1 00:00:01,260 --> 00:00:07,620 Muy bien, ya hemos terminado con las técnicas espectroscópicas y pasamos al nuevo tema. 2 00:00:08,480 --> 00:00:12,939 Este tema también se va a dividir en dos temas a su vez. 3 00:00:13,880 --> 00:00:19,219 En tres técnicas de separación tendríamos dos tipos, que serían la cromatografía y la electroforesis. 4 00:00:19,559 --> 00:00:22,519 La cromatografía, como he dicho, es una técnica de separación. 5 00:00:23,100 --> 00:00:27,100 Por tanto, lo primero que tenemos que tener en cuenta es que si vamos a separar, 6 00:00:27,100 --> 00:00:31,179 tenemos que tener al menos dos componentes, porque si no, no tenemos nada que separar. 7 00:00:31,260 --> 00:00:37,759 Es decir, no tiene sentido hacer una cromatografía a una sustancia pura, que tenga un único componente. 8 00:00:38,119 --> 00:00:41,200 Lo que digo, no separaríamos nada, saldría todo junto. 9 00:00:42,899 --> 00:00:50,140 Al igual que al principio del módulo, hacíamos una comparación entre el análisis químico clásico y el análisis instrumental, 10 00:00:50,659 --> 00:00:55,920 pues aquí vamos a comparar un poquito con las técnicas de separación clásicas, con la cromatografía. 11 00:00:55,920 --> 00:01:06,140 Creo que en el módulo de muestreo habéis trabajado, si no lo habéis hecho ya, pues lo haréis, los que todavía no habéis tenido un muestreo, con diferentes técnicas de separación. 12 00:01:06,519 --> 00:01:23,840 Entre esas, pues habéis visto, por ejemplo, la decantación, la filtración, la sedimentación, la extracción, el sol, que la habéis estado haciendo estos días en práctica, los que estáis este año, las otras técnicas, pues la evaporación, hay un montón más. 13 00:01:23,840 --> 00:01:27,379 Bueno, pues a esa lista vamos a añadir la cromatografía 14 00:01:27,379 --> 00:01:31,819 Pero antes de seguir, pues vamos a comparar 15 00:01:31,819 --> 00:01:35,560 ¿Qué es lo que hace a la cromatografía tan especial? 16 00:01:36,379 --> 00:01:40,760 ¿Por qué no la habéis visto con las técnicas de análisis clásico y la vemos este año con el instrumental? 17 00:01:41,680 --> 00:01:46,579 Bueno, pues la cromatografía nos va a permitir separar componentes que estén íntimamente ligados 18 00:01:46,579 --> 00:01:50,599 Es decir, que no podamos separarlos mediante los métodos convencionales 19 00:01:50,599 --> 00:01:53,680 Como por ejemplo puede ser una mezcla de aminoácidos 20 00:01:53,680 --> 00:02:09,620 En el grupo de técnicas de separación, también lo que os decía, que incluimos la electroforesis, que está en el siguiente tema y también lo habéis visto más detallado en biotecnología. 21 00:02:09,620 --> 00:02:19,300 Pero, ahora, digo yo, si de momento los análisis nos están saliendo bien, lo que hemos estado 22 00:02:19,300 --> 00:02:24,139 haciendo mediante pH, conductividad, las técnicas de análisis químico que habéis visto de 23 00:02:24,139 --> 00:02:29,060 las valoraciones, si están saliendo bien, ¿por qué queremos separar los componentes? 24 00:02:29,060 --> 00:02:30,060 ¿Para qué lo hacemos? 25 00:02:30,060 --> 00:02:35,800 ¿Merece la pena o es una pérdida de tiempo o qué? 26 00:02:35,800 --> 00:02:43,379 Pues para empezar, no tendremos que ver la cromatografía como un suplemento o una forma 27 00:02:43,379 --> 00:02:48,099 de mejora de otras técnicas, aunque sí es verdad que en muchas ocasiones sí se utiliza 28 00:02:48,099 --> 00:02:54,240 como una técnica híbrida junto a otras técnicas, como por ejemplo la espectroscopía de masas. 29 00:02:54,240 --> 00:02:58,840 Pero la cromatografía es una técnica que es totalmente independiente y que va a aportar 30 00:02:58,840 --> 00:03:02,599 muchísima información. 31 00:03:02,599 --> 00:03:05,919 Pero bueno, vuelvo a la pregunta que estábamos diciendo antes. 32 00:03:06,240 --> 00:03:08,460 ¿Qué objetivo buscamos con la cromatografía? 33 00:03:09,400 --> 00:03:17,159 Pues veréis, cuando nosotros estamos aislando un componente y usamos una técnica complementaria a la cromatografía, 34 00:03:17,879 --> 00:03:22,520 pues vamos a obtener una mejor selectividad, ya que no tenemos ningún tipo de interferente. 35 00:03:22,520 --> 00:03:26,199 Recordad que la selectividad estaba relacionada con la especificidad, 36 00:03:26,199 --> 00:03:29,259 con que la técnica o el método aplicado 37 00:03:29,259 --> 00:03:33,039 determine únicamente al analito de interés. 38 00:03:33,740 --> 00:03:38,020 Eso lo vamos a conseguir al separar los componentes mediante la cromatografía. 39 00:03:39,360 --> 00:03:41,979 Además de la selectividad, 40 00:03:42,319 --> 00:03:44,460 también vamos a conseguir mejorar la sensibilidad. 41 00:03:45,199 --> 00:03:50,580 Si nosotros aislamos un componente y lo transferimos a un menor volumen 42 00:03:50,580 --> 00:03:55,539 de disolvente, va a quedar como más concentrado. 43 00:03:56,199 --> 00:04:01,180 Entonces, estamos haciendo una preconcentración, por decirlo así de una manera. 44 00:04:01,939 --> 00:04:05,520 Entonces, de esta manera estamos consiguiendo, a partir de una cantidad pequeña de analito, 45 00:04:06,139 --> 00:04:12,080 una concentración que nos va a dar señales en las que nos vamos a manejar bastante bien. 46 00:04:14,580 --> 00:04:20,139 Y ahora, con todo esto, utilizar la cromatografía junto con otras técnicas, 47 00:04:20,139 --> 00:04:44,220 En muchos casos se pueden acoplar detectores a las técnicas cromatográficas, se le ponen detectores y así además de separar los componentes y obtener información cualitativa, pues nos estamos identificando, no con el detector y también podemos obtener información cuantitativa para contabilizar a estos componentes que hemos separado. 48 00:04:44,220 --> 00:04:53,500 Según la IUPAC, la cromatografía es un método usado principalmente para la separación de 49 00:04:53,500 --> 00:04:59,339 los componentes de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos 50 00:04:59,339 --> 00:05:07,680 fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es móvil, es decir, 51 00:05:07,680 --> 00:05:13,100 la muestra se va a poner en una fase móvil, que puede ser un gas, un líquido o un fluido 52 00:05:13,100 --> 00:05:21,839 supercrítico. Esta fase móvil se va desplazando sobre una fase estacionaria, que suele ser 53 00:05:21,839 --> 00:05:29,579 un sólido o un líquido ligado a un sólido. Hemos dicho que la fase móvil que lleva la 54 00:05:29,579 --> 00:05:35,720 muestra se desplaza por una fase estacional. En este momento es cuando se produce la separación, 55 00:05:36,839 --> 00:05:42,500 ya que los componentes se van quedando retenidos en la fase estacionaria, unos más que otros. 56 00:05:42,500 --> 00:05:48,920 Es como si hubiera una competencia entre fase móvil y fase estacionaria por el o los analitos. 