1 00:00:00,620 --> 00:00:06,379 Vale, ya estoy grabando, así que ya sabéis que ya sale foto, sale voz y sale todo. 2 00:00:06,879 --> 00:00:11,080 Este tema es un poquito más cortito por lo que os decía, que dentro de las técnicas de separación 3 00:00:11,080 --> 00:00:16,219 sí están repartidas entre los módulos de instrumental y de biotecnología un poco 4 00:00:16,219 --> 00:00:21,800 y instrumental se queda un poco más con la parte de cromatografía HPLC o cromatografía de gases 5 00:00:21,800 --> 00:00:27,379 y biotecnología se queda más con la cromatografía de capa fina, con la cromatografía en placa, 6 00:00:27,379 --> 00:00:32,859 la cromatografía en papel y la electroforesis, que sigue siendo otra técnica de separación. 7 00:00:33,439 --> 00:00:37,600 Pero bueno, como son técnicas de separación y las estamos viendo y como cada uno vais a un ritmo 8 00:00:37,600 --> 00:00:41,719 y tenéis unos módulos y otros no, pues aunque al final, si queréis titular, 9 00:00:41,820 --> 00:00:48,479 biotecnología va a caer en un año o en otro, pero bueno, en instrumental también lo tenemos puesto un poquito. 10 00:00:48,479 --> 00:00:52,939 Pero es un tema que es bastante corto respecto a los anteriores. 11 00:00:52,939 --> 00:00:57,939 La electroforesis al final sigue siendo una técnica que al final sí se usa en muchos laboratorios, 12 00:00:58,979 --> 00:01:08,340 sobre todo los que más han dedicado a la biotecnología porque sí estamos orientados a separarle el ADN, el ARN, moléculas, proteínas. 13 00:01:08,459 --> 00:01:17,159 Las proteínas por ejemplo en función de su tamaño se separan muy bien por electroforesis y también en función de la carga eléctrica. 14 00:01:17,719 --> 00:01:21,719 Entonces por eso esa parte se queda un poquito más con biotecnología. 15 00:01:22,939 --> 00:01:35,780 Pero bueno, vamos a empezar un poquillo con la parte del fundamento de la técnica y ya vamos viendo un poco los diferentes tipos que hay y todo lo que se puede utilizar. 16 00:01:35,780 --> 00:01:47,459 Entonces, si es verdad que casi todas las moléculas al final van a tener una carga eléctrica y la magnitud va a depender del pH y del medio en el que se encuentran. 17 00:01:47,959 --> 00:01:56,099 Esto nos va a permitir hacer las separaciones y distinguir las diferentes moléculas para poder separarlas, identificarlas y cuantificarlas. 18 00:01:56,219 --> 00:02:05,239 Entonces, como tienen diferente carga en función del pH que nosotros tengamos, se van a desplazar cuando nosotros las vamos a someter a un campo eléctrico. 19 00:02:05,640 --> 00:02:11,419 Nosotros lo ponemos en medio de un campo eléctrico, como hacíamos con las muestras en pH y en conductividad, 20 00:02:11,560 --> 00:02:16,740 que nosotros utilizamos un compás eléctrico para poder hacer esa identificación, para obtener la información. 21 00:02:17,400 --> 00:02:23,400 Aquí lo que vamos a hacer es una separación por la diferente movilidad que tienen en el campo eléctrico en el que se encuentran. 22 00:02:23,400 --> 00:02:27,860 Y eso va a depender de la carga que tengan, del tamaño y del pH del medio en el que se encuentran. 23 00:02:27,860 --> 00:02:49,939 Entonces una partícula normalmente cuando está cargada, creo que la mayoría de las biomoléculas tienen carga, pues las moléculas que están cargadas están en una región donde hay un campo eléctrico y aquí van a experimentar una fuerza que va a ser igual al producto de su carga por la intensidad del campo eléctrico. 24 00:02:49,939 --> 00:03:02,620 Esta sería la fórmula en la que se basa la electroforesis. Igual que en las técnicas ópticas tenemos la ley de Lambert-Bier, pues aquí tendríamos esta fórmula. 25 00:03:02,620 --> 00:03:13,580 Bueno, yo lo que decía que hemos quedado en que la electroforesis al final va a ser el proceso en el que se separan los elementos de un compuesto por medio de la electricidad. 26 00:03:15,520 --> 00:03:20,479 Hago referencia a biotecnología porque creo que ya la habéis terminado de ver. 27 00:03:20,479 --> 00:03:31,699 Lo que hacemos al final es aplicar una corriente eléctrica mediante un par de electrodos que están conectados a una fuente de alimentación eléctrica y están sumergidos en una disolución. 28 00:03:32,620 --> 00:03:37,340 El electrodo que está conectado al polipositivo lo llamamos ánodo. 29 00:03:37,740 --> 00:03:41,360 Y el electrodo que está conectado al polo negativo se le llama cátodo. 30 00:03:41,780 --> 00:03:45,419 Esto también lo hemos visto en la parte de pH, potencial y todo eso. 31 00:03:45,639 --> 00:03:49,259 Que yo en su tiempo os dije que ahí no os liarais con eso. 32 00:03:49,780 --> 00:03:56,639 Ahora, igual si nos sirve, necesitamos saber quién es el cátodo, quién es el ánodo, quién es positivo y quién es negativo. 33 00:03:56,639 --> 00:03:58,639 Para ver el desplazamiento de las proteínas. 34 00:03:58,639 --> 00:04:04,259 proteínas. Entonces, el polo positivo es el ánodo, el polo negativo es el cátodo. 35 00:04:04,860 --> 00:04:09,479 Ahora, cada uno de estos dos electrodos, sean ánodo o cátodo, van a atraer a los iones 36 00:04:09,479 --> 00:04:15,159 de la carga opuesta. Por lo tanto, el ánodo, que hemos dicho que es el polo positivo, va 37 00:04:15,159 --> 00:04:20,800 a atraer a los negativos, que son los aniones. Al final, más que llevan el nombre del polo 38 00:04:20,800 --> 00:04:27,060 que son, llevan el nombre de lo que atraen. Entonces, los aniones, que son negativos, 39 00:04:27,060 --> 00:04:28,699 o los iones negativos 40 00:04:28,699 --> 00:04:30,620 los aniones o iones negativos 41 00:04:30,620 --> 00:04:32,480 son atraídos hacia el ánodo 42 00:04:32,480 --> 00:04:33,439 que es el polo positivo 43 00:04:33,439 --> 00:04:35,980 mientras que los iones positivos 44 00:04:35,980 --> 00:04:36,920 o cationes 45 00:04:36,920 --> 00:04:38,660 son atraídos hacia el cátodo 46 00:04:38,660 --> 00:04:40,439 que era el electrodo negativo 47 00:04:40,439 --> 00:04:42,100 es decir, cargas opuestas van 48 00:04:42,100 --> 00:04:45,560 en la parte que hacíamos de separación 49 00:04:45,560 --> 00:04:48,660 bueno, no lo digo por hacer lo del HPLF 50 00:04:48,660 --> 00:04:49,579 que es lo último que hicimos 51 00:04:49,579 --> 00:04:52,199 pero con cualquier disolución que hayáis tenido 52 00:04:52,199 --> 00:04:53,560 cualquier separación que hayáis visto 53 00:04:53,560 --> 00:04:55,079 en muestreo también lo tenéis 54 00:04:55,079 --> 00:04:56,879 que lo polar va con lo polar 55 00:04:56,879 --> 00:05:01,560 y lo apolar con lo apolar, ahí teníamos igualdad como de condiciones, aquí cuando 56 00:05:01,560 --> 00:05:05,959 hablamos de cargas va al revés, lo positivo atrae a lo negativo y lo negativo atrae a 57 00:05:05,959 --> 00:05:11,300 lo positivo. Entonces bueno, por lo positivo y por lo negativo cada uno atrae al contrario. 58 00:05:12,019 --> 00:05:16,579 Además de la carga eléctrica esta que tengamos, el movimiento de las moléculas también va 59 00:05:16,579 --> 00:05:21,639 a estar influido por otras dos fuerzas que son extras que no teníamos en cuenta hasta 60 00:05:21,639 --> 00:05:27,120 ahora, que sería la fricción con el solvente, esta fricción sería como una especie de 61 00:05:27,120 --> 00:05:33,680 rozamiento y lo que va a hacer es dificultar el movimiento, va a frenar el desplazamiento 62 00:05:33,680 --> 00:05:39,560 de estas moléculas que están yendo hacia el electrodo y al hacer una repulsión o al 63 00:05:39,560 --> 00:05:45,819 ir frenando se va a originar una fuerza que es opuesta. Entonces la fricción, eso sería 64 00:05:45,819 --> 00:05:51,839 que es la fuerza de rozamiento, la fuerza de frenado, que va en sentido opuesto al desplazamiento. 65 00:05:52,339 --> 00:05:57,399 Y luego, por otro lado, las moléculas también tienen que moverse de una forma aleatoria, ¿vale? 66 00:05:57,399 --> 00:05:59,060 Por la energía cinética que tienen. 67 00:05:59,740 --> 00:06:02,920 Entonces, bueno, este movimiento es el que se denomina difusión. 68 00:06:03,740 --> 00:06:09,199 Ahora, ¿cómo favorecemos uno u otro o hacia dónde van o quién tira más, quién tira menos? 69 00:06:09,660 --> 00:06:13,079 Bueno, pues, por ejemplo, la energía cinética, que es la de la difusión, 70 00:06:13,079 --> 00:06:17,519 Aquí la podemos aumentar con la temperatura 71 00:06:17,519 --> 00:06:21,279 Por ejemplo, la mayor temperatura tenemos mayor difusión 72 00:06:21,279 --> 00:06:26,199 Y vamos a facilitar el desplazamiento hacia el polo que nosotros queremos 73 00:06:26,199 --> 00:06:29,800 Si enfriamos, disminuye esta difusión 74 00:06:29,800 --> 00:06:31,879 Y no es que aumente la fricción 75 00:06:31,879 --> 00:06:35,060 Pero bueno, como la difusión disminuye 76 00:06:35,060 --> 00:06:37,939 Pues va teniendo más peso la fricción que la difusión 77 00:06:37,939 --> 00:06:40,459 Y parece que cuesta más que se muevan 78 00:06:40,459 --> 00:06:42,399 Cuesta más este desaplazamiento 79 00:06:42,399 --> 00:06:50,480 El que existan estas dos fuerzas es lo que nosotros vamos a aprovechar para obtener toda la información que necesitamos 80 00:06:50,480 --> 00:06:52,459 Lo que aprovechamos nosotros para el análisis 81 00:06:52,459 --> 00:07:00,660 Ya que la suma de estas dos fuerzas va a provocar que las moléculas no emigren de una manera homogénea 82 00:07:00,660 --> 00:07:05,300 Decíamos que en función de la situación en la que tenemos, de la muestra que tengamos, de la carga que tenga 83 00:07:05,300 --> 00:07:08,300 Pues tira para un lado o para otro, más o menos 84 00:07:08,300 --> 00:07:14,279 Entonces no va a ser de la misma manera y eso es lo que nosotros vamos a utilizar para hacer la separación. 85 00:07:14,959 --> 00:07:23,319 Nosotros podemos ir regulando el movimiento de las moléculas según nos interese a nosotros y ahí vamos a ir pudiendo separar las moléculas. 86 00:07:23,519 --> 00:07:26,439 Por eso lo vamos a utilizar la electroforesis como una técnica de separación. 87 00:07:27,120 --> 00:07:34,220 Antes toda esta parte de las propiedades eléctricas lo utilizábamos para las propiedades físicas, pH, conductividad 88 00:07:34,220 --> 00:07:40,779 y ahora vamos a utilizar estas propiedades eléctricas para separar a las diferentes moléculas que hay en una muestra. 89 00:07:41,519 --> 00:07:45,899 Como siempre, bueno que no lo he dicho, pero igual que en HPLC, al ser una técnica de separación, 90 00:07:46,459 --> 00:07:50,019 para separar tiene que haber más de una cosa, que sean interferentes, lo que sea, 91 00:07:50,079 --> 00:07:54,459 que nosotros pongamos una sustancia que supuestamente es pura, pues para, como decíamos aquí con la cafeína, 92 00:07:54,459 --> 00:08:00,420 pues para verificar que es pura, solamente tiene que verse un pico, pues aquí tendríamos un desplazamiento 93 00:08:00,420 --> 00:08:03,899 y todo iría a la misma velocidad y para el mismo sitio. 94 00:08:04,220 --> 00:08:12,740 Vale, entonces eso, nosotros regulamos el movimiento de las moléculas en función de lo que nos convenga según la información que vayamos a obtener. 95 00:08:13,680 --> 00:08:21,860 Una forma muy común de hacer este movimiento sería utilizar un soporte de gel, que es el que hicisteis vosotros en betonología. 96 00:08:22,240 --> 00:08:23,319 ¿Qué va a ser el gel? 97 00:08:23,319 --> 00:08:35,659 Pues el gel es un polímero que es soluble de un alto pase molecular que va a atrapar las moléculas de agua y va a actuar como si fuera un tamiz. 98 00:08:35,960 --> 00:08:44,399 Ese tamiz lo que va a hacer es dificultar el movimiento de los diferentes solutos que lo atraviesan y por eso la migración de las moléculas va a ser más lenta. 99 00:08:44,399 --> 00:08:59,539 En función de los huequecitos que deje este gel, nosotros vamos a ir viendo cómo se van colando las moléculas, van avanzando más o menos. Cuanto más pequeño sea el poro, más cuesta pasar, entonces se van a quedar más retenidas. 100 00:08:59,539 --> 00:09:15,580 En la parte de HPLC, cuando hablábamos de la columna y hablábamos de la exclusión molecular, decíamos que las moléculas que eran más grandes pasaban primero porque no se iban metiendo por los poros del gel o por el poro de la partícula. 