1 00:00:09,710 --> 00:00:40,299 Bueno, el otro día ya os expliqué la tecnología del ADN recombinante, lo dejé grabado, no sé si habéis tenido tiempo de verlo y si tenéis alguna duda y si no pues continuamos con el tema. 2 00:00:42,299 --> 00:00:43,659 No, no hay dudas, ¿no? 3 00:00:45,729 --> 00:00:53,509 Bueno, pues hoy vamos a seguir, a terminar ya este tema, el tema 4. 4 00:00:54,829 --> 00:01:10,700 Entonces teníamos, a ver si tengo aquí la… vale, teníamos la ingeniería genética y ya hemos visto el corte, cómo se puede cortar el ADN, cómo se puede unir. 5 00:01:10,700 --> 00:01:20,480 Hoy el otro día vimos la tecnología del ADN recombinante, la PCR, la CRISPR vimos un poquito y la hibridación. 6 00:01:21,480 --> 00:01:23,719 Y hoy nos quedaría la secuenciación. 7 00:01:25,659 --> 00:01:34,980 Vale, pues si recordáis que se hacía en cada técnica, pues por ejemplo en la técnica de la PCR, 8 00:01:34,980 --> 00:01:39,980 la PCR es la reacción en cadena de la polimerasa. 9 00:01:40,700 --> 00:01:43,079 Y veis mi pantalla, ¿verdad? 10 00:01:49,140 --> 00:01:50,319 Sí, Susana, así se ve. 11 00:01:50,420 --> 00:01:50,700 Vale. 12 00:01:53,590 --> 00:02:16,270 Entonces, en la PCR, lo que teníamos era que amplificábamos una secuencia de ADN, un fragmento de ADN, lo que tenemos aquí en verde, 13 00:02:16,270 --> 00:02:36,719 A partir de una pequeña muestra amplificamos un segmento de ADN y hacemos miles de copias de este fragmento y utilizamos un termociclador para ello y después estas copias se pueden analizar. 14 00:02:36,719 --> 00:02:45,719 Esto se llama clonación acelular y para ello se utiliza la polimerasa, la TAC polimerasa. 15 00:02:47,580 --> 00:03:04,340 En cambio, la técnica del ADN, de la tecnología del ADN recombinante, la clonación es celular. 16 00:03:04,340 --> 00:03:29,539 ¿Por qué? Porque utilizamos células para hacer copias, también hacemos copias de un pequeño fragmento de ADN, pero estas copias las hacemos, por ejemplo, introduciendo ese pequeño fragmento de ADN en una bacteria y para introducir ese fragmento de ADN en esta bacteria lo que utilizábamos era un vector de clonación, ¿os acordáis? 17 00:03:29,539 --> 00:03:40,039 Es un vector de clonación y este vector de clonación puede ser un plásmido, un virus, un cósmido, pero normalmente lo que se utilizan son plásmidos. 18 00:03:40,900 --> 00:03:52,759 Entonces, ese plásmido se corta, se une al ADN que nos interesa, también se corta, se une el plásmido con el fragmento de ADN, 19 00:03:52,759 --> 00:04:04,020 Ya tendríamos el ADN recombinante que es lo que introducimos en la bacteria y lo que vamos a obtener muchas copias de ese fragmento de ADN recombinante. 20 00:04:04,539 --> 00:04:17,060 Utilizamos una célula para hacer esas copias y además lo que nos interesa es que este fragmento de ADN que estamos copiando va a expresar, va a codificar a una proteína, 21 00:04:17,060 --> 00:04:23,180 a una proteína de interés como puede ser la insulina o puede ser la mona del crecimiento 22 00:04:23,180 --> 00:04:31,639 o puede ser una proteína que tenga propiedades herbicidas cuando nosotros lo que hacemos 23 00:04:31,639 --> 00:04:38,160 es introducirlo en ese ADN en una planta, pues esa proteína que se genera tiene propiedades 24 00:04:38,160 --> 00:04:44,939 herbicidas o insecticidas. Entonces esa es la diferencia entre la PCR y la tecnología 25 