57 00:05:49,620 --> 00:05:55,740 En el ejemplo que veis aquí en la diapositiva, vemos una mezcla de tres componentes, 58 00:05:56,500 --> 00:06:00,040 que eran uno rojo, uno verde y uno azul. 59 00:06:01,079 --> 00:06:05,899 Ahí está hablando de la fase estacionaria, de por dónde va a ir la fase móvil, 60 00:06:06,639 --> 00:06:11,199 y vemos ahí que al principio están todos juntos, y veis todos los colores que se ven bien. 61 00:06:11,199 --> 00:06:16,720 entran todos juntos, se ve como una pelota ahí como mini partículas de muchos colores 62 00:06:16,720 --> 00:06:22,199 y según avanza la cromatografía pues vemos como esas mini partículas se van organizando 63 00:06:22,199 --> 00:06:29,300 y separando por colores, es ahí que ya van, se van viendo como están separados 64 00:06:29,300 --> 00:06:33,100 el azul coge ventaja, el rojo parece que está entero pero se mezcla un poquito con el verde 65 00:06:33,100 --> 00:06:36,800 entonces esos colores van avanzando a una velocidad diferente 66 00:06:36,800 --> 00:06:39,680 primero van los azules 67 00:06:39,680 --> 00:06:40,959 luego van los rojos 68 00:06:40,959 --> 00:06:43,100 que parece que ya se están ahí 69 00:06:43,100 --> 00:06:44,699 casi separando del todo 70 00:06:44,699 --> 00:06:47,459 y luego por último estarían los verdes 71 00:06:47,459 --> 00:06:49,319 que ya salen los últimos 72 00:06:49,319 --> 00:06:50,199 y están separaditos 73 00:06:50,199 --> 00:06:52,519 ahí ya por ejemplo cuando va a salir, sale el rojo solo 74 00:06:52,519 --> 00:06:54,279 no tiene nada de vejez con el verde 75 00:06:54,279 --> 00:06:56,740 y por último saldría el verde 76 00:06:56,740 --> 00:06:59,220 habéis visto arriba 77 00:06:59,220 --> 00:07:00,779 que sale aquí 78 00:07:00,779 --> 00:07:01,839 una vez que ha salido 79 00:07:01,839 --> 00:07:04,480 un color pues se ha hecho 80 00:07:04,480 --> 00:07:06,540 un pico, ha salido un gráfico 81 00:07:06,540 --> 00:07:14,339 que es con un pico. Ahora, vamos a hablar un poco bien. En vez de llamarlo pelota, mini 82 00:07:14,339 --> 00:07:18,839 partículas, colores, colorichis o lo que sea, pues vamos a llamar a cada cosa por su 83 00:07:18,839 --> 00:07:26,720 nombre. Por un lado tendremos el eluyente. El eluyente es la disolución que entra en 84 00:07:26,720 --> 00:07:32,120 la columna. Al atravesar la columna es donde se produce el proceso de desaparición, ya 85 00:07:32,120 --> 00:07:35,959 que los componentes se van quedando retenidos de forma diferente a la fase estacionaria. 86 00:07:35,959 --> 00:07:38,600 que es lo que pasaba con lo de antes de los colores 87 00:07:38,600 --> 00:07:39,839 y al final 88 00:07:39,839 --> 00:07:42,600 van a conseguir salir por el extremo de la columna 89 00:07:42,600 --> 00:07:43,839 en este caso que estamos 90 00:07:43,839 --> 00:07:45,959 con una columna 91 00:07:45,959 --> 00:07:48,459 a esta disolución que ha salido 92 00:07:48,459 --> 00:07:49,939 es a lo que se llama 93 00:07:49,939 --> 00:07:51,139 el huato 94 00:07:51,139 --> 00:07:54,079 y todo el proceso es la 95 00:07:54,079 --> 00:07:55,779 elusión, pero 96 00:07:55,779 --> 00:07:57,259 ahora te digo yo 97 00:07:57,259 --> 00:08:00,180 hemos dicho que hay 98 00:08:00,180 --> 00:08:01,600 una competencia 99 00:08:01,600 --> 00:08:04,339 entre una fase móvil 100 00:08:04,339 --> 00:08:05,660 y una fase estacionaria 101 00:08:05,660 --> 00:08:10,019 Pero esta competencia, esta retención, ¿por qué se produce? ¿En qué nos basamos? ¿Qué va a ser? 102 00:08:10,759 --> 00:08:27,120 Pues esto va a depender de parámetros como son la solubilidad, la absorción, la volatilidad, el tamaño de las partículas, la carga, todo lo que sea de los diferentes amiguitos. 103 00:08:27,120 --> 00:08:39,120 Entonces, el principio de separación junto con la fase móvil y la fase estacionaria utilizada nos van a permitir hacer varias clasificaciones. 104 00:08:40,500 --> 00:08:47,100 En los apuntes he puesto un enlace a una tabla que he hecho yo por si no os gusta la que hay en los propios apuntes. 105 00:08:47,860 --> 00:08:51,659 Pero bueno, que dentro de los apuntes hay también tabletas. 106 00:08:52,259 --> 00:08:54,759 Eso ya como venga mejor. 107 00:08:54,759 --> 00:08:59,779 Las separaciones que vamos a hacer o las clasificaciones que vamos a hacer 108 00:08:59,779 --> 00:09:02,759 las podemos hacer en base a varias cosas 109 00:09:02,759 --> 00:09:07,700 Lo primero, lo haríamos en base al estado de la fase móvil 110 00:09:07,700 --> 00:09:12,179 Si la fase móvil es un líquido, se habla de cromatografía de líquidos 111 00:09:12,179 --> 00:09:15,799 En estos casos, la fase estacionaria suele ser o bien un sólido 112 00:09:15,799 --> 00:09:18,500 o un sólido recubierto por un líquido 113 00:09:18,500 --> 00:09:21,259 que no es visible con la fase móvil 114 00:09:21,259 --> 00:09:29,860 Un ejemplo de cromatografía de líquidos, el HPLF, que igual es el que más os puede sonar, o el que más tenéis ganas de hacer. 115 00:09:31,080 --> 00:09:41,019 Luego, si la fase móvil es un gas, pues se llama cromatografía de gases, y la fase estacionaria, pues como antes, o un sólido o un sólido recubierto por un líquido. 116 00:09:41,980 --> 00:09:49,600 Aquí destacar que para que la fase móvil no sirva cualquier gas, tiene que ser un gas inerte. 117 00:09:49,600 --> 00:09:58,600 Y luego, si la fase móvil no usamos ni líquido ni gas, sino que usamos un fluido supercrítico, pues cromatografía de fluidos supercríticos. 118 00:09:59,580 --> 00:10:02,519 Aquí la fase estacionaria, pues o un sólido o un líquido. 119 00:10:03,059 --> 00:10:06,379 Pero bueno, como veis, con los nombres tampoco se han conflictado mucho. 120 00:10:07,539 --> 00:10:15,779 Ahora, otra opción que tenemos, o otro tipo de clasificación que se hace, es según cómo se encuentra la fase estacionaria. 121 00:10:15,779 --> 00:10:20,159 esta va a ser la cromatografía en columna 122 00:10:20,159 --> 00:10:23,120 en la que la fase estacionaria está dentro de un tubo 123 00:10:23,120 --> 00:10:24,940 por el que se hace pasar la fase móvil 124 00:10:24,940 --> 00:10:28,919 de hecho la cromatografía cuando se descubrió 125 00:10:28,919 --> 00:10:32,019 fue por eso, porque se quisieron separar 126 00:10:32,019 --> 00:10:34,440 los pigmentos vegetales y se hizo pasar 127 00:10:34,440 --> 00:10:38,100 la mezcla de los pigmentos a través de una columna 128 00:10:38,100 --> 00:10:41,240 y se vio que se iban separando, entonces fue la primera que se hizo 129 00:10:41,240 --> 00:10:43,360 y luego puede ser otra 130 00:10:43,360 --> 00:10:46,279 que es la cromatografía en capa fina, ¿vale? 131 00:10:46,500 --> 00:10:54,460 En este tipo la fase móvil es líquida y se desplaza por la fase estacionaria por capilaridad, ¿vale? 132 00:10:54,480 --> 00:10:55,559 Así va a ser el movimiento. 133 00:10:56,100 --> 00:11:01,960 De este tipo tendríamos dos tipos o dos partes de cromatografía en capa fina, 134 00:11:02,039 --> 00:11:07,840 que sería la capa fina llamada así, que es esta que tenéis aquí en el dibujo, 135 00:11:08,220 --> 00:11:09,860 o la cromatografía en papel, ¿vale? 136 00:11:09,860 --> 00:11:12,360 Que también se mete dentro de la capa fina, ¿vale? 137 00:11:12,360 --> 00:11:14,179 el TLC es por 138 00:11:14,179 --> 00:11:15,980 cromatografía de capa fina en inglés. 139 00:11:16,600 --> 00:11:18,200 Por último, pues vamos a hacer una 140 00:11:18,200 --> 00:11:20,299 clasificación en función del principio 141 00:11:20,299 --> 00:11:22,299 de separación, de por qué se produce 142 00:11:22,299 --> 00:11:24,360 esta separación o esta competencia. 143 00:11:25,159 --> 00:11:25,980 Aquí vamos a tener 144 00:11:25,980 --> 00:11:28,279 la primera, la cromatografía 145 00:11:28,279 --> 00:11:30,059 de absorción, ¿vale? Repito, 146 00:11:30,220 --> 00:11:31,500 absorción con D. 147 00:11:32,059 --> 00:11:34,000 Aquí la fase estacionaria es sólida 148 00:11:34,000 --> 00:11:35,980 y la fase móvil, pues suele ser 149 00:11:35,980 --> 00:11:37,679 generalmente líquida o aseosa. 150 00:11:38,679 --> 00:11:39,700 En este caso, 151 00:11:40,179 --> 00:11:41,879 las sustancias del analito de interés 152 00:11:41,879 --> 00:11:48,080 quedan absorbidas en la superficie de las partículas sólidas de la fase estacionaria. 153 00:11:48,879 --> 00:11:51,980 Y esto es por fuerzas de Van der Waals. 