en paralelo una curva patrón en las mismas condiciones para conocer la cantidad total de ADN que se está amplificando.

354
00:50:18,730 --> 00:50:34,010
Bueno, hay dos formas de hacer esta PCR a tiempo real. Una forma es añadiendo agentes intercalantes y otra forma es añadiendo sondas específicas marcadas con fluorocromos.

355
00:50:34,010 --> 00:50:43,309
Bueno, como en el documento solamente viene explicada esta, la de sondas, pues no nos vamos a liar con los agentes intercalantes

356
00:50:43,309 --> 00:50:54,849
Los agentes intercalantes simplemente son fluorocromos, moléculas, que lo que hacen es meterse entre las dos cadenas de ADN

357
00:50:54,849 --> 00:51:11,170
Es decir, que según se va amplificando el ADN, se va metiendo ahí esa molécula entre la doble hélice y entonces vamos a ir detectando, detectamos ese fluorocromo y vamos a ir detectando cómo va aumentando.

358
00:51:12,250 --> 00:51:19,510
Pero bueno, ya os digo, vamos a ver mejor esta, que es las ondas específicas, que es lo que tenéis explicado en el documento.

359
00:51:21,269 --> 00:51:22,969
Bueno, ¿qué consisten las ondas?

360
00:51:22,969 --> 00:51:27,369
Estas ondas son secuencias de nucleótidos

361
00:51:27,369 --> 00:51:37,789
Lo que pasa es que estas secuencias de nucleótidos llevan adherido en un extremo una molécula fluorescente

362
00:51:37,789 --> 00:51:43,010
Y en el otro extremo una molécula que inhibe la fluorescencia y que se llama cuenches

363
00:51:43,010 --> 00:51:49,989
Esto es un poco complicado pero ya el próximo día si queréis lo repasamos

364
00:51:49,989 --> 00:51:57,889
Pero vamos a intentar, hoy os lo explico y os lo miráis y ya el próximo día lo repasamos.

365
00:51:58,849 --> 00:52:01,449
Entonces, mirad, vamos a ver si lo tengo aquí.

366
00:52:02,530 --> 00:52:04,949
Tenemos nuestra cadena de ADN, esta de aquí.

367
00:52:06,030 --> 00:52:08,230
Tenemos nuestro primer, este de aquí.

368
00:52:08,989 --> 00:52:11,630
Y además de nuestro primer, añadimos una sonda.

369
00:52:13,530 --> 00:52:18,409
Esta sonda tiene, por un lado, esto aquí en verde sería el fluorocromo.

370
00:52:18,409 --> 00:52:33,829
Y esto de aquí en rojo sería lo que se llama cuencher. Este fluorocromo, esta molécula, va a emitir radiación, lo que pasa es que este cuencher de aquí va a inhibir esta radiación que está emitiendo.

371
00:52:33,829 --> 00:52:37,829
Por lo tanto, al principio no vamos a ver fluorescencia.

372
00:52:39,809 --> 00:52:49,090
Ahora, el primer se hibrida a la molécula de ADN y la sombra también se hibrida a la molécula de ADN.

373
00:52:50,110 --> 00:52:52,829
Este sería el paso 2, que sería, hemos dicho, alineamiento.

374
00:52:54,750 --> 00:53:03,230
Ahora, en el paso 3, que es la elongación, la ADN polimerasa, esto que está aquí dibujado en naranja, empieza a copiar.

375
00:53:03,829 --> 00:53:11,309
Copia, va copiando ADN, ADN, va copiando las bases nitrogenadas hasta que de repente llega a la sonda.

376
00:53:12,230 --> 00:53:16,389
Pues cuando llega a la sonda lo que va a hacer es romper esta molécula.

377
00:53:17,190 --> 00:53:22,690
Rompe esta molécula y entonces vamos a empezar a ver fluorescencia.

378
00:53:24,130 --> 00:53:27,730
Esta molécula va a emitir fluorescencia y se va a poder ver.

379
00:53:27,730 --> 00:53:31,489
antes no podíamos ver la fluorescencia que está emitiendo

380
00:53:31,489 --> 00:53:34,110
porque este quencher nos lo está absorbiendo

381
00:53:34,110 --> 00:53:39,070
pero ahora como la ADN polimerasa ha roto esta sonda

382
00:53:39,070 --> 00:53:41,869
pues vamos a poder ver fluorescencia

383
00:53:41,869 --> 00:53:45,369
y así según se va amplificando

384
00:53:45,369 --> 00:53:48,690
las cadenas del fragmento de ADN

385
00:53:48,690 --> 00:53:50,750
vamos a ir viendo más fluorescencia

386
00:53:50,750 --> 00:53:53,130
y así se puede cuantificar

387
00:53:53,130 --> 00:54:11,730
Aquí tenéis un vídeo desde donde he sacado estos dibujos y ahí si lo veis os va a poder ayudar a entender esta técnica.