00:04:44,939 --> 00:05:08,220 del ADN recombinante. Vimos también al principio lo que era la hibridación. Si os acordáis 26 00:05:08,220 --> 00:05:15,600 en la hibridación lo que hacíamos era, tenemos el ADN que es una doble hélice, la conformación 27 00:05:15,600 --> 00:05:22,480 secundaria es una doble hélice, lo que hacemos era desnaturalizar esa doble hélice, es decir, 28 00:05:22,519 --> 00:05:29,420 desnaturalizar, separamos las dos cadenas de la doble hélice y se separan con, o sea 29 00:05:29,420 --> 00:05:39,050 la desnaturalización se realiza con hidróxido de sodio. Y una vez desnaturalizado lo que 30 00:05:39,050 --> 00:05:45,990 podemos hacer es añadir otro fragmento de ADN que sea complementario a esta secuencia 31 00:05:45,990 --> 00:05:58,569 a una de estas cadenas de ADN que hemos separado y esta secuencia de ADN que añadimos la tenemos marcada con una sonda 32 00:05:58,569 --> 00:06:07,730 y así podemos, si esta secuencia de ADN que añadimos es complementaria al fragmento de ADN que queremos identificar, 33 00:06:08,430 --> 00:06:13,290 pues luego se podrá detectar, porque esta sonda está marcada con un fluorófono. 34 00:06:13,290 --> 00:06:20,350 Bueno, esto es un resumen así un poco rápido de lo que era la hibridación 35 00:06:20,350 --> 00:06:26,670 Y ahora vamos a ver lo que es la secuenciación 36 00:06:26,670 --> 00:06:34,889 Bueno, aquí teníamos la hibridación, la Norder, la Southern, la hibridación in situ 37 00:06:34,889 --> 00:06:39,089 Bueno, pues ahora vamos a ver lo que es la secuenciación, que es el punto 4-3 38 00:06:39,089 --> 00:06:45,329 que dijimos que nos los saltábamos porque a mí me parecía un poquito más complicado 39 00:06:45,329 --> 00:06:49,730 y entonces pues ahora volvemos al punto 4.3. 40 00:06:56,089 --> 00:07:01,839 Entonces, ¿qué es secuenciar el ADN? 41 00:07:02,000 --> 00:07:06,939 Bueno, pues secuenciar lo que significa es que vamos a saber cada uno de los nucleótidos 42 00:07:06,939 --> 00:07:09,879 que están formando esa cadena de ADN. 43 00:07:09,879 --> 00:07:15,519 Vamos a conocer los nucleótidos y el orden en el que están esos nucleótidos. 44 00:07:15,519 --> 00:07:22,379 Vamos a saber si tenemos adenina, timina, timina, adenina, guanina, guanina, citosina, citosina. 45 00:07:22,800 --> 00:07:27,540 Vamos a saber esa secuencia de toda la cadena de ADN. 46 00:07:28,939 --> 00:07:38,019 Bueno, pues esta secuencia de ADN constituye la información genética heredable de un organismo. 47 00:07:38,019 --> 00:07:47,360 Entonces, para determinar la secuencia de ADN es útil en el estudio de la investigación básica de los procesos biológicos fundamentales. 48 00:07:48,839 --> 00:08:00,720 Y las técnicas actuales han aumentado a gran velocidad esta secuenciación, esta detección de la secuencia de ADN. 49 00:08:00,720 --> 00:08:23,500 Y esta técnica también ha sido muy importante para conocer el genoma humano, lo que es el proyecto del genoma humano. El genoma humano tiene como unas 3.000 millones de bases, pues se conoce todo lo que constituye el genoma humano, todas esas bases. 50 00:08:23,500 --> 00:08:43,820 Pues la técnica más importante en secuenciación es denominada secuenciación Sanger. ¿En qué consiste esta secuenciación Sanger? 