154 00:11:53,559 --> 00:11:56,820 Luego tendríamos la cromatografía de reparto, 155 00:11:57,399 --> 00:12:01,740 que la fase estacionaria es un líquido retenido sobre un soporte sólido 156 00:12:01,740 --> 00:12:05,519 y la fase móvil es líquida o gaseosa. 157 00:12:05,519 --> 00:12:09,399 El reparto se va a producir entre las dos fases. 158 00:12:09,399 --> 00:12:14,559 Luego tenemos la cromatografía de intercambio iónico 159 00:12:14,559 --> 00:12:23,159 Este tipo de cromatografía se va a basar en la unión de aniones o cationes a la fase estacionaria 160 00:12:23,159 --> 00:12:30,299 La fase estacionaria es sólida, de forma que se va a coger una carga neta 161 00:12:30,299 --> 00:12:32,720 Este tipo de unión es una unión covalente 162 00:12:32,720 --> 00:12:36,179 Es decir, la fase estacionaria está cargada 163 00:12:36,179 --> 00:12:38,279 los iones de la muestra también 164 00:12:38,279 --> 00:12:40,759 pero de una carga opuesta a la fase estacionaria 165 00:12:40,759 --> 00:12:42,440 por lo que son atraídos 166 00:12:42,440 --> 00:12:43,860 por fuerzas electrostáticas 167 00:12:43,860 --> 00:12:46,639 la fase móvil es líquida 168 00:12:46,639 --> 00:12:48,500 y ahora digo yo 169 00:12:48,500 --> 00:12:50,519 el analito 170 00:12:50,519 --> 00:12:52,159 es atraído por la fase estacionaria 171 00:12:52,159 --> 00:12:54,419 si están todos cargados 172 00:12:54,419 --> 00:12:56,220 ¿cómo vamos a separarlos? 173 00:12:56,460 --> 00:12:57,320 en la fase estacionaria, ¿vale? 174 00:12:57,379 --> 00:13:00,120 porque si van a quedarse ahí retenidos y no van a salir 175 00:13:00,120 --> 00:13:01,980 y se quedan todos igual, ¿qué hacemos? 176 00:13:03,039 --> 00:13:03,679 bueno, pues 177 00:13:03,679 --> 00:13:06,799 no nos interriemos de si se separan 178 00:13:06,799 --> 00:13:08,600 o no, o no sé qué sé 179 00:13:08,600 --> 00:13:09,639 ¿cómo separamos? 180 00:13:10,919 --> 00:13:12,039 pues la separación 181 00:13:12,039 --> 00:13:14,960 va a depender de la fuerza de atracción 182 00:13:14,960 --> 00:13:16,659 que hay entre el analito 183 00:13:16,659 --> 00:13:18,720 y la fase estacionaria, estas fuerzas electrostáticas 184 00:13:18,720 --> 00:13:19,519 que estamos diciendo 185 00:13:19,519 --> 00:13:22,000 lo que se suele hacer para separarlos 186 00:13:22,000 --> 00:13:24,679 de la fase estacionaria, cuando quedan muy muy 187 00:13:24,679 --> 00:13:26,399 retenidos y no conseguimos que avancen 188 00:13:26,399 --> 00:13:28,600 para separarlos de la fase estacionaria 189 00:13:28,600 --> 00:13:30,639 lo que hacemos es cambiar la fase 190 00:13:30,639 --> 00:13:31,059 móvil 191 00:13:31,059 --> 00:13:37,960 para formar una fase móvil que tenga una mayor atracción 192 00:13:37,960 --> 00:13:40,659 y compita más por el analito que la fase estacionaria. 193 00:13:41,440 --> 00:13:43,980 En general, si el analito es negativo, 194 00:13:44,480 --> 00:13:47,259 la fase estacionaria tendría que ser positiva, 195 00:13:47,679 --> 00:13:49,580 pues la fase móvil sería mucho más positiva 196 00:13:49,580 --> 00:13:51,320 para que atraiga mucho más al analito. 197 00:13:51,759 --> 00:13:54,179 Otro tipo serían las cromatografías de afinidad. 198 00:13:54,919 --> 00:13:59,120 Esta, para compararlo, no sé si os suena el modelo de llave cerradura. 199 00:13:59,120 --> 00:14:03,240 no todas las llaves abren todas las puertas 200 00:14:03,240 --> 00:14:05,279 cada una tiene unos dientes, unas moscas 201 00:14:05,279 --> 00:14:08,059 que se van a corresponder con la cerradura de la puerta que tienen que abrir 202 00:14:08,059 --> 00:14:09,539 pues aquí pasa igual 203 00:14:09,539 --> 00:14:13,240 vamos a intentar que haya una interacción muy específica 204 00:14:13,240 --> 00:14:16,580 entre un tipo de moléculas de la muestra y la fase estacional 205 00:14:16,580 --> 00:14:18,980 entonces se van a quedar retenidas solamente 206 00:14:18,980 --> 00:14:22,200 un tipo de sustancias que nos interesen a nosotros 207 00:14:22,200 --> 00:14:26,360 y por último la cromatografía de exclusión molecular 208 00:14:26,360 --> 00:14:31,860 Este tipo de cromatografía se trata de una cromatografía de separación por tamaño 209 00:14:31,860 --> 00:14:37,059 No hay una interacción o no buscamos una interacción entre la fase estacionaria y la muestra 210 00:14:37,059 --> 00:14:42,299 La fase estacionaria al final va a actuar como un tamiz por el que se desplaza la fase móvil 211 00:14:42,299 --> 00:14:45,820 La fase móvil pues sí, o líquida o gaseosa 212 00:14:45,820 --> 00:14:50,019 Pero la fase móvil pues lleva los componentes que va a separar 213 00:14:50,019 --> 00:14:54,159 Tiene que atravesar la fase estacionaria que es como un tamiz y ahí es donde se produce la separación 214 00:14:54,159 --> 00:15:14,259 Por ejemplo, en un tamiz, ¿vale? Que también lo habéis visto en muestre. ¿Qué va a pasar? Pues lo que ocurre es que poco a poco vais disminuyendo el poro, vais disminuyendo el... o sea, en el último tamiz es el luz de malla más pequeño, ¿vale? El ciego no, el otro. Es el luz de malla más pequeño. 215 00:15:14,259 --> 00:15:18,919 Entonces aquí cada vez vamos dejando pasar partículas más pequeñas 216 00:15:18,919 --> 00:15:22,659 Las grandes se quedan arriba y cada vez vamos con partículas más pequeñas 217 00:15:22,659 --> 00:15:23,639 ¿Vale? 218 00:15:24,600 --> 00:15:27,159 Entonces aquí va a ser algo parecido pero al revés 219 00:15:27,159 --> 00:15:32,700 La fase estacionaria, pues lo digo, es como si fuera, no sé, imaginaros como si fuera un gel 220 00:15:32,700 --> 00:15:33,299 ¿Vale? 221 00:15:33,620 --> 00:15:35,360 En este gel tiene poros 222 00:15:35,360 --> 00:15:36,019 ¿Vale? 223 00:15:36,340 --> 00:15:38,480 Pero los poros son muy, muy, muy chiquititos 224 00:15:38,480 --> 00:15:38,759 ¿Vale? 225 00:15:38,759 --> 00:15:39,500 Son muy pequeños 226 00:15:39,500 --> 00:15:43,639 Y no va a dejar que pasen por ahí pues moléculas que sean más grandes que el poro del gel 227 00:15:43,639 --> 00:15:45,460 las moléculas que son más grandes 228 00:15:45,460 --> 00:15:47,940 pues son eluidas por la fase móvil 229 00:15:47,940 --> 00:15:49,320 y salen las primeras 230 00:15:49,320 --> 00:15:52,000 y las pequeñas pues van penetrando 231 00:15:52,000 --> 00:15:53,399 por dichos poros 232 00:15:53,399 --> 00:15:55,360 entonces se van como entreteniendo 233 00:15:55,360 --> 00:15:57,600 y tienen un recorrido más largo 234 00:15:57,600 --> 00:15:59,919 para poder salir, por eso se recargan más 235 00:15:59,919 --> 00:16:01,320 y saldrían las últimas 236 00:16:01,320 --> 00:16:03,519 vale, sale todo, no es como en el 237 00:16:03,519 --> 00:16:04,799 camis que he dicho de muestreo 238 00:16:04,799 --> 00:16:06,620 que se va quedando arriba 239 00:16:06,620 --> 00:16:09,019 lo más grande y abajo lo más pequeño 240 00:16:09,019 --> 00:16:11,519 aquí saldría todo, pero a diferente tiempo 241 00:16:11,519 --> 00:16:13,000 pues primero salen las grandes 242 00:16:13,000 --> 00:16:15,240 que bajan por los huecos grandes que hay 243 00:16:15,240 --> 00:16:17,139 y luego saldrían las pequeñas 244 00:16:17,139 --> 00:16:18,919 que se van metiendo por todos los poros 245 00:16:18,919 --> 00:16:20,679 de la fase estacionaria que tienen 246 00:16:20,679 --> 00:16:22,419 por eso tardan más tiempo 247 00:16:22,419 --> 00:16:25,480 pero ahora, todo eso del reparto que he dicho yo 248 00:16:25,480 --> 00:16:25,980 ¿qué es? 249 00:16:26,220 --> 00:16:28,899 también en muestreo habéis visto algo 250 00:16:28,899 --> 00:16:31,279 voy a irme con