101 00:09:15,580 --> 00:09:31,580 En cromatografía de columna no sería gel como aquí, pero que no iba pasando por los poros de la columna o por el diámetro de la partícula, sino que iba buscando los huecos que había entre las diferentes partículas que hay. 102 00:09:31,580 --> 00:09:53,799 Aquí es un gel que tiene que ser más homogéneo y si tenemos esos poros. Por lo tanto, cuanto más pequeño sea el poro, más tarda la molécula en pasar. Las moléculas más grandes, en principio, según lo que está diciendo el fundamento teórico, las moléculas más grandes tendrían un desplazamiento más lento y les costaría más pasar, entonces se quedarían más atrás, se quedarían al final. 103 00:09:53,799 --> 00:10:09,100 De forma general, para ver un poco del principio con cierta perspectiva, la separación de la electroforesis se va a basar en la diferente velocidad de migración de las moléculas con carga diferente dentro de un campo eléctrico. 104 00:10:09,100 --> 00:10:13,480 vale lo que estábamos diciendo a ver cómo se va a mover cuando nosotros aplicamos este campo 105 00:10:13,480 --> 00:10:19,720 eléctrico y también va a depender de la movilidad electroforetica de una partícula que va a depender 106 00:10:19,720 --> 00:10:26,980 de su carga su masa el medio en el que tiene lugar la separación del campo eléctrico vale 107 00:10:26,980 --> 00:10:34,240 la movilidad electroforetica sería este sube que tenemos aquí él es el campo eléctrico y 108 00:10:34,240 --> 00:10:38,559 y la UV será la velocidad, entonces por eso tenemos esas dos dependientes. 109 00:10:39,399 --> 00:10:44,820 Lo que digo, no sé si lo habéis visto en biotecnología, por eso digo que es a modo de recordatorio, 110 00:10:45,159 --> 00:10:49,120 que más o menos sirva como recordatorio para los que lo habéis visto, 111 00:10:49,620 --> 00:10:53,980 sino de introducción para los que no tengáis el módulo, 112 00:10:53,980 --> 00:11:00,299 pero bueno, que ese sería el fundamento general, en lo que se basaría la electroforesis de forma general, 113 00:11:00,299 --> 00:11:02,000 tengamos el gel que tengamos 114 00:11:02,000 --> 00:11:03,639 y el campo eléctrico que tengamos 115 00:11:03,639 --> 00:11:06,379 y luego las condiciones que pongamos 116 00:11:06,379 --> 00:11:08,559 entonces sería la teoría general 117 00:11:08,559 --> 00:11:09,940 de la electroforesis 118 00:11:09,940 --> 00:11:13,100 y ahora sí vamos a ver un poco de particularidades 119 00:11:13,100 --> 00:11:14,759 porque bueno claro 120 00:11:14,759 --> 00:11:16,220 según lo que queramos conseguir 121 00:11:16,220 --> 00:11:18,360 según la información que nos hayan pedido 122 00:11:18,360 --> 00:11:20,879 pues tenemos que montar el equipo 123 00:11:20,879 --> 00:11:23,299 tenemos que montar todo el montaje 124 00:11:23,299 --> 00:11:24,899 y luego el material que debemos utilizar 125 00:11:24,899 --> 00:11:26,360 de una forma diferente 126 00:11:26,360 --> 00:11:28,639 o que es mismamente 127 00:11:28,639 --> 00:11:30,820 las propiedades del gel son diferentes 128 00:11:30,820 --> 00:11:32,659 ¿vale? aunque el montaje sea el mismo 129 00:11:32,659 --> 00:11:34,320 pero las propiedades que tengamos del gel 130 00:11:34,320 --> 00:11:36,639 van a ser diferentes, igual que 131 00:11:36,639 --> 00:11:38,820 en HPLC, si os acordáis 132 00:11:38,820 --> 00:11:40,600 los que vinisteis, decíamos que teníamos 133 00:11:40,600 --> 00:11:42,519 varios tipos de columnas, ¿vale? 134 00:11:42,580 --> 00:11:44,179 y varios rellenos, pues 135 00:11:44,179 --> 00:11:46,779 que yo escojo en cada uno en función 136 00:11:46,779 --> 00:11:48,460 de lo que quiera separar, pues ahora pasaría 137 00:11:48,460 --> 00:11:50,779 lo mismo, ¿vale? yo me planteo el material 138 00:11:50,779 --> 00:11:52,679 los equipos, los instrumentos, ¿vale? 139 00:11:52,679 --> 00:11:54,580 como queráis llamarlo, en función 140 00:11:54,580 --> 00:11:56,639 del objetivo que yo tenga, es decir 141 00:11:56,639 --> 00:12:02,139 yo primero tengo que saber qué es lo que quiero conseguir y luego ya pues yo voy 142 00:12:02,139 --> 00:12:06,120 seleccionando las herramientas que yo tengo para poder conseguirlo entonces 143 00:12:06,120 --> 00:12:11,019 nosotros vamos a diferenciar la electroforesis en dos vamos a hacer dos 144 00:12:11,019 --> 00:12:15,179 tandas de electroforesis la electroforesis convencional o clásica y 145 00:12:15,179 --> 00:12:20,100 la electroforesis capilar que sería más la parte instrumental vale la una sería 146 00:12:20,100 --> 00:12:24,659 la clásica como análisis químico hemos separado un clásico instrumental pues 147 00:12:24,659 --> 00:12:36,299 Tenemos la electroforesis convencional y la electroforesis capilar, que la capilar sería la que se denomina electroforesis instrumental o sea seleccionado o clasificado como una técnica instrumental. 148 00:12:37,320 --> 00:12:42,720 La electroforesis clásica, pues más o menos es la que habréis visto en biotecnología. 149 00:12:43,580 --> 00:12:52,259 Dentro de la electroforesis convencional, pues sí, vamos a hacer otra mini clasificación en función del soporte que vayamos a utilizar. 150 00:12:52,259 --> 00:13:04,000 Es decir, en función de lo que utilicemos para que se desplacen las moléculas, ya que cada soporte tiene unas características especiales que le hacen más adecuados para un determinado uso. 151 00:13:04,639 --> 00:13:16,799 En principio, ahí tenemos que ver si queremos hacer una separación analítica o una separación preparativa, y si son moléculas grandes o moléculas pequeñas. 152 00:13:16,799 --> 00:13:28,539 Por ejemplo, en la parte de la separación analítica, nuestro objetivo sería la identificación y la caracterización física de los componentes de una muestra. 153 00:13:29,519 --> 00:13:37,379 Y para una separación preparativa, en este caso queremos separar los componentes de una muestra. 154 00:13:37,379 --> 00:13:54,240 Es decir, nosotros queremos obtener pequeñas cantidades de los diferentes componentes de una muestra y luego esos componentes ya los iremos utilizando para lo que sea, ¿vale? Para lo que utilicemos, porque si a lo mejor es para purificar, para añadir a algún sitio, para preconcentrar, pues no sé qué. 155 00:13:54,240 --> 00:13:58,820 Bueno, nosotros separamos, tenemos los componentes separados y ya le damos el uso que queramos. 156 00:13:59,759 --> 00:14:06,139 Para hacer la separación, pues sí podemos utilizar diferentes soportes, ¿no? 157 00:14:06,139 --> 00:14:08,480 Pues, por ejemplo, sería el papel, ¿vale? 158 00:14:08,480 --> 00:14:12,080 El papel es una técnica que es bastante sencilla, ¿vale? 159 00:14:12,200 --> 00:14:17,700 Lo que pasa, como desventaja, sería que tiene una elevada absorción, ¿vale? 160 00:14:18,139 --> 00:14:21,360 Debido a los grupos hidroxilo que tiene la celulosa, ¿vale? 161 00:14:21,360 --> 00:14:23,480 Se hace en papel de celulosa. 162 00:14:23,480 --> 00:14:28,039 este fue el primero por facilidad por sencillez por lo que queráis fue el de 163 00:14:28,039 --> 00:14:31,700 las primeras electroforesis que se hizo pues se utilizaba en papel igual que en 164 00:14:31,700 --> 00:14:36,200 cromatografía tenía la cromatografía de placa que es el gel de sílice donde 165 00:14:36,200 --> 00:14:40,179 pone que es luego sale con la anidrina sale así el rosita y luego la 166 00:14:40,179 --> 00:14:44,440 electroforesis de papel perdón la cromatografía de papel creo que coges 167 00:14:44,440 --> 00:14:51,320 un papel hacéis un punto con un rotulador y lo ponéis mojado en agua y 168 00:14:51,320 --> 00:14:57,080 y se ven los diferentes colores que forman ese color del rotulador, que sería lo más básico. 169 00:14:57,399 --> 00:14:59,460 Entonces aquí el de papel fue de las primeras electroforesis, 170 00:15:00,379 --> 00:15:04,580 pero sí es verdad que como se ha ido automatizando todo, se han ido mejorando, 171 00:15:04,740 --> 00:15:05,919 la de papel casi no se usa. 172 00:15:06,539 --> 00:15:12,740 En este caso las moléculas que son pequeñas, tipo aminoácidos, se separan en papel. 173 00:15:12,740 --> 00:15:17,539 A lo mejor sería la excepción que tendríamos, porque como es un soporte muy fino, 174 00:15:17,539 --> 00:15:25,320 Pues si no, va a dejar detectar con más facilidad las sustancias pequeñas o las pequeñas manchas que se hayan producido. 175 00:15:26,039 --> 00:15:30,799 Otro tipo que tendríamos, sería en vez del papel, sería el acetato de celulosa. 176 00:15:31,120 --> 00:15:35,480 Por ejemplo, que aquí sí tiene un bajo poder de absorción, a diferencia del papel. 177 00:15:36,220 --> 00:15:41,220 También en agarosa. No sé si dijisteis el de agarosa o el de poliacrilamida. 178 00:15:41,220 --> 00:16:07,700 Pero bueno, el agarosa es un polisacárido que viene de las algas, sería algo parecido al agar, que es de los medios de microbiología, el agar-agar. Aquí la preparación sería igual, tú lo disuelves en agua que esté caliente, no hace falta que hierva, a 50-60 grados y ahí nosotros disolvemos que quede homogéneo y al enfriar se va a solidificar formando un gel. Este gel tiene una elevada porosidad. 179 00:16:07,700 --> 00:16:12,919 para que utilizamos los de agarosa pues por ejemplo para la separación de los ácidos nucleicos 180 00:16:12,919 --> 00:16:20,659 porque los poros del gel va a hacer como también como un colador y va a permitir que las moléculas 181 00:16:20,659 --> 00:16:25,519 que sean más pequeñas se muevan más rápido que las grandes que lo que decíamos a las grandes 182 00:16:25,519 --> 00:16:32,360 les cuesta más no pueden pasar por él por los poros del gel las condiciones que pongamos de 183 00:16:32,360 --> 00:16:37,639 campo eléctrico de velocidad de tiempo pues si las podemos ir ajustando las podemos ir poniendo 184 00:16:37,639 --> 00:16:41,720 en función de lo que nosotros queramos, en función de la separación que queramos hacer 185 00:16:41,720 --> 00:16:45,860 en un rango que nosotros tengamos que utilizar, que queramos. 186 00:16:46,679 --> 00:16:51,299 Y el otro que también se utiliza, que en vez de ser un gel de agarosa, sería un gel de poliacrilamida. 187 00:16:52,100 --> 00:16:59,659 El gel de poliacrilamida viene de la polidermalización química de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. 188 00:17:00,960 --> 00:17:04,079 Por eso he preguntado, que no sé si hicisteis el de agarosa o el de poliacrilamida, 189 00:17:04,079 --> 00:17:10,220 porque esta acrilamida hay una que es más tóxica, mutagénica, teratogénica, todo lo malo que queráis 190 00:17:10,220 --> 00:17:18,079 y si hay como que desactivar esa peligrosidad, por eso que no sé cuál hicisteis, pero bueno, al final se hace un gel también 191 00:17:18,079 --> 00:17:27,339 y en función de la concentración que tengamos de acrilamida y bisacrilamida, pues vamos a conseguir distintas porosidades del gel. 192 00:17:27,839 --> 00:17:33,480 Entonces, este poro siempre va a ser más pequeño que el de agarosa, por eso que en función de lo que queramos separar 193 00:17:33,480 --> 00:17:35,640 utilizamos el de agarosa o el de 194 00:17:35,640 --> 00:17:36,460 poliacrilamida 195 00:17:36,460 --> 00:17:39,779 al final el de poliacrilamida aunque tenga esa parte 196 00:17:39,779 --> 00:17:41,599 de toxicidad que os digo que luego para 197 00:17:41,599 --> 00:17:43,579 los residuos y todo pues si 198 00:17:43,579 --> 00:17:45,500 hay que tomarlo como residuos peligrosos 199 00:17:45,500 --> 00:17:47,460 pues al final es con lo que 200 00:17:47,460 --> 00:17:49,660 con lo que mejor se van a 201 00:17:49,660 --> 00:17:51,220 lograr las separaciones electroforeticas 202 00:17:51,220 --> 00:17:53,960 el poro es muy pequeño 203 00:17:53,960 --> 00:17:55,799 y tenemos una mejor separación 204 00:17:55,799 --> 00:17:57,559 y bueno pues aquellas cosas que tengan 205 00:17:57,559 --> 00:17:59,380 poro similar o que no 206 00:17:59,380 --> 00:18:01,400 pudiera separarlos un gel de agarosa con el de 207 00:18:01,400 --> 00:18:03,220 poliacrilamida si se consigue 208 00:18:03,220 --> 00:18:24,200 Por ejemplo, pues las proteínas se pueden separar con un rango de un 5 a un 15%, ¿vale? Entonces, cuanto menos porcentaje, mayor tamaño de poro vamos a conseguir y esto, bueno, pues para proteínas de gran tamaño, pues tendríamos que ir variando este porcentaje. 209 00:18:24,200 --> 00:18:36,700 Pero bueno, que tampoco, como van a depender de la separación que queráis hacer y del procedimiento, pues tampoco para mí, para Instrumental, no hace falta que os aprendáis porcentaje ni nada de eso. 210 00:18:37,319 --> 00:18:45,539 Pero como decía eso, que en función del objetivo que tengamos, en función de la información que necesitamos obtener, tenemos que elegir el soporte que más nos convenga. 