1
00:00:01,649 --> 00:00:06,790
Bien, vamos a ver la primera parte del tema de secuenciación de ácidos nucleicos.

2
00:00:07,410 --> 00:00:10,550
Vamos a ver fundamentalmente estos tres primeros puntos,

3
00:00:11,650 --> 00:00:15,710
algunas generalidades sobre la secuenciación de ácidos nucleicos

4
00:00:15,710 --> 00:00:21,050
y vamos a ver los dos primeros métodos, que son métodos manuales,

5
00:00:21,089 --> 00:00:27,070
son los primeros métodos que se diseñaron para poder secuenciar un ácido nucleico,

6
00:00:27,070 --> 00:00:32,350
que es el método químico de Maxan y Gilbert y el método enzimático de Sanger.

7
00:00:33,530 --> 00:00:38,609
Ambos métodos, especialmente el segundo, el método enzimático, es importante

8
00:00:38,609 --> 00:00:45,450
puesto que está en la base para poder entender el resto de técnicas de secuenciación,

9
00:00:46,009 --> 00:00:48,810
especialmente la secuenciación automática de primera generación.

10
00:00:53,060 --> 00:00:56,700
Cuando hablamos de secuenciación, en realidad, ¿a qué nos estamos refiriendo?

11
00:00:56,700 --> 00:01:09,819
Por tanto, secuenciar un ácido nucleico no es ni más ni menos que el proceso por el cual vamos a determinar cuál es la secuencia de nucleótidos que componen una molécula tanto de DNA como de RNA.

12
00:01:10,260 --> 00:01:21,260
Es decir, el orden en el que están las bases nitrogenadas, los nucleótidos, en una secuencia lineal de DNA o de RNA.

13
00:01:21,260 --> 00:01:27,060
Por tanto, cuando hablamos de la secuencia de nucleótidos

14
00:01:27,060 --> 00:01:30,120
nos estamos refiriendo al orden

15
00:01:30,120 --> 00:01:33,840
¿Cuál es el primer nucleótido? ¿El segundo? ¿El tercero? ¿El cuarto?

16
00:01:34,400 --> 00:01:38,879
Hemos de determinar cuál es el orden de cada uno de los nucleótidos

17
00:01:38,879 --> 00:01:42,680
de una secuencia de DNA o de RNA

18
00:01:42,680 --> 00:01:46,280
Ese es el concepto fundamental

19
00:01:46,280 --> 00:01:47,599
Eso es la secuenciación

20
00:01:47,599 --> 00:02:14,039
¿De acuerdo? Una idea importante es que la secuenciación siempre la vamos a tener que dar en dirección 5'-3'. De hecho, en cualquier base de datos donde podamos acceder a secuencias del genoma, siempre vamos a encontrar todas las secuencias en dirección 5'-3'.

21
00:02:14,039 --> 00:02:21,060
Ya sabemos que el DNA es bicatenario, pero solamente nos van a dar la secuencia de una de las hebras. Cinco prima, tres prima.

22
00:02:22,819 --> 00:02:27,340
¿Qué técnicas se utilizan actualmente en la secuenciación o existen?

23
00:02:27,979 --> 00:02:35,139
Lo que vamos a ver hoy son las técnicas manuales. Son técnicas antiguas. Ya están en desuso, completamente en desuso.

24
00:02:35,139 --> 00:02:42,639
Entonces, la primera de ellas es una técnica diseñada por Maxan y por Gilbert

25
00:02:42,639 --> 00:02:50,580
Este de aquí es Gilbert, del cual toma nombre la técnica en sí

26
00:02:50,580 --> 00:02:55,840
Y se basa en reacciones químicas sobre el DNA que queremos secuenciar

27
00:02:55,840 --> 00:02:58,539
Simples reacciones químicas

28
00:02:58,539 --> 00:03:04,219
Sin embargo, el método que tuvo más éxito no fue el de Gilbert

29
00:03:04,219 --> 00:03:06,639
sino que fue el de

30
00:03:06,639 --> 00:03:08,599
Friedrich Sanger que en realidad está

31
00:03:08,599 --> 00:03:10,520
fundamentado en reacciones enzimáticas

32
00:03:10,520 --> 00:03:12,699
porque utiliza polimerasas

33
00:03:12,699 --> 00:03:14,599
polimerasas

34
00:03:14,599 --> 00:03:19,080
más adelante

35
00:03:19,080 --> 00:03:20,340
años más adelante

36
00:03:20,340 --> 00:03:22,560
sobre todo a finales de los años 80

37
00:03:22,560 --> 00:03:23,620
y principio, bueno

38
00:03:23,620 --> 00:03:26,400
los métodos de Max Sanger y de

39
00:03:26,400 --> 00:03:28,659
Friedrich Sanger son de finales

40
00:03:28,659 --> 00:03:30,139
de los años 60-70

41
00:03:30,139 --> 00:03:31,400
¿de acuerdo?

42
00:03:32,000 --> 00:03:33,819
a finales de los años 80

43
00:03:33,819 --> 00:03:41,180
se producen dos mejoras tecnológicas, biotecnológicas

44
00:03:41,180 --> 00:03:44,099
en las técnicas de biología molecular de secuenciación

45
00:03:44,099 --> 00:03:46,500
que es por un lado el desarrollo de la PCR

46
00:03:46,500 --> 00:03:49,360
ya sabemos que Mewlis a principios de los 80

47
00:03:49,360 --> 00:03:53,340
diseña y desarrolla la técnica de PCR

48
00:03:53,340 --> 00:04:00,340
y entonces gracias al desarrollo de la PCR

49
00:04:00,340 --> 00:04:03,460
y a una nueva tecnología de electroforesis

50
00:04:03,460 --> 00:04:08,419
que no se realiza en geles de agarosa ni en geles de poliaclamida

51
00:04:08,419 --> 00:04:12,620
sino que es lo que llamamos una electroforesis en capilar que utiliza otro tipo de polímero

52
00:04:12,620 --> 00:04:17,519
que permitía hacer una electroforesis tremendamente rápida en muy poco tiempo

53
00:04:17,519 --> 00:04:20,060
y con muchísima fiabilidad y resolución

54
00:04:20,060 --> 00:04:25,819
aunando la técnica de PCR con este nuevo tipo de electroforesis capilar

55
00:04:25,819 --> 00:04:33,279
se desarrollan a finales de los años 80 los primeros métodos automáticos

56
00:04:33,279 --> 00:04:39,319
Los anteriores, el de reacciones químicas y reacciones enzimáticas son manuales

57
00:04:39,319 --> 00:04:42,160
Todo se hacía a mano en el laboratorio

58
00:04:42,160 --> 00:04:46,120
Esta es la primera vez que se puede automatizar el proceso de secuenciación

59
00:04:46,120 --> 00:04:50,000
Y entonces hablamos de los métodos automáticos de primera generación

60
00:04:50,000 --> 00:04:53,779
Ya los veremos, ya los veremos más adelante

61
00:04:53,779 --> 00:04:59,500
Estos métodos automáticos de primera generación están basados en la tecnología Sanker

62
00:04:59,500 --> 00:05:01,579
En el método manual de Sanker

63
00:05:01,579 --> 00:05:03,540
como ya veremos.

64
00:05:05,439 --> 00:05:09,639
Estas mejoras tecnológicas, tanto el desarrollo de la PCR

65
00:05:09,639 --> 00:05:11,720
como este nuevo tipo de electroforesis

66
00:05:11,720 --> 00:05:16,339
que permitía una secuenciación rapidísima de pequeños fragmentos de DNA

67
00:05:16,339 --> 00:05:21,319
es lo que pone en marcha a principios de los años 90,

68
00:05:21,319 --> 00:05:26,319
de hecho en el año 90, comience el proyecto Genoma Humano.