388
00:54:11,730 --> 00:54:25,949
Ahora, para analizar la fluorescencia lo que necesitamos es un termociclador pero que tenga también lector de fluorescencia

389
00:54:25,949 --> 00:54:32,309
porque claro, a nuestras muestras que tenemos aquí les vamos a tener que incidir con una luz ultravioleta

390
00:54:32,309 --> 00:54:37,269
estas muestras absorben parte de esa luz y emiten fluorescencia

391
00:54:37,269 --> 00:54:45,329
Pues esa fluorescencia que van a emitir la tenemos que detectar y para ello necesitamos un lector de fluorescencia.

392
00:54:46,969 --> 00:54:51,550
Entonces necesitamos un termociclador que tenga lector de fluorescencia.

393
00:54:53,510 --> 00:54:56,869
Ahora, ¿qué ventajas tiene la PCR a tiempo real?

394
00:54:56,869 --> 00:55:10,869
Pues sobre todo que podemos cuantificar y además como luego no vamos a tener que hacer ninguna electroforesis pues se van a minimizar los problemas que teníamos de contaminación.

395
00:55:10,869 --> 00:55:30,619
Bueno, aquí tenemos algunas de las aplicaciones que serían aplicaciones en medicina, lo que hemos visto de la detección del virus, del COVID, también en ciencias forenses, lo que os explicaba antes.

396
00:55:30,619 --> 00:55:49,139
También a partir de una muestra de ADN, de sangre, de semen, podemos detectar el ADN de un sospechoso, comprobar si el sospechoso ha sido el que ha hecho ese crimen.

397
00:55:49,139 --> 00:56:00,119
También en antropología, en paleontología, mirad por ejemplo, bueno esto el próximo día ya os lo amplío un poquito más

398
00:56:00,119 --> 00:56:07,980
Bueno también en detección de organismos transgénicos, es lo que os comentaba antes, en paleontología, en ciencias forenses, en medicina

399
00:56:07,980 --> 00:56:31,579
Y esto os lo he puesto aquí porque hay una exposición, no sé si todavía está, de Pompeya, de cuando el volcán, el Vesubio, la erupción del Vesubio, y bueno, si tenéis tiempo y está todavía esa exposición, está muy bien, es con realidad virtual.

400
00:56:31,579 --> 00:56:58,019
Y esto lo hice una foto porque aquí se decía, ponían que investigadores de la Universidad de Copenhague habían caracterizado el ADN, el genoma humano, de un individuo víctima de esta erupción del Vesuvio y habían detectado que había tenido tuberculosis.

401
00:56:58,019 --> 00:57:28,500
Bueno, os lo he puesto aquí como curiosidad. Bien, pues bueno, el próximo día ya vemos un poco más las aplicaciones. No sé si tenéis alguna duda. Me imagino que ya... Hoy igual os he dado un poco de paliza, pero quería ampliar para... Como luego ya viene Semana Santa, para que tuvierais este...

402
00:57:28,500 --> 00:57:38,400
Yo le iba a preguntar, nosotros tenemos clase el martes siguiente de Semana Santa

403
00:57:38,400 --> 00:57:40,699
y después el jueves es que es la práctica, ¿cierto?

404
00:57:41,340 --> 00:57:48,599
El martes en principio no hay clases, cuando hay prácticas en principio no hay clases

405
00:57:48,599 --> 00:57:58,159
lo que pasa que igual lo que hago es subir una clase de la siguiente técnica

406
00:57:58,159 --> 00:58:00,059
que es la del ADN recombinante

407
00:58:00,059 --> 00:58:02,139
para poder ir avanzando

408
00:58:02,139 --> 00:58:04,179
pero en principio el martes

409
00:58:04,179 --> 00:58:06,059
le voy a preguntar a María José por si acaso

410
00:58:06,059 --> 00:58:08,079
pero en principio

411
00:58:08,079 --> 00:58:10,159
no habría clase el martes

412
00:58:10,159 --> 00:58:12,199
empezaríamos eso, la práctica

413
00:58:12,199 --> 00:58:13,079
el jueves

414
00:58:13,079 --> 00:58:16,039
o sea, no hay clase pero de igual

415
00:58:16,039 --> 00:58:18,139
forma usted sube a una clase

416
00:58:18,139 --> 00:58:20,179
para que nosotros podamos continuar

417
00:58:20,179 --> 00:58:21,880
el tema

418
00:58:21,880 --> 00:58:22,960
eso es, sí

419
00:58:22,960 --> 00:58:24,940
y

420
00:58:24,940 --> 00:58:28,159
¿Qué más os iba a decir?