211 00:18:45,900 --> 00:18:52,200 Entonces, si quiero separar ácidos nucleicos, cojo uno, si quiero proteínas grandes, cojo otro, si quiero proteínas pequeñas, cojo el otro. 212 00:18:52,200 --> 00:18:58,500 y si quiero pues ácidos nucleicos o aminoácidos pues como otra cosa antes va a depender un poco 213 00:18:58,500 --> 00:19:03,880 del procedimiento y del objetivo que nosotros tengamos vale no cerréis en banda a los 214 00:19:03,880 --> 00:19:09,259 procedimientos o las técnicas de solo para esto vale igual que en otra violeta visible yo os 215 00:19:09,259 --> 00:19:16,079 digo el visible es de 380 a 780 nanómetros pues es más o menos no hay una pared a un paredón que 216 00:19:16,079 --> 00:19:23,519 no deje pasar la luz 380 350 400 ahí los rangos se van moviendo un poquito vale 217 00:19:23,519 --> 00:19:28,319 pero más o menos es un rango para el que nos acordemos que hay seguro seguro y 218 00:19:28,319 --> 00:19:32,180 por ahí van bajando las cosas 219 00:19:32,180 --> 00:19:35,880 otras partes del equipo vale que no tenemos solamente soporte otras partes 220 00:19:35,880 --> 00:19:39,720 del equipo pues tendríamos la fuente de alimentación por ejemplo la fuente 221 00:19:39,720 --> 00:19:43,680 alimentación es la que nos va a proporcionar el campo eléctrico y para 222 00:19:43,680 --> 00:19:49,140 eso vamos a quitar dos electrodos entre los dos electrodos establecemos una diferencia de potencial 223 00:19:49,140 --> 00:19:54,140 y con esa diferencia potencial pues conseguimos que se muevan los electrones que pasen la corriente 224 00:19:54,140 --> 00:19:59,039 eléctrica y que se muevan todo lo que tengamos dentro del soporte de la cubeta de lo que sea 225 00:19:59,039 --> 00:20:07,980 luego tenemos la cubeta que va a ser el recipiente donde vamos a poner nosotros la muestra el gel o 226 00:20:07,980 --> 00:20:12,759 lo que sea y aquí en los extremos de la cubeta es donde van a estar conectados los electrodos 227 00:20:12,759 --> 00:20:18,180 donde vamos a conectarlos para que pase la corriente eléctrica y bueno los 228 00:20:18,180 --> 00:20:22,160 electrodos lo que decía que es la conexión entre la cubeta y la fuente de 229 00:20:22,160 --> 00:20:26,279 alimentación y luego ya aparte una vez que tenemos 230 00:20:26,279 --> 00:20:31,940 todo esto puesto ahora es como lo monto lo monto de forma horizontal lo monto de 231 00:20:31,940 --> 00:20:36,599 forma vertical inclinado diagonal las dos que hay sería en la horizontal y la 232 00:20:36,599 --> 00:20:42,200 vertical de momento inclinado tipo de slam no hay ninguno no se suele utilizar 233 00:20:42,200 --> 00:20:48,200 que yo sepa. La parte que se hace, yo creo que la que veis aquí es horizontal, si no 234 00:20:48,200 --> 00:20:54,160 recuerdo mal los equipos que hay, pero al final es una cubeta de dos electrodos y lo 235 00:20:54,160 --> 00:20:59,420 pones de pie, lo pones tumbado y ya está. En la horizontal el soporte se va a impregnar 236 00:20:59,420 --> 00:21:09,079 por capilaridad de una disolución tampón. Este tampón va a disolver la muestra y además 237 00:21:09,079 --> 00:21:11,000 también va a mantener el contacto eléctrico 238 00:21:11,000 --> 00:21:13,019 también se aplica 239 00:21:13,019 --> 00:21:13,640 la muestra 240 00:21:13,640 --> 00:21:17,240 depositándola con una pipeta 241 00:21:17,240 --> 00:21:18,740 o con un capilar 242 00:21:18,740 --> 00:21:20,920 o un aplicador que sea específico 243 00:21:20,920 --> 00:21:22,660 con una pipeta, micropipeta 244 00:21:22,660 --> 00:21:24,720 con la punta de una micropipeta, de las pequeñas 245 00:21:24,720 --> 00:21:26,740 como una gota de agua 246 00:21:26,740 --> 00:21:28,480 sobre el soporte, ya sea 247 00:21:28,480 --> 00:21:30,720 de papel, de acetato, de celulosa 248 00:21:30,720 --> 00:21:33,039 ahí sería 249 00:21:33,039 --> 00:21:34,160 parecido a la parte 250 00:21:34,160 --> 00:21:36,599 de cromatografía en placa 251 00:21:36,599 --> 00:21:38,599 de papel o acetato sería parecida 252 00:21:38,599 --> 00:21:44,299 la cromatografía en placa. Y luego si utilizamos geles como el agarosa o el de poliacrilamida, 253 00:21:44,720 --> 00:21:50,619 pues lo que se hacen son unos pocillos donde nosotros depositamos la muestra. Ahora vemos 254 00:21:50,619 --> 00:21:57,640 cómo se hace. Y luego tenemos la deposición vertical. Aquí normalmente la vertical va 255 00:21:57,640 --> 00:22:03,779 solamente con el gel, papel no. Para papel en vertical mejor la cromatografía en placa. 256 00:22:03,779 --> 00:22:07,900 Aquí se utiliza casi siempre con el gel, sobre todo de poliacrilamida 257 00:22:07,900 --> 00:22:15,400 Porque es más resistente, no se desliza tanto como la agarosa 258 00:22:15,400 --> 00:22:20,920 Y bueno, pues aquí se suele utilizar para proteínas, para ácidos nucleicos 259 00:22:20,920 --> 00:22:22,640 Que son de pequeño tamaño 260 00:22:22,640 --> 00:22:26,880 La muestra la ponemos con una micropipeta en un pocillo 261 00:22:26,880 --> 00:22:29,039 Igual que en el horizontal de antes 262 00:22:29,039 --> 00:22:33,440 Y bueno, que el pocillo sea hecho al polimerizar el gel 263 00:22:33,440 --> 00:22:40,500 Ahora, ¿cómo trabajamos? Ya sabemos que vamos a hacer un gel de agarosa, que lo vamos 264 00:22:40,500 --> 00:22:46,960 a poner en disposición horizontal, porque queremos separar, pues lo que sea. Me da igual 265 00:22:46,960 --> 00:22:52,720 la muestra que tengamos. Pues tenemos que organizarnos. Es muy importante que nosotros 266 00:22:52,720 --> 00:22:57,019 tengamos organización en el laboratorio. Una vez que ya nosotros sabemos un poco de 267 00:22:57,019 --> 00:23:02,920 qué va todo esto, de cuál es el fundamento, de qué material voy a utilizar, qué disposición 268 00:23:02,920 --> 00:23:07,980 voy a hacer, pues tenemos que organizarnos para poder trabajar, ¿vale? Acordaos, ¿vale? 269 00:23:08,000 --> 00:23:13,640 No tengamos que llevar al laboratorio, empezar a coger el material al tuntún y a ver qué 270 00:23:13,640 --> 00:23:19,960 sale. En el laboratorio siempre es imprescindible la organización, ¿vale? Y que sepamos qué 271 00:23:19,960 --> 00:23:24,660 estamos haciendo y para qué, ¿vale? No tiene sentido que nosotros cojamos ahí una cubeta, 272 00:23:24,660 --> 00:23:29,000 ahora un pocillo, lo hago más grande, más pequeño, qué punta cojo, pongo un capilar 273 00:23:29,000 --> 00:23:32,880 y nosotros no sepamos la marcha que lleva eso ni cuál es el sentido, ¿vale? 274 00:23:32,880 --> 00:23:37,400 Digo que el gel, el porcentaje que pongamos de acrilamida, bisacrilamida, 275 00:23:37,880 --> 00:23:40,900 va a depender de, o sea, en función del porcentaje que pongamos, 276 00:23:41,039 --> 00:23:43,819 va a depender del tamaño del poro y en función del tamaño del poro 277 00:23:43,819 --> 00:23:46,559 voy a separar unas cosas u otras, pues tendré que saber 278 00:23:46,559 --> 00:23:49,380 qué es lo que quiero separar para ver la mezcla que hago. 279 00:23:50,220 --> 00:23:54,680 ¿Qué lo dice el procedimiento? Muy bien, pero que nosotros podamos ir viendo por qué, ¿vale? 280 00:23:54,680 --> 00:23:57,920 Que interpretemos el procedimiento y sepamos por qué va a ser todo esto. 281 00:23:59,000 --> 00:24:07,759 Luego ya muchos equipos que sí, que están automatizados y le damos a un botón y ya, pero al botón hay que darle con cabeza, que sepamos qué es lo que pasa. 282 00:24:08,700 --> 00:24:14,279 Ahora, ya sabemos que vamos a hacer una electroforesis en un gel y vamos a prepararlo. 283 00:24:14,680 --> 00:24:23,980 ¿Cómo lo hacemos? Pues bueno, lo primero sería la preparación del gel, según la concentración requerida y según lo que nos hayan dicho en función de lo que vayamos a separar. 284 00:24:23,980 --> 00:24:36,779 ¿Qué haríamos? Pues disolveríamos la garosa o la acrilamida y la bisacrilamida, lo que necesitemos, en un tampón. Los que se suelen utilizar más son el TAE y el TBE. 285 00:24:36,779 --> 00:24:45,140 Esto luego final se va a fundir utilizando microondas hasta que tengamos una solución homogénea 286 00:24:45,140 --> 00:24:48,440 Un microondas o un calor, una fuente de calor 287 00:24:48,440 --> 00:24:54,339 Que sea transparente, que sea homogéneo, que no veamos precipitado, ni turbidez, ni nada de eso 288 00:24:54,339 --> 00:24:59,799 Esta disolución que hemos preparado nosotros la vamos a vaciar en un mueble 289 00:24:59,799 --> 00:25:02,559 Y vamos a colocar un peine 290 00:25:02,559 --> 00:25:08,480 el peine es el que va a formar los pozos donde se depositan las muestras 291 00:25:08,480 --> 00:25:12,480 lo tenemos ahí puesto para que sea parte del molde 292 00:25:12,480 --> 00:25:14,500 o de la forma que queramos darle a nosotros 293 00:25:14,500 --> 00:25:18,380 al final, dependiendo si es vertical u horizontal 294 00:25:18,380 --> 00:25:23,960 queda más como la foto en horizontal o un tipo castillo en vertical 295 00:25:23,960 --> 00:25:28,720 con el molde caliente y el peine puesto 296 00:25:28,720 --> 00:25:31,640 dejamos enfriar para que se polimerice 297 00:25:31,640 --> 00:25:33,880 y para formar una matriz porosa 298 00:25:33,880 --> 00:25:35,920 que va a depender, el poro va a depender 299 00:25:35,920 --> 00:25:37,859 del tamaño según la concentración 300 00:25:37,859 --> 00:25:38,839 que hayamos obtenido 301 00:25:38,839 --> 00:25:41,900 no hace falta que sepáis 302 00:25:41,900 --> 00:25:44,019 porcentajes, pero si tenéis que saber 303 00:25:44,019 --> 00:25:45,940 que la concentración de lo que pongamos 304 00:25:45,940 --> 00:25:47,920 nosotros va a influir en el tamaño del poro 305 00:25:48,700 --> 00:25:49,839 eso sí es 306 00:25:49,839 --> 00:25:50,500 importante 307 00:25:50,500 --> 00:25:53,799 además del tamaño del poro y de todo 308 00:25:53,799 --> 00:25:55,579 lo que estoy diciendo del pene y todo eso 309 00:25:55,579 --> 00:25:57,599 pues la migración 310 00:25:57,599 --> 00:26:00,180 o el desplazamiento de estos fragmentos 311 00:26:00,180 --> 00:26:19,220 De ADN, por ejemplo, pues va a variar en función del tamaño, ¿vale? Pues como tenemos diferente poro, pues en función del tamaño del ADN que tengamos, pues será más fácil o menos pasar, ¿vale? También va a depender de la conformación molecular, pues si es un lineal, si es un circular, si está súper enrollado, todo eso también influye. 312 00:26:19,220 --> 00:26:33,900 La concentración de agarosa en el gel, el voltaje que nosotros pongamos, la dirección del campo eléctrico, la presencia de diferentes colorantes que nosotros hayamos añadido y que se fijen o se intercalen en el ADN. 313 00:26:34,200 --> 00:26:45,680 Uno de los que se suele utilizar mucho es el bromuro de tibio, lo que pasa que es igual, que no es muy bueno para la salud, entonces se intentan buscar sustituyentes. 314 00:26:45,680 --> 00:26:51,980 Y luego también va a depender del tampón que nosotros hayamos utilizado, del buffer que tengamos en el gel 315 00:26:51,980 --> 00:26:56,319 Una vez que hayamos formado el gel, nosotros vamos a preparar la muestra 316 00:26:56,319 --> 00:27:02,319 Para preparar la muestra para una electroforesis necesitamos que la muestra esté diluida 317 00:27:02,319 --> 00:27:07,160 Otras veces es verdad que hemos trabajado con sustancias sólidas, con sustancias gaseosas 318 00:27:07,160 --> 00:27:10,220 O yo os he dicho, pues hay pH metros para sólidos 319 00:27:10,220 --> 00:27:14,900 O hay espectrofotómetros de ultravioleta visible para sólidos 320 00:27:14,900 --> 00:27:16,960 o el infrarrojo 321 00:27:16,960 --> 00:27:18,940 infrarrojo nosotros hemos trabajado con sólidos 322 00:27:18,940 --> 00:27:20,180 pero también hemos visto 323 00:27:20,180 --> 00:27:22,680 la celda de llenado que tienen 324 00:27:22,680 --> 00:27:24,859 para el infrarrojo para líquidos 325 00:27:24,859 --> 00:27:25,940 bueno pues aquí no 326 00:27:25,940 --> 00:27:28,859 aquí siempre tenemos que 327 00:27:28,859 --> 00:27:30,799 trabajar con una muestra que esté diluida 328 00:27:30,799 --> 00:27:32,900 para electroforesis tiene que estar 329 00:27:32,900 --> 00:27:35,079 diluida y además tiene que estar diluida 330 00:27:35,079 --> 00:27:36,579 en el mismo tampón 331 00:27:36,579 --> 00:27:38,940 que en el que se va a desarrollar la electroforesis 332 00:27:38,940 --> 00:27:40,500 esto sería algo similar 333 00:27:40,500 --> 00:27:42,200 a lo que hicimos en HPLC 334 00:27:42,200 --> 00:27:44,259 vamos a disolver la muestra 335 00:27:44,259 --> 00:27:45,900 en la misma fase móvil 336 00:27:45,900 --> 00:27:48,180 para ver su comportamiento en la fase móvil 337 00:27:48,180 --> 00:27:50,140 pues aquí la muestra tiene que estar 338 00:27:50,140 --> 00:27:51,720 disuelta, tiene que estar 339 00:27:51,720 --> 00:27:54,079 diluida también, en el mismo 340 00:27:54,079 --> 00:27:55,980 tampón en el que vamos a utilizar nosotros para 341 00:27:55,980 --> 00:27:57,220 la electroforesis 342 00:27:57,220 --> 00:27:59,619 además aquí 343 00:27:59,619 --> 00:28:02,339 tenemos que tener una precaución 344 00:28:02,339 --> 00:28:04,039 un punto crítico o una llamada 345 00:28:04,039 --> 00:28:05,119 de atención, como queráis 346 00:28:05,119 --> 00:28:08,400 para evitar la evaporación del tampón 347 00:28:08,400 --> 00:28:10,079 ¿qué pasa si se 348 00:28:10,079 --> 00:28:11,859 evapora el tampón? cuando nosotros pasamos 349 00:28:11,859 --> 00:28:14,140 la corriente eléctrica, al final queramos 350 00:28:14,140 --> 00:28:21,099 o no, pues se genera calor y se puede ir evaporando del tampón poco a poco. No sé si habéis 351 00:28:21,099 --> 00:28:24,400 visto algún vídeo porque la electroforesis me habéis dicho que no la habéis visto correr. 