51 00:08:43,820 --> 00:08:59,419 El principio fundamental de esta secuenciación Sanger es que vamos a utilizar unos nucleótidos trifosfato, o sea, la adenina, la timina, la citosina con el grupo fosfato, 52 00:09:00,419 --> 00:09:12,460 pero esos nucleótidos tienen una característica particular. Esos nucleótidos los vamos a llamar, se llaman didesoxinucleótidos. 53 00:09:12,460 --> 00:09:36,779 Pues esa característica que tienen estos didesoxinucleótidos es la siguiente, y es que nosotros en un nucleótido, el nucleótido normal, lo que teníamos, si os acordáis, teníamos el grupo fosfato, teníamos el azúcar y teníamos la base nitrogenada. 54 00:09:36,779 --> 00:09:50,960 Eso en el nucleótido, un ADN normal, ¿no? Y luego en el azúcar acordaros que teníamos un grupo OH y aquí en este carbono de aquí solamente aquí tenemos un hidrógeno. 55 00:09:50,960 --> 00:09:53,519 recordad que en el ARN 56 00:09:53,519 --> 00:09:55,500 aquí el azúcar es lo que cambia 57 00:09:55,500 --> 00:09:57,759 en el ARN teníamos aquí un OH 58 00:09:57,759 --> 00:09:59,679 y aquí también otro OH 59 00:09:59,679 --> 00:10:02,740 y luego esta de aquí serían eso 60 00:10:02,740 --> 00:10:03,899 las bases nitrogenadas 61 00:10:03,899 --> 00:10:05,220 que en el ADN teníamos 62 00:10:05,220 --> 00:10:08,440 adenina, timina, citosina y guanina 63 00:10:08,440 --> 00:10:11,340 y luego esto de aquí es el grupo fosfato 64 00:10:11,340 --> 00:10:14,299 que es igual en todos los nucleótidos 65 00:10:14,299 --> 00:10:17,299 vale, pues en esta técnica 66 00:10:17,299 --> 00:10:20,440 bueno, perdonad, antes de eso 67 00:10:20,440 --> 00:10:47,460 Y lo que sabemos es que los nucleótidos se unen unos a otros formando toda la cadena de ADN y se unen a través de este carbono de aquí, o sea, a través de este OH de aquí que está en el carbono 3, este OH de aquí y luego el siguiente nucleótido se une por este carbono de aquí, que es el 5. 68 00:10:47,460 --> 00:11:04,440 Entonces, el OH que tiene aquí este azúcar se une al grupo fosfato del siguiente nucleótido. Aquí otra vez, el OH del carbono 3 se une al siguiente nucleótido y por el grupo fosfato. 69 00:11:04,440 --> 00:11:15,100 Recordad que estos eran enlaces fosfodiéster, se llaman fosfodiéster porque tenemos aquí el fósforo y tenemos aquí dos ésteres 70 00:11:15,100 --> 00:11:24,559 Recordad también que las bases nitrogenadas estaban unidas unas a otras pero estos eran puentes de hidrógeno 71 00:11:24,559 --> 00:11:27,320 Unidas a otras con la otra cadena 72 00:11:27,320 --> 00:11:41,259 Pero bueno, aquí lo importante que tenemos que ver aquí es que los nucleótidos tenemos el grupo fosfato, el azúcar con un OH y la base nitrogenada. 73 00:11:41,440 --> 00:11:52,919 Bueno, pues en esta técnica de aquí lo que vamos a hacer es añadir didesoxinucleótidos y los didesoxinucleótidos serían estos de aquí. 74 00:11:53,879 --> 00:12:05,860 Estos tidesoxinucleótidos no tienen OH aquí, ¿veis? Aquí tienen un H y aquí otro, no tienen grupo hidróxilo, no tienen OH aquí en el azúcar. 75 00:12:05,860 --> 00:12:32,860 Por lo tanto, si tenemos este nucleótido, no va a poderse unir aquí ningún otro nucleótido, porque aquí no tenemos grupo OH, aquí no se puede unir este grupo fosfato, porque aquí no tenemos OH, entonces aquí no va a poder continuar la cadena. 76 00:12:32,860 --> 00:13:02,049 Bueno, pues lo que se hace entonces en esta técnica, se hacen una serie de mezclas y los componentes de esta mezcla serían el ADN que queremos codificar, que queremos analizar en forma monocatenaria, o sea, una de las cadenas. 