1
00:00:00,000 --> 00:00:07,280
secuenciar el ADN. Bueno, pues secuenciar lo que significa es que vamos a saber cada uno de los nucleótidos

2
00:00:07,280 --> 00:00:15,279
que están formando esa cadena de ADN. Vamos a conocer los nucleótidos y el orden en el que están esos nucleótidos.

3
00:00:16,320 --> 00:00:22,699
Vamos a saber si tenemos adenina, timina, timina, adenina, guanina, guanina, citosina, citosina.

4
00:00:23,140 --> 00:00:27,879
Vamos a saber esa secuencia de toda la cadena de ADN.

5
00:00:27,879 --> 00:00:38,340
Bueno, pues esta secuencia de ADN constituye la información genética heredable de un organismo.

6
00:00:39,079 --> 00:00:47,679
Entonces, para determinar la secuencia de ADN es útil en el estudio de la investigación básica de los procesos biológicos fundamentales.

7
00:00:47,679 --> 00:01:01,060
Y las técnicas actuales han aumentado a gran velocidad esta secuenciación, esta detección de la secuencia de ADN.

8
00:01:01,380 --> 00:01:14,439
Y esta técnica también ha sido muy importante para conocer el genoma humano, lo que es el proyecto del genoma humano.

9
00:01:14,439 --> 00:01:23,840
El genoma humano tiene como unas 3.000 millones de bases, pues se conoce todo lo que constituye el genoma humano, todas esas bases.

10
00:01:29,799 --> 00:01:39,099
La técnica más importante en secuenciación se denomina la secuenciación Sanger.

11
00:01:41,599 --> 00:01:44,159
¿En qué consiste esta secuenciación Sanger?

12
00:01:44,159 --> 00:02:05,359
El principio fundamental de esta secuenciación Sanger es que vamos a utilizar unos nucleótidos trifosfato, o sea, la adenina, la timina, la citosina con el grupo fosfato, pero esos nucleótidos tienen una característica particular.

13
00:02:05,359 --> 00:02:12,819
Esos nucleótidos los vamos a llamar, se llaman didesoxinucleótidos

14
00:02:12,819 --> 00:02:22,210
Pues esa característica que tienen estos didesoxinucleótidos es la siguiente

15
00:02:22,210 --> 00:02:27,530
Y es que nosotros en un nucleótido, el nucleótido normal

16
00:02:27,530 --> 00:02:31,389
Lo que teníamos, si os acordáis, teníamos el grupo fosfato

17
00:02:31,389 --> 00:02:37,129
Teníamos el azúcar y teníamos la base nitrogenada

18
00:02:37,129 --> 00:02:41,789
Eso en el nucleótido, un ADN normal

19
00:02:41,789 --> 00:02:45,909
Y luego en el azúcar acordaros que teníamos un grupo OH

20
00:02:45,909 --> 00:02:51,870
Y aquí en este carbono de aquí solamente aquí tenemos un hidrógeno

21
00:02:51,870 --> 00:02:55,830
Recordad que en el ARN aquí el azúcar es lo que cambia

22
00:02:55,830 --> 00:03:00,009
En el ARN teníamos aquí un OH y aquí también otro OH

23
00:03:00,009 --> 00:03:04,229
Y luego esta de aquí serían eso, las bases nitrogenadas

24
00:03:04,229 --> 00:03:14,610
En el ADN teníamos adenina, timina, citosina y guanina. Y luego esto de aquí es el grupo fosfato, que es igual en todos los nucleótidos.

25
00:03:14,610 --> 00:03:33,349
Vale, pues en esta técnica, bueno, perdonad, antes de eso, lo que sabemos es que los nucleótidos se unen unos a otros formando toda la cadena de ADN y se unen a través de este carbono de aquí,

26
00:03:33,349 --> 00:03:47,789
o sea, a través de este OH de aquí, que está en el carbono 3, este OH de aquí, y luego el siguiente nucleótido se une por este carbono de aquí, que es el 5.

27
00:03:47,789 --> 00:04:04,770
Entonces, el OH que tiene aquí este azúcar se une al grupo fosfato del siguiente nucleótido. Aquí otra vez, el OH del carbono 3 se une al siguiente nucleótido y por el grupo fosfato.

28
00:04:04,770 --> 00:04:15,430
Recordad que estos eran enlaces fosfodiéster, se llaman fosfodiéster porque tenemos aquí el fósforo y tenemos aquí dos ésteres

29
00:04:15,430 --> 00:04:24,889
Recordad también que las bases nitrogenadas estaban unidas unas a otras pero estos eran por puentes de hidrógeno

30
00:04:24,889 --> 00:04:27,649
Unidas a otras con la otra cadena

31
00:04:27,649 --> 00:04:41,589
Pero bueno, aquí lo importante que tenemos que ver aquí es que los nucleótidos tenemos el grupo fosfato, el azúcar con un OH y la base nitrogenada.

32
00:04:41,769 --> 00:04:53,250
Bueno, pues en esta técnica de aquí lo que vamos a hacer es añadir didesoxinucleótidos y los didesoxinucleótidos serían estos de aquí.