352 00:28:24,539 --> 00:28:28,960 ¿Tampoco visteis el principio de la electroforesis de cómo corría? Ni el principio ni el final, 353 00:28:29,079 --> 00:28:33,779 no visteis solo el revelado. Es que cuando ponéis la electroforesis, bueno, sobre todo 354 00:28:33,779 --> 00:28:39,339 al principio porque como hay calor se evapora, se empiezan a ver como unas burbujitas en 355 00:28:39,339 --> 00:28:49,000 el tampón. Esas burbujitas son de la hidrólisis del agua, la ruptura del agua que alguna vez 356 00:28:49,000 --> 00:28:55,839 la hemos visto en la parte de las técnicas electroquímicas nosotros. Entonces se van 357 00:28:55,839 --> 00:29:00,720 viendo las burbujitas y eso es porque el agua se está rompiendo debido al campo eléctrico. 358 00:29:01,359 --> 00:29:07,119 Si se genera calor, se forma un vaho, si se evapora el gel aumentaría la concentración 359 00:29:07,119 --> 00:29:12,039 de sal, ¿vale? Del tampón que tengamos nosotros. Se va el agua, pues se queda el sólido, queda 360 00:29:12,039 --> 00:29:16,519 como más concentrado. Entonces, para evitarlo, pues se pone una tapa. Entonces, quitamos 361 00:29:16,519 --> 00:29:21,900 la tapa, pues si vemos el calor saliendo, por eso ponemos la tapa, para evitar la evaporación. 362 00:29:23,200 --> 00:29:29,200 Vale, entonces, nosotros conectamos la cubeta a la fuente de alimentación y ya seleccionaríamos 363 00:29:29,200 --> 00:29:34,519 las condiciones de la electroforesis, las condiciones de procedimiento, del desarrollo, 364 00:29:34,519 --> 00:29:39,519 y ya lo conectamos a la fuente de alimentación. 365 00:29:39,859 --> 00:29:44,740 Queremos 100 milivoltios o 1,5 voltios o 100 minutos 366 00:29:44,740 --> 00:29:47,799 o lo que sea en función de lo que queramos separar. 367 00:29:48,200 --> 00:29:50,319 Una vez que nosotros eso lo programamos 368 00:29:50,319 --> 00:29:52,980 y una vez que haya pasado el tiempo de desarrollo 369 00:29:52,980 --> 00:29:55,079 pues desconectamos la corriente eléctrica 370 00:29:55,079 --> 00:29:57,579 y ya vamos viendo las bandas. 371 00:29:58,180 --> 00:30:00,539 Que las bandas, ya las he visto, 372 00:30:00,720 --> 00:30:02,200 pues sí quedaría algo similar a esto. 373 00:30:02,200 --> 00:30:04,500 entonces tenemos que ir localizando 374 00:30:04,500 --> 00:30:06,779 las bandas que queramos 375 00:30:06,779 --> 00:30:08,420 ver, que queramos detectar o que nos sirvan 376 00:30:08,420 --> 00:30:10,420 a nosotros, sería como una especie 377 00:30:10,420 --> 00:30:11,299 de revelado 378 00:30:11,299 --> 00:30:13,880 en el que parte del soporte 379 00:30:13,880 --> 00:30:16,500 sabemos en qué parte del soporte 380 00:30:16,500 --> 00:30:18,779 y en qué cantidad se encuentran las sustancias 381 00:30:18,779 --> 00:30:19,940 que nos interesan a nosotros 382 00:30:19,940 --> 00:30:22,680 que supuestamente están separadas 383 00:30:22,680 --> 00:30:24,900 y nosotros podemos separarlas y cuantificarlas 384 00:30:24,900 --> 00:30:26,380 más o menos 385 00:30:26,380 --> 00:30:28,940 si medimos el área de la banda 386 00:30:28,940 --> 00:30:30,480 más o menos, pues podríamos 387 00:30:30,480 --> 00:30:33,019 hacer una cuantificación 388 00:30:33,019 --> 00:30:34,900 pero bueno, estas son 389 00:30:34,900 --> 00:30:36,859 casi todo técnicas 390 00:30:36,859 --> 00:30:38,839 cualitativas para ver 391 00:30:38,839 --> 00:30:40,700 entonces ponemos una muestra que sea patrón 392 00:30:40,700 --> 00:30:42,559 y ponemos la muestra problema 393 00:30:42,559 --> 00:30:44,980 y vamos identificando los fragmentos que tiene 394 00:30:44,980 --> 00:30:45,579 o los que no 395 00:30:45,579 --> 00:30:48,900 esta 396 00:30:48,900 --> 00:30:50,900 determinación que estamos hablando 397 00:30:50,900 --> 00:30:52,480 pues si se puede hacer 398 00:30:52,480 --> 00:30:55,200 midiendo alguna propiedad física de la molécula 399 00:30:55,200 --> 00:30:57,000 pues como por ejemplo la absorción 400 00:30:57,000 --> 00:30:58,640 de luz, esta revelación, esta 401 00:30:58,640 --> 00:31:03,259 identificación se puede hacer mediante un detector por absorción de luz como 402 00:31:03,259 --> 00:31:07,460 hacíamos el ultravioleta el visible también se puede hacer por el índice de 403 00:31:07,460 --> 00:31:12,920 refracción o mediante una reacción química vale que también se suele 404 00:31:12,920 --> 00:31:17,059 utilizar mucho vale con una atención pues se intercala el tinte o el 405 00:31:17,059 --> 00:31:22,740 colorante en la enfermedad que nosotros queramos y así lo podemos identificar 406 00:31:22,740 --> 00:31:24,160 para verlo, porque si no 407 00:31:24,160 --> 00:31:26,859 esto es porque 408 00:31:26,859 --> 00:31:28,119 tienen alguna tinción 409 00:31:28,119 --> 00:31:30,039 en este caso, tienen alguna 410 00:31:30,039 --> 00:31:32,299 tinción, o yo creo que lo visteis con 411 00:31:32,299 --> 00:31:34,420 la campana de ultravioleta 412 00:31:34,420 --> 00:31:35,539 creo que lo visteis vosotros 413 00:31:35,539 --> 00:31:37,720 o se suele ver aquí el gel 414 00:31:37,720 --> 00:31:39,160 se ve la ultravioleta 415 00:31:39,160 --> 00:31:41,920 o con una linterna de ultravioleta y se van viendo 416 00:31:41,920 --> 00:31:43,460 las bandas mejor 417 00:31:43,460 --> 00:31:45,900 entonces bueno, es una forma en la que nosotros 418 00:31:45,900 --> 00:31:47,180 tenemos que verlo 419 00:31:47,180 --> 00:31:49,720 que normalmente se hace la 420 00:31:49,720 --> 00:31:51,259 tinción, porque 421 00:31:51,259 --> 00:32:04,799 Porque no todas las sustancias de una misma familia, por ejemplo las proteínas, tienen su máximo de absorción, su longitud de onda máxima a la misma longitud de onda. 422 00:32:04,799 --> 00:32:10,640 Entonces, trabajar con un detector de ultravioleta visible con una longitud de onda fija sería difícil. 423 00:32:10,859 --> 00:32:18,500 Por eso se suelen tener y ver las bandas, porque aparecen negras, azules y con colorantes que no sean malos para nosotros. 424 00:32:18,500 --> 00:32:26,140 Las bandas que nosotros obtenemos, estas de aquí, una vez que nosotros hemos terminado la electroforesis 425 00:32:26,140 --> 00:32:30,859 Pues si se ensanchan por difusión, dentro del soporte 426 00:32:30,859 --> 00:32:37,759 Entonces este sería otro de los puntos críticos, que no podamos dejar ahí el gel y verlo dentro de tres meses 427 00:32:37,759 --> 00:32:40,480 Porque si puede que se nos solapen algunas 428 00:32:40,480 --> 00:32:57,039 Entonces, bueno, para evitar esta difusión y ese ensanchamiento, lo que podemos hacer es, antes de hacer la atención, antes de la coloración, pues secar el papel, secar el soporte con el que estamos trabajando, ¿vale? 429 00:32:57,039 --> 00:33:05,680 Si estamos trabajando, por ejemplo, con proteínas en gel, pues tenemos que hacer que precipiten con ácido acético, ¿vale? 430 00:33:05,680 --> 00:33:12,539 O con alguna cosa, algo de TCA, algo que ayude a que precipite para evitar la difusión, ¿vale? 431 00:33:12,539 --> 00:33:15,680 Pero yo le digo que va todo en función del procedimiento, yo os hablo de cosas generales. 432 00:33:16,680 --> 00:33:20,799 Y luego, bueno, pues esto es, lo que hagamos para que precipiten, pues a veces llevan colorantes también. 433 00:33:20,799 --> 00:33:23,579 una vez que ya hemos terminado 434 00:33:23,579 --> 00:33:25,440 la electroforesis 435 00:33:25,440 --> 00:33:26,579 para ver las batas 436 00:33:26,579 --> 00:33:28,960 se sumerge el gel 437 00:33:28,960 --> 00:33:31,440 en un recipiente que tiene una disolución 438 00:33:31,440 --> 00:33:33,519 del colorante, esperemos a que 439 00:33:33,519 --> 00:33:35,279 se impregne, creo que está aquí 440 00:33:35,279 --> 00:33:37,099 en el este que hay como 441 00:33:37,099 --> 00:33:39,279 un balanceo que tiene que estar 442 00:33:39,279 --> 00:33:41,839 ahí el gel un rato 443 00:33:41,839 --> 00:33:43,119 y está balanceándose 444 00:33:43,119 --> 00:33:44,480 para que sea homogéneo 445 00:33:44,480 --> 00:33:47,380 y el colorante lo que hace es unirse a las moléculas 446 00:33:47,380 --> 00:33:49,039 que están ya separadas 447 00:33:49,039 --> 00:33:51,099 en el gel, luego lavamos el gel 448 00:33:51,099 --> 00:33:52,960 y al lavar el gel lo que se hace 449 00:33:52,960 --> 00:33:54,940 es eliminar el exceso de 450 00:33:54,940 --> 00:33:57,099 tinción, y ya observaríamos 451 00:33:57,099 --> 00:33:58,539 se elimina igual que 452 00:33:58,539 --> 00:34:01,119 las tensiones del micro 453 00:34:01,119 --> 00:34:02,980 pues eliminamos los 454 00:34:02,980 --> 00:34:05,019 extras y ya quedaría solamente 455 00:34:05,019 --> 00:34:07,180 unido a las bandas que nos interesan 456 00:34:07,180 --> 00:34:09,059 que más o menos se vería como esto de aquí 457 00:34:09,059 --> 00:34:11,380 a lo mejor si, si un poco más azulado 458 00:34:11,380 --> 00:34:12,840 esta parte de aquí más oscura 459 00:34:12,840 --> 00:34:14,800 pero bueno, se distinguen bien las 460 00:34:14,800 --> 00:34:16,760 bandas por las que nosotros queremos trabajar 461 00:34:16,760 --> 00:34:18,159 y ahora 462 00:34:18,159 --> 00:34:37,719 Hay un tipo dentro de la electroforesis clásica, hay un tipo especial, una variante de esta electroforesis clásica que sería la electroforesis bidimensional, porque vamos a hacer la separación en dos sentidos, en dos direcciones. 463 00:34:37,719 --> 00:35:03,679 Este tipo de electroforesis lo que hace es mezclar dos técnicas, para hacer esa separación que digo yo en dos direcciones vamos a utilizar el isoelectroenfoque o el enfoque isoeléctrico o el IEF del inglés también, entonces esta parte del isoelectroenfoque es una variante de la electroforesis en gel, sobre todo el gel de poliacrilamida. 464 00:35:03,679 --> 00:35:07,340 entonces lo que se va a hacer es trabajar con un gradiente 465 00:35:07,340 --> 00:35:11,780 nosotros vamos a tener en el gel un gradiente de pH que esté fijado 466 00:35:11,780 --> 00:35:16,920 ponemos el gel y empezamos por el pH 3 y el otro pH 10 467 00:35:16,920 --> 00:35:21,119 ahora si no lo vemos un momento en dibujo 468 00:35:21,119 --> 00:35:26,579 este gradiente lo vamos a conseguir poniendo en la preparación del gel 469 00:35:26,579 --> 00:35:29,840 además de la clamida, biseclamida y todo lo que queramos 470 00:35:29,840 --> 00:35:33,260 vamos a añadir moléculas que son ionizables 471 00:35:33,260 --> 00:35:40,460 que además tienen valores de pk diferentes vale no sé si os acordáis del pk del punto 472 00:35:40,460 --> 00:35:51,500 isoeléctrico y todo eso del año pasado pero si no le damos un repaso ahora al tener estas diferentes 473 00:35:51,500 --> 00:35:58,699 este gradiente diferente y todo esto pues al avanzar los componentes de la muestra a lo largo 474 00:35:58,699 --> 00:36:03,260 del gel se va a encontrar con ph diferentes en función de donde esté pues 475 00:36:03,260 --> 00:36:08,960 unas veces tendrá ph 4 otras 5 otras ph 7 vale y bueno pues ahí eso va a 476 00:36:08,960 --> 00:36:14,699 regular la separación entonces cuando la sustancia que estoy separando con la 477 00:36:14,699 --> 00:36:20,059 molécula la muestra alcanza una región en la que el ph es igual al punto 478 00:36:20,059 --> 00:36:24,559 isoeléctrico de la molécula muestra de una parte de una molécula de la muestra 479 00:36:24,559 --> 00:36:30,199 o de un analito que yo estoy trabajando, en este punto la molécula se va a detener, se va a parar. 480 00:36:31,219 --> 00:36:34,099 Cuando pasa esto, pues se alcanzaría un equilibrio. 