69
00:05:26,319 --> 00:05:32,639
humano. Entonces la secuenciación del genoma humano empieza en el año 90 y gracias a este

70
00:05:32,639 --> 00:05:39,860
método automático de primera generación se concluye en el año 2002, es decir, tardaron 12 años en

71
00:05:39,860 --> 00:05:49,860
secuenciar todo el genoma humano, un genoma tipo, ¿de acuerdo? Sobre el año 2012, aproximadamente

72
00:05:49,860 --> 00:05:57,500
10 años después surge una nueva tecnología de secuenciación tremendamente más rápida que son

73
00:05:57,500 --> 00:06:03,199
los métodos automáticos de segunda generación que también los veremos de acuerdo daos cuenta

74
00:06:03,199 --> 00:06:11,060
que si habían tardado 12 años del año 90 al 2002 que se publica nature in science la secuenciación

75
00:06:11,060 --> 00:06:18,040
del genoma humano esta nueva tecnología permitió en apenas unas semanas secuenciar todo el genoma

76
00:06:18,040 --> 00:06:23,040
humano. De tal manera que estos nuevos métodos de secuenciación de segunda generación, también

77
00:06:23,040 --> 00:06:32,879
llamados NGS o Next Generation Sequencing, permiten un salto cualitativo. De tal manera que ahora para

78
00:06:32,879 --> 00:06:39,980
poder secuenciar no hace falta ya que purifiquemos un DNA y secuenciemos gen a gen, sino que de una

79
00:06:39,980 --> 00:06:46,199
tacada con esta nueva metodología podemos secuenciar el genoma completo de un individuo,

80
00:06:46,199 --> 00:06:49,600
de un paciente en muy poco tiempo.

81
00:06:52,199 --> 00:06:54,079
Actualmente se han desarrollado también

82
00:06:54,079 --> 00:06:57,040
métodos automáticos de tercera generación

83
00:06:57,040 --> 00:07:00,579
y la verdad es que esta parte es bastante alucinante

84
00:07:00,579 --> 00:07:02,319
porque parece que estamos entrando en el mundo

85
00:07:02,319 --> 00:07:04,560
de la ciencia ficción, ¿de acuerdo?

86
00:07:04,639 --> 00:07:08,379
Estos métodos automáticos aunan las técnicas clásicas

87
00:07:08,379 --> 00:07:13,680
de biología molecular con los desarrollos científicos

88
00:07:13,680 --> 00:07:19,899
de la nanotecnología. De tal manera que estos métodos automáticos de tercera generación

89
00:07:19,899 --> 00:07:27,379
están miniaturizados. Entonces, en tarjetas de un tamaño muy pequeño podemos llegar

90
00:07:27,379 --> 00:07:32,180
a secuenciar el genoma completo de un individuo en apenas unas horas.

91
00:07:33,720 --> 00:07:39,560
Una idea importante que tenemos que tener en cuenta cuando estamos hablando de secuenciación

92
00:07:39,560 --> 00:07:47,540
de ácidos nucleicos es que actualmente ya no secuenciamos genes individuales, a no ser que

93
00:07:47,540 --> 00:07:53,959
sea para aplicaciones muy concretas. Por ejemplo, estudiar la mutación en un único gen, una única

94
00:07:53,959 --> 00:08:01,060
mutación para saber si un paciente tiene una mutación u otra, pero se tiende actualmente a

95
00:08:01,060 --> 00:08:07,800
secuenciar el genoma completo de ese individuo, de esa persona. Eso hace que a la biología molecular

96
00:08:07,800 --> 00:08:13,560
se le haya unido una nueva disciplina que surgió también hace ya unas décadas

97
00:08:13,560 --> 00:08:20,899
que es la bioinformática, puesto que de la secuenciación de estos genomas completos

98
00:08:20,899 --> 00:08:26,560
el genoma completo de un individuo, se van a generar cantidades ingentes de información

99
00:08:26,560 --> 00:08:34,299
que debemos saber procesar, gestionar para poder sacar conclusiones e información valiosa

100
00:08:34,299 --> 00:08:54,019
Para ello necesitamos eso, gestionar toda esa información gracias a aplicaciones bioinformáticas. Por tanto, en este campo de la secuenciación, la biología molecular necesita de la bioinformática para poder analizar todos los datos y extraer conclusiones.

101
00:08:54,019 --> 00:08:59,960
¿De acuerdo? Bueno, estas son unas ideas así generales sobre la secuenciación

102
00:08:59,960 --> 00:09:05,379
también como un overview para enmarcar todo el tema que vamos a tratar

103
00:09:05,379 --> 00:09:10,279
¿De acuerdo? Vamos a comenzar con el primer método de secuenciación

104
00:09:10,279 --> 00:09:14,320
El primer método de secuenciación, tanto el método químico de Max-Anne y Gilbert

105
00:09:14,320 --> 00:09:18,779
como el de Sanger, el enzimático de Sanger, son prácticamente coetáneos

106
00:09:18,779 --> 00:09:40,240
Uno surge un poquito antes que otro y este método de secuenciación se basa en reacciones químicas. Vamos a tener nuestro DNA y vamos a hacer sobre él reacciones químicas específicas para modificar algunas bases nitrogenadas, ¿de acuerdo?

107
00:09:40,240 --> 00:09:42,720
dos desventajas

108
00:09:42,720 --> 00:09:44,200
que tienen este método químico

109
00:09:44,200 --> 00:09:46,480
y esto nos tiene que quedar claro ya desde el principio

110
00:09:46,480 --> 00:09:48,679
es que el método químico de Maxan y Gilbert

111
00:09:48,679 --> 00:09:50,460
fue desplazado muy pronto

112
00:09:50,460 --> 00:09:53,000
por el método enzimático de sangre

113
00:09:53,000 --> 00:09:54,159
por estas dos

114
00:09:54,159 --> 00:09:56,279
desventajas, entre otras

115
00:09:56,279 --> 00:09:58,639
primero, porque solamente podemos

116
00:09:58,639 --> 00:10:00,279
secuenciar fragmentos muy pequeños

117
00:10:00,279 --> 00:10:02,639
fragmentos cortitos de DNA

118
00:10:02,639 --> 00:10:04,120
y además

119
00:10:04,120 --> 00:10:06,559
porque para esta secuenciación

120
00:10:06,559 --> 00:10:08,299
requerimos de grandes

121
00:10:08,299 --> 00:10:10,080
cantidades de DNA purificado

122
00:10:10,080 --> 00:10:14,980
claro, esto en la clínica muchas veces es inviable

123
00:10:14,980 --> 00:10:17,940
¿por qué? porque a lo mejor la muestra que tenemos

124
00:10:17,940 --> 00:10:21,580
es una pequeña muestra de una biopsia minúscula

125
00:10:21,580 --> 00:10:25,340
de la cual podemos extraer un poquito de DNA purificado

126
00:10:25,340 --> 00:10:28,740
lo normal es que a partir de ese DNA purificado

127
00:10:28,740 --> 00:10:31,200
ahora en el laboratorio lo amplificamos

128
00:10:31,200 --> 00:10:34,360
o bien por PCR o bien por otras técnicas

129
00:10:34,360 --> 00:10:36,559
como veremos, lo amplificamos

130
00:10:36,559 --> 00:10:56,779
Entonces, da igual tener poco DNA de partida, porque lo vamos a amplificar. Pero en este método químico de Maxán y Gilbert no hay amplificación. Si no hay amplificación, para poder secuenciar el DNA necesito partir de grandes cantidades. Y esto no siempre es posible. ¿De acuerdo?