33
00:04:53,250 --> 00:05:01,470
Estos tidesoxinucleótidos no tienen OH aquí, ¿veis? Aquí tienen un H y aquí otro

34
00:05:01,470 --> 00:05:06,209
No tienen grupo hidróxilo, no tienen OH aquí en el azúcar

35
00:05:06,209 --> 00:05:16,610
Por lo tanto, si este nucleótido se une, o sea, si tenemos este nucleótido

36
00:05:16,610 --> 00:05:20,810
No va a poderse unir aquí ningún otro nucleótido

37
00:05:20,810 --> 00:05:33,930
Porque aquí no tenemos grupo OH, aquí no se puede unir este grupo fosfato, porque aquí no tenemos OH, entonces aquí no va a poder continuar la cadena.

38
00:05:33,930 --> 00:06:02,410
Bueno, pues lo que se hace entonces en esta técnica, se hacen una serie de mezclas y los componentes de esta mezcla serían el ADN que queremos codificar, que queremos analizar en forma monocatenaria, o sea, una de las cadenas.

39
00:06:02,410 --> 00:06:22,449
Vamos a necesitar también una ADN polimerasa, la ADN polimerasa que va a ir copiando este ADN. Vamos a necesitar también un cebador, recordad los cebadores son necesarios para que la ADN polimerasa pueda empezar a copiar la cadena.

40
00:06:22,449 --> 00:06:39,089
Pues además vamos a necesitar los cuatro nucleótidos. Estos cuatro nucleótidos son los desoxinucleótidos trifosfáticos. Desoxiadenintrifosfato, desoxicitosintrifosfato.

41
00:06:39,089 --> 00:06:57,170
Esto simplemente es el nucleótido, este de aquí, este nucleótido, pues si esta base de nitrógeno es adenina, pues este es el nucleótido desoxinucleótido, desoxiadenin trifosfato.

42
00:06:57,170 --> 00:07:24,750
Se dice trifosfato porque aquí habría tres grupos fosfato, pero bueno, lo que necesitamos sería eso, el ADN que queremos analizar, la ADN polimerasa, un cebador, los cuatro nucleotidos, porque claro, la ADN polimerasa va a ir copiando la cadena y pues va a tener que ir añadiendo, pues donde haya adenina, pues la ADN polimerasa pone timina, pues coge una timina.

43
00:07:24,750 --> 00:07:44,610
Que hay una guanina, pues coge un nucleótido que tenga citosina y así va copiando. Pero, además, lo que os decía, vamos a añadir también nucleótidos didesoxinucleótidos, o sea, didesoxinadenitrifosfato, didesoxicitosintrifosfato.

44
00:07:44,610 --> 00:07:50,110
Estos didesoxi no tienen aquí grupo OH

45
00:07:50,110 --> 00:08:00,680
Pues entonces lo que se hace es preparar cuatro disoluciones diferentes

46
00:08:00,680 --> 00:08:05,939
En las cuatro tenemos estos componentes

47
00:08:05,939 --> 00:08:11,560
El ADN, el ADN polimerasa, el cebador y los cuatro nucleótidos

48
00:08:11,560 --> 00:08:17,579
Estos son los componentes comunes en los cuatro tubos de ensayo.

49
00:08:18,279 --> 00:08:20,399
Estos son los cuatro componentes comunes.

50
00:08:21,139 --> 00:08:29,560
Pero luego lo que hacemos es, en uno de ellos añadimos el didesoxiadenin trifosfato.

51
00:08:30,420 --> 00:08:38,100
Por ejemplo, aquí añadimos un nucleótido que como base nitrogenada tiene adenina y que además aquí no tiene grupos OH.

52
00:08:38,100 --> 00:09:02,480
En el siguiente tubo añadimos también el ADN, a descodificar la ADN polimerasa, el cebador, los cuatro nucleótidos y añadimos un D-desoxicitosina, en este caso tenemos la citosina, la citosina sin grupo OH aquí.

53
00:09:02,480 --> 00:09:24,580
En el tercero, pues los mismos, todos estos componentes, pero en este caso la guanina. Aquí como base nitrogenada la guanina y aquí sin OH. Y en el último, pues todos estos componentes más la D-desoxi, esta sería la timina.

54
00:09:24,580 --> 00:09:36,460
Vale, entonces aquí adenina, timina, perdón, citosina, guanina y timina, pero este de aquí, endidesoxi, sino H.

55
00:09:37,480 --> 00:09:42,240
Entonces, ¿qué es lo que va a ocurrir cuando tengamos esta mezcla?

56
00:09:43,120 --> 00:09:51,360
Pues que la ADN polimerasa va a ir copiando, va a ir copiando la cadena,

57
00:09:51,360 --> 00:10:04,360
Pero, por ejemplo, aquí en este tubo de aquí va a llegar un momento en el que va a coger, en vez de coger este nucleótido normal, va a coger este otro, el didesoxi.

58
00:10:04,960 --> 00:10:16,320
Pues cuando la ADN polimerasa coja este didesoxi nucleótido de adenina y lo incorpore a la cadena, ¿qué va a pasar?

59
00:10:16,320 --> 00:10:28,279
que ahí va a terminar la cadena de copiarse, ya no puede seguir copiando la ADN polimerasa porque no hay grupo OH al que se pueda unir el siguiente nucleótido.

60
00:10:28,639 --> 00:10:32,940
Entonces ahí va a terminar la reacción.

61
00:10:34,460 --> 00:10:43,539
En el siguiente tubo pues va a ocurrir algo parecido, lo que pasa que aquí lo que tenemos es la citosina, la diitesoxi citosina.