el ejemplo 251 00:16:31,279 --> 00:16:32,039 de los apuntes 252 00:16:32,039 --> 00:16:34,899 para seguirlo un poco y que quede claro 253 00:16:34,899 --> 00:16:36,539 vamos a imaginar 254 00:16:36,539 --> 00:16:38,700 que ponemos en un vaso 255 00:16:38,700 --> 00:16:40,159 agua con hexano 256 00:16:40,159 --> 00:16:45,100 Estos dos son inestibles, por lo tanto, se van a formar dos fases 257 00:16:45,100 --> 00:16:50,039 Y las dos fases se van a distribuir en función de la densidad de cada uno 258 00:16:50,039 --> 00:16:55,039 El hexano, que es menos denso, se va a quedar arriba y el agua se va a quedar abajo 259 00:16:55,039 --> 00:16:59,840 Ahora, a esta mezcla que tenemos vamos a añadir una tercera cosa 260 00:16:59,840 --> 00:17:01,519 Vamos a añadirle acetona 261 00:17:01,519 --> 00:17:05,740 Pues ahí tendríamos que ver cómo se distribuye cuando añadimos el acetona 262 00:17:05,740 --> 00:17:10,099 Se va a formar una tercera fase, se va a disolver el acetona en el agua 263 00:17:10,099 --> 00:17:14,180 se va a disolver en el exano. ¿Qué hacemos? ¿Vale? ¿O qué pasa 264 00:17:14,180 --> 00:17:18,299 como lo vemos nosotros? Pues debido a las características de la cetona 265 00:17:18,299 --> 00:17:22,180 esta puede estar distribuida en las dos fases, ¿vale? 266 00:17:22,180 --> 00:17:25,440 Puede disolverse tanto en el agua como en el exano. Pero 267 00:17:25,440 --> 00:17:30,019 aquí viene la cosa, ¿vale? Que no va a estar en la misma concentración, no 268 00:17:30,019 --> 00:17:34,039 se va a repartir igual en el agua con el exano, ¿vale? Va a tener 269 00:17:34,039 --> 00:17:37,980 más ganas de irse con uno que con otro. Entonces aquí es donde definimos 270 00:17:37,980 --> 00:17:40,700 el coeficiente de reparto, ¿vale? 271 00:17:40,720 --> 00:17:45,200 Que es la relación entre la concentración de acetona en cada una de las fases. 272 00:17:46,220 --> 00:17:46,359 ¿Vale? 273 00:17:46,400 --> 00:17:50,680 Entonces ya quedaría la mezcla, es que si conseguiríamos, un poco se vería a lo mejor 274 00:17:50,680 --> 00:17:54,339 alguna fase por ahí, pero bueno, con la acetona se consigue bastante. 275 00:17:55,119 --> 00:17:59,799 En cromatografía, pues pasa algo parecido, pero en vez de llamarlo coeficiente de reparto, 276 00:17:59,799 --> 00:18:02,839 se va a llamar coeficiente de distribución, ¿vale? 277 00:18:02,839 --> 00:18:07,579 y pues igual, es la relación que hay entre la concentración de una muestra 278 00:18:07,579 --> 00:18:12,140 entre la fase estacionaria y la concentración que hay en la fase móvil 279 00:18:12,140 --> 00:18:14,799 y esto es lo que nos va a ayudar a separar 280 00:18:14,799 --> 00:18:19,660 cuando hablamos de cromatografía de reparto, se basa esto al reparto que hay 281 00:18:19,660 --> 00:18:23,680 en los componentes de una muestra, ya que estos se van a disolver 282 00:18:23,680 --> 00:18:27,279 mejor en la fase móvil o en la fase estacionaria 283 00:18:27,279 --> 00:18:31,460 aquellos que se vayan a disolver mejor en la fase móvil 284 00:18:31,460 --> 00:18:34,200 irán arrastrados por esta 285 00:18:34,200 --> 00:18:36,359 y los que estén más 286 00:18:36,359 --> 00:18:38,420 o mejor en la fase 287 00:18:38,420 --> 00:18:40,160 estacionaria van a quedar retenidos 288 00:18:40,160 --> 00:18:42,500 y les va a costar más desplazarse y salir 289 00:18:42,500 --> 00:18:44,420 de la fase estacionaria 290 00:18:44,420 --> 00:18:46,140 de donde estén, sea una columna, una placa 291 00:18:46,140 --> 00:18:47,339 o lo que sea 292 00:18:47,339 --> 00:18:50,140 ya sabemos separar los componentes 293 00:18:50,140 --> 00:18:52,259 pero hemos dicho 294 00:18:52,259 --> 00:18:53,960 que la técnica la da información 295 00:18:53,960 --> 00:18:56,279 cualitativa e información 296 00:18:56,279 --> 00:18:58,059 cuantitativa, pues vamos a ver 297 00:18:58,059 --> 00:19:00,660 que sacamos nosotros de ahí, como lo interpretamos 298 00:19:00,660 --> 00:19:04,460 todo eso, igual que las técnicas espectroscópicas 299 00:19:04,460 --> 00:19:08,819 hemos obtenido un espectro, aquí vamos a tener un gráfico 300 00:19:08,819 --> 00:19:12,359 un diagrama que se va a llamar cromatograma 301 00:19:12,359 --> 00:19:16,019 el aspecto que tiene, parecido a cuando hacíamos el barrido 302 00:19:16,019 --> 00:19:20,380 en espectroscopía de ultravioleta visible, es como una campana de Gauss 303 00:19:20,380 --> 00:19:23,940 más o menos, pero no tiene el mismo significado 304 00:19:23,940 --> 00:19:28,079 sino que cada cosa va a ser un parámetro diferente 305 00:19:28,079 --> 00:19:35,039 En cromatografía, en el eje de X vamos a poner el tiempo 306 00:19:35,039 --> 00:19:43,559 Y luego tenemos el eje que nos va a dar información sobre la altura del pico 307 00:19:43,559 --> 00:19:46,400 La altura del pico va en el eje D 308 00:19:46,400 --> 00:19:51,359 Y es la forma con la que vamos a poder trabajar 309 00:19:51,359 --> 00:19:53,700 Con anchuras y con alturas de pico 310 00:19:53,700 --> 00:19:56,220 Hay cosas que podamos ver 311 00:19:56,220 --> 00:20:01,940 Pues primero, la línea de base, ¿vale? Esto va a corresponder a la fase móvil. 312 00:20:02,059 --> 00:20:09,220 Es como una línea recta que aparece entre los picos, ¿vale? Es como la señal que da la fase móvil. 313 00:20:10,259 --> 00:20:21,759 Luego tendríamos la altura del pico, ¿vale? La altura del pico es la distancia que hay entre la, o la altura que hay entre la cima del pico y la línea de base. 314 00:20:21,759 --> 00:20:29,220 Y aquí pues ya va a depender un poco de la forma que tenga el cromatograma o de la forma que tenga el pico 315 00:20:29,220 --> 00:20:33,759 ¿Vale? Si tiene un vértice redondeado así como si fuera una montanita 316 00:20:33,759 --> 00:20:40,779 Pues la altura de la cima va a quedar determinada por el punto de corte de las dos rectas tangentes 317 00:20:40,779 --> 00:20:43,980 ¿Vale? A los puntos de inflación de las laderas 318 00:20:43,980 --> 00:20:46,900 ¿Vale? Que es lo que sale aquí en esta de aquí 319 00:20:46,900 --> 00:20:48,700 ¿Vale? Es donde sería la altura del pico 320 00:20:48,700 --> 00:20:55,680 No podemos determinar esta, porque qué punto coges este o este, pues lo que se intenta es hacer un triángulo. 321 00:20:56,099 --> 00:21:03,460 Entonces hacemos una tangente aquí, una tangente por aquí y donde se cruce es lo que cogemos como altura del pico. 322 00:21:04,559 --> 00:21:14,259 La anchura del pico es la distancia ahí que hay entre los dos cortes de las laderas con la línea base. 323 00:21:14,259 --> 00:21:18,220 ¿Veis? Aquí no hacemos una extrapolación a las tangentes 324 00:21:18,220 --> 00:21:22,039 ¿Vale? Para la anchura del pico nos quedamos con donde corta 325 00:21:22,039 --> 00:21:23,539 ¿Vale? Tampoco es como en el barrido 326 00:21:23,539 --> 00:21:25,980 Que no llegaba a cortar nunca 327 00:21:25,980 --> 00:21:27,039 Aquí sí, sí corta 328 00:21:27,039 --> 00:21:28,180 Tenemos la línea de base 329 00:21:28,180 --> 00:21:30,859 Luego sube, baja y vuelve a la línea de base 330 00:21:30,859 --> 00:21:34,059 ¿Vale? Unas veces mejor, otras veces con más deriva 331 00:21:34,059 --> 00:21:36,960 O con algún hombro puede salir 332 00:21:36,960 --> 00:21:38,700 Pero siempre va a volver abajo 333 00:21:38,700 --> 00:21:48,700 Otro de los parámetros tendríamos la anchura del pico en la semialtura, aquí es la distancia 334 00:21:48,700 --> 00:21:55,880 que hay entre las dos laderas a la mitad de la altura del pico, la altura recordar que 335 00:21:55,880 --> 00:22:02,079 es hasta arriba del