131
00:10:56,779 --> 00:11:00,340
vale, ¿cómo se realiza

132
00:11:00,340 --> 00:11:02,019
el método químico de Maxan y Gilbert?

133
00:11:02,620 --> 00:11:04,320
bueno, pues la primera fase

134
00:11:04,320 --> 00:11:06,480
es una de fosforilación

135
00:11:06,480 --> 00:11:08,100
y una fosforilación, imaginaos que

136
00:11:08,100 --> 00:11:09,759
nosotros tenemos esta

137
00:11:09,759 --> 00:11:12,200
secuencia de DNA, es el DNA que hemos

138
00:11:12,200 --> 00:11:14,320
purificado, pues lo que vamos

139
00:11:14,320 --> 00:11:16,240
a hacer, vamos a marcar en el

140
00:11:16,240 --> 00:11:17,259
extremo 5'

141
00:11:17,580 --> 00:11:20,279
claro, para poder marcar en el

142
00:11:20,279 --> 00:11:22,080
extremo 5' de esta

143
00:11:22,080 --> 00:11:24,120
cadena, lo primero que vamos a hacer va a ser

144
00:11:24,120 --> 00:11:25,440
una de fosforilación

145
00:11:26,779 --> 00:11:43,320
Con una fosfata, ¿sabes? De tal manera que vamos a eliminar este fosfato. Y una vez hemos eliminado este fosfato, lo vamos a fosforilar nosotros. Pero, ojo, lo vamos a fosforilar con un fosfato radioactivo, fósforo 32.

146
00:11:43,320 --> 00:12:11,019
Entonces vamos a utilizar un ATP que es portador de fósforo 32. De tal manera que después de la defosforilación y la fosforilación tenemos nuestro DNA marcado radioactivamente con un fosfato radioactivo en 5'. ¿Por qué no marcamos en 3'? Podríamos marcar en 3'. Pero es mejor siempre marcar en 5'. Ya veremos por qué.

147
00:12:13,320 --> 00:12:19,179
porque esta base, este nucleótido 3' lo vamos a perder.

148
00:12:19,639 --> 00:12:21,980
Todo esto lo vamos a ver ahora más adelante.

149
00:12:22,500 --> 00:12:26,179
Por tanto, la primera fase es, una vez yo he purificado todo mi DNA,

150
00:12:26,860 --> 00:12:29,279
que necesito microgramos y microgramos de DNA,

151
00:12:30,000 --> 00:12:35,980
lo que hago es de fosforilo en 5' y fosforilo con fosfato 32.

152
00:12:36,320 --> 00:12:41,379
De tal manera que ahora todas las hebras del DNA llevan un fosforo 32

153
00:12:41,379 --> 00:12:47,000
y por tanto las puedo detectar por autoradiografía, porque son radioactivos, ¿de acuerdo?

154
00:12:48,440 --> 00:12:52,860
Una vez ya tengo todo el DNA marcado, empieza la segunda fase.

155
00:12:53,720 --> 00:12:58,720
El DNA lo voy a repartir en cuatro tubos, ¿de acuerdo?

156
00:12:59,360 --> 00:13:03,639
En cuatro tubos, tubo 1, 2, 3 y 4, todo el DNA.

157
00:13:03,840 --> 00:13:06,299
Lo reparto en partes iguales en cuatro tubos.

158
00:13:06,299 --> 00:13:11,519
y en cada uno de estos tubos voy a llevar a cabo una reacción química diferente.

159
00:13:12,419 --> 00:13:13,860
En todos tengo el mismo DNA

160
00:13:13,860 --> 00:13:19,399
y lo he repartido equitativamente entre los cuatro epéndromos, los cuatro tubos.

161
00:13:19,879 --> 00:13:25,299
Y lo que voy a hacer va a ser una reacción química con un reactivo químico diferente,

162
00:13:25,539 --> 00:13:27,860
si os dais cuenta, en cada uno de los tubos

163
00:13:27,860 --> 00:13:32,200
para que se produzca una modificación química de una base diferente,

164
00:13:32,700 --> 00:13:33,960
una base nitrogenada diferente.

165
00:13:33,960 --> 00:13:59,139
En el tubo 1 voy a añadir dimetilsulfato. El dimetilsulfato va a modificar aleatoriamente las guaninas. En el tubo 2 añado ácido fórmico que es un ácido orgánico débil porque es un ácido orgánico y va a modificar específicamente todas las bases públicas, es decir, adeninas y guaninas.

166
00:13:59,139 --> 00:14:12,139
En el tubo 3 añado hidracina. La hidracina modifica específicamente las bases pirimidínicas, timina y citosina, si estamos hablando del DNA. Si fuera RNA es diferente.

167
00:14:13,480 --> 00:14:26,320
Y en el tubo 4, además de hidracina, voy a poner una alta concentración de sales, 2 molar de cloruro sódico. Esto produce una modificación específica solo de las citosinas.

168
00:14:26,320 --> 00:14:37,700
¿De acuerdo? Por tanto, en cada tubo he producido modificaciones químicas, por reacciones químicas de estos compuestos, con determinadas bases.

169
00:14:38,019 --> 00:14:46,580
Uno. Y la segunda idea es que la concentración del reactivo la voy a poner a concentración limitante.

170
00:14:47,059 --> 00:14:51,940
¿Eso qué significa? Eso significa que voy a poner poquita concentración.

171
00:14:51,940 --> 00:14:59,500
Solamente la concentración necesaria para que en cada molécula de DNA se modifique una guanina

172
00:14:59,500 --> 00:15:02,399
Una única guanina de todas las que hay en su secuencia

173
00:15:02,399 --> 00:15:04,519
Y se va a modificar de forma aleator

174
00:15:04,519 --> 00:15:08,279
En el tubo 2, una adenina o una guanina

175
00:15:08,279 --> 00:15:11,120
En el tubo 3, una timina o una citosina

176
00:15:11,120 --> 00:15:13,480
En el tubo 4, una citosina

177
00:15:13,480 --> 00:15:17,620
Esto lo vamos a ver ahora ejemplificado

178
00:15:17,620 --> 00:15:20,179
Imaginaos que yo quiero secuenciar este DNA

179
00:15:20,179 --> 00:15:35,519
Es una secuencia de ADN, ya hemos hecho la primera fase, por tanto en 5' tenemos aquí el marcaje radioactivo con fósforo 32 y en el tubo 1 hemos dicho que vamos a modificar las guaninas añadiendo dimetilsulfato e incubando.

180
00:15:35,519 --> 00:15:56,899
De tal manera que después de la reacción química, en el tubo habíamos puesto nuestra secuencia de DNA, nuestro DNA a secuenciar, después del tratamiento con dimetilsulfato voy a obtener toda una colección de fragmentos de DNA en las cuales aleatoriamente voy a tener una guanina modificada.

181
00:15:56,899 --> 00:16:19,159
Las he pintado aquí en verde. Aquí sería esta, aquí esta, aquí esta, aquí esta, la última, la última, ¿de acuerdo? Esto de forma aleatoria. Ya veis que pongo puntos suspensivos porque serían, voy a tener tantos fragmentos de DNA diferentemente marcados, marcados diferentes, tantos como guaninas tiene la secuencia.