62
00:10:43,539 --> 00:10:55,139
Entonces, la ADN polimerasa va a ir copiando, va copiando, va copiando. Cuando llegue a una base nitrogenada que haya guanina, la ADN polimerasa copiará como citosina.

63
00:10:56,159 --> 00:11:02,340
Sigue copiando, sigue copiando. Si hay otra guanina, pues coge otro nucleótido que sea citosina.

64
00:11:03,059 --> 00:11:15,419
Pero va a haber un momento en el que en vez de coger la citosina normal, el desoxinucleotido normal con OH, pues va a coger este otro, el didesoxi.

65
00:11:15,740 --> 00:11:28,059
Bueno, pues cuando coja este didesoxinucleotido, ¿qué va a pasar? Que ahí se va a cortar la cadena aquí, ahí ya va a terminar de copiar la ADN polimerasa, ya no se va a poder copiar más.

66
00:11:30,360 --> 00:11:36,399
Aquí tenéis un ejemplo. Esto es más o menos lo que os he explicado.

67
00:11:37,240 --> 00:11:40,080
Para iniciar la secuenciación se deben realizar cuatro mezclas.

68
00:11:40,759 --> 00:11:46,659
Cada una de ellas debe contener el ADN a secuenciar, los cuatro nucleótidos, la ADN polimerasa y el cebador.

69
00:11:47,759 --> 00:11:52,220
Además, en cada una de las mezclas se debe introducir un nucleótido de disoxi distinto.

70
00:11:53,059 --> 00:12:00,259
El proceso que se lleva a cabo se inicia con la adhesión de los cebadores en la parte correspondiente de la cadena de ADN.

71
00:12:00,960 --> 00:12:06,639
Acordaros que siempre tiene que haber un cebador para que pueda empezar a copiar la ADN polimerasa.

72
00:12:07,659 --> 00:12:11,759
Entonces se inicia la replicación del ADN molde gracias a la acción de la enzima.

73
00:12:12,240 --> 00:12:22,100
En el orden en que la cadena molde vaya informando, la enzima añadirá los nucleótidos necesarios para completar la cadena de nueva creación.

74
00:12:22,220 --> 00:12:24,360
Esto es lo que ya os he contado.

75
00:12:25,399 --> 00:12:30,399
Ahora, este proceso se va realizando simultáneamente en una gran cantidad de moléculas de ADN,

76
00:12:31,059 --> 00:12:36,840
por lo que estadísticamente, cada vez que se deba añadir una nueva base,

77
00:12:37,720 --> 00:12:46,059
alguna de esas moléculas no añadirán un nucleótido, sino que añadirán un nucleótido di-desoxi.

78
00:12:46,500 --> 00:12:53,639
Estos últimos tienen la particularidad de haber perdido el grupo OH del carbono 3.

79
00:12:53,720 --> 00:12:59,759
por lo que en el momento en que se incorporan en la cadena que se están formando, finalizan la reacción,

80
00:13:00,299 --> 00:13:04,039
puesto que no disponen de la capacidad de introducir el siguiente nucleótido.

81
00:13:05,820 --> 00:13:10,860
Así pues, la cadena se irá replicando al mismo tiempo los cuatro recipientes,

82
00:13:11,559 --> 00:13:15,019
de tal forma que en cada uno van quedando algunas cadenas finalizadas

83
00:13:15,019 --> 00:13:20,860
cuando se incorpora un nucleótido correspondiente al didesoxi introducido en ese recipiente.

84
00:13:20,860 --> 00:13:41,379
Bueno, pues vamos a ver el ejemplo que tenéis aquí en el documento. Nos tenemos, por ejemplo, esta secuencia que se quiere replicar, citosina, adenina, citosina, guanina, timina, adenina, adenina, guanina, citosina, timina, guanina, guanina, timina, adenina y guanina.

85
00:13:41,379 --> 00:13:44,059
Esto es ADN

86
00:13:44,059 --> 00:13:50,200
Pues ahora, la cadena complementaria que se va a copiar, que se va a replicar

87
00:13:50,200 --> 00:13:55,879
Pues sería, si aquí tenemos citosina, guanina, adenina, timina

88
00:13:55,879 --> 00:14:02,559
Guanina, citosina, adenina, timina, timina, citosina, guanina, adenina, citosina

89
00:14:02,559 --> 00:14:10,240
Si tenemos aquí guanina, pues citosina, guanina, citosina, timina, adenina, adenina, timina, guanina, citosina

90
00:14:10,240 --> 00:14:22,440
Bueno, pues si solamente tuviéramos los nucleótidos normales, los de soxinucleótidos, pues esta cadena se copiaría tal cual.

91
00:14:23,500 --> 00:14:33,159
Pero, lo que os digo, en esta tecnología, tecnología Sanger, utilizamos cuatro tubos diferentes.

92
00:14:33,159 --> 00:14:51,519
Entonces, en este tenemos la didesoxiadenina y entonces cuando la cadena, cuando la ADN polimerasa empieza a copiar, pues empieza a copiar, ¿no? La citosina, pues pone guanina, adenina, timina, citosina, guanina, guanina, citosina.

93
00:14:51,519 --> 00:15:06,399
Ahora, llega aquí timina y tiene que poner una adenina, pues resulta que esta adenina que ha cogido es la didersoxi, por lo tanto ya no puede continuar la cadena copiándose.