481 00:36:34,840 --> 00:36:41,900 Y lo que vamos a conseguir al final es la separación de los componentes de la muestra según su punto es eléctrico. 482 00:36:42,400 --> 00:36:46,539 Y este punto es eléctrico, pues además lo podemos medir, ya que nosotros podemos conocer, 483 00:36:46,539 --> 00:36:49,460 el gradiente de pH lo hemos puesto nosotros, nosotros lo conocemos. 484 00:36:49,460 --> 00:37:05,159 Tendríamos por ejemplo a lo mejor una proteína que nosotros queremos separar que tiene una proteína que tenemos el punto isoeléctrico sería 6,5 y nosotros la queremos separar. 485 00:37:05,159 --> 00:37:11,619 Para eso vamos a hacer un gel que hemos dicho que tiene un gradiente de pH. 486 00:37:12,199 --> 00:37:22,440 Entonces empezamos por pH 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, ¿vale? Ya, no cabe más. 487 00:37:23,019 --> 00:37:26,880 Entonces nosotros tenemos el gradiente pH en cada zona. 488 00:37:26,880 --> 00:37:29,119 esta zona de aquí 489 00:37:29,119 --> 00:37:30,579 pues tendría pH 10 490 00:37:30,579 --> 00:37:32,199 esta de aquí pH 9 491 00:37:32,199 --> 00:37:34,300 esta pH 8, 7 492 00:37:34,300 --> 00:37:36,000 esta de aquí pH 4 493 00:37:36,000 --> 00:37:38,840 si la proteína va en este sentido 494 00:37:38,840 --> 00:37:41,619 pues se va encontrando con diferentes pH 495 00:37:41,619 --> 00:37:42,719 y en función 496 00:37:42,719 --> 00:37:44,579 de su punto S eléctrico 497 00:37:44,579 --> 00:37:46,079 y si coincide con el pH 498 00:37:46,079 --> 00:37:47,599 pues vamos a ir bien 499 00:37:47,599 --> 00:37:51,139 cuando el pH es superior al punto S eléctrico 500 00:37:51,139 --> 00:37:53,500 pues la proteína va a tener una carga negativa 501 00:37:53,500 --> 00:37:54,519 es decir, cuando estamos 502 00:37:54,519 --> 00:38:03,820 en esta parte de aquí, cuando la proteína está en esta parte de aquí, pues la proteína 503 00:38:03,820 --> 00:38:09,699 va a tener una carga negativa, porque el pH, pH 10, es superior al punto isoeléctrico 504 00:38:09,699 --> 00:38:18,260 que es de 6,5. En un terno que tengamos el pH que sea más pequeño que el punto isoeléctrico, 505 00:38:18,260 --> 00:38:22,940 por aquí por ejemplo, pues la proteína tiene una carga positiva 506 00:38:22,940 --> 00:38:29,739 y bueno, si la proteína va avanzando por aquí 507 00:38:29,739 --> 00:38:34,159 pues la carga va a hacer que las moléculas de la proteína se vayan desplazando 508 00:38:34,159 --> 00:38:37,639 nosotros generamos la corriente eléctrica o el potencial 509 00:38:37,639 --> 00:38:40,659 y vamos a hacer que la proteína se mueva 510 00:38:40,659 --> 00:38:46,699 a ver aquí dibujado, por si la proteína en vez de entrar por aquí sigue este camino 511 00:38:46,699 --> 00:38:52,739 entonces en función del voltaje que hayamos puesto nosotros y del campo eléctrico que hayamos puesto 512 00:38:52,739 --> 00:38:58,400 la proteína va a avanzar, al moverse pues va cambiando el pH de su entorno 513 00:38:58,400 --> 00:39:05,480 aquí empezamos por pH 9, luego pasa a pH 10, pH 9, pH 8, pH 7, se va moviendo 514 00:39:05,480 --> 00:39:13,579 cuando la proteína va en esta dirección y ahí lo que va haciendo es que va perdiendo carga neta 515 00:39:13,579 --> 00:39:38,650 La carga va a hacer que las moléculas de la proteína sigan desplazándose y al alcanzar el pH igual al punto isoeléctrico, por ejemplo, más o menos por aquí, pues la proteína ya no tiene carga neta, se tendría una carga nula y ya no se mueve más. 516 00:39:38,650 --> 00:39:41,670 si entra por aquí 517 00:39:41,670 --> 00:39:44,030 iría pasando de negativo 518 00:39:44,030 --> 00:39:45,849 carga neta, si entra por aquí 519 00:39:45,849 --> 00:39:48,210 sería de carga positiva 520 00:39:48,210 --> 00:39:49,409 a carga 0 521 00:39:49,409 --> 00:39:51,289 eso sería más o menos 522 00:39:51,289 --> 00:39:53,550 lo que pasa en esta parte 523 00:39:53,550 --> 00:39:55,130 del isoelectroenfoque 524 00:39:55,130 --> 00:39:57,170 una vez que ya hemos 525 00:39:57,170 --> 00:39:58,769 una vez que hacemos eso 526 00:39:58,769 --> 00:40:01,429 pues nosotros tendríamos 527 00:40:01,429 --> 00:40:02,650 si nosotros tenemos 528 00:40:02,650 --> 00:40:05,389 aquí nuestro gel 529 00:40:05,389 --> 00:40:07,789 y tenemos aquí el pH 10 530 00:40:07,789 --> 00:40:15,869 y aquí tenemos el pH 3 ahí hemos puesto, pues tendremos proteínas que estén puestas en diferentes sitios 531 00:40:15,869 --> 00:40:21,469 en función de su punto isoeléctrico, pues aquí tengo una proteína, aquí tengo otra, 532 00:40:23,739 --> 00:40:32,739 van a ir separándose, voy a ponerlas a la misma altura, entonces nosotros vamos añadiendo las proteínas 533 00:40:32,739 --> 00:40:41,940 y las vamos separando en función de su punto isoeléctrico, pues aquí por ejemplo tendríamos 3. 534 00:40:41,940 --> 00:40:44,420 entonces una vez que hemos hecho esta separación 535 00:40:44,420 --> 00:40:45,500 esta primera separación 536 00:40:45,500 --> 00:40:48,559 lo que hayamos obtenido que es esa línea de proteínas 537 00:40:48,559 --> 00:40:50,800 que he hecho yo, pues se va a someter 538 00:40:50,800 --> 00:40:51,639 a otra 539 00:40:51,639 --> 00:40:54,260 electroforesis o a otra separación 540 00:40:54,260 --> 00:40:55,739 que va a utilizar otro 541 00:40:55,739 --> 00:40:58,280 mecanismo, que se hará 542 00:40:58,280 --> 00:41:00,320 en otra dirección, va a ser 543 00:41:00,320 --> 00:41:02,440 en dirección perpendicular, entonces normalmente 544 00:41:02,440 --> 00:41:04,260 la primera parte es un 545 00:41:04,260 --> 00:41:04,719 electro 546 00:41:04,719 --> 00:41:07,940 electroisofoque o un enfoque 547 00:41:07,940 --> 00:41:10,280 isoeléctrico, en un gel 548 00:41:10,280 --> 00:41:16,619 que es cilíndrico, normalmente en vez de ser tan, yo lo he puesto así encuadrado porque a lo mejor es más fácil de ver, 549 00:41:16,739 --> 00:41:25,599 pero bueno, suele ser un gel que es cilíndrico, que es estrecho y luego esto lo ponemos como muestra para una electroforesis 550 00:41:25,599 --> 00:41:27,380 que va separada por el peso molecular. 551 00:41:27,780 --> 00:41:33,500 Una vez que tenemos eso, pues separaríamos en función del peso molecular, por ejemplo, esto, 552 00:41:33,500 --> 00:41:40,000 luego ya pasaría a hacer la separación en este sentido. 553 00:41:40,280 --> 00:41:46,679 En este sentido va el peso molecular, en este sentido va el punto isoeléctrico 554 00:41:46,679 --> 00:41:48,659 y ya tendríamos eso en las moléculas. 555 00:41:48,800 --> 00:41:52,519 A lo mejor queda esta por aquí arriba, que la teníamos en el medio, 556 00:41:53,179 --> 00:42:01,920 esta queda más abajo y esta azul queda por aquí intermedia. 557 00:42:03,940 --> 00:42:06,320 La separamos en función del peso molecular. 558 00:42:06,739 --> 00:42:10,239 Haciendo esto, pues sí, quedan cosas que parece que es follón, 559 00:42:10,239 --> 00:42:12,599 que son mapas que son muy complejos 560 00:42:12,599 --> 00:42:13,960 o estructuras muy 561 00:42:13,960 --> 00:42:16,199 complejas, pero bueno, que son 562 00:42:16,199 --> 00:42:17,780 características de cada muestra 563 00:42:17,780 --> 00:42:20,119 y nos da bastante información, son muy 564 00:42:20,119 --> 00:42:22,539 útiles para comparar 565 00:42:22,539 --> 00:42:24,320 con una muestra similar 566 00:42:24,320 --> 00:42:25,699 con patrones 567 00:42:25,699 --> 00:42:28,119 así de primeras no nos dice nada, pero 568 00:42:28,119 --> 00:42:29,699 hacer una comparación con algún patrón 569 00:42:29,699 --> 00:42:31,519 si se va a conseguir algo 570 00:42:31,519 --> 00:42:33,639 entonces esto sería 571 00:42:33,639 --> 00:42:35,639 lo que, por lo menos la 572 00:42:35,639 --> 00:42:37,480 normal, la de diferencia 573 00:42:37,480 --> 00:42:39,679 según el campo eléctrico 574 00:42:39,679 --> 00:42:44,260 y todo eso sería, o por separado, me da igual, aunque no sea el nivel dimensional, 575 00:42:44,860 --> 00:42:47,239 sería más o menos lo que habéis visto en biotecnología. 576 00:42:47,840 --> 00:42:49,480 Y luego quedaría, que no sé si lo habéis visto, 577 00:42:49,840 --> 00:42:55,019 quedaría la parte de la electroforesis instrumental o la electroforesis capilar. 578 00:42:55,840 --> 00:43:01,219 En este caso, lo que digo que es la versión instrumental de la electroforesis clásica. 579 00:43:01,679 --> 00:43:05,440 Entonces aquí sigue siendo una técnica analítica, que es de separación, 580 00:43:05,440 --> 00:43:08,239 que se basa en la diferente velocidad de desplazamiento, 581 00:43:08,239 --> 00:43:12,539 la diferente velocidad de desplazamiento 582 00:43:12,539 --> 00:43:15,199 que tienen las diferentes proteínas 583 00:43:15,199 --> 00:43:16,920 dentro de un medio líquido 584 00:43:16,920 --> 00:43:20,320 y aquí lo que hacemos es que 585 00:43:20,320 --> 00:43:22,420 lo tenemos todo dentro de nuestro soporte 586 00:43:22,420 --> 00:43:26,559 o todo va a estar dentro de un tubo capilar 587 00:43:26,559 --> 00:43:29,760 y aquí este tubo capilar está sometido 588 00:43:29,760 --> 00:43:31,280 a un campo eléctrico 589 00:43:31,280 --> 00:43:35,900 a los dos electrodos que forman el campo eléctrico 590 00:43:35,900 --> 00:43:37,719 ¿Cómo vamos a hacer la separación? 591 00:43:37,719 --> 00:43:54,780 Bueno, pues lo tenemos. La separación, la parte de separación, lo que antes hemos puesto el gel, aquí sería el capilar este que está aquí en forma de U invertida. Entonces todo tiene lugar dentro de un capilar. ¿Cómo son de grandes los capilares? Pues depende de lo que queramos hacer. 592 00:43:54,780 --> 00:44:04,460 Yo digo que tenemos de diámetro interno, pues entre 10 y 75 micras, por ejemplo, ¿vale? Es igual que las columnas, que cuánto tienen de partícula, de largo, de ancho, todo. 593 00:44:05,059 --> 00:44:10,780 ¿Vale? Aquí, pues entre 10 y 75 micras, que es pequeño, el capilar es pequeño, pues sí, suele ser el diámetro interno. 594 00:44:11,760 --> 00:44:23,139 ¿De grande cómo son los capilares? Pues aquí entre 20 y 100 centímetros. Fijaos que son, o sea, un metro puede ser también el capilar, entre 20 centímetros y un metro, más o menos puede ser, ¿vale? 595 00:44:23,139 --> 00:44:24,460 En función de lo que yo haga. 596 00:44:25,579 --> 00:44:28,679 Normalmente los capilares sí están hechos de sílice fundida. 597 00:44:29,519 --> 00:44:32,340 Y bueno, dentro lo que tenemos es el tampón, ¿vale? 598 00:44:32,340 --> 00:44:34,639 Igual que teníamos la electroferencia normal, un tampón. 599 00:44:35,079 --> 00:44:43,400 Aquí dentro también tenemos un tampón que lo que va a hacer es el soporte o el medio donde va a tener lugar la separación. 600 00:44:44,199 --> 00:44:44,380 ¿Vale? 601 00:44:44,500 --> 00:44:48,840 Y también tenemos una serie de viales que están situados en los extremos del capilar. 