182
00:16:19,159 --> 00:16:37,879
Tendría una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho. Por tanto, después de la reacción química en el tubo, lo que voy a tener es una mezcla de ocho tipos de secuencias diferentes con ocho marcajes de guaninas diferentes.

183
00:16:37,879 --> 00:16:55,240
¿De acuerdo? ¿De aquí bien? Esto es lo que ocurre en el tubo 1. ¿Qué ocurre en el tubo 2? Pues algo análogo. En el tubo 2 hemos puesto ácido fórmico. Entonces, este ácido fórmico, después de la incubación, sabemos que el ácido fórmico modifica las purinas.

184
00:16:55,240 --> 00:17:06,339
Por tanto, de forma aleatoria, en un fragmento de DNA marca una guanina o marca una adenina, de forma aleatoria, unas u otras.

185
00:17:06,799 --> 00:17:12,599
De tal manera que también al final de la reacción, en el tubo voy a tener una colección de fragmentos con diferente marcaje.

186
00:17:13,200 --> 00:17:21,440
Marcaje quiere decir con diferente base, una base, una guanina o una adenina, modificada químicamente.

187
00:17:22,279 --> 00:17:22,940
¿De acuerdo?

188
00:17:24,900 --> 00:17:26,380
¿Qué ocurre en el tubo 3?

189
00:17:26,380 --> 00:17:42,579
En el tubo 3, como ha puesto hidracina, después de la incubación con hidracina, la modificación se produce en las bases pirilínicas. Por tanto, también de forma aleatoria se modifica una citosina, una timina, una antes, otra después, según la secuencia.

190
00:17:42,579 --> 00:17:55,180
Al final, nuevamente tenemos en el tubo una mezcla de fragmentos con una única base modificada y que está modificada de forma aleatoria.

191
00:17:56,380 --> 00:18:14,140
¿De acuerdo? Y en el último tubo, que es el tubo 4, exactamente lo mismo. Lo que pasa es que al añadir sales a la hidracina, la hidracina ya es incapaz de modificar la timina y por eso solamente modifica aleatoriamente las citosinas. ¿De acuerdo?

192
00:18:14,140 --> 00:18:40,099
¿Verdad? Nuevamente, en este tubo también vamos a tener una mezcla de fragmentos con una citosina aleatoriamente modificada. ¿Sí? ¿Hasta aquí bien? Perfecto. Una vez hemos llevado a cabo la reacción química con estos compuestos, con todos estos compuestos químicos, y ya han sido modificadas unas bases nitrogenadas determinadas de forma aleatoria, lo que hago es una segunda incubación.

193
00:18:40,099 --> 00:18:57,099
Y añado a todos los tubos piperidina. La piperidina es un compuesto que lo que va a hacer es que se va a pegar al DNA, se une al DNA, la piperidina, y va a fragmentar el DNA por donde esté la base nitrogenada modificada.

194
00:18:57,099 --> 00:19:18,500
Es decir, en el tubo 1, ¿qué es lo que ocurre ahora? Una vez hemos puesto el dimetilsulfato y añadimos la piperidina, lo que va a ocurrir es que en estos fragmentos se va a fragmentar el DNA justo por donde se encuentra la base nitrogenada modificada.

195
00:19:18,500 --> 00:19:34,240
Aquí, por tanto, este fragmento ahora me quedaría muy cortito, una secuencia muy cortita. ¿Por qué? Porque la piperidina, pum, fragmenta aquí. Este más largo fragmenta aquí, fragmenta aquí, aquí, aquí, aquí.

196
00:19:34,240 --> 00:19:54,460
De tal manera que después del tratamiento con piperidina en el tubo lo que voy a tener va a ser un pool de fragmentos, ojo, marcados y no marcados porque la secuencia que viene aquí, que ahora no la he dibujado, que sería toda esta secuencia de aquí desde la timina hasta la guanina, ha quedado también libre ahora.

197
00:19:54,460 --> 00:20:10,500
Este fragmento ha quedado libre en el tubo. ¿Me explico? ¿Se entiende? Pero, ¿qué es lo que ocurre? Que este fragmento, desde la timina hasta la guanina, no está marcado radioactivamente. Solamente estará marcado este de aquí. ¿De acuerdo?

198
00:20:10,500 --> 00:20:28,640
De tal manera que después del tratamiento con piperidina lo que obtengo es un montón de fragmentos que proceden del DNA original y que todos ellos, uno, están marcados en 5' y dos, acaban todos en guanina. ¿Os dais cuenta? Todos acaban en guanina.

199
00:20:28,640 --> 00:20:58,240
¿Qué ocurre en el tubo 2? En el tubo 2 lo mismo, ¿de acuerdo? Después del tratamiento con piperidina se fragmentan las secuencias de DNA allá por donde tengan las bases nitrogenadas modificadas, de tal manera que nuevamente voy a obtener un pool de fragmentos marcados radioactivamente en 5' y que en este caso todos acaban o por guanina o por adenina, ¿de acuerdo?

200
00:20:58,240 --> 00:21:02,099
Aquí nuevamente dibujados solo unos pocos, pero serían muchos más.

201
00:21:02,819 --> 00:21:08,740
En el tubo 3, lo mismo, pero todos ellos acaban en citosinas o timinas.

202
00:21:09,420 --> 00:21:17,660
Y en el tubo 4, lo mismo, todos los fragmentos marcados en 5' radioactivamente y todos acaban, en este caso, en citosinas.

203
00:21:18,180 --> 00:21:18,460
¿De acuerdo?

204
00:21:18,940 --> 00:21:23,480
¿En qué se diferencian estos, todos estos fragmentos?

205
00:21:23,980 --> 00:21:26,380
Del tubo 4, del tubo 3, del 2 y del 1.

206
00:21:26,380 --> 00:21:43,059
Todos ellos se diferencian ahora en el tamaño. Unos son más grandes, otros son más cortos, pero todos ellos empiezan igual, marcados en 5' con el fosfato y todos acaban en citosina, ¿de acuerdo?

207
00:21:43,059 --> 00:22:03,519
Muy bien, una vez ya he llevado a cabo las reacciones de modificación de bases nitrogenadas y he hecho el tratamiento con la piperidina, lo que hago ahora es el contenido de cada tubo lo voy a correr en una electroforesis, pero una electroforesis en gel de poliacrilamida.

208
00:22:03,519 --> 00:22:22,559
La poliacrilamida tiene muchísimo mayor poder de resolución que la agarosa y además lo pongo hiperconcentrado. Para que os deis cuenta, normalmente se suelen hacer geles para correr una PCR del 1 al 2%, como mucho, ¿de acuerdo?

209
00:22:22,559 --> 00:22:28,619
Aquí vamos a hacer poliaclamida que va a estar en el entorno 10 veces más, de 10 al 20%.

210
00:22:28,619 --> 00:22:40,200
¿Esto qué me va a permitir? Esto me va a permitir en la electroforesis poder diferenciar bandas de secuencias cuya diferencia es un único nucleótido.

211
00:22:41,559 --> 00:22:43,779
¿De acuerdo? Son de altísima resolución.

212
00:22:44,240 --> 00:22:48,920
Una vez hecha la electroforesis, lo único que tengo que hacer es la autoradiografía del gel.

213
00:22:48,920 --> 00:22:52,220
Recordemos que los fragmentos son radioactivos

214
00:22:52,220 --> 00:22:54,740
Y ya analizamos la autoradiografía

215
00:22:54,740 --> 00:22:57,460
Resumiendo

216
00:22:57,460 --> 00:23:00,500
Nosotros teníamos un DNA de partida

217
00:23:00,500 --> 00:23:01,220
¿De acuerdo?