421
00:58:29,019 --> 00:58:30,519
Vale, la vuelta sería eso

422
00:58:30,519 --> 00:58:31,000
El día

423
00:58:31,000 --> 00:58:34,840
Sería el 4

424
00:58:34,840 --> 00:58:36,460
El 4 de abril

425
00:58:36,460 --> 00:58:38,559
Es la práctica, ¿verdad?

426
00:58:40,159 --> 00:58:40,860
Esa las

427
00:58:40,860 --> 00:58:41,380
Creo que es

428
00:58:41,380 --> 00:58:44,039
La práctica usted no las va a poner en el

429
00:58:44,039 --> 00:58:46,920
En el aula

430
00:58:46,920 --> 00:58:48,480
Para que la podamos imprimir

431
00:58:48,480 --> 00:58:50,260
Eso es, la práctica

432
00:58:50,260 --> 00:58:52,199
La pongo en el aula

433
00:58:52,199 --> 00:58:54,480
Y lo que vamos a hacer

434
00:58:54,480 --> 00:59:03,820
es analizar un organismo transgénico. Entonces el jueves primero vamos a extraer el ADN y

435
00:59:03,820 --> 00:59:12,579
después el jueves siguiente haremos la PCR y tenemos que hacer también una electroforesis

436
00:59:12,579 --> 00:59:22,059
en gel de agarosa. Lo que no estoy muy segura es si quizá necesitemos otro día, pero dejadme

437
00:59:22,059 --> 00:59:23,980
que lo hable con Mari José

438
00:59:23,980 --> 00:59:25,400
y ya

439
00:59:25,400 --> 00:59:27,980
os lo confirmo, porque no sé

440
00:59:27,980 --> 00:59:29,599
si nos va a dar tiempo, en dos días

441
00:59:29,599 --> 00:59:31,820
no creo que nos dé tiempo

442
00:59:31,820 --> 00:59:37,860
os he puesto también, os puse

443
00:59:37,860 --> 00:59:39,860
el otro día ya los vídeos, los últimos

444
00:59:39,860 --> 00:59:41,800
me falta el del último día

445
00:59:41,800 --> 00:59:42,940
el del martes pasado

446
00:59:42,940 --> 00:59:45,780
y a ver si

447
00:59:45,780 --> 00:59:48,039
mañana ya puedo poneros

448
00:59:48,039 --> 00:59:50,460
el del

449
00:59:50,460 --> 00:59:52,460
martes pasado y este de hoy, para que

450
00:59:52,460 --> 00:59:54,280
así los tengáis en Semana Santa.

451
00:59:55,380 --> 00:59:56,420
Y os pondré también

452
00:59:56,420 --> 00:59:58,420
la... Intentaré poneros

453
00:59:58,420 --> 00:59:59,539
también la presentación

454
00:59:59,539 --> 01:00:01,800
de esto último que hemos visto.

455
01:00:03,880 --> 01:00:04,719
Y no sé

456
01:00:04,719 --> 01:00:06,360
si me queda algo más. ¿Qué tal vais

457
01:00:06,360 --> 01:00:07,400
con el...? ¿Habéis hecho

458
01:00:07,400 --> 01:00:09,579
la práctica

459
01:00:09,579 --> 01:00:12,760
del ADN

460
01:00:12,760 --> 01:00:14,000
de la cebolla?

461
01:00:18,980 --> 01:00:19,900
Yo sí lo hice en

462
01:00:19,900 --> 01:00:20,440
estos días.

463
01:00:25,559 --> 01:00:26,340
Yo tenía una duda.

464
01:00:26,739 --> 01:00:33,619
Ahí decía que solamente se podía subir una foto. Bueno, las otras fotos las puse en el informe, no hay problema, ¿cierto?

465
01:00:34,000 --> 01:00:38,059
Vale, no hay problema. A ver, un segundo que voy a…