todo, no hasta la cima de la montaña sino hasta que se cruza y las 336 00:22:02,079 --> 00:22:06,420 anchuras todo como hemos puesto tiempo se expresa en unidades de tiempo, tanto la anchura 337 00:22:06,420 --> 00:22:10,140 como la anchura en semi altura son las dos unidades de tiempo 338 00:22:10,140 --> 00:22:14,359 y luego tendríamos lo que es el área 339 00:22:14,359 --> 00:22:17,200 calculamos el área del pico 340 00:22:17,200 --> 00:22:22,420 entonces sería lo que hay entre el pico y la prolongación de la línea 341 00:22:22,420 --> 00:22:25,599 de base, entonces sería la zona de color que hay aquí 342 00:22:25,599 --> 00:22:30,079 en la figura, intentamos calcular el área esa y 343 00:22:30,079 --> 00:22:34,519 al final el área es lo que vamos a utilizar nosotros 344 00:22:34,519 --> 00:22:38,500 como señal. Igual que en espectroscopía nuestra señal era la absorbancia 345 00:22:38,500 --> 00:22:41,759 o en técnicas electroquímicas nuestra señal era el potencial 346 00:22:41,759 --> 00:22:46,380 o la conductividad, aquí nuestra señal o la señal 347 00:22:46,380 --> 00:22:50,180 que íbamos a utilizar nosotros para trabajar con el tratamiento de datos 348 00:22:50,180 --> 00:22:54,500 son las áreas. Las áreas nos van a determinar o nos van a dejar 349 00:22:54,500 --> 00:22:58,259 determinar el porcentaje de cada uno de los componentes 350 00:22:58,259 --> 00:23:02,299 en una mezcla inductable. Lo que sí es que 351 00:23:02,299 --> 00:23:04,700 cuando tengamos varios componentes 352 00:23:04,700 --> 00:23:06,940 en el cromatograma no nos va a salir solamente 353 00:23:06,940 --> 00:23:08,819 un pico, sino que nos van a salir varios 354 00:23:08,819 --> 00:23:10,680 picos y cada uno de los picos 355 00:23:10,680 --> 00:23:12,559 va a corresponder con un componente 356 00:23:12,559 --> 00:23:14,799 ahí sí es donde veríamos la separación 357 00:23:14,799 --> 00:23:16,440 ¿vale? que es lo que pasaba 358 00:23:16,440 --> 00:23:18,980 en esta de aquí 359 00:23:18,980 --> 00:23:20,359 a ver si sale otra vez 360 00:23:20,359 --> 00:23:22,660 ¿vale? en esta 361 00:23:22,660 --> 00:23:24,880 de aquí, yo antes os he dicho 362 00:23:24,880 --> 00:23:26,420 que se iban separando 363 00:23:26,420 --> 00:23:27,940 y me aburrían los colores 364 00:23:27,940 --> 00:23:30,859 y que cada vez que salía un color 365 00:23:30,859 --> 00:23:38,539 por un extremo de aquí, pues se iba a ver un pico diferente, se iba a ver el cromatograma. 366 00:23:38,539 --> 00:23:43,460 Como aquí teníamos tres colores, que eran el rojo, el verde y el azul, pues tendríamos 367 00:23:43,460 --> 00:23:44,460 tres picos. 368 00:23:44,460 --> 00:23:53,099 Lo que sí que decía que los picos no salen siempre bonitos y perfectos, sino que puede 369 00:23:53,099 --> 00:23:58,160 que salgan con algún hombro, que salgan con deriva, que salgan más anchos por un lado 370 00:23:58,160 --> 00:24:05,339 que por otro, son irregulares normalmente. Hasta el momento, pues si hemos estado hablando 371 00:24:05,339 --> 00:24:13,220 de que los analitos quedan retenidos o no en la fase estacionaria, pero imaginad que 372 00:24:13,220 --> 00:24:18,339 estamos en una cromatografía de columna, como la que he puesto yo ahí. Cuando nos 373 00:24:18,339 --> 00:24:22,920 referimos al tiempo, estamos hablando del tiempo que tarda el analito en recorrer una 374 00:24:22,920 --> 00:24:32,859 desde que entra por la columna desde que entra por aquí lo que tarda en recorrer todo esto de 375 00:24:32,859 --> 00:24:40,099 aquí hasta que sale aquí ya saldría y se mediría el tiempo que ha tardado y es la anchura de la que 376 00:24:40,099 --> 00:24:46,259 estamos hablando de los parámetros de antes desde la entrada a la salida si es un analito que por 377 00:24:46,259 --> 00:24:53,539 ejemplo no queda retenido nada, pues tardará poco tiempo. Si es un analito que sí tarda, 378 00:24:53,539 --> 00:25:00,700 y es un analito que queda retenido, pues tardará más. Y entonces ese es el tiempo al que nos 379 00:25:00,700 --> 00:25:06,599 referimos, es el que nos va a dar la información tanto cualitativa, porque el tiempo sí es propio 380 00:25:06,599 --> 00:25:12,680 de cada sustancia, en unas condiciones determinadas, eso sí. Pero bueno, luego nosotros podemos comparar 381 00:25:12,680 --> 00:25:14,460 En base a los tiempos que han tardado en salir 382 00:25:14,460 --> 00:25:15,779 ¿Vale? 383 00:25:16,500 --> 00:25:17,700 La fase móvil, por ejemplo 384 00:25:17,700 --> 00:25:19,839 Hemos dicho que la fase móvil va a desplazar 385 00:25:19,839 --> 00:25:22,220 Va a llevar los componentes de la muestra 386 00:25:22,220 --> 00:25:22,819 Los anonitos 387 00:25:22,819 --> 00:25:24,640 Y también va a atravesar la columna 388 00:25:24,640 --> 00:25:27,339 La fase móvil no debería quedar retenida 389 00:25:27,339 --> 00:25:29,240 La cual entra, va a salir 390 00:25:29,240 --> 00:25:29,579 ¿Vale? 391 00:25:29,599 --> 00:25:30,180 Pero bueno, sí 392 00:25:30,180 --> 00:25:34,299 Tarda un tiempo en recorrer la columna 393 00:25:34,299 --> 00:25:34,460 ¿Vale? 394 00:25:34,460 --> 00:25:35,619 Tiene que pasar por aquí 395 00:25:35,619 --> 00:25:37,299 Se tiene que atravesar todo esto 396 00:25:37,299 --> 00:25:37,960 Entonces, bueno 397 00:25:37,960 --> 00:25:39,319 Aunque sea un segundo, dos segundos 398 00:25:39,319 --> 00:25:39,980 O lo que queráis 399 00:25:39,980 --> 00:25:42,079 Tarda en hacerlo 400 00:25:42,079 --> 00:25:42,480 ¿Vale? 401 00:25:42,680 --> 00:25:44,859 Y eso se la va a llamar tiempo muerto. 402 00:25:45,640 --> 00:25:47,079 El tiempo muerto o el volumen muerto. 403 00:25:48,339 --> 00:25:51,660 Bueno, como generalmente hablamos de tiempos o nos vamos a manejar con tiempos, 404 00:25:52,299 --> 00:25:53,140 pues tiempo muerto. 405 00:25:54,019 --> 00:25:54,759 Ahora, ¿qué pasa? 406 00:25:55,240 --> 00:25:58,240 Si un analito queda retenido, ¿vale? 407 00:25:58,539 --> 00:26:00,160 Pues va a salir más tarde. 408 00:26:00,759 --> 00:26:04,420 Si no queda retenido, pues saldrá a la fase móvil, ¿no? 409 00:26:04,420 --> 00:26:08,339 Entonces, llamamos tiempo de retención o volumen de retención 410 00:26:08,339 --> 00:26:13,259 al tiempo-volumen necesario para que salga cada analito. 411 00:26:14,400 --> 00:26:21,160 Ahora, ¿qué pasa si en este tiempo-volumen, 412 00:26:21,980 --> 00:26:24,539 pero qué pasa? 413 00:26:25,119 --> 00:26:29,599 Pues que en este tiempo-volumen también está metida la fase móvil. 414 00:26:30,259 --> 00:26:33,460 Por tanto, no es un tiempo de verdad, por así decirlo. 