218
00:23:01,500 --> 00:23:04,839
Este DNA de partida, lo primero que hemos hecho ha sido marcarlo en 5'

219
00:23:05,160 --> 00:23:07,579
Con fosfato radioactivo

220
00:23:07,579 --> 00:23:09,099
¿Sí? Fosforo 32

221
00:23:09,099 --> 00:23:11,119
¿Hasta aquí bien? Muy bien

222
00:23:11,119 --> 00:23:12,220
Perfecto

223
00:23:12,220 --> 00:23:15,640
Una vez lo hemos llevado a cabo, el marcaje

224
00:23:17,259 --> 00:23:20,119
Hemos hecho las reacciones de modificación química

225
00:23:20,119 --> 00:23:35,180
Este DNA ya marcado lo hemos repartido en cuatro tubos diferentes y en cada uno de ellos hemos añadido un reactivo químico diferente y se van a llevar a cabo una serie de modificaciones químicas de bases nitrogenadas diferentes.

226
00:23:35,180 --> 00:23:42,279
Después añadimos la piperidina, incubamos, hacemos el tratamiento con piperidina

227
00:23:42,279 --> 00:23:47,799
y lo que tenemos en cada uno de estos tubos, si os dais cuenta, es una colección de fragmentos

228
00:23:47,799 --> 00:23:49,700
unos marcados y otros no

229
00:23:49,700 --> 00:23:55,480
Los no marcados no los voy a ver en la autorreografía, me imagino que estáis viendo

230
00:23:55,480 --> 00:23:59,920
y además que son de diferente tamaño, unos son más pequeños, otros son más largos

231
00:23:59,920 --> 00:24:02,779
pero todos ellos en este tubo acaban por guanina

232
00:24:02,779 --> 00:24:27,660
En este tubo acaban en adenina o guanina, aquí en citosina o timina y aquí todos acaban en citosina. ¿De acuerdo? ¿Qué es lo que hago ahora? Ahora voy a coger el contenido de cada tubo y lo voy a correr en un gel de poliacrilamida al 10-20%. ¿De acuerdo? Cada uno en un carril, en una calle diferente del gel.

233
00:24:27,660 --> 00:24:50,380
Cuando hago esto, ¿de acuerdo? Corro el gel de electrophoresis, obtengo un patrón de bandas. Este patrón de banda corresponde a, desde los fragmentos más pequeños, que están aquí abajo, porque migran más de los fragmentos más pequeños a los fragmentos más grandes, ¿de acuerdo? Que estarían aquí arriba.

234
00:24:50,380 --> 00:24:58,640
Ya veis que las bandas se disponen a diferentes alturas

235
00:24:58,640 --> 00:25:05,160
La diferencia que hay entre este fragmento y el siguiente fragmento

236
00:25:05,160 --> 00:25:06,579
Es un único nucleótido

237
00:25:06,579 --> 00:25:10,079
Entre este y este es un único nucleótido

238
00:25:10,079 --> 00:25:12,880
Entre este y este es un único nucleótido, etc.

239
00:25:12,880 --> 00:25:33,980
De tal manera que si los fragmentos más pequeños son los que más corren, los fragmentos más pequeños, si tiro para atrás, son aquellos, ¿veis? Los fragmentos más pequeños son aquellos que están más cerca del cinco prima, ¿sí? Del marcaje.

240
00:25:33,980 --> 00:25:39,960
Por tanto, los fragmentos que migran más lejos en el gel son los que están en 5'.

241
00:25:39,960 --> 00:25:47,970
Entonces lo único que tengo que ir haciendo ahora es leer la secuencia,

242
00:25:48,329 --> 00:25:52,970
sabiendo que el 5' está aquí abajo y sabiendo que el 3' está aquí arriba,

243
00:25:53,390 --> 00:25:57,230
es ir leyendo la secuencia de abajo arriba.

244
00:25:58,849 --> 00:26:00,970
¿De acuerdo? Y ya tendría la secuencia.

245
00:26:01,970 --> 00:26:04,130
Fijaos, la secuencia en este caso es esta.

246
00:26:05,349 --> 00:26:20,029
Entonces empiezo y ¿cuál es la primera banda que me encuentro? Me encuentro esta primera banda. ¿En qué carril está? Está en este tercer carril. Este tercer carril es aquel en el que se modifican citosinas o timinas.

247
00:26:20,029 --> 00:26:29,430
¿Cómo sé yo si este fragmento, la última base nitrogenada, la base nitrogenada marcada, es una timina o una citosina?

248
00:26:30,029 --> 00:26:36,890
Si fuera una citosina, tendría que aparecer esta banda también en este carril, como este caso, fijaos

249
00:26:36,890 --> 00:26:43,490
Esto yo sé que es una citosina, ¿sí? ¿Por qué? Porque aparece aquí, pero también aparece aquí

250
00:26:43,490 --> 00:26:45,230
Y no es una timina

251
00:26:45,230 --> 00:26:49,390
Esto es una timina, ¿por qué? Porque aparece aquí, pero no aparece aquí

252
00:26:49,390 --> 00:27:09,730
Por tanto, timina. En este caso, una adenina. ¿Por qué? Porque si fuera una guanina, tendría que aparecer también aquí otra banda, como esta. ¿De acuerdo? Guanina. ¿Por qué es guanina? Porque aparece aquí y aparece aquí. Dos bandas. Si solo aparece una banda, significa que es una adenina.

253
00:27:09,730 --> 00:27:36,880
La siguiente, una adenina. Citosina, timina, timina, citosina, guanina, timina, adenina, adenina. Entonces lo único que tenemos que hacer es coger nuestro gel, después de haber hecho la autoradiografía y obtener el patrón de bandas, es leer la secuencia directamente de abajo arriba. Y esta es la secuencia 5'-3' de nuestro fragmento. ¿De acuerdo?

254
00:27:36,880 --> 00:27:52,680
¿Verdad? Pues estos son los fundamentos del método químico de Max and Gilbert, que como ya os decía, está completamente obsoleto, quedó obsoleto al poco tiempo por el desarrollo del método enzimático de sangre, ¿de acuerdo?

255
00:27:52,680 --> 00:28:04,819
Entre otras cosas también porque la radioactividad está en desuso. Siempre que se puedan utilizar otros, otro tipo de sistemas que sean igual de sensibles y específicos, pues mejor que la radioactividad.

256
00:28:04,819 --> 00:28:08,380
¿Sí? Muy bien

257
00:28:08,380 --> 00:28:11,640
El método enzimático de terminación de la cadena

258
00:28:11,640 --> 00:28:12,880
Es el método de Sanker

259
00:28:12,880 --> 00:28:13,920
¿Por qué se le llama así?

260
00:28:14,400 --> 00:28:15,759
Método enzimático

261
00:28:15,759 --> 00:28:17,599
Porque vamos a utilizar polimerasas

262
00:28:17,599 --> 00:28:21,380
Claro, daos cuenta que a finales de los 60

263
00:28:21,380 --> 00:28:22,779
A principios de los 70

264
00:28:22,779 --> 00:28:24,740
No existía la PCR

265
00:28:24,740 --> 00:28:27,079
No existía la PCR

266
00:28:27,079 --> 00:28:29,559
Pero sí que existía porque en los años 50

267
00:28:29,559 --> 00:28:30,799
Se había purificado ya

268
00:28:30,799 --> 00:28:33,579
Se habían aislado las polimerasas

269
00:28:33,579 --> 00:28:43,859
La RNA polimerasa y la DNA polimerasa fueron aisladas y purificadas y descritas por primera vez por Arthur Korver y por Severo Ochoa.