94
00:15:06,919 --> 00:15:10,120
Aquí termina este fragmento de ADN que se copia.

95
00:15:11,179 --> 00:15:17,299
Entonces, esto es, estadísticamente se van formando todas estas secuencias.

96
00:15:17,299 --> 00:15:29,019
Entonces, habrá otro momento en el que la adenopolimerasa va copiando, va copiando, va copiando, va copiando hasta que llega, por ejemplo, aquí a esta timina.

97
00:15:29,879 --> 00:15:37,980
Entonces, en esta timina, en vez de coger la adenina normal, la desoxiadenina con el grupo 8, coge la didesoxi.

98
00:15:37,980 --> 00:15:47,139
Por lo tanto, aquí, si se une una adenina didesoxi, pues aquí termina la cadena de copiarse.

99
00:15:47,299 --> 00:15:58,120
En cambio, en este tubo de aquí, que tenemos la didesoxicitosina, pues la ADN polimerasa va copiando.

100
00:15:58,419 --> 00:16:02,820
Copia citosina, guanina, adenina, timina, citosina, guanina.

101
00:16:03,220 --> 00:16:06,419
Ahora, aquí por ejemplo, guanina, citosina.

102
00:16:06,639 --> 00:16:11,679
Pues aquí es probable que en vez de coger una citosina normal, coja la didesoxi.

103
00:16:11,679 --> 00:16:16,620
Pues aquí se pararía de copiar la ADN polimerasa.

104
00:16:16,620 --> 00:16:18,419
ya no puede continuar de copiar

105
00:16:18,419 --> 00:16:21,720
luego se va a formar otro fragmento

106
00:16:21,720 --> 00:16:25,220
que llegue hasta aquí

107
00:16:25,220 --> 00:16:27,700
hasta esta citosina que se copia

108
00:16:27,700 --> 00:16:29,059
y ya aquí pare

109
00:16:29,059 --> 00:16:33,480
en este caso de aquí que tenemos la didesoxiguanina

110
00:16:33,480 --> 00:16:37,019
la didesoxiguanina puede ser que

111
00:16:37,019 --> 00:16:39,960
en el primer nucleótido

112
00:16:39,960 --> 00:16:42,360
que tenemos citosina y que lo copiamos

113
00:16:42,360 --> 00:16:45,240
con la adn polimerasa tiene que poner guanina

114
00:16:45,240 --> 00:16:57,379
puede ser que la ADN polimerasa ya coja el D-desoxi y entonces ya la cadena para de copiarse y así sucesivamente.

115
00:16:57,379 --> 00:17:12,759
En este de aquí tenemos la D-desoxi timina, pues la ADN polimerasa copia citosina o adenina timina, pues aquí timina, aquí ya ha cogido la D-desoxi, aquí ya se para de copiar la cadena.

116
00:17:13,660 --> 00:17:22,700
Para analizar todos estos fragmentos de ADN, lo que se hace es una electroforesis en gel de agarosa.

117
00:17:23,299 --> 00:17:27,559
Los que habéis hecho las prácticas ya habéis visto cómo es la técnica.

118
00:17:29,480 --> 00:17:37,220
Entonces prepararíamos el gel de agarosa y le haríamos, si os acordáis, una serie de pocillos.

119
00:17:37,220 --> 00:17:46,539
Aquí hacemos cuatro pocillos y en cada uno de los pocillos lo que vamos a introducir es cada una de estas disoluciones.

120
00:17:48,119 --> 00:17:57,579
Entonces, en cada una de estas disoluciones vamos a tener diferentes fragmentos de ADN y además cada uno de ellos tiene diferente masa molecular.

121
00:17:58,579 --> 00:18:19,299
Acordaros, los de mayor masa molecular quedan retenidos arriba, porque el gel de agarosa tiene una serie de poros, y por esos poros, los de mayor peso molecular no pueden atravesar esos poros y el ADN queda retenido arriba.

122
00:18:19,299 --> 00:18:32,480
En cambio, los de menor peso molecular, que serían estos, la guanina, guanina timina, eso sí que van a ir atravesando los poros y nos aparecerán en la parte de abajo del gel.

123
00:18:33,880 --> 00:18:45,960
Bueno, pues entonces, como hemos introducido en cada pocillo, introducimos estas disoluciones, esta aquí, esta por aquí, esta por aquí y esta aquí en el 4.

124
00:18:45,960 --> 00:19:01,819
Por ejemplo, en el pocillo 3, en el que teníamos la didesoxi guanina, en este pocillo nos va a aparecer una banda en la que solamente vamos a tener guanina, que será esta de aquí.