415 00:26:33,559 --> 00:26:36,920 Es para averiguar cuánto tiempo realmente está retenido el elemento, 416 00:26:36,920 --> 00:26:38,319 debemos restar 417 00:26:38,319 --> 00:26:41,440 al tiempo que ha tardado en salir 418 00:26:41,440 --> 00:26:42,779 el tiempo muerto 419 00:26:42,779 --> 00:26:43,880 que será 420 00:26:43,880 --> 00:26:47,539 el tiempo muerto de la fase móvil 421 00:26:47,539 --> 00:26:49,319 entonces el tiempo de retención 422 00:26:49,319 --> 00:26:51,099 verdadero, por así decirlo 423 00:26:51,099 --> 00:26:53,059 sería el tiempo muerto menos el tiempo de retención 424 00:26:53,059 --> 00:26:55,359 y así sabemos justo cuánto tiempo 425 00:26:55,359 --> 00:26:56,940 ha estado dentro de la columna 426 00:26:56,940 --> 00:26:59,680 es como si quitáramos el recorrido 427 00:26:59,680 --> 00:27:03,200 y luego hay veces 428 00:27:03,200 --> 00:27:04,519 que lo que nos interesa 429 00:27:04,519 --> 00:27:06,420 es 430 00:27:06,420 --> 00:27:09,079 comparar el tiempo de retención de un analito 431 00:27:09,079 --> 00:27:10,619 con el de la fase inmóvil 432 00:27:10,619 --> 00:27:11,859 ¿vale? esto se le va ya 433 00:27:11,859 --> 00:27:13,839 como un tiempo relativo 434 00:27:13,839 --> 00:27:16,319 se le llama factor de capacidad 435 00:27:16,319 --> 00:27:18,859 ¿vale? y la relación entre el tiempo 436 00:27:18,859 --> 00:27:20,299 de retención verdadero 437 00:27:20,299 --> 00:27:22,940 ¿vale? el rosa, el que hemos hecho ya 438 00:27:22,940 --> 00:27:24,920 la resta y el de la fase 439 00:27:24,920 --> 00:27:25,279 inmóvil 440 00:27:25,279 --> 00:27:28,160 cuanto mayor sea el factor de capacidad 441 00:27:28,160 --> 00:27:30,859 pues mayor será el tiempo de retención del componente 442 00:27:30,859 --> 00:27:32,660 ¿vale? tenemos más numerador 443 00:27:32,660 --> 00:27:34,579 porque tenemos más tiempo de retención 444 00:27:34,579 --> 00:27:35,960 pues más alto será 445 00:27:35,960 --> 00:27:38,140 y más medio será el factor de capacidad 446 00:27:38,140 --> 00:27:40,019 también 447 00:27:40,019 --> 00:27:43,279 hemos dicho que el tiempo de retención 448 00:27:43,279 --> 00:27:44,779 de un alito 449 00:27:44,779 --> 00:27:46,019 en unas condiciones 450 00:27:46,019 --> 00:27:47,359 era fijo 451 00:27:47,359 --> 00:27:49,240 en las mismas condiciones 452 00:27:49,240 --> 00:27:51,859 si variamos las condiciones 453 00:27:51,859 --> 00:27:53,500 pues varía el tiempo 454 00:27:53,500 --> 00:27:56,700 entonces el factor de capacidad 455 00:27:56,700 --> 00:27:58,839 si el tiempo de retención 456 00:27:58,839 --> 00:28:00,759 es fijo 457 00:28:00,759 --> 00:28:01,960 es el factor de capacidad 458 00:28:01,960 --> 00:28:04,240 también debería serlo 459 00:28:04,240 --> 00:28:06,000 y ahora 460 00:28:06,000 --> 00:28:07,759 ¿qué pasa si esto cambia? 461 00:28:08,880 --> 00:28:10,339 pues eso quiere decir 462 00:28:10,339 --> 00:28:11,559 que están cambiando las condiciones 463 00:28:11,559 --> 00:28:14,259 por lo tanto el factor de capacidad 464 00:28:14,259 --> 00:28:16,400 pues también nos va a orientar un poco sobre el mantenimiento 465 00:28:16,400 --> 00:28:17,460 de la columna por ejemplo 466 00:28:17,460 --> 00:28:20,220 si en lugar de 467 00:28:20,220 --> 00:28:22,460 comparar el tiempo de retención del componente 468 00:28:22,460 --> 00:28:23,779 con la fase móvil 469 00:28:23,779 --> 00:28:25,259 lo comparamos con 470 00:28:25,259 --> 00:28:28,059 un componente 471 00:28:28,059 --> 00:28:29,920 con otro, lo que os decía que en vez del factor 472 00:28:29,920 --> 00:28:31,779 de capacidad se llama el tiempo de retención 473 00:28:31,779 --> 00:28:33,440 relativo, ¿vale? 474 00:28:33,480 --> 00:28:35,720 y sería, lo que sí tiene que ser 475 00:28:35,720 --> 00:28:37,759 mayor a la unidad, ¿vale? entonces el que 476 00:28:37,759 --> 00:28:40,119 tenga mayor tiempo de retención va arriba en el numerador 477 00:28:40,119 --> 00:28:41,480 y el otro va abajo 478 00:28:41,480 --> 00:28:43,880 entonces de momento estamos hablando 479 00:28:43,880 --> 00:28:45,920 de tiempos de retención, ¿vale? 480 00:28:45,960 --> 00:28:47,660 de condiciones de la columna, de condiciones 481 00:28:47,660 --> 00:28:49,400 de la ilusión, pero bueno 482 00:28:49,400 --> 00:28:51,759 también hemos dicho que puede que el 483 00:28:51,759 --> 00:28:53,539 anadito no quede retenido, ¿vale? 484 00:28:53,640 --> 00:28:54,779 y salga por la columna, ¿no? 485 00:28:55,240 --> 00:28:57,940 estábamos diciendo de los primeros que si va por ahí pues no sale 486 00:28:57,940 --> 00:28:59,420 es por lo que 487 00:28:59,420 --> 00:29:01,759 su tiempo de retención sería el tiempo 488 00:29:01,759 --> 00:29:07,000 muerto no tal cual hemos dicho que sale pues tiempo de retención igual a tiempo 489 00:29:07,000 --> 00:29:13,500 muerto y entonces el tiempo de retención en el verdadero verdadero de la resta 490 00:29:13,500 --> 00:29:18,759 sería cero por lo tanto el factor de capacidad también sería cero pero esto 491 00:29:18,759 --> 00:29:23,500 esto porque pasa esto porque puede pasar si hay un hábito que sale a la vez que 492 00:29:23,500 --> 00:29:27,420 la fase móvil quiere decir que no está retenido no hay competencia se va siempre 493 00:29:27,420 --> 00:29:31,539 con la fase móvil no tiene atracción por la fase estacional entonces acompaña 494 00:29:31,539 --> 00:29:35,460 siempre a la fase móvil, por lo que está totalmente disuelta la fase móvil y la fase 495 00:29:35,460 --> 00:29:44,240 estacionaria no quiere saber nada. Si vemos un coeficiente de reparto, no tendríamos 496 00:29:44,240 --> 00:29:48,920 nada en la fase estacionaria. Acordaros que el coeficiente de reparto es la concentración 497 00:29:48,920 --> 00:29:54,460 en una fase y la concentración en la otra. Si en la fase estacionaria no hay nada, concentración 498 00:29:54,460 --> 00:30:04,880 Entonces aquí, pues sí podemos establecer una relación entre el tiempo muerto, el tiempo de retención y el coeficiente de reparto. 499 00:30:05,619 --> 00:30:13,240 Aquí igual, pues en función de cuánto sea el tiempo de retención respecto al tiempo muerto, podemos ir jugando un poco con los diferentes factores de capacidad. 500 00:30:14,160 --> 00:30:23,519 Además del factor de capacidad, ¿vale? del tiempo de retención, pues tenemos otros parámetros, otras propiedades que nos vayan a permitir, pues, ver cómo va la separación. 501 00:30:23,519 --> 00:30:27,539 Si estamos trabajando bien, si no, si hay que cambiar alguna cosa, si podemos mejorarla, ¿vale? 502 00:30:27,579 --> 00:30:30,700 En qué condiciones vamos a trabajar. 503 00:30:31,920 --> 00:30:37,160 El parámetro que vamos a ver ahora en el plato teórico es algo imaginario, ¿vale? 504 00:30:37,220 --> 00:30:42,059 En la vida real de la columna no existe físico, no podemos verlo, ¿vale? 505 00:30:42,119 --> 00:30:49,200 Pero es el que se utiliza a la hora de comercializar las columnas y, bueno, se tiene ahí, ¿vale? 506 00:30:49,200 --> 00:30:56,279 De base por si os toca comprar una columna o cuando llegue una columna, ver las condiciones y trabajarlo, ¿vale? 507 00:30:57,079 --> 00:30:58,299 Entonces, es lo que se llama eso. 508 00:30:58,779 --> 00:31:00,900 O el número de platos o el plato teórico, ¿vale? 509 00:31:01,420 --> 00:31:05,839 Entonces, como es algo imaginario que no es físico, pues venga, vamos a imaginar, ¿vale? 510 00:31:06,599 --> 00:31:12,579 Imaginaros que sacamos el relleno de una columna y vamos a dividir en diferentes secciones. 511 00:31:12,759 --> 00:31:14,599 Vamos a hacer lonchas, ¿vale? 512 00:31:14,660 --> 00:31:18,500 Estas secciones las dividimos en más secciones y estas en más. 513 00:31:18,500 --> 00:31:20,200 Entonces, esto, ¿hasta cuándo? 514 00:31:20,500 --> 00:31:22,619 O sea, ¿cuánto de fina podemos hacer la loncha? 515 00:31:22,779 --> 00:31:25,200 ¿Cuánto de fina podemos hacer la sección por la que estamos trabajando? 516 00:31:25,359 --> 00:31:26,019 ¿Cuándo paramos? 517 00:31:26,559 --> 00:31:31,420 Entonces, a estas secciones, las más pequeñas que tengamos, es a lo que se llama platos. 518 00:31:31,920 --> 00:31:35,859 Cuanto más platos tengamos, pues más eficaz va a ser la separación. 