602 00:44:49,099 --> 00:44:49,199 ¿Vale? 603 00:44:49,219 --> 00:44:50,860 Los viales serían estos dos. 604 00:44:51,579 --> 00:44:51,800 ¿Vale? 605 00:44:51,800 --> 00:44:56,059 entonces lo sumergimos cada extremo en uno de los viales y ya está 606 00:44:56,059 --> 00:44:58,900 la muestra la vamos a poner en otro vial 607 00:44:58,900 --> 00:45:02,059 en uno de los extremos del capilar pues en vez de estar en el capilar aquí 608 00:45:02,059 --> 00:45:05,900 lo cambiamos aquí en el momento de la inyección o en el momento de análisis de la muestra 609 00:45:05,900 --> 00:45:09,400 pues lo cambiamos a la muestra en vez de al vial 610 00:45:09,400 --> 00:45:13,320 y ya tendríamos la muestra ahí puesta 611 00:45:13,320 --> 00:45:18,139 entonces bueno, ahí aplicaríamos una pequeña sobrepresión 612 00:45:18,139 --> 00:45:21,199 a la hora de poner la muestra o la inyección de la muestra 613 00:45:21,199 --> 00:45:24,579 para conseguir esta separación 614 00:45:24,579 --> 00:45:26,579 que tenemos un ánodo y un cátodo 615 00:45:26,579 --> 00:45:28,000 vamos a generar un campo eléctrico 616 00:45:28,000 --> 00:45:30,059 que lo vamos a conseguir 617 00:45:30,059 --> 00:45:32,000 con una fuente de alimentación 618 00:45:32,000 --> 00:45:33,579 si no, no hacemos nada 619 00:45:33,579 --> 00:45:36,739 también necesitamos una fuente de alimentación 620 00:45:36,739 --> 00:45:38,679 que sea de un voltaje 621 00:45:38,679 --> 00:45:39,500 altillo 622 00:45:39,500 --> 00:45:41,599 y que están en los extremos 623 00:45:41,599 --> 00:45:44,780 del capilar 624 00:45:44,780 --> 00:45:48,400 está unido 625 00:45:48,400 --> 00:45:50,079 a los dos extremos que tenemos 626 00:45:50,079 --> 00:45:51,960 de los viales, en medio del ánodo 627 00:45:51,960 --> 00:45:52,880 y el cátodo, vamos 628 00:45:52,880 --> 00:45:55,699 esta parte de aquí está automatizada 629 00:45:55,699 --> 00:45:57,800 pues sí, casi todo lo podemos hacer desde 630 00:45:57,800 --> 00:45:59,579 el ordenador, teniendo todo 631 00:45:59,579 --> 00:46:01,500 ahí guardaico y bueno 632 00:46:01,500 --> 00:46:03,420 todas las técnicas ya están muy 633 00:46:03,420 --> 00:46:05,619 monitorizadas, vale 634 00:46:05,619 --> 00:46:07,719 entonces la separación si es verdad 635 00:46:07,719 --> 00:46:08,780 que lo que decía, se lleva 636 00:46:08,780 --> 00:46:11,420 en la columna, vale 637 00:46:11,420 --> 00:46:13,900 cuando hay, ponemos 638 00:46:13,900 --> 00:46:15,320 nosotros un detector 639 00:46:15,320 --> 00:46:17,380 en un punto del capilar 640 00:46:17,380 --> 00:46:18,300 pues 641 00:46:18,300 --> 00:46:20,739 normalmente 642 00:46:20,739 --> 00:46:21,920 sirve la que se pone 643 00:46:21,920 --> 00:46:24,400 antes del extremo 644 00:46:24,400 --> 00:46:26,679 tenemos que ponerlo para la detección 645 00:46:26,679 --> 00:46:28,880 que no llegue a salir, sino que se pone 646 00:46:28,880 --> 00:46:30,659 antes, es igual que en la 647 00:46:30,659 --> 00:46:32,000 cromatografía, la de placa 648 00:46:32,000 --> 00:46:34,619 no tenemos que dejar que corra 649 00:46:34,619 --> 00:46:36,920 hasta mañana si quiere 650 00:46:36,920 --> 00:46:38,960 porque si no se va del frente 651 00:46:38,960 --> 00:46:40,280 entonces aquí pasa igual 652 00:46:40,280 --> 00:46:42,679 en el capilar de la columna antes de que salga 653 00:46:42,679 --> 00:46:44,699 el extremo ponemos el sistema de 654 00:46:44,699 --> 00:46:45,320 detección 655 00:46:45,320 --> 00:47:09,579 Entonces, en función de la detección que pongamos, tendrá una forma u otra. Y ya con el ordenador que va unido a este programa o al sistema de detección, ya íbamos controlando todo lo que queramos nosotros. Del voltaje, de la detección, de áreas, de cuantificación, tratamiento de datos, todo eso lo va haciendo con el detector. 656 00:47:09,579 --> 00:47:22,500 La separación al final, aunque esté automatizada, sigue basándose en todo lo tradicional, lo que hemos visto anteriormente 657 00:47:22,500 --> 00:47:24,800 Pero tiene lugar dentro de un capilar 658 00:47:24,800 --> 00:47:27,440 ¿Por qué lo hacemos dentro de un capilar? 659 00:47:27,440 --> 00:47:32,599 Pues lo primero porque es más sencillo, parece que es más fácil 660 00:47:32,599 --> 00:47:41,719 También vamos a conseguir más velocidad que en HPLC por ejemplo que es otro de los que la clásica que son otros tipos de separación. 661 00:47:42,860 --> 00:47:52,880 También en HPLC por ejemplo teníamos algunas dificultades a la hora de seleccionar los solventes pues aquí dentro del capilar no, no tenemos estos problemas. 662 00:47:52,880 --> 00:47:57,099 los disolventes 663 00:47:57,099 --> 00:47:58,940 no son tan tóxicos 664 00:47:58,940 --> 00:48:01,360 como otros utilizados en otras técnicas 665 00:48:01,360 --> 00:48:02,199 instrumentales 666 00:48:02,199 --> 00:48:05,559 o en otros tipos de electroforesis 667 00:48:05,559 --> 00:48:07,619 también es más barato 668 00:48:07,619 --> 00:48:09,719 y al final por beneficio 669 00:48:09,719 --> 00:48:11,360 que tengamos lo podemos conseguir 670 00:48:11,360 --> 00:48:13,679 más barato que HPLC sobre todo 671 00:48:13,679 --> 00:48:15,719 que a lo mejor con la cromatografía 672 00:48:15,719 --> 00:48:17,860 clásica pues hay ahí 673 00:48:17,860 --> 00:48:19,500 pero que para HPLC también 674 00:48:19,500 --> 00:48:21,739 y lo que dice que los disolventes 675 00:48:21,739 --> 00:48:23,860 normalmente son casi todos muy acuosos 676 00:48:23,860 --> 00:48:26,280 entonces no necesitamos las mezclas 677 00:48:26,280 --> 00:48:28,300 de metanol con acetonitrilo, exano 678 00:48:28,300 --> 00:48:29,900 y no sé qué que hacíamos en 679 00:48:29,900 --> 00:48:31,699 en HPLC 680 00:48:31,699 --> 00:48:33,139 son muy acuosos 681 00:48:33,139 --> 00:48:35,920 si tienen la concentración única que tienen 682 00:48:35,920 --> 00:48:36,800 es muy bajita 683 00:48:36,800 --> 00:48:40,039 al tener más velocidad también pues el tiempo 684 00:48:40,039 --> 00:48:41,739 de análisis se reduce 685 00:48:41,739 --> 00:48:44,000 entonces bueno, también depende un poco del equipo 686 00:48:44,000 --> 00:48:44,599 que tengamos 687 00:48:44,599 --> 00:48:47,780 que luego ya del equipo con el que trabajéis 688 00:48:47,780 --> 00:48:49,260 pues hay otros que van 689 00:48:49,260 --> 00:48:51,440 muy muy muertos 690 00:48:51,440 --> 00:48:52,940 y otros que van rápido 691 00:48:52,940 --> 00:48:55,219 aquí yo creo que si 692 00:48:55,219 --> 00:48:57,500 ibas a utilizar los dos equipos de ultravioleta 693 00:48:57,500 --> 00:48:59,179 visible, ya habéis visto que 694 00:48:59,179 --> 00:49:00,920 uno se tardaba más que con otro 695 00:49:00,920 --> 00:49:03,300 y la técnica sigue siendo la misma y el fundamento 696 00:49:03,300 --> 00:49:05,280 sigue siendo el mismo 697 00:49:05,280 --> 00:49:07,260 pero bueno, normalmente en un par 698 00:49:07,260 --> 00:49:09,099 de minutillos así ya tenemos 699 00:49:09,099 --> 00:49:11,260 los resultados, podemos trabajar con 700 00:49:11,260 --> 00:49:13,199 ellos y bueno, con la tradicional 701 00:49:13,199 --> 00:49:14,380 se tarda un poco más 702 00:49:14,380 --> 00:49:16,960 un poco bastante más 703 00:49:16,960 --> 00:49:19,059 pero aquí con la capilar pues 704 00:49:19,059 --> 00:49:21,000 nada, en un poquillo de tiempo 705 00:49:21,000 --> 00:49:26,780 lo tenemos. Y luego también la cantidad de muestras que estemos utilizando. Sí es verdad 706 00:49:26,780 --> 00:49:33,280 que en HPLC y en la cromatografía clásica, en la ultrafóresis clásica, perdón, utilizamos 707 00:49:33,280 --> 00:49:39,340 muy pequeño porque utilizamos micropipetas o en HPLC necesitábamos 20-40 microlitros, 708 00:49:39,860 --> 00:49:44,139 pero aquí siguen siendo microlitros pero menos. Entonces también necesitamos menos 709 00:49:44,139 --> 00:49:49,280 cantidad de muestras. Aunque tengamos pocas ya en las anteriores, pero aquí menos. 710 00:49:51,000 --> 00:50:06,820 Y ahora vamos a ver cómo vamos a separar nosotros. Igual que hemos visto un poco de qué dependía antes la biodimensional, cómo hacíamos esa separación en esta electroforesis capilar, cómo interpretamos nosotros los resultados o cómo conseguimos separar. 711 00:50:06,820 --> 00:50:19,820 La separación sí se basa en cosas tradicionales y en los procedimientos, en los fundamentos en los que se basaría sería en la movilidad electroforetica y en el flujo electroosmótico o electroosmótico. 712 00:50:19,820 --> 00:50:28,800 La movilidad electroforetica, pues esa es específica de cada analito, entonces en función de lo que yo vaya a separar, pues tengo que tenerlo en cuenta. 713 00:50:29,300 --> 00:50:36,739 También va a depender, aunque sea específica de cada analito, dentro de cada analito va a depender de la relación carga-tamaño que tengamos. 714 00:50:36,920 --> 00:50:42,280 Dentro de la misma muestra, pues va a depender de la relación carga-tamaño de las sustancias que yo quiera separar. 715 00:50:42,280 --> 00:50:46,420 los cationes por ejemplo pues migran hacia el cátodo 716 00:50:46,420 --> 00:50:48,639 que lo decíamos antes que van hacia el polo negativo 717 00:50:48,639 --> 00:50:50,980 los aniones hacia el ánodo que es el polo positivo 718 00:50:50,980 --> 00:50:55,579 y los neutros pues ahí se dejan llevar un poco 719 00:50:55,579 --> 00:50:58,059 en función de lo que diga el campo eléctrico 720 00:50:58,059 --> 00:51:00,840 eso sería lo que depende de la movilidad electroforetica 721 00:51:00,840 --> 00:51:03,139 carga tamaño sobre todo 722 00:51:03,139 --> 00:51:07,480 y luego tenemos el flujo electroendosmótico 723 00:51:07,480 --> 00:51:10,739 en este caso se mueve el disolvente 724 00:51:10,739 --> 00:51:17,380 desde el molo positivo hasta el polo negativo, que va actuando como si fuera una bomba, como si fuera la fase móvil. 725 00:51:18,420 --> 00:51:23,360 Al poner la corriente eléctrica, pues el disolvente también se va a mover. 726 00:51:25,179 --> 00:51:34,320 Aquí lo que se consigue también es una doble capa eléctrica, que se va a producir entre el espacio que tenemos, 727 00:51:34,420 --> 00:51:38,699 la interfaz que tenemos, la sílice, acordaros que el capilar decíamos que estaba hecho de sílice, 728 00:51:38,699 --> 00:51:45,000 muchos y la disolución, entonces ahí pues esa parte tenemos que tenerla en cuenta para 729 00:51:45,000 --> 00:51:51,860 el flujo y luego el capilar también está cargado negativamente en su superficie y va 730 00:51:51,860 --> 00:51:58,039 a traer a todos los iones positivos del disolvente, entonces tenemos por un lado la parte de la 731 00:51:58,039 --> 00:52:01,579 movilidad de lo que serían las muestras, de la carga tamaño y luego hay que tener 732 00:52:01,579 --> 00:52:07,760 en cuenta la movilidad que tiene este flujo o este disolvente que tengamos nosotros, entonces 733 00:52:07,760 --> 00:52:12,059 Bueno, no es como un blanco que hay que restárselo, pero tenemos que tenerlo en cuenta que también se está moviendo. 734 00:52:13,019 --> 00:52:18,780 Ahora, una vez que ya lo tenemos todo separado, ¿qué vemos nosotros? ¿Cómo lo interpretamos? 735 00:52:19,139 --> 00:52:21,880 ¿No? Mejor dicho, ¿qué hacemos con los resultados? ¿Vale? 736 00:52:21,900 --> 00:52:24,840 ¿Qué es lo que a nosotros nos está llamando de ahí algo la atención? 737 00:52:25,800 --> 00:52:36,820 Pues este flujo electroosmótico que estamos diciendo del tapón normalmente es más grande o es más alto o es mayor que el flujo electroforetico. 738 00:52:36,820 --> 00:52:39,780 Entonces bueno, el que dependía de los analitos 739 00:52:39,780 --> 00:52:46,320 Entonces bueno, pues también eso lo que nos hace es que los aniones también se muevan hacia el cátodo 740 00:52:46,320 --> 00:52:50,460 Acordaros que hemos dicho que el disolvente se movía hacia el polo positivo 741 00:52:50,460 --> 00:52:53,380 Entonces los aniones que tenían que ir hacia el ánodo 742 00:52:53,380 --> 00:52:58,960 Hay parte del, al moverse el disolvente también está tirando de ellos hacia el cátodo 743 00:52:58,960 --> 00:53:01,260 Entonces van más lentos, por así decir 744 00:53:01,260 --> 00:53:08,260 Los cationes que sean pequeños o que estén cargados serían los primeros en salir 745 00:53:08,260 --> 00:53:16,719 ¿Vale? Los cationes que son, o sea, los pequeños y cargados, porque son cationes, pues serían los primeros en salir 746 00:53:16,719 --> 00:53:22,119 ¿Vale? Van antes que los que son más grandes, ¿vale? Con el que tienen menos carga 747 00:53:22,119 --> 00:53:26,699 Entonces primero los cationes pequeños, ¿vale? Cargados, con carga pequeña 748 00:53:26,699 --> 00:53:30,980 Después los cationes que son más grandes, ¿vale? O que tienen mayor tamaño 749 00:53:30,980 --> 00:53:33,820 después irían la especie neutra 750 00:53:33,820 --> 00:53:35,699 ¿vale? que bueno, las neutras 751 00:53:35,699 --> 00:53:38,059 si es verdad que van todas juntas 752 00:53:38,059 --> 00:53:39,800 ¿vale? sale como una banda así 753 00:53:39,800 --> 00:53:41,719 en el medio, luego irían 754 00:53:41,719 --> 00:53:43,260 los aniones que son 755 00:53:43,260 --> 00:53:45,619 grandes ¿vale? que tienen 756 00:53:45,619 --> 00:53:46,699 una carga baja 757 00:53:46,699 --> 00:53:49,539 y luego ya por último irían 758 00:53:49,539 --> 00:53:51,420 los aniones que son pequeños 759 00:53:51,420 --> 00:53:52,840 y que están muy cargados 760 00:53:52,840 --> 00:53:55,480 ¿vale? tendrían estos últimos los aniones que son 761 00:53:55,480 --> 00:53:57,380 pequeños y que tienen mucha carga negativa 762 00:53:57,380 --> 00:53:59,000 serían los últimos en salir 763 00:53:59,000 --> 00:54:00,920 entonces bueno, pues si tenemos una mezcla 764 00:54:00,920 --> 00:54:02,699 pues más o menos podríamos saber 765 00:54:02,699 --> 00:54:04,460 por dónde va cada uno 766 00:54:04,460 --> 00:54:08,130 vale, pues ese tema 767 00:54:08,130 --> 00:54:11,110 más o menos ya estaría 768 00:54:11,110 --> 00:54:12,909 lo que os he dicho 769 00:54:12,909 --> 00:54:15,030 que quería hacer un momento un ejercicio 770 00:54:15,030 --> 00:54:16,630 de lo de la normalización 771 00:54:16,630 --> 00:54:18,090 de las áreas 772 00:54:18,090 --> 00:54:20,050 por si había alguna duda 773 00:54:20,050 --> 