125
00:19:01,819 --> 00:19:05,279
tendremos otra banda en la que vamos a tener

126
00:19:05,279 --> 00:19:07,079
guanina, timina y guanina

127
00:19:07,079 --> 00:19:08,460
que sería esta de aquí

128
00:19:08,460 --> 00:19:11,519
otra banda en la que vamos a tener

129
00:19:11,519 --> 00:19:14,460
estas hasta aquí

130
00:19:14,460 --> 00:19:18,079
hasta este fragmento

131
00:19:18,079 --> 00:19:22,740
en este de aquí que sería la timina

132
00:19:22,740 --> 00:19:24,039
pues algo parecido

133
00:19:24,039 --> 00:19:26,440
en el primero tenemos guanina, timina

134
00:19:26,440 --> 00:19:27,740
este de aquí

135
00:19:27,740 --> 00:19:33,559
El siguiente sería guanina timina, guanina citosina, adenina timina

136
00:19:33,559 --> 00:19:38,460
Pues sería este de aquí, guanina timina, guanina citosina, adenina timina

137
00:19:38,460 --> 00:19:43,799
Y así sucesivamente, acordaros, los de mayor peso molecular arriba

138
00:19:43,799 --> 00:19:50,559
Pues así vamos a poder saber la secuencia de nucleótidos de nuestro ADN

139
00:19:50,559 --> 00:20:08,130
Bueno, pues esta técnica nos sirve para secuencias de ADN más bien cortas, entre comillas, como hasta 500 fragmentos.

140
00:20:08,130 --> 00:20:14,970
Pero claro, si queremos, por ejemplo, para el estudio del genoma humano, que la longitud es de 3.000 millones de bases,

141
00:20:14,970 --> 00:20:23,210
por lo que tenemos que, claro, no podemos hacer tantas secuencias de este tipo, sería muy difícil.

142
00:20:23,369 --> 00:20:26,970
Entonces lo que se hace es una técnica Sanger modificada.

143
00:20:28,269 --> 00:20:35,730
Pero antes de eso, vamos a ver, bueno, aquí tenemos en resumen cada vez que se introduce un nucleótido

144
00:20:35,730 --> 00:20:44,890
existe la probabilidad, y de hecho sucede, de que en alguna de las cadenas, en lugar de desoxi, X, lo que sea,

145
00:20:44,970 --> 00:20:47,630
se introduzca la D-desoxy-X.

146
00:20:48,930 --> 00:20:50,250
Esto es lo que ya os he dicho.

147
00:20:50,369 --> 00:20:54,789
A continuación se colocan muestras de los cuatro recipientes en cuatro carriles distintos del gel

148
00:20:54,789 --> 00:20:57,170
y se separan por electrofloresis.

149
00:20:58,089 --> 00:21:02,210
Las posiciones relativas entre las cuatro calles se utilizan entonces para leer de abajo a arriba

150
00:21:02,210 --> 00:21:04,230
la secuencia de ADN como se indica.

151
00:21:04,990 --> 00:21:09,769
De esta manera se puede deducir el orden y la composición de la cadena que se ha sintetizado.

152
00:21:11,009 --> 00:21:14,210
A su vez esta es la cadena complementaria de la cadena inicial.

153
00:21:16,279 --> 00:21:32,619
Vale, entonces, vamos a ver este vídeo que hay aquí, a ver, lo tenía aquí abierto,

154
00:21:32,619 --> 00:21:48,269
como no tiene voz, solo tiene música, vale, hay que desnaturalizar el ADN, y ahora lo

155
00:21:48,269 --> 00:21:54,269
que se ve mucho es que esta sería la secuencia que queremos copiar, añadimos el timer y

156
00:21:54,269 --> 00:22:20,660
Y ponemos lo común, añadimos también los dióxidos, los óptimos dióxidos, y añadimos los didesóxidos, cada uno uno.

157
00:22:22,420 --> 00:22:24,680
Y otro referente, didesóxido.

158
00:22:27,359 --> 00:22:28,660
Voy a quitar el volumen.

159
00:22:30,279 --> 00:22:34,839
Vale, hemos añadido, entonces aquí tenemos, a ver un segundo, vuelvo atrás.

160
00:22:35,859 --> 00:22:49,500
Aquí tenemos la cadena, el primer que ya se ha hibridado a la cadena, tenemos los nucleótidos normales y el didesoxi en cada uno, en cada tubo uno diferente.

161
00:22:49,740 --> 00:23:02,960
Ahora la ADN polimerasa va copiando hasta que, por ejemplo, en este caso ha llegado esta base nitrogenada que no tiene grupo H, esto lo identifican así.

162
00:23:02,960 --> 00:23:35,190
Pues ahí ya para de copiar la ADN polimerasa. Ahí ya para. Ahí ya tendríamos un fragmento donde se van formando diferentes fragmentos en cada tubo.

163
00:23:38,859 --> 00:23:53,130
Luego haríamos la gel. Bueno, aquí lo hacen en gel de poliacrilamida. Se aplica una carga. Acordaros, como el ADN tiene carga negativa debido a los grupos fosfato,

164
00:23:53,130 --> 00:23:58,069
pues la carga negativa se va a dirigir hacia el polo positivo

165
00:23:58,069 --> 00:24:03,009
y así obtenemos los diferentes fragmentos

166
00:24:03,009 --> 00:24:19,660
cuando más pequeño pues van a aparecer más abajo

167
00:24:19,660 --> 00:24:22,759
menos masa molecular más abajo

168
00:24:22,759 --> 00:24:27,440
y así vemos todos los

169
00:24:27,440 --> 00:24:32,640
vamos a obtener el ADN

170
00:24:32,640 --> 00:24:33,539
la secuencia

171
00:24:33,539 --> 00:24:59,529
Aquí en este caso la primera es adenina, luego anina, bueno aquí lo ponen un poco diferente y así podemos conocer la secuencia de este fragmento de ADN.