270
00:28:44,460 --> 00:28:47,720
Ambos recibieron el premio Nobel, si no recuerdo mal, en el 59.

271
00:28:48,819 --> 00:28:49,140
¿De acuerdo?

272
00:28:49,660 --> 00:28:53,000
Entonces, se conocían las polimerasas.

273
00:28:53,339 --> 00:28:56,299
¿Qué es lo que hace este método?

274
00:28:56,380 --> 00:28:57,839
¿Qué es lo que idea Sanger?

275
00:28:57,839 --> 00:29:18,539
Bueno, si yo tengo una secuencia de DNA que quiero secuenciar, pues voy a utilizar una polimerasa y voy a hacer primero una copia, pero va a ser una copia un pelín diferente a como lo hace una PCR, ¿de acuerdo? O como lo hace la célula durante la replicación, ¿de acuerdo?

276
00:29:18,539 --> 00:29:37,339
¿En qué se fundamenta este método? En reacciones de polimerización de cadenas complementarias. Y esto es muy importante. Yo quiero secuenciar la cadena 5'-3'. ¿Sí? Pues lo primero que voy a hacer va a ser una reacción de polimerización para copiar esta cadena.

277
00:29:37,339 --> 00:29:59,599
Y la vamos a copiar, si os acordáis, si utilizamos la polimerasa, la vamos a copiar de 3' a 5', ¿de acuerdo? Muy bien. Pero lo que vamos a hacer, vamos a utilizar una mezcla de nucleótidos. Si os acordáis de los DNTPs de la PCR, los DNTPs de la PCR son de este estilo, ¿de acuerdo?

278
00:29:59,599 --> 00:30:16,400
Tendríamos la pentosa, tenemos el trifosfato, los DNTPs trifosfato, si os acordáis, para que pueda utilizarlos la polimerasa, aquí tendríamos la base correspondiente y esta es una desoxi, es un desoxinucleótido.

279
00:30:16,400 --> 00:30:19,460
Aquí en 3' tenemos el OH, el grupo hidróxido

280
00:30:19,460 --> 00:30:20,940
Pues junto con estos

281
00:30:20,940 --> 00:30:23,099
DNTPs

282
00:30:23,099 --> 00:30:24,880
Vamos a utilizar también los

283
00:30:24,880 --> 00:30:26,359
Dideoxinucleótidos

284
00:30:26,359 --> 00:30:29,079
¿Eso qué significa? Son en realidad ribonucleótidos

285
00:30:29,079 --> 00:30:29,740
Si os dais cuenta

286
00:30:29,740 --> 00:30:31,559
En 3' hemos

287
00:30:31,559 --> 00:30:34,880
Deoxidado

288
00:30:34,880 --> 00:30:37,019
De tal manera que en lugar de tener un hidróxido

289
00:30:37,019 --> 00:30:39,619
Ahora tenemos un hidrógeno

290
00:30:39,619 --> 00:30:39,960
¿Sí?

291
00:30:40,480 --> 00:30:42,920
Pues vamos a añadir a la mezcla de reacción

292
00:30:42,920 --> 00:30:45,200
Además de los DNTPs

293
00:30:45,200 --> 00:31:07,359
Dideoxinucleótidos. ¿Qué es lo que ocurre si la polimerasa va, en las reacciones de polimerización, va añadiendo dNTPs, pero por casualidad coge del medio un ddNTPs, un dideoxi, mete un dideoxi y una vez lo ha metido ya no puede continuar la síntesis.

294
00:31:07,359 --> 00:31:12,359
¿Por qué? Porque le falta el hidroxilo en 3' para poder introducir el siguiente nucleótido.

295
00:31:13,480 --> 00:31:17,119
Por tanto, ¿para qué necesitamos estos dideoxi en la reacción?

296
00:31:17,740 --> 00:31:22,559
Para que la polimerasa cuando los introduzca, ¡pum!, termine la secuencia.

297
00:31:22,980 --> 00:31:25,380
Termine y se detenga la síntesis.

298
00:31:26,859 --> 00:31:29,119
¿De acuerdo? Este es el fundamento del T.

299
00:31:29,400 --> 00:31:36,279
Entonces vamos a realizar reacciones de polimerización utilizando una mezcla de reacción en la que tengo dNTPs y dideoxis.

300
00:31:36,279 --> 00:31:51,279
Cuando la polimerasa va metiendo DNTPs, pues continúa, continúa hasta el final de la secuencia, hasta que llega un momento que, por casualidad, introduce un d-deoxy y entonces, ¡pum!, para la síntesis. ¿De acuerdo? Este es el fundamento.

301
00:31:51,279 --> 00:32:14,200
Fundamento. Nuevamente, ya podéis suponer que la gran ventaja que tiene este método respecto del anterior es que podemos partir de DNA, de cantidades pequeñas de DNA. ¿Por qué? Porque en realidad lo que queremos secuenciar lo vamos a amplificar primero, lo vamos a amplificar por reacciones de polificación.

302
00:32:14,200 --> 00:32:32,579
Entonces, aunque parta de cantidades pequeñas de DNA, da igual, porque vamos a amplificar. ¿De acuerdo? Muy bien. ¿Cómo lo hacemos? Bueno, pues este método diseñado por Sanger lo diseñó también para fragmentos pequeños de DNA y monocatenarios.

303
00:32:32,579 --> 00:32:43,279
Por tanto, antes de comenzar, si queremos secuenciar DNA bicatenario, que es lo habitual, lo primero que tenemos que hacer es un paso previo de desnaturalización.

304
00:32:43,700 --> 00:32:51,039
Y a partir de este DNA monocatenario vamos a comenzar las reacciones de polimerización.

305
00:32:51,039 --> 00:33:16,400
Ah, y otra cosa importante, si vamos a utilizar la polimerasa necesitamos, además de los DNTPs, del buffer, de bla bla bla bla bla, todo lo que sabemos, necesitamos un primer. ¿Os acordáis? Porque es uno de los grandes defectos, entre comillas, que tienen las polimerasas, que han de partir de un pequeño fragmento bicatenal. Por tanto, también hemos de diseñar un primer. ¿De acuerdo?

306
00:33:16,400 --> 00:33:20,180
Entonces nosotros, ¿qué es lo que vamos a hacer?

307
00:33:20,339 --> 00:33:24,059
Ese DNA de partida lo vamos a repartir también en cuatro tubos

308
00:33:24,059 --> 00:33:25,440
Vamos a preparar cuatro tubos

309
00:33:25,440 --> 00:33:28,220
Entonces, ¿qué vamos a poner en cada uno de los tubos?

310
00:33:28,980 --> 00:33:35,819
Pues primero vamos a poner el DNA molde, monocatenario, 5'-3', que es el que queremos secuenciar

311
00:33:35,819 --> 00:33:38,059
¿Qué más vamos a añadir al tubo?

312
00:33:38,059 --> 00:33:41,160
Pues vamos a poner el primer, ¿de acuerdo?

313
00:33:41,240 --> 00:33:44,259
El primer, pero aquí está lo importante

314
00:33:44,259 --> 00:33:51,319
el primer, en este caso igual que en el método anterior, va a ir marcado radioactivamente, ¿de acuerdo?

315
00:33:51,559 --> 00:33:56,740
Le vamos a poner en 5' un fosforo de enteros, un fosfato radioactivo.