00:54:22,989 o alguna cosa que podamos verlo 774 00:54:22,989 --> 00:54:25,030 porque a lo mejor yo sola en el vídeo 775 00:54:25,030 --> 00:54:27,389 pues claro, voy hablando yo sola 776 00:54:27,389 --> 00:54:29,389 y no tenéis dudas, no podéis decir nada 777 00:54:29,389 --> 00:54:30,550 aunque no hayáis dicho nada 778 00:54:30,550 --> 00:54:32,449 en los foros, pero 779 00:54:32,449 --> 00:54:34,809 pero bueno, vamos a verlo 780 00:54:34,809 --> 00:54:36,449 entonces bueno, está el 781 00:54:36,449 --> 00:54:38,869 ejercicio que está ahí medio resuelto 782 00:54:38,869 --> 00:54:40,210 y como os digo en el vídeo 783 00:54:40,210 --> 00:54:42,849 que formas de hacerlo, hay varias 784 00:54:42,849 --> 00:54:44,730 al final nosotros 785 00:54:44,730 --> 00:54:46,750 tenemos que seguir un orden 786 00:54:46,750 --> 00:54:48,030 que nosotros entendamos 787 00:54:48,030 --> 00:54:50,989 y yo en el vídeo lo he explicado de una forma diferente 788 00:54:50,989 --> 00:54:53,090 pero porque como si dijéramos 789 00:54:53,090 --> 00:54:55,150 que he ido desglosando 790 00:54:55,150 --> 00:54:57,469 la fórmula que viene en los apuntes 791 00:54:57,469 --> 00:54:59,010 le he ido haciendo paso por paso 792 00:54:59,010 --> 00:55:00,829 en vez de hacerla toda junta 793 00:55:00,829 --> 00:55:14,269 A mí me gusta más paso por paso, más que nada para no liarlo muchas veces de quién iba en el enumerador, quién en el denominador, ahora van cruzados los estos, ahora el espejo de aquí, entonces ir viendo paso por paso qué es lo que quiero hacer yo. 794 00:55:15,130 --> 00:55:24,289 Antes os decía, voy a hacer un ejemplo si queréis y luego ya si tenéis otras dudas me vais diciendo, pero bueno, está por ver algún ejercicio más. 795 00:55:24,949 --> 00:55:30,329 Para hacer la normalización de las áreas, como os comentaba, se suele hacer sobre todo en la parte de cromatografía. 796 00:55:30,789 --> 00:55:39,010 En las técnicas electroquímicas o en las técnicas ópticas no se suele hacer porque la señal que tenemos y los resultados que obtenemos son diferentes. 797 00:55:39,590 --> 00:55:45,309 En cromatografía, al final, en el cromatograma, nosotros vamos a tener un pico por cada uno de los componentes que tengamos. 798 00:55:45,889 --> 00:55:48,909 Y de ese pico mediamos las áreas. 799 00:55:48,909 --> 00:55:53,909 Entonces vamos a trabajar con las áreas de los picos del cromatograma. 800 00:55:54,289 --> 00:56:03,710 Bien, para trabajar con la normalización del área lo primero es que vamos a suponer que el área va a ser proporcional a la concentración. 801 00:56:04,769 --> 00:56:18,030 Aquí en los que habéis hecho HPLC lo hemos visto, que cuando nosotros buscábamos el pico, buscábamos el área, cuando en los patrones, por ejemplo, el primer patrón era menos concentrado, pues el pico era más pequeño. 802 00:56:18,030 --> 00:56:33,409 La señal o la absorción que teníamos era más pequeña también, sí, pero como luego al final nuestra señal o lo que nos interesa o la relación que hacemos nosotros es relación área-concentración, nosotros cuando hacemos la recta de calibrado no ponemos la absorción. 803 00:56:33,409 --> 00:56:48,590 Igual que en las técnicas ópticas si poníamos la absorbancia frente a la concentración, en las técnicas cromatográficas nuestra señal va a ser el área y nosotros establecemos un área frente a una concentración para poder hacer la recta de calibrado. 804 00:56:48,590 --> 00:56:56,869 Hacemos Y es igual a más BX en una recta normal y en la Y es el área, en las técnicas cromatográficas. 805 00:56:57,389 --> 00:57:12,409 En las técnicas ópticas, en vez de ser el área, nosotros poníamos la absorbancia frente a la concentración para poder hacer la absorbancia o la transmitancia. 806 00:57:12,409 --> 00:57:29,690 Pero bueno, la absorbancia normalmente porque es relación lineal, ¿vale? La transmitancia, acordaros que tiene una relación logarítmica. Entonces en las ópticas utilizamos la absorbancia, en las técnicas cromatográficas se suele utilizar el área con el que vamos a trabajar nosotros. 807 00:57:29,690 --> 00:57:35,769 Y aquí es donde suponemos la relación que hay, que hay una relación de proporcionalidad entre la concentración y el área que medimos. 808 00:57:37,590 --> 00:57:43,349 Proporcional es sí, pero tampoco al 100%. Por eso en las rectas no sale siempre una R de 1. 809 00:57:44,550 --> 00:57:53,110 No es del todo real. Por eso lo digo que al hacer esta suposición de la normalización de las áreas y cualquier recta de calibrado, 810 00:57:53,110 --> 00:57:57,730 al final siempre va a ser una aproximación de acuerdo al que la recta de calibrado bueno pues 811 00:57:57,730 --> 00:58:03,769 coge la recta que más se asemeja a los puntos que tenemos nosotros que mejor nos conviene pero 812 00:58:03,769 --> 00:58:12,070 rectas de uno tampoco salen todas pero bueno en la normalización en parte de las áreas eso suponemos 813 00:58:12,070 --> 00:58:19,329 que la concentración es totalmente proporcional y por eso es aproximado y no es exacto del todo 814 00:58:19,329 --> 00:58:26,469 también pues va a depender de las respuestas que tengamos en el detector no todos los los 815 00:58:26,469 --> 00:58:33,849 analitos van a responder de la misma manera lo que sí necesitamos como requisito de para hacer 816 00:58:33,849 --> 00:58:39,550 la normalización de las áreas es que todos los componentes que tengamos nosotros en la muestra 817 00:58:39,550 --> 00:58:46,389 tienen que eluir necesitamos echar a todos si nosotros en la de la cafeína que hicimos aquí 818 00:58:46,389 --> 00:58:52,730 por HPLC, pues mirábamos solamente la concentración de cafeína, nosotros mirábamos esa área 819 00:58:52,730 --> 00:58:58,309 y lo establecíamos la relación con la concentración y no esperábamos a que hubiera más cosas. 820 00:58:59,170 --> 00:59:04,369 Hacíamos una relación entre esa área y esa concentración. En la normalización de 821 00:59:04,369 --> 00:59:09,530 las áreas necesitamos que todos los componentes que haya eluyan, porque vamos a hacer, dentro 822 00:59:09,530 --> 00:59:13,909 de que es una técnica relativa la normalización de las áreas o la cromatografía, pues esta 823 00:59:13,909 --> 00:59:20,130 es todavía más relativo, es decir, vamos a hacer referencia a otros patrones. Además 824 00:59:20,130 --> 00:59:23,670 de que todos eluyan, también tienen que ser todos detectados, porque si no, no hay señales, 825 00:59:23,670 --> 00:59:29,610 es como si no hubieran eluido. Y que es la parte, y eso a lo mejor podemos decir que 826 00:59:29,610 --> 00:59:37,250 es obvio, pero luego la parte que cae más o que hay más peligro es que todos tienen 827 00:59:37,250 --> 00:59:43,469 que tener la misma sensibilidad. Y aquí es donde ya más se mete la pata, porque el detector 828 00:59:43,469 --> 00:59:48,030 no responde de la misma manera a todos, incluso siendo la misma no va a responder de la misma 829 00:59:48,030 --> 00:59:55,010 forma. Entonces bueno, por eso también son mejores otras calibraciones, pero quiero que 830 00:59:55,010 --> 01:00:00,389 conozcáis esta por si alguna vez os toca, que no os quedéis extrañados y que no la 831 01:00:00,389 --> 01:00:06,349 hayáis hecho nunca. En la parte de aquí es una técnica simple, la normalización va 832 01:00:06,349 --> 01:00:11,409 a ser una técnica simple y bueno, si vamos a obtener la concentración en porcentaje, 833 01:00:11,409 --> 01:00:18,409 No vamos a trabajar en gramo, litro, ni molaridad, ni nada, sino que vamos a tener una concentración en porcentaje. 834 01:00:19,469 --> 01:00:22,210 Entonces vamos a hacer un ejemplo. 835 01:00:23,630 --> 01:00:33,110 Si nosotros tenemos una mezcla y hacemos una cromatografía, me da igual que sea de gases, que sea de líquido, que sea de lo que sea, 836 01:00:33,590 --> 01:00:39,630 y vamos a suponer que hay tres componentes y los tres tienen que eluir. 837 01:00:39,630 --> 01:00:57,710 Vamos a trabajar solamente con una inyección, es un patrón que tengamos, patrón conocido, y vamos a hacer una inyección, es decir, en el mismo vial tenemos la mezcla de metanol, etanol y propanol, que son las tres cosas que vamos a separar. 838 01:00:57,710 --> 01:01:13,800 Si nosotros los separamos, pues tendríamos, este sería uno, este sería el otro y bueno, estoy haciendo picos así, anchos, bandas en vez de picos, pero bueno, y aquí tendríamos el otro. 839 01:01:13,800 --> 01:01:16,920 tiempos de retención 840 01:01:16,920 --> 01:01:18,739 no nos sirven, nosotros acordaros 841 01:01:18,739 --> 01:01:21,019 que nos fijamos en el área, el tiempo me da igual 842 01:01:21,019 --> 01:01:23,059 pero bueno, por detectarlos 843 01:01:23,059 --> 01:01:24,880 por comparar con otros patrones 844 01:01:24,880 --> 01:01:26,679 o por otra cosa que sea, pues si 845 01:01:26,679 --> 01:01:28,980 podríamos hacerlo, este sería de 846 01:01:28,980 --> 01:01:30,760 no sé, 1.34 847 01:01:30,760 --> 01:01:33,059 aquí más o menos 848 01:01:33,059 --> 01:01:34,199 2.84 849 01:01:34,199 --> 01:01:36,699 y aquí 850 01:01:36,699 --> 01:01:38,880 3.53 851 01:01:38,880 --> 01:01:41,019 vale 852 01:01:41,019 --> 01:01:42,099 el tiempo en minutos 853 01:01:42,099 --> 01:01:45,519 y luego nosotros vamos a medir las áreas 854 01:01:45,519 --> 01:01:47,280 que es la parte que nos interesa 855 01:01:47,280 --> 01:01:50,179 este área de aquí que es negra 856 01:01:50,179 --> 01:01:53,059 esta sería la del metanol 857 01:01:53,059 --> 01:01:55,460 entonces el área del metanol 858 01:01:55,460 --> 01:01:57,639 pues vamos a suponer que ha medido 859 01:01:57,639 --> 01:02:01,400 531 en las unidades que sea 860 01:02:01,400 --> 01:02:05,500 que ya sabéis que salen cosas muy grandes aquí en las áreas 861 01:02:05,500 --> 01:02:08,000 entonces en función de las unidades que tengamos 862 01:02:08,000 --> 01:02:10,860 el siguiente en salir 863 01:02:10,860 --> 01:02:27,590 tendría un área, el etanol, de 424 y por último sale el propanol, habíamos dicho, que sería de 201. 864 01:02:29,920 --> 01:02:35,800 Como hemos dicho que nuestra suposición es que el área es proporcional a la concentración, 865 01:02:36,340 --> 01:02:40,940 pues si nosotros sabemos qué relación de proporcionalidad hay entre uno y otro, 866 01:02:40,940 --> 01:02:44,940 pues podremos saber la concentración en la que están cada uno de ellos. 867 01:02:45,380 --> 01:02:48,460 ¿Qué vamos a hacer? Pues vamos a sumar todas las áreas. 868 01:02:49,360 --> 01:02:56,940 Nosotros hacemos la suma de todo y tendríamos que la suma de las áreas es de... 869 01:02:56,940 --> 01:03:07,559 Si hacemos 531 más 424 más 201, pues la suma de las áreas es 1156. 870 01:03:10,239 --> 01:03:11,340 Ese es el área total. 871 01:03:11,340 --> 01:03:25,340 Y ahora para ver cuál es cada uno, pues haríamos, ¿qué porcentaje tiene? Sería como el factor gravimétrico, como cuánto hay de metanol en el área total, ¿vale? Sería, os digo que es sencillo. 872 01:03:25,340 --> 01:03:44,179 Para el metanol, por ejemplo, para ver el porcentaje de metanol que hay en la muestra, ¿qué haríamos? Pues el área del metanol entre el área total y multiplicamos por 100 para expresarlo en porcentaje. 873 01:03:44,179 --> 01:03:50,639 Y esto nos da un 45,93%. 874 01:03:50,639 --> 01:04:02,340 Ya sabemos que el metanol va a estar en un 45,93% y esa es la cantidad de metanol que hay respecto a los anteriores. 875 01:04:03,239 --> 01:04:10,239 El etanol, lo pongo por aquí debajo para que se vea, que si no luego con la banda esta no se ve. 876 01:04:10,239 --> 01:04:26,820 El etanol pues lo mismo, su área 424 entre el área total que es 1156 y multiplicado por 100 pues nos va a dar 36,68. 877 01:04:26,820 --> 01:04:29,519 y el otro que teníamos 878 01:04:29,519 --> 01:04:30,400 el propanol 879 01:04:30,400 --> 01:04:37,159 201 que era el área 880 01:04:37,159 --> 01:04:39,380 entre 1156 881 01:04:39,380 --> 01:04:41,340 por 100 882 01:04:41,340 --> 01:04:42,900 y sale 883 01:04:42,900 --> 01:04:46,679 de 17,39 884 01:04:46,679 --> 01:04:52,889 y ya tenemos los porcentajes 885 01:04:52,889 --> 01:04:54,289 en lo que está cada uno 886 01:04:54,289 --> 01:04:56,849 yo he ido directamente a una muestra 887 01:04:56,849 --> 01:04:58,130 que sea desconocida 888 01:04:58,130 --> 01:05:00,269 que no sabíamos nada de ellos 889 01:05:00,269 --> 01:05:02,469 que pasa que si nosotros hacemos 890 01:05:02,469 --> 01:05:10,510 con patrones que tengan una concentración conocida, vemos que esto no es tan real, que 891 01:05:10,510 --> 01:05:16,030 se desplaza un poquito. Que a lo mejor si nosotros hubiéramos puesto un patrón con 892 01:05:16,030 --> 01:05:23,090 una concentración de un 40% de etanol, pues nos hubiera salido un 36,68. Es decir, no 893 01:05:23,090 --> 01:05:31,269 se ajusta 100% a la realidad. Por eso digo que no es una técnica que sea muy exacta 894 01:05:31,269 --> 01:05:44,949 Y que sea muy precisa. Para evitar esta desfase que hay de los resultados que tenemos, se ha hecho una corrección de este método. 