519 00:31:36,539 --> 00:31:41,299 Pero bueno, también si tenemos más platos, pues necesitaríamos una columna más larga, ¿no? 520 00:31:41,299 --> 00:31:46,680 Porque tenemos muchas secciones ahí, pues necesitaríamos una columna más larga, ¿no? 521 00:31:46,680 --> 00:31:49,220 o va a depender de 522 00:31:49,220 --> 00:31:51,319 como de grande y como de alto es cada plato 523 00:31:51,319 --> 00:31:52,740 cada plato 524 00:31:52,740 --> 00:31:55,579 ese parámetro, la altura del plato 525 00:31:55,579 --> 00:31:57,839 es otra cosa con la que trabajamos 526 00:31:57,839 --> 00:31:59,259 ahí he puesto 527 00:31:59,259 --> 00:32:01,380 la fórmula 528 00:32:01,380 --> 00:32:02,940 porque, una foto de la fórmula 529 00:32:02,940 --> 00:32:04,779 porque creo que a lo mejor en los apuntes 530 00:32:04,779 --> 00:32:07,099 la paréntesis de lo que vuelvo al cuadrado 531 00:32:07,099 --> 00:32:08,539 no se ve muy allá 532 00:32:08,539 --> 00:32:09,819 pero bueno, es la misma 533 00:32:09,819 --> 00:32:12,700 lo que pasa es que la anchura 534 00:32:12,700 --> 00:32:14,579 uno la ha llamado A y otro la ha llamado 535 00:32:14,579 --> 00:32:15,900 la W, pero 536 00:32:15,900 --> 00:32:20,740 para que veáis que el paréntesis engloba toda la fracción 537 00:32:20,740 --> 00:32:25,200 lo que decíamos, que si nosotros queremos aumentar la eficacia de la columna 538 00:32:25,200 --> 00:32:28,319 pues está bien que haya muchos platos, ¿no? o más o menos bien 539 00:32:28,319 --> 00:32:33,180 y bueno, ya ideal que estos sean pequeños, ¿vale? para que cada sección 540 00:32:33,180 --> 00:32:37,160 pues quepan muchos, muchos, muchos platos, pero creo que si nosotros queremos meter 541 00:32:37,160 --> 00:32:41,579 muchos platos, pues al final lo que estamos haciendo es que la columna sea más larga 542 00:32:41,579 --> 00:32:44,839 ¿vale? si la columna es más larga, tenemos más tiempo 543 00:32:44,839 --> 00:32:47,059 dar más tiempo de análisis, porque la fase móvil 544 00:32:47,059 --> 00:32:48,599 ya va a tardar más en salir, 545 00:32:48,700 --> 00:32:51,220 no lo mismo que una columna de un centímetro que de siete metros. 546 00:32:51,880 --> 00:32:52,900 Entonces, tenemos más tiempo 547 00:32:52,900 --> 00:32:54,960 de análisis. Entonces, tenemos que ir 548 00:32:54,960 --> 00:32:56,700 valorando y ir viendo las dos cosas 549 00:32:56,700 --> 00:32:58,480 cómo las hacemos. 550 00:32:59,339 --> 00:33:00,380 ¿Quién es bien y mejor? 551 00:33:00,599 --> 00:33:02,740 Llegar a un punto intermedio para que 552 00:33:02,740 --> 00:33:04,740 podamos tener una buena eficacia 553 00:33:04,740 --> 00:33:06,799 y no estar siete horas para hacer 554 00:33:06,799 --> 00:33:07,440 una separación. 555 00:33:08,940 --> 00:33:11,039 Por último, tenemos la resolución. 556 00:33:11,599 --> 00:33:12,940 La resolución es 557 00:33:12,940 --> 00:33:14,480 otro de los parámetros que 558 00:33:14,480 --> 00:33:17,099 va a influir en los resultados 559 00:33:17,099 --> 00:33:18,119 que tengamos nosotros 560 00:33:18,119 --> 00:33:20,440 algo de resolución 561 00:33:20,440 --> 00:33:22,900 en espectroscopía 562 00:33:22,900 --> 00:33:23,779 si la hemos visto 563 00:33:23,779 --> 00:33:26,579 en microbiología igual yo comparo siempre 564 00:33:26,579 --> 00:33:28,720 en microbiología el poder de resolución 565 00:33:28,720 --> 00:33:29,880 de microscopio lo habéis visto 566 00:33:29,880 --> 00:33:33,059 nosotros la resolución donde más la hemos visto 567 00:33:33,059 --> 00:33:34,680 ha sido en la parte de infrarrojo 568 00:33:34,680 --> 00:33:37,140 pero bueno así rápidamente 569 00:33:37,140 --> 00:33:39,160 la resolución pues sería 570 00:33:39,160 --> 00:33:41,220 cómo podemos diferenciar dos picos 571 00:33:41,220 --> 00:33:43,319 que estén muy juntitos como si fueran 572 00:33:43,319 --> 00:33:44,200 independientes 573 00:33:44,200 --> 00:33:45,680 vale, ahí tenemos la foto 574 00:33:45,680 --> 00:33:48,440 de aquí lo que decía, pues bueno, en el caso 575 00:33:48,440 --> 00:33:50,400 de la figura de arriba, en este 576 00:33:50,400 --> 00:33:52,339 de aquí, como medimos 577 00:33:52,339 --> 00:33:53,859 el área, como medimos la anchura 578 00:33:53,859 --> 00:33:56,480 si el pico no ha llegado a bajar del todo 579 00:33:56,480 --> 00:33:58,039 no ha llegado a la línea de base, no tenemos 580 00:33:58,039 --> 00:34:00,079 tema de corte, que es ahí, que hacemos ahí 581 00:34:00,079 --> 00:34:02,180 vale, o es el mismo pico y tenemos que 582 00:34:02,180 --> 00:34:04,119 medir de base a base, vale 583 00:34:04,119 --> 00:34:05,119 y aquí que hacemos 584 00:34:05,119 --> 00:34:08,199 en este caso de aquí, tenemos 585 00:34:08,199 --> 00:34:10,079 dos picos, son las fotos que a lo mejor 586 00:34:10,079 --> 00:34:12,039 aquí se ven un poco borrosas, pero son las fotos de 587 00:34:12,039 --> 00:34:13,719 de los apuntes de la plataforma 588 00:34:13,719 --> 00:34:21,460 aquí por ejemplo si tenemos dos picos que están perfectamente separados y de base a base y de 589 00:34:21,460 --> 00:34:28,900 base a base y no tendríamos ningún tipo de problema entonces creo que estáis todos de 590 00:34:28,900 --> 00:34:32,980 acuerdo que cuanto más resolución tengamos pues mejor más separados están los picos 591 00:34:32,980 --> 00:34:38,619 muy nudos tenemos vale y esto entre otras cosas va a depender de la longitud de la 592 00:34:38,619 --> 00:34:44,300 columna entonces cuanto mayor sea la columna vale cuanto más larga sea la columna es mejor 593 00:34:44,300 --> 00:34:51,340 vale más separación y más resolución entonces se ha separado mejor por eso que al final que 594 00:34:51,340 --> 00:34:59,380 sacrificamos vale la resolución y la eficacia o la altura de la columna y el tiempo de análisis 595 00:34:59,380 --> 00:35:05,079 entonces llegar ahí un poco a un punto intermedio vale que podamos separar que veamos bien y que 596 00:35:05,079 --> 00:35:08,360 no tenga que ser mucho tiempo de análisis 597 00:35:08,360 --> 00:35:10,659 más que nada no solamente por el tiempo 598 00:35:10,659 --> 00:35:12,360 el tiempo de análisis 599 00:35:12,360 --> 00:35:13,599 porque ya 600 00:35:13,599 --> 00:35:16,480 los que habéis hecho venir a las prácticas 601 00:35:16,480 --> 00:35:17,579 de HPC 602 00:35:17,579 --> 00:35:20,559 ya os lo he contado que está todo muy automatizado 603 00:35:20,559 --> 00:35:22,519 entonces a veces que el tiempo 604 00:35:22,519 --> 00:35:24,360 de análisis no perdemos 605 00:35:24,360 --> 00:35:26,519 tiempo de analista porque podemos hacer otras cosas 606 00:35:26,519 --> 00:35:28,440 entre medias pero bueno si es un 607 00:35:28,440 --> 00:35:29,400 gasto de fase móvil 608 00:35:29,400 --> 00:35:32,400 si tenemos una columna que sea 609 00:35:32,400 --> 00:35:34,400 7 metros el volumen que tiene 610 00:35:34,400 --> 00:35:37,579 que pasar por ahí, desde que empieza la columna hasta que sale, no es el mismo que si tenemos 611 00:35:37,579 --> 00:35:43,780 una columna de 5 centímetros. Entonces, es gasto de fase móvil, el gasto de disolventes 612 00:35:43,780 --> 00:35:50,280 y los de cromatografía, pues son un pelín más caros, que lo normal no es agua del grifo. 