316
00:33:57,079 --> 00:34:00,279
Por tanto, los primers que voy a utilizar es el mismo primer en todos,

317
00:34:00,539 --> 00:34:05,140
porque quiero secuenciar el mismo fragmento, este primer va marcado.

318
00:34:05,740 --> 00:34:10,780
Ahora no marcamos el DNA, sino que marcamos el primer que vamos a utilizar, ¿de acuerdo?

319
00:34:11,300 --> 00:34:14,179
Una diferencia importante con el método anterior.

320
00:34:14,260 --> 00:34:28,360
¿Qué más añadimos en cada tubo? Por supuesto, la polimerasa, la adenina polimerasa. ¿Qué más añadimos? El buffer, el cloruro de magnesio, aquí no lo pongo, pero me imagino que es fundamental, ¿no? Es básico, todo el mundo lo ve.

321
00:34:28,360 --> 00:34:46,500
¿Qué más añadimos? Los DNTPs, la mezcla de los cuatro DNTPs, adeninas, nucleótidos de adenina, citosina, timina y guanina, la mezcla. Y además, y esto es lo importante, en cada tubo vamos a poner un dideoxi diferente.

322
00:34:46,500 --> 00:34:59,820
En el tubo 1 ponemos el dideoxi pero de adenina, solo el de adenina. En el segundo, el de timina. En el tercero, el de citosina. Y en el cuarto, el de guanina.

323
00:35:00,179 --> 00:35:16,320
Por tanto, si os dais cuenta, en los cuatro tubos que he preparado, insisto, en cada uno hay que añadir también el báfer, el cloruro de magnesio, pero no lo pongo aquí. En lo único que se diferencian los cuatro tubos es en el dideoxinucleótido que voy a utilizar.

324
00:35:17,440 --> 00:35:33,380
¿De acuerdo? Muy bien. ¿Qué consigo con esto? Pues fijaos, si yo tengo aquí el DNA de partida y yo este fragmento aquí en rojo es el que quiero secuenciar, he diseñado un cebador que va a estar en 5'.

325
00:35:33,380 --> 00:35:45,239
Claro, si yo quiero secuenciar 5' a 3', este cebador que está en 5' a 3' hibrida aquí. Por tanto, la síntesis va a ir en este sentido, hacia allá, hacia la izquierda.

326
00:35:45,239 --> 00:35:49,719
¿De acuerdo? Esto me parece que es obvio y lo conocemos.

327
00:35:50,300 --> 00:35:57,320
Aquí tenemos, después de realizar las reacciones de polimerización en cada uno de los tubos, ¿qué es lo que va a ocurrir?

328
00:35:57,500 --> 00:36:05,400
Pues a partir del primer, la polimerasa va a ir extendiendo, va a ir extendiendo, aquí va a ir metiendo los DNTPs,

329
00:36:05,400 --> 00:36:11,739
Como hemos metido el dideóxido de adenina, pues va a ir metiendo nucleótidos complementarios,

330
00:36:11,900 --> 00:36:16,179
aunque hasta que llega un momento que por casualidad mete un dideóxido.

331
00:36:16,960 --> 00:36:20,320
Cuando mete un dideóxido, la síntesis finaliza.

332
00:36:21,159 --> 00:36:23,840
Por tanto, este fragmento llega hasta aquí.

333
00:36:25,159 --> 00:36:29,019
Otro fragmento, pues puede ser que cuando toque introducir la adenina,

334
00:36:29,179 --> 00:36:33,260
meta un dNTP de adenina normal, continúa la síntesis,

335
00:36:33,260 --> 00:36:39,079
hasta que da la casualidad que mete un di de óxido de adenina, plum, para la síntesis.

336
00:36:39,880 --> 00:36:41,219
Y aquí lo mismo, ¿de acuerdo?

337
00:36:41,460 --> 00:36:46,059
Esta es una secuencia muy cortita y lo han hecho para que en cada tubo se generen tres,

338
00:36:46,239 --> 00:36:50,880
está diseñada a posta para que en cada tubo se generen tres fragmentos, ¿de acuerdo?

339
00:36:51,139 --> 00:36:55,760
Si la secuencia es mucho más larga, 200 pares de base, bueno, pues imaginaos,

340
00:36:55,820 --> 00:37:02,039
en cada tubo vamos a tener una colección de fragmentos que cumplen dos características.

341
00:37:02,039 --> 00:37:15,079
Una, todos estos fragmentos, acordaos, en 5' está fosforilado radioactivamente, por tanto, todos ellos en 5' están marcados radioactivamente y en este tubo todos acaban por adenina.

342
00:37:16,539 --> 00:37:25,739
En el segundo tubo todos están marcados y todos los fragmentos de diferentes tamaños acaban en citosina, aquí en guanina y aquí en tina.

343
00:37:25,739 --> 00:37:39,099
¿De acuerdo? Muy bien, ya hemos llevado a cabo las reacciones de polimerización y hemos conseguido en cada uno de los tubos un pool de fragmentos de diferente tamaño

344
00:37:39,099 --> 00:37:50,840
que todos acaban en el mismo tipo de base nitrógena. Muy bien, ¿qué es lo que hacemos ahora? Igual que en el método anterior vamos a hacer una electroforesis

345
00:37:50,840 --> 00:37:55,280
pero en este caso también es de poliaquilamida de alta resolución

346
00:37:55,280 --> 00:37:58,840
por tanto podemos llegar a diferenciar dos fragmentos

347
00:37:58,840 --> 00:38:03,320
cuyo tamaño es diferente en un nucleótido

348
00:38:03,320 --> 00:38:05,119
que se diferencian en un nucleótido

349
00:38:05,119 --> 00:38:09,079
pero antes vamos a desnaturalizar

350
00:38:09,079 --> 00:38:11,980
por tanto desnaturalizamos todo el denero

351
00:38:11,980 --> 00:38:16,960
en condiciones desnaturalizantes vamos a realizar el gel de poliaquilamida

352
00:38:16,960 --> 00:38:19,599
y la electroforesis de alta resolución

353
00:38:19,599 --> 00:38:36,639
De tal manera que lo que vamos a hacer después de la electroforesis es hacer la autoradiografía que vamos a obtener un patrón de bandas y analizar ese patrón de bandas. ¿Cuál es la gran diferencia entre este gel de electroforesis y la secuencia que obtenemos y el método anterior?

354
00:38:36,639 --> 00:38:40,980
Que nuevamente obtenemos una secuencia escalonada hacia arriba

355
00:38:40,980 --> 00:38:42,800
La vamos a leer de abajo a arriba

356
00:38:42,800 --> 00:38:46,920
Pero es la secuencia reversa y complementaria

357
00:38:46,920 --> 00:38:48,039
¿De acuerdo?

358
00:38:48,519 --> 00:38:49,340
Volvemos atrás

359
00:38:49,340 --> 00:38:51,360
Yo la secuencia que quiero es esta

360
00:38:51,360 --> 00:38:57,360
Pero los fragmentos que están marcados son reversos

361
00:38:57,360 --> 00:38:58,719
Porque van de aquí a aquí

362
00:38:58,719 --> 00:39:00,860
Y además son el complementario

363
00:39:00,860 --> 00:39:01,780
¿De acuerdo?

364
00:39:01,780 --> 00:39:14,239
Por tanto, la secuencia que yo voy a obtener en el gel de electroforesis es la secuencia reversa y complementaria de la que yo estoy secuenciando, ¿de acuerdo?