172
00:24:59,529 --> 00:25:45,000
Vale, pues lo que os decía. Esto nos sirve para diferenciar como unos 500 fragmentos, pero para el estudio del genoma humano, si necesitamos analizar unos 3.000 millones de bases, esto no es viable.

173
00:25:45,000 --> 00:25:55,640
Se ha hecho una técnica de Sanger modificada. ¿En qué consiste esta técnica modificada?

174
00:25:56,799 --> 00:26:06,920
Pues mirad, hay dos formas. Una sería la secuenciación utilizando colorantes que se acoplan al cebador.

175
00:26:06,920 --> 00:26:15,799
y este cebador se puede marcar en su extremo 5' mediante un colorante fluorescente

176
00:26:15,799 --> 00:26:22,380
y así luego puedes detectar las secuencias de ADN.

177
00:26:23,200 --> 00:26:31,119
Pero la técnica más novedosa sería esta, que es la secuenciación por terminador fluorescente.

178
00:26:31,119 --> 00:26:42,299
La ventaja que tiene esta técnica es que en una sola reacción se obtiene la secuencia de ADN

179
00:26:42,299 --> 00:26:48,339
Es decir, no necesitamos poner los cuatro didesoxinucleótidos en cada tubo

180
00:26:48,339 --> 00:26:53,160
Sino que en un mismo tubo se puede hacer toda la reacción

181
00:26:53,160 --> 00:27:00,920
Y ahora lo que se hace es marcar cada uno de los cuatro didesoxinucleótidos con un colorante fluorescente diferente

182
00:27:00,920 --> 00:27:04,680
y luego se separan por cromatografía.

183
00:27:05,920 --> 00:27:09,759
Entonces, de esta técnica es simplemente saber eso,

184
00:27:09,880 --> 00:27:13,500
que es una técnica mejorada de la técnica Sanger.

185
00:27:14,380 --> 00:27:22,440
Vamos a ver este vídeo de Javier Novo, de este científico, para que lo entendáis.

186
00:27:22,440 --> 00:27:30,559
Pero lo que quiero que sepáis es lo que es la técnica Sanger, la sencilla,

187
00:27:30,920 --> 00:27:39,039
Y luego esta, simplemente saber que hay una técnica mejor, que se utilizan colorantes florescentes.

188
00:27:40,160 --> 00:27:42,160
Y mirad, vamos a ver este vídeo.

189
00:27:42,980 --> 00:27:44,799
Creo que lo tengo aquí abierto también.

190
00:28:00,630 --> 00:28:01,869
Voy a poner...

191
00:28:07,470 --> 00:28:10,230
La secuenciación consta de un cebador.

192
00:28:11,309 --> 00:28:14,970
Voy a poner los subtítulos, que de paso no lo escucháis.

193
00:28:15,369 --> 00:28:16,910
Una reacción de secuenciación...

194
00:28:16,910 --> 00:28:18,029
A ver, paro.

195
00:28:19,829 --> 00:28:34,769
los subtítulos. Una reacción de secuenciación consta de un cebador, una cadena de ADN molde

196
00:28:34,769 --> 00:28:42,329
que queremos secuenciar, obsérvese la dirección 5'3' de esta cadena y del cebador, nucleótidos

197
00:28:42,329 --> 00:28:47,390
libres y una molécula de ADN polimerasa que es la que va a llevar a cabo la síntesis.

198
00:28:47,390 --> 00:29:13,230
El cebador se une a la cadena molde por complementariedad de bases y la ADN polimerasa va a sintetizar ADN extendiendo el cebador a partir de su extremo 3', incorporando los nucleótidos complementarios a cada una de las posiciones de la cadena molde que queremos secuenciar.

199
00:29:13,230 --> 00:29:22,630
La reacción comienza cuando los nucleótidos se van incorporando por acción de la polimerasa a la cadena molde que se quiere secuenciar

200
00:29:22,630 --> 00:29:28,369
En la mezcla de nucleótidos hay algunos que están marcados con un fluorocromo

201
00:29:28,369 --> 00:29:32,430
y a su vez terminan la síntesis de la cadena

202
00:29:32,430 --> 00:29:37,390
Cuando uno de estos nucleótidos se incorpora la extensión de la cadena se termina

203
00:29:37,390 --> 00:29:42,390
como sucede en este caso con esta adenina que va marcada con un fluorocromo específico

204
00:29:42,390 --> 00:29:48,250
específico y que termina la cadena. Lógicamente hay cuatro tipos de moléculas terminadoras,

205
00:29:48,349 --> 00:29:53,569
cada una de ellas marcadas con un fluorocromo distinto, de manera que al final de la reacción

206
00:29:53,569 --> 00:30:01,230
tenemos cadenas que han sido extendidas en todos los posibles tamaños, cada una de ellas terminada

207
00:30:01,230 --> 00:30:07,890
por un fluorocromo distinto. Así se pueden obtener lecturas de unos 500-800 nucleótidos de longitud.

208
00:30:07,890 --> 00:30:29,809
Todos estos fragmentos hay que introducirlos después en un aparato especial, un secuenciador, que hace una electroforesis en un capilar para separar cada uno de estos fragmentos por tamaños, de manera que los fragmentos más pequeños migran más rápido que los fragmentos de tamaños mayores.

209
00:30:29,809 --> 00:30:42,009
Esto lo vemos aquí ejemplificado muy bien con todos los fragmentos que hemos obtenido al ir leyendo esta secuencia molde, cada uno de ellos terminado por un fluorocromo distinto.