895 01:05:45,329 --> 01:05:55,250 Se utiliza una normalización de las áreas con un factor de respuesta, que sería parecido al que hemos utilizado otras veces en el tema 1. 896 01:05:56,070 --> 01:06:01,070 Cuando hacemos el factor de respuesta, en vez de hacer una sola inyección como ahora, 897 01:06:01,409 --> 01:06:06,030 que vamos con ciegas, lo que hacemos son dos inyecciones. 898 01:06:06,610 --> 01:06:10,289 En una vamos a poner un patrón que tenga la mezcla de las tres cosas, 899 01:06:10,409 --> 01:06:15,550 del metanol, del etanol y del propanol, creo que los tres que he dicho. 900 01:06:15,550 --> 01:06:18,710 Y luego una muestra desconocida que no sabemos que tiene, 901 01:06:19,070 --> 01:06:21,949 que en este caso nuestra muestra desconocida sería esta. 902 01:06:21,949 --> 01:06:35,599 Vamos a seguir midiendo la concentración en porcentaje, pero es verdad que esta parte tendría menos requisitos que la que no tiene factor de respuesta. 903 01:06:36,639 --> 01:06:41,880 Menos requisitos por parte del detector que he dicho. 904 01:06:42,619 --> 01:06:51,199 Seguimos teniendo el fallo de que no es exactamente directamente proporcional por la diferente respuesta que tenemos del detector de cada analito. 905 01:06:51,199 --> 01:06:56,039 pero bueno, tenemos mejores resultados que el anterior 906 01:06:56,039 --> 01:06:59,340 y bueno, si es más preciso o más exacto que el anterior 907 01:06:59,340 --> 01:07:01,360 pero también es un poco más difícil 908 01:07:01,360 --> 01:07:04,039 bueno, más difícil, que es más elaborado el procedimiento 909 01:07:04,039 --> 01:07:06,280 porque aquí ya habéis visto que sumamos y dividimos 910 01:07:06,280 --> 01:07:07,739 y no tiene mayor dificultad 911 01:07:07,739 --> 01:07:10,079 aquí vamos a calcular varias cosas 912 01:07:10,079 --> 01:07:12,940 vamos a calcular un factor de respuesta absoluto 913 01:07:12,940 --> 01:07:15,139 es decir, un factor de respuesta independiente 914 01:07:15,139 --> 01:07:16,920 para cada uno de los analitos 915 01:07:16,920 --> 01:07:18,880 y un factor de respuesta relativo 916 01:07:18,880 --> 01:07:28,679 Es decir, un factor de respuesta comparable entre los diferentes analitos o que haga referencia al resto de los analitos que nosotros tenemos en la mezcla. 917 01:07:29,119 --> 01:07:33,900 Y con esos dos factores de respuesta vamos a hacer un área corregida. 918 01:07:34,820 --> 01:07:41,219 Entonces, vamos a suponer que tenemos una muestra que tiene cuatro componentes. 919 01:07:41,219 --> 01:07:46,639 pues en vez de, para no poner nombres de metanol, propanol, todo eso, A, B, C y D, ¿vale? 920 01:07:47,059 --> 01:07:56,440 Y están todos en la misma proporción, es decir, pues si tenemos 4 y todos están iguales, pues 25% cada uno, ¿vale? 921 01:07:56,440 --> 01:08:14,199 Entonces tenemos el componente A, B, C y vamos a ver las diferentes cosas que vamos a calcular de cada uno. 922 01:08:17,159 --> 01:08:22,720 Lo primero que tendríamos que tener en cuenta serían las áreas que vamos a medir. 923 01:08:22,720 --> 01:08:31,439 Como es nuestra señal, lo que nosotros utilizamos como referencia, pues tenemos que medir el área de cada uno de ellos. 924 01:08:31,439 --> 01:08:36,380 Tendríamos aquí el área del patrón. 925 01:08:40,300 --> 01:09:02,329 Nosotros medimos experimentalmente y, por ejemplo, esta sería 32,6, esta 42,8, estas son 73,8 y 84,9. 926 01:09:03,949 --> 01:09:06,369 Esas son las áreas que nosotros hemos medido. 927 01:09:08,710 --> 01:09:18,890 Primero, lo que vamos a hacer es calcular el factor absoluto o el factor de respuesta de cada uno de ellos, teniendo en cuenta la desproporción que hay. 928 01:09:19,909 --> 01:09:23,489 Entonces, factor absoluto. 929 01:09:24,689 --> 01:09:32,369 Para calcular el factor absoluto, lo que vamos a hacer es ver la relación entre la concentración y el área. 930 01:09:32,369 --> 01:09:41,210 Es decir, el factor absoluto, sea del que sea, el factor de respuesta absoluto sería la concentración entre el área. 931 01:09:42,170 --> 01:09:46,630 Concentración, sabemos que de todos es el 25% y el área va variando. 932 01:09:47,649 --> 01:09:59,869 Entonces, del primero, que era el A, su factor de respuesta sería la concentración, que hemos dicho que era 25%, entre el área, que era 32,6. 933 01:09:59,869 --> 01:10:08,810 Y sale un factor de respuesta de 0,76687. 934 01:10:10,869 --> 01:10:12,329 Hacemos lo mismo con todos. 935 01:10:12,729 --> 01:10:24,149 Pues el factor de respuesta de B sería el área, o sea, la concentración, perdón, que es 25, entre su área, que es 42,8. 936 01:10:24,149 --> 01:10:37,369 Y nos sale un factor de respuesta de 0,5841, bueno tiene más decimales pero pues no escribir más. 937 01:10:39,069 --> 01:10:49,430 El factor de respuesta de C, pues 25 entre el área y el área de C era 73,8. 938 01:10:49,430 --> 01:11:00,710 Y nos sale un factor de respuesta de 0,33875. 939 01:11:01,390 --> 01:11:03,050 Y hacemos lo mismo con D. 940 01:11:06,220 --> 01:11:09,939 Y 25 entre 84,9. 941 01:11:12,729 --> 01:11:22,369 Y tenemos un factor de respuesta de 0,29446. 942 01:11:23,649 --> 01:11:28,289 Los voy a poner aquí para tenerlo organizado. 943 01:11:31,069 --> 01:11:51,840 Una vez que ya tenemos los factores de respuesta absolutos, vamos a hacer la parte relativa. 944 01:11:52,359 --> 01:12:01,340 Vamos a intentar comparar entre ellos por si ha habido algún error, alguna fluctuación, alguna respuesta al detector que no era la adecuada. 945 01:12:01,859 --> 01:12:04,920 Pues intentar hacer una especie de corrección. 946 01:12:04,920 --> 01:12:13,500 Para eso elegimos A1, el que sea, el que queráis, el factor del que sea, de A, de C, de D, del que queráis 947 01:12:13,500 --> 01:12:24,520 Yo voy a elegir el de D, porque es el más pequeño y así ahora cuando tenga que operar me salen todos superiores a la unidad 948 01:12:24,520 --> 01:12:30,199 Entonces, como es el más pequeño, elijo ese, pero no hay ningún problema en elegir cualquiera de los otros 949 01:12:30,199 --> 01:12:34,579 Y ahora vamos a calcular el factor de respuesta relativo 950 01:12:34,579 --> 01:12:48,779 Vamos a hacer un factor de respuesta más específico. El factor de respuesta relativo sería el factor de respuesta de la muestra entre el factor de respuesta de referencia. 951 01:12:48,779 --> 01:12:52,560 Entonces vamos a operar como teníamos antes. 952 01:12:53,680 --> 01:13:09,840 Para A teníamos un factor de respuesta, el suyo, que era de 0, 7, 6, 6, 8, 7, que es el que estoy utilizando esta columna de aquí, ¿vale? 953 01:13:09,920 --> 01:13:11,939 O esta página de aquí. 954 01:13:12,960 --> 01:13:17,699 Y lo vamos a dividir entre el más pequeño, que habíamos dicho que era el de D. 955 01:13:17,699 --> 01:13:31,439 Pues 0,29446 y nos sale el factor de respuesta relativo de A, que sale 2,6043. 956 01:13:31,439 --> 01:13:44,779 Hacemos el de B y es 0,58411 entre 0,29446 957 01:13:44,779 --> 01:13:51,100 Y sale un factor de respuesta relativo de 1,9836 958 01:13:51,100 --> 01:14:12,819 C, 0,33875, que era el factor de respuesta suyo absoluto, entre 0,29446 y nos sale 1,1504. 959 01:14:12,819 --> 01:14:25,779 Y el de D, que es 0,29446 entre 0,29446, que es el de referencia, y sale 1. 960 01:14:26,340 --> 01:14:28,939 Ya tenemos los factores de referencia relativos. 961 01:14:29,100 --> 01:14:36,760 Por si ha habido alguna fluctuación o alguna respuesta desparejada o que ha habido algún error de respuesta, 962 01:14:37,359 --> 01:14:41,319 pues es la forma de suprimirla, por así decirlo. 963 01:14:41,319 --> 01:14:53,560 Y esto lo estamos trabajando solamente con la primera inyección. Voy a ponerlo aquí. Aquí tendríamos el factor relativo. 964 01:14:53,560 --> 01:15:07,449 y ahora lo siguiente sería trabajar con la segunda inyección 965 01:15:07,449 --> 01:15:09,390 ponemos la segunda inyección 966 01:15:09,390 --> 01:15:11,710 y como es una muestra desconocida 967 01:15:11,710 --> 01:15:14,069 no sabemos en qué concentración está cada uno 968 01:15:14,069 --> 01:15:18,550 lo que sí nos da opción es a ver las áreas 969 01:15:18,550 --> 01:15:20,750 que tenemos de cada uno de ellos 970 01:15:20,750 --> 01:15:23,890 entonces aquí tenemos el área de la muestra 971 01:15:23,890 --> 01:15:28,470 que también se obtiene experimentalmente 972 01:15:28,470 --> 01:15:30,250 como área de la muestra 973 01:15:30,250 --> 01:15:40,310 Pues 35, 22, 44 y 53 974 01:15:40,310 --> 01:15:49,789 Y ahora vamos a aplicar esa frutación que hemos eliminado con los factores de repuesta 975 01:15:49,789 --> 01:15:53,890 Vamos a aplicárselo a la muestra, es decir, vamos a hacer una muestra corregida 976 01:15:53,890 --> 01:16:07,409 Para calcular el área corregida, tenemos que hacer el área de la muestra, la que hayamos puesto nosotros, por el factor de respuesta relativo. 977 01:16:09,670 --> 01:16:13,289 No es de referencia, el factor de respuesta relativo. 978 01:16:13,850 --> 01:16:15,470 Vamos a corregir las áreas. 979 01:16:15,869 --> 01:16:17,850 Empezamos otra vez con A. 980 01:16:17,850 --> 01:16:27,710 A hemos dicho que es el área de 35 por su factor de respuesta que es 260.43 y el área 981 01:16:27,710 --> 01:16:46,640 corregida sale 91,1505. Para B utilizamos el área que era 22 por el factor de respuesta 982 01:16:46,640 --> 01:17:02,500 y el factor de respuesta era 1,9836 y tenemos su área corregida que va a ser 43,6392. 983 01:17:02,500 --> 01:17:24,180 Para C tenemos el área que era 44 por 1,1504 y tenemos su área corregida que es 50,6176. 984 01:17:24,180 --> 01:17:35,579 Y por último D, que es el área que era 53, por el factor de respuesta suyo que era 1. 985 01:17:36,220 --> 01:17:38,539 Entonces tenemos un área de 53. 986 01:17:41,819 --> 01:17:46,579 Me vuelvo aquí y ponemos el área corregida. 987 01:17:46,579 --> 01:18:08,529 Y ahora ya actuaríamos como una normalización de áreas como la que hemos visto antes 988 01:18:08,529 --> 01:18:13,109 Tenemos que sumar todas las áreas y luego ya hacer la proporcionalidad 989 01:18:13,109 --> 01:18:41,609 Si yo sumo todas las áreas, es decir, 91,1505 más 43,6392 más 50,6176 más 53, pues si yo lo sumo me sale 238,4073. 990 01:18:41,609 --> 01:18:49,189 Y ahora para calcular las concentraciones de cada uno de ellos, pues divido su área entre el sumatorio de áreas. 991 01:18:49,829 --> 01:18:58,529 Entonces, para A, para calcular la proporción, pues teníamos su área corregida, ¿vale? 992 01:18:58,529 --> 01:19:10,939 Aquí estoy para calcular la porcentaje, sería el área corregida entre el sumatorio de áreas corregidas. 993 01:19:10,939 --> 01:19:33,399 Entonces A sería 91,1505 entre el sumatorio que era 238,4073 por 100 y me da un porcentaje de A de 38,23%. 994 01:19:33,399 --> 01:19:58,270 Para B, pues tenemos 43,6392 entre 238,4073% y tenemos un área de 18,30%. 995 01:19:58,270 --> 01:20:19,590 Para C era 50,6176 entre 238,4073 multiplicado por 100 para que dé el porcentaje. 996 01:20:19,590 --> 01:20:46,899 Tenemos 21,23% y para D, 53 entre 238,4073 multiplicado por 100 y da un porcentaje de 22,23%. 997 01:20:46,899 --> 01:20:49,979 Y esas serían las proporciones en las que aparece cada uno. 998 01:20:49,979 --> 01:20:52,680 y ahora aquí la concentración de la muestra 999 01:20:52,680 --> 01:21:12,359 y ya está 1000 01:21:12,359 --> 01:21:15,779 ya el ejercicio se acabaría aquí 1001 01:21:15,779 --> 01:21:17,600 pero aquí sería eso 1002 01:21:17,600 --> 01:21:19,779 que normalmente se aplica el factor de respuesta 1003 01:21:19,779 --> 01:21:21,039 porque 1004 01:21:21,039 --> 01:21:23,800 si hay variabilidad en las respuestas del detector 1005 01:21:23,800 --> 01:21:24,979 entonces para 1006 01:21:24,979 --> 01:21:26,720 suprimir esa 1007 01:21:26,720 --> 01:21:29,460 lo que se hace es calcular el factor de respuesta relativo 1008 01:21:29,460 --> 01:21:31,039 y así vamos quitando 1009 01:21:31,039 --> 01:21:34,390 y ya 1010 01:21:34,390 --> 01:21:37,310 voy a dejar de compartir