365
00:39:14,699 --> 00:39:22,500
Entonces, esto es lo que hemos realizado aquí. Una vez ya hemos hecho las reacciones de polimerización, lo que hacemos es nuevamente nuestro gel de electroforesis

366
00:39:22,500 --> 00:39:30,099
y en cada uno de los carriles, en cuatro carriles diferentes, lo que vamos a hacer va a ser correr el contenido de cada tubo, ¿sí?

367
00:39:30,099 --> 00:39:37,840
dependiendo del tamaño pues migrarán cuanto más migren es que son fragmentos más pequeños aquí

368
00:39:37,840 --> 00:39:43,780
el que más migra es este de aquí este fragmento de aquí es el más pequeño de todos porque contiene

369
00:39:43,780 --> 00:39:49,420
solamente el primer y una timina pues este es el que encontramos aquí entonces una vez obtengo aquí

370
00:39:49,420 --> 00:39:57,039
mi patrón de bandas nuevamente hago lo mismo 5 prima 3 prima vamos a irla leyendo pero en este

371
00:39:57,039 --> 00:40:05,119
caso, la banda que obtengo ya me dice directamente cuál es el nucleótido. Timina, timina, citosina,

372
00:40:05,219 --> 00:40:11,940
guanina, guanina, adenina, guanina, citosina, timina, citosina, adenina, adenina. ¿De acuerdo?

373
00:40:12,500 --> 00:40:20,960
Pero esta secuencia que acabo de obtener es una secuencia que está 5'-3', pero no es la que yo

374
00:40:20,960 --> 00:40:27,719
quiero, la secuencia que yo quiero para obtenerla tengo que hacer la complementaria reversa, si aquí

375
00:40:27,719 --> 00:40:32,880
tenía 5 prima, 3 prima, ahora aquí abajo voy a tener 3 prima y 5 prima y tengo que hacer la

376
00:40:32,880 --> 00:40:39,199
complementaria, timina, timina, guanina, adenina, guanina, citosina, timina, citosina, citosina,

377
00:40:39,400 --> 00:40:46,579
guanina, adenina, adenina, si os dais cuenta esta secuencia es la que yo quería secuenciar y que

378
00:40:46,579 --> 00:40:56,559
tengo. ¿De acuerdo? Bueno, es un método diferente, partimos de cantidades mucho menores de DNA, no

379
00:40:56,559 --> 00:41:02,480
necesitamos mucha cantidad de DNA, vamos a amplificar, vamos a utilizar la polimerasa, por

380
00:41:02,480 --> 00:41:07,239
tanto necesitamos un primer, necesitamos una mezcla de reacción en la cual vamos a poner los

381
00:41:07,239 --> 00:41:14,840
DNTPs y dideoxis, ¿de acuerdo? Que son nucleótidos que tienen la pentosa modificada y que actúan como

382
00:41:14,840 --> 00:41:18,800
terminadores de síntesis, acaban las síntesis, ¿de acuerdo?

383
00:41:19,400 --> 00:41:23,119
Bien, pues así hemos visto ya los métodos manuales, el método

384
00:41:23,119 --> 00:41:26,820
químico y el método enzimático, Max-San y Gilbert y el método de Sanger

385
00:41:26,820 --> 00:41:33,159
¿de acuerdo? Este es un ejemplo de un gel, este Sanger

386
00:41:33,159 --> 00:41:36,800
con un macro gel de los que él corría, fijaos que aquí

387
00:41:36,800 --> 00:41:40,420
cada uno de estos son conjuntos de cuatro carriles

388
00:41:40,420 --> 00:41:45,119
cuatro carriles, cuatro carriles, cuatro, cuatro, cuatro, ¿de acuerdo? De tal manera que aquí tienen

389
00:41:45,119 --> 00:41:46,880
un gel, fijaos que

390
00:41:46,880 --> 00:41:49,099
tamaño tienen estos gels

391
00:41:49,099 --> 00:41:50,900
de poliacrilamida, hay que correrlos

392
00:41:50,900 --> 00:41:52,500
muchísimo tiempo

393
00:41:52,500 --> 00:41:54,940
porque tienen una capacidad

394
00:41:54,940 --> 00:41:56,780
de resolución elevadísima, ¿de acuerdo?

395
00:41:57,019 --> 00:41:58,940
Aquí lo que ha corrido en cada grupo

396
00:41:58,940 --> 00:42:00,800
de cuatro carriles son secuencias diferentes

397
00:42:00,800 --> 00:42:03,099
¿de acuerdo? Y luego lo único que tenía que hacer

398
00:42:03,099 --> 00:42:04,300
era ir hacia arriba, ¿no?

399
00:42:04,679 --> 00:42:06,679
Lo leemos hacia arriba, aquí tendríamos la secuencia

400
00:42:06,679 --> 00:42:08,519
de mina, de mina, guanina, quimina

401
00:42:08,519 --> 00:42:10,519
hacia arriba, ¿de acuerdo?

402
00:42:11,460 --> 00:42:12,500
Aquí os propongo

403
00:42:12,500 --> 00:42:13,860
un ejercicio

404
00:42:13,860 --> 00:42:17,780
imaginaos que esta es la secuencia

405
00:42:17,780 --> 00:42:18,880
un ejercicio práctico

406
00:42:18,880 --> 00:42:21,199
esta es la secuencia que yo quiero secuenciar

407
00:42:21,199 --> 00:42:23,139
os la doy en 5'3'

408
00:42:23,420 --> 00:42:24,780
y

409
00:42:24,780 --> 00:42:26,820
es sencillo

410
00:42:26,820 --> 00:42:29,079
yo os pido, oye, ¿me puedes dibujar

411
00:42:29,079 --> 00:42:31,099
el patrón de bandas

412
00:42:31,099 --> 00:42:32,900
de electroforesis que obtendrías

413
00:42:32,900 --> 00:42:34,820
si esta

414
00:42:34,820 --> 00:42:35,880
secuencia

415
00:42:35,880 --> 00:42:39,380
las secuencias

416
00:42:39,380 --> 00:42:41,139
por el método

417
00:42:41,139 --> 00:42:42,440
químico de Max and Gilbert

418
00:42:42,440 --> 00:42:44,699
o por el método de sangre?

419
00:42:44,860 --> 00:42:46,820
¿Cuál sería el patrón de bandas

420
00:42:46,820 --> 00:42:50,059
por el método de Max-Hann y Gilbert que saldría?

421
00:42:50,420 --> 00:42:52,300
¿Y cuál sería el patrón de bandas

422
00:42:52,300 --> 00:42:54,440
por el método enzimático de sangre?

423
00:42:55,500 --> 00:42:55,820
¿De acuerdo?

424
00:42:56,199 --> 00:42:58,119
Este es un ejercicio práctico que yo os propongo.

425
00:42:58,599 --> 00:42:59,960
Lo podéis hacer y ya lo corregimos.

426
00:43:00,099 --> 00:43:02,420
Luego lo corregiremos en clase.

427
00:43:03,119 --> 00:43:03,480
¿De acuerdo?

428
00:43:04,679 --> 00:43:06,940
Pues nada, con esto acabamos la primera parte

429
00:43:06,940 --> 00:43:10,400
de la explicación del tema de secuenciación

430
00:43:10,400 --> 00:43:11,500
de ácidos nucleicos.

431
00:43:11,500 --> 00:43:23,119
Y ya con esta base, estos fundamentos, estamos preparados para poder entender ya los métodos automáticos que son los que se utilizan en los laboratorios actuales. ¿De acuerdo? Pues venga.