210
00:30:42,710 --> 00:30:51,650
Cuando todos estos fragmentos se introducen en el capilar donde tiene lugar la electroforesis, la migración es distinta.

211
00:30:51,750 --> 00:30:55,349
Los fragmentos más pequeños avanzan más rápido que los fragmentos mayores.

212
00:30:56,109 --> 00:31:21,329
Por tanto llegan antes al final del capilar donde hay un láser que excita los fluorocromos que emiten una luz en una longitud de onda distinta y de esta forma podemos ir viendo la secuencia de nucleótidos que se han ido incorporando en la reacción, que no es otra que la secuencia complementaria a la de la cadena molde original que queríamos secuenciar.

213
00:31:21,329 --> 00:31:26,009
Al final obtenemos archivos de este tipo con una gran cantidad de picos

214
00:31:26,009 --> 00:31:29,849
que indican la secuencia de nucleótidos de la molécula original.

215
00:31:31,970 --> 00:31:40,190
Bueno, pues en este punto lo que nos hablan es identificar microorganismos.

216
00:31:41,029 --> 00:31:48,869
Entonces, nosotros normalmente lo que se hace es, por ejemplo, cuando hay un crimen,

217
00:31:48,869 --> 00:32:06,670
Lo que se hace es analizar las huellas dactilares, por ejemplo, o analizar la sangre o saliva y de ahí sacar el ADN de ese posible sospechoso.

218
00:32:06,670 --> 00:32:30,789
Hay veces que no tenemos material biológico para analizar, no hay cantidad suficiente de sangre o no hay huellas, entonces hay una técnica que sería analizar los microorganismos, o sea las bacterias.

219
00:32:30,789 --> 00:32:37,089
En estos casos las bacterias podrían aportar información complementaria

220
00:32:37,089 --> 00:32:39,990
Voy a leer esto de aquí

221
00:32:39,990 --> 00:32:47,150
Las huellas dactilares y el estudio del ADN humano son herramientas de probada eficacia en el lugar de un hecho criminal

222
00:32:47,150 --> 00:32:50,089
Sin embargo no siempre es posible disponer de ellas

223
00:32:50,089 --> 00:32:57,150
Hay situaciones en las que por falta de materiales biológicos, tales como por ejemplo sangre o saliva

224
00:32:57,150 --> 00:33:00,869
no se tienen posibilidades de tomar muestras de ADN humano,

225
00:33:01,529 --> 00:33:08,529
o bien los objetos susceptibles de presentar huellas tienen superficies en donde no quedan impresas de forma satisfactoria.

226
00:33:09,309 --> 00:33:12,890
En estos casos, las bacterias podrían aportar información complementaria.

227
00:33:13,809 --> 00:33:17,549
Numerosos estudios en el campo de la microbiología ya habían dejado clara

228
00:33:17,549 --> 00:33:23,230
la gran variabilidad de comunidades de bacterias presentes entre las personas.

229
00:33:23,849 --> 00:33:26,970
No todos los individuos tienen las mismas bacterias en sus manos.

230
00:33:27,150 --> 00:33:34,430
Las huellas dactilares bacterianas dejarán rastros que ayudarán a identificar rápidamente al sospechoso y resolverán el caso.

231
00:33:34,430 --> 00:33:43,910
Es decir, por medio del análisis de las bacterias que se hayan quedado podemos identificar al sospechoso.

232
00:33:44,910 --> 00:33:50,430
Bueno, pues hay dos métodos de identificación, los métodos fenotípicos y los métodos genotípicos.

233
00:33:50,430 --> 00:33:58,269
fenotípicos. Los métodos fenotípicos, pues esto seguramente habéis estudiado en biología, ¿no?

234
00:33:58,849 --> 00:34:06,289
¿Cómo se pueden estudiar? Pues las propiedades bioquímicas o la morfología de los microorganismos,

235
00:34:06,390 --> 00:34:14,190
el color de las colonias y a partir de estas propiedades podemos tipificar un tipo de bacteria

236
00:34:14,190 --> 00:34:21,349
u otra. Ahora, ¿qué ocurre con estos métodos genotípicos? Pues que el poder de tipificar

237
00:34:21,349 --> 00:34:27,510
es limitado. No se pueden tipificar todas las bacterias porque cada una es aplicable

238
00:34:27,510 --> 00:34:33,710
a un número reducido de especies bacterianas. Cada ensayo de estos, cada estudio, pues es

239
00:34:33,710 --> 00:34:40,070
aplicable solamente a una serie de especies bacterianas. Bueno, pues para resolver esto

240
00:34:40,070 --> 00:34:46,690
tenemos los métodos genotípicos. Entonces, en estos, ¿qué se analiza? Pues la genética,

241
00:34:46,969 --> 00:34:53,090
genotípico, se analiza la estructura genética de ese organismo y estos tienen la ventaja

242
00:34:53,090 --> 00:35:00,760
de que se pueden aplicar a cualquier especie bacteriana. Vale, pues entonces, dentro de

243
00:35:00,760 --> 00:35:06,659
estos métodos genotípicos tenemos tres tipos. Podemos analizar los perfiles plasmídicos,

244
00:35:07,099 --> 00:35:21,659
Podemos analizar los perfiles de restricción del ADN genómico o podemos analizar, o sea, se puede hacer un perfil de amplificación génica basado en la PCR, la reacción en cadena de la polimerasa.