613 00:35:51,380 --> 00:35:55,679 Y ahora vamos a ver un poquito, ¿vale? Porque como esta es la que creo que más habéis 614 00:35:55,679 --> 00:36:00,440 visto en mi tecnología, no me voy a entretener mucho, ¿vale? Los apuntes ya habéis visto 615 00:36:00,440 --> 00:36:02,440 que viene muy poquito y yo la voy a 616 00:36:02,440 --> 00:36:04,340 resolver un poco, ¿vale? Entonces 617 00:36:04,340 --> 00:36:06,219 la cromatografía de capa fina 618 00:36:06,219 --> 00:36:08,420 si vamos a ver cada tipo de cromatografía 619 00:36:08,420 --> 00:36:10,039 yo lo que digo es que me voy a centrar sobre todo 620 00:36:10,039 --> 00:36:12,480 en HPLC, ¿vale? Que es la 621 00:36:12,480 --> 00:36:14,260 parte de cromatografía de líquidos y 622 00:36:14,260 --> 00:36:16,440 columnos y cromatografía 623 00:36:16,440 --> 00:36:18,320 de gases, ¿vale? Cromatografía 624 00:36:18,320 --> 00:36:20,219 de fluidos 625 00:36:20,219 --> 00:36:22,440 supercríticos y de capa fina un poquito 626 00:36:22,440 --> 00:36:24,320 ¿vale? Pero poco, ¿vale? 627 00:36:24,340 --> 00:36:25,900 Porque esta la veis en 628 00:36:25,900 --> 00:36:28,460 biotecnología y la de fluidos supercríticos 629 00:36:28,460 --> 00:36:30,320 es un poco mezclada las dos, entonces 630 00:36:30,320 --> 00:36:32,719 Vamos a ver las diferencias que tiene con las otras dos. 631 00:36:33,420 --> 00:36:35,019 En la cromatografía de capa fina. 632 00:36:35,099 --> 00:36:37,079 Capa fina, en capa fina o en papel. 633 00:36:37,460 --> 00:36:38,199 Cualquiera de las dos. 634 00:36:39,039 --> 00:36:40,219 Esta es muy cívica. 635 00:36:41,699 --> 00:36:43,420 Hasta igual la habéis hecho en el instituto. 636 00:36:44,599 --> 00:36:51,440 Esta que se pone el papel en un rotulador y se ve cómo se separa la tinta en diferentes colores. 637 00:36:52,719 --> 00:36:58,719 En este tipo de cromatografía, la fase móvil es un líquido que va a ascender por capilaridad. 638 00:36:58,719 --> 00:37:01,159 desplazándose por una fase estacional 639 00:37:01,159 --> 00:37:03,760 que es sólida y polar 640 00:37:03,760 --> 00:37:05,440 entonces las placas 641 00:37:05,440 --> 00:37:07,760 que serían estas de aquí 642 00:37:07,760 --> 00:37:10,179 pues si podéis prepararlas vosotros 643 00:37:10,179 --> 00:37:11,659 con la mezcla 644 00:37:11,659 --> 00:37:13,039 y los ingredientes que sean 645 00:37:13,039 --> 00:37:14,139 pero bueno, generalmente 646 00:37:14,139 --> 00:37:16,000 ya se compran bien hechas 647 00:37:16,000 --> 00:37:18,780 entonces tampoco vamos a entrar mucho en detalle 648 00:37:18,780 --> 00:37:20,000 en cómo se prepara la placa 649 00:37:20,000 --> 00:37:22,239 lo que sí, lo que tenemos que hacer nosotros 650 00:37:22,239 --> 00:37:24,320 la parte nuestra, una vez que tenemos la placa 651 00:37:24,320 --> 00:37:26,300 pues la recortamos en base a 652 00:37:26,300 --> 00:37:28,980 el trabajo que vayamos a realizar 653 00:37:28,980 --> 00:37:31,219 las condiciones, cuántos componentes 654 00:37:31,219 --> 00:37:32,840 tengamos, cuánto tiempo necesitamos 655 00:37:32,840 --> 00:37:34,840 si sube muy rápido o no 656 00:37:34,840 --> 00:37:37,179 la por capilaridad 657 00:37:37,179 --> 00:37:39,159 entonces, respetando las condiciones 658 00:37:39,159 --> 00:37:40,519 pues recortamos la placa 659 00:37:40,519 --> 00:37:41,820 ¿vale? y estas pues también 660 00:37:41,820 --> 00:37:44,659 cuanto más aprovechamiento podamos hacer de la placa, mejor 661 00:37:44,659 --> 00:37:46,780 porque también tienen 662 00:37:46,780 --> 00:37:48,019 un precio elevado 663 00:37:48,019 --> 00:37:50,159 lo siguiente que tendríamos que hacer sería 664 00:37:50,159 --> 00:37:53,159 marcar una línea, ¿vale? para tener una referencia 665 00:37:53,159 --> 00:37:54,960 a la hora de aplicar 666 00:37:54,960 --> 00:38:01,860 las muestras al final esto va a ser como una carrera a ver quién llega antes al final para 667 00:38:01,860 --> 00:38:06,900 que sea justo que no haya trampa pues tiene que empezar todos los componentes y todos los 668 00:38:06,900 --> 00:38:12,900 componentes desde el mismo sitio una vez marcada la línea vamos a aplicar con un capilar la muestra 669 00:38:13,800 --> 00:38:19,840 además de la muestra vamos a poner una serie de patrones de los que suponemos que va a tener 670 00:38:19,840 --> 00:38:25,619 muestra para que podamos ver la muestra qué componentes tiene si no comparamos con un patrón 671 00:38:25,619 --> 00:38:32,440 vamos a ver solamente manchas de colores y no vamos a saber qué es entonces tendríamos en este 672 00:38:32,440 --> 00:38:40,719 caso por ejemplo por ejemplo por ejemplo tendríamos el patrón 1 el patrón 2 el patrón 3 y luego pues 673 00:38:40,719 --> 00:38:49,539 1 2 3 y 4 muestras diferentes y luego veremos la separación ponemos la placa en una cubeta donde 674 00:38:49,539 --> 00:38:50,840 se encuentra la fase móvil 675 00:38:50,840 --> 00:38:52,940 y como he dicho 676 00:38:52,940 --> 00:38:55,119 que por capitalidad va ascendiendo 677 00:38:55,119 --> 00:38:56,460 junto con los componentes 678 00:38:56,460 --> 00:38:58,420 aquellos que sean más polares 679 00:38:58,420 --> 00:39:01,300 quedarán retenidos en la fase estacionaria 680 00:39:01,300 --> 00:39:02,679 y no ascenderán 681 00:39:02,679 --> 00:39:05,639 lo que tenemos que tener cuidado 682 00:39:05,639 --> 00:39:06,480 también es 683 00:39:06,480 --> 00:39:09,619 en terminar la elusión antes de que se termine 684 00:39:09,619 --> 00:39:10,659 la placa 685 00:39:10,659 --> 00:39:12,739 que hay muchas veces que nosotros dejamos 686 00:39:12,739 --> 00:39:14,079 que el eluyente vaya subiendo 687 00:39:14,079 --> 00:39:16,840 el eluyente va subiendo por aquí y por aquí 688 00:39:16,840 --> 00:39:18,280 y va arrastrando los componentes 689 00:39:18,280 --> 00:39:20,639 y se nos sale, se va por aquí 690 00:39:20,639 --> 00:39:21,860 y si hay algún componente 691 00:39:21,860 --> 00:39:24,280 que vaya con la fase móvil 692 00:39:24,280 --> 00:39:26,639 ahí se va 693 00:39:26,639 --> 00:39:27,280 y no lo vemos 694 00:39:27,280 --> 00:39:29,820 entonces se nos escapa 695 00:39:29,820 --> 00:39:32,739 y lo que digo es que se escapa un componente 696 00:39:32,739 --> 00:39:33,599 y no lo determinamos 697 00:39:33,599 --> 00:39:35,940 esa sería la separación, a nivel 698 00:39:35,940 --> 00:39:38,639 cualitativo, pues veríamos 699 00:39:38,639 --> 00:39:40,019 la altura de las manchas 700 00:39:40,019 --> 00:39:42,940 lo que antes hablábamos de tiempos de retención 701 00:39:42,940 --> 00:39:44,860 aquí vemos altura de manchas 702 00:39:44,860 --> 00:39:46,559 no vemos un gráfico ni nada 703 00:39:46,559 --> 00:39:50,639 la cromatografía en placa, sino que veríamos una serie de manchas, una serie de círculos 704 00:39:50,639 --> 00:39:54,599 que son de diferentes colores y nosotros lo que hacemos es 705 00:39:54,599 --> 00:39:58,179 calcular la distancia desde la línea de salida 706 00:39:58,179 --> 00:40:02,059 que hemos marcado antes hasta el punto donde se ha quedado. 707 00:40:02,280 --> 00:40:06,619 Si podemos ir de centro a centro, mejor. A nivel cualitativo 708 00:40:06,619 --> 00:40:10,340 vemos la altura de las manchas de la muestra y luego si comparamos 709 00:40:10,340 --> 00:40:14,000 con los patrones, tendríamos una serie de manchas que están en la muestra 710 00:40:14,000 --> 00:40:17,159 y una serie de manchas que salen del patrón. 711 00:40:17,260 --> 00:40:18,639 El patrón sí es puro, ¿vale? 712 00:40:18,639 --> 00:40:21,599 El patrón no tiene mezcla, sale una mancha única. 713 00:40:21,940 --> 00:40:23,840 Entonces, por comparación de alturas del patrón 714 00:40:23,840 --> 00:40:25,599 con las cosas que hayan salido de la muestra, 715 00:40:26,199 --> 00:40:28,940 pues podemos decir, tiene este componente. 716 00:40:29,360 --> 00:40:31,440 Entonces, como han salido del mismo, 717 00:40:31,539 --> 00:40:32,940 tienen la misma altura, pues lo veríamos. 718 00:40:33,659 --> 00:40:35,579 Para el análisis cuantitativo, 719 00:40:36,000 --> 00:40:37,719 pues no aporta mucha información, 720 00:40:38,380 --> 00:40:40,239 pero bueno, se puede medir el área de la mancha 721 00:40:40,239 --> 00:40:42,199 que no suele ser tan redonda. 722 00:40:42,199 --> 00:40:43,559 Es un poquito más irregular.