245
00:35:21,659 --> 00:35:38,179
Bueno, pues, por ejemplo, los perfiles plasmídicos. El plasmido, acordaros, que es un cromosoma que se replica independiente del cromosoma de la célula, de la bacteria.

246
00:35:38,179 --> 00:35:44,559
¿Cómo podemos estudiar estos plásmidos?

247
00:35:45,119 --> 00:35:48,820
Haríamos un análisis celular, o sea, romper la membrana plasmática

248
00:35:48,820 --> 00:35:52,760
obtener el ADN plasmídico, o sea, separar el ADN

249
00:35:52,760 --> 00:35:57,139
lo que es el plasmídico del cromosómico, esto ya lo vimos

250
00:35:57,139 --> 00:36:00,440
cuando vimos la obtención de ADN

251
00:36:00,440 --> 00:36:05,039
y después podríamos hacer una electroforesis en gel de agarosa

252
00:36:05,039 --> 00:36:07,940
¿Cuál es el problema de esta técnica?

253
00:36:08,179 --> 00:36:23,780
Pues es que como los plásmidos tienen su ADN circular, ¿qué pasa? Que pueden presentar diferentes conformaciones. El ADN del plásmido puede estar así, en un círculo, pero puede estar así también, o de esta otra forma, o de esta otra forma.

254
00:36:23,780 --> 00:36:47,099
¿Qué ocurre? Que cuando hagamos la electroforesis en gel de agarosa, aunque tengamos el mismo plásmido, si este plásmido está en esta conformación y el mismo plásmido está en otra conformación, pues nos van a aparecer bandas en zonas diferentes, por lo que no vamos a poder distinguirse ese plásmido.

255
00:36:47,099 --> 00:36:57,340
Bueno, pues para resolver esto, lo que se puede hacer es cortar ese plásmido con enzimas de restricción.

256
00:36:57,940 --> 00:37:05,639
Nosotros tenemos un plásmido que es circular, pues lo cortamos con alguna enzima de restricción y lo que nos va a quedar es un ADN lineal.

257
00:37:05,780 --> 00:37:10,800
Y así ya podemos analizarlo sin problemas con el troforesis en gel de agarosa.

258
00:37:11,539 --> 00:37:27,769
Otra forma de analizar la genética de estas bacterias sería analizar el ADN genómico, no el plasmídico, sino el genómico.

259
00:37:28,909 --> 00:37:36,670
Para ello, que se utilizan por lo mismo endonucleasas de restricción que van a cortar ese ADN genómico en muchos fragmentos.

260
00:37:36,670 --> 00:37:43,809
Y esos fragmentos luego lo mismo, los separamos haciendo una electroforesis en gel de agarosa.

261
00:37:46,650 --> 00:37:57,170
Ahora, una forma de interpretar estos resultados más fácil sería la combinación de este método con el uso de sondas.

262
00:37:57,570 --> 00:38:05,349
Una sonda, acordaros, es una secuencia de ADN que tiene a lo mejor un grupo fluoróforo que emite radiación.

263
00:38:05,349 --> 00:38:15,570
y luego se transferiría a una membrana nitrocelulosa, acordaros que esto en la técnica de hibridación lo hemos visto,

264
00:38:16,369 --> 00:38:18,349
y después ya se separaría por electroforesis.

265
00:38:20,090 --> 00:38:28,670
Entonces los que hayan hibridado con esa secuencia de ADN que teníamos, pues quedarán fijados en la membrana.

266
00:38:28,670 --> 00:38:50,130
Bueno, este sería la técnica de perfiles de restricción de ADN genómico. Cortar el ADN con endonucleasas de restricción y luego hacer una hibridación con sondas y después ya la electroforesis a gel de agarosa.

267
00:38:50,130 --> 00:39:08,909
Y por último tendríamos los perfiles de amplificación génica. ¿En qué consiste? Pues consiste en hacer una PCR, una reacción en cadena de la polimerasa.

268
00:39:08,909 --> 00:39:24,590
Si os acordáis en la PCR, por cada fragmento de ADN que queríamos amplificar, ¿qué utilizábamos? Pues utilizábamos dos cebadores o primers. Esos cebadores o primers eran los que delimitaban la secuencia que queríamos amplificar.

269
00:39:24,590 --> 00:39:37,829
Pues en este caso lo que hacemos es utilizar solamente un único oligogonucleotido, o sea, un único cebador. Normalmente eso de 10 pares de bases.

270
00:39:37,829 --> 00:39:57,329
Y entonces ese único cebador se va a unir aleatoriamente a la cadena de ADN y se van a obtener fragmentos de diferente masa molecular de esa cadena de ADN.

271
00:39:57,329 --> 00:40:09,349
Y esta técnica se denomina RAPD, Random, Aleatorio, Amplification, Polymorphic DNA o ADN.

272
00:40:09,769 --> 00:40:13,289
O sea, se amplifica de forma aleatoria.

273
00:40:13,789 --> 00:40:21,030
Se utiliza solamente un único nucleótido que se va a unir a diferentes zonas del ADN

274
00:40:21,030 --> 00:40:28,349
y entonces se van a ir amplificando, se van a ir haciendo copias de diferentes fragmentos de ese ADN.