77 00:13:02,049 --> 00:13:22,110 Vamos a necesitar también una ADN polimerasa, la ADN polimerasa que va a ir copiando este ADN. Vamos a necesitar también un cebador, recordad los cebadores son necesarios para que la ADN polimerasa pueda empezar a copiar la cadena. 78 00:13:22,110 --> 00:13:38,769 Pues además vamos a necesitar los cuatro nucleótidos. Estos cuatro nucleótidos son los desoxinucleótidos trifosfáticos. Desoxiadenintrifosfato, desoxicitosintrifosfato. 79 00:13:38,769 --> 00:13:56,850 Esto simplemente es el nucleótido, este de aquí, este nucleótido, pues si esta base de nitrógeno es adenina, pues este es el nucleótido desoxinucleótido, desoxiadenin trifosfato. 80 00:13:56,850 --> 00:14:24,429 Se dice trifosfato porque aquí habría tres grupos fosfato, pero bueno, lo que necesitamos sería eso, el ADN que queremos analizar, la ADN polimerasa, un cebador, los cuatro nucleótidos, porque claro, la ADN polimerasa va a ir copiando la cadena y pues va a tener que ir añadiendo, pues donde haya adenina, pues la ADN polimerasa pone timina, pues coge una timina. 81 00:14:24,429 --> 00:14:44,289 Que hay una guanina, pues coge un nucleótido que tenga citosina y así va copiando. Pero además, lo que os decía, vamos a añadir también nucleótidos didesoxinucleótidos, o sea, didesoxinadenitrifosfato, didesoxicitosinitrifosfato. 82 00:14:45,250 --> 00:14:49,769 Estos didesoxi, o lo que os digo, no tienen aquí grupo OH. 83 00:14:52,700 --> 00:15:00,320 Pues entonces, lo que se hace es preparar cuatro disoluciones diferentes. 84 00:15:01,120 --> 00:15:11,200 En las cuatro tenemos estos componentes, el ADN, el ADN polimerasa, el cebador y los cuatro nucleótidos. 85 00:15:11,200 --> 00:15:17,240 Estos son los componentes comunes en los cuatro tubos de ensayo. 86 00:15:17,940 --> 00:15:20,080 Estos son los cuatro componentes comunes. 87 00:15:20,820 --> 00:15:29,200 Pero luego lo que hacemos es, en uno de ellos añadimos el didesoxiadenin trifosfato. 88 00:15:30,080 --> 00:15:37,779 Por ejemplo, aquí añadimos un nucleótido que como base nitrogenada tiene adenina y que además aquí no tiene grupos OH. 89 00:15:37,779 --> 00:16:02,159 En el siguiente tubo añadimos también el ADN, a descodificar la ADN polimerasa, el cebador, los cuatro nucleótidos y añadimos un D-desoxicitosina, en este caso tenemos la citosina, la citosina sin grupo OH aquí. 90 00:16:02,159 --> 00:16:24,259 En el tercero, pues los mismos, todos estos componentes, pero en este caso la guanina. Aquí como base nitrogenada la guanina y aquí sin OH. Y en el último, pues todos estos componentes más la didesoxi, esta sería la timina. 91 00:16:24,259 --> 00:16:36,139 Vale, entonces aquí adenina, timina, perdón, citosina, guanina y timina, pero este de aquí, endidesoxi, sino H. 92 00:16:37,120 --> 00:16:41,919 Entonces, ¿qué es lo que va a ocurrir cuando tengamos esta mezcla? 93 00:16:42,779 --> 00:16:49,159 Pues que la ADN polimerasa va a ir copiando. 94 00:16:49,159 --> 00:17:04,019 Va a ir copiando la cadena, pero por ejemplo, aquí en este tubo de aquí, va a llegar un momento en el que va a coger, en vez de coger este nucleótido normal, va a coger este otro, el didesoxi. 95 00:17:04,019 --> 00:17:15,980 Pues cuando la ADN polimerasa coja este disoxinucleotido de adenina y lo incorpore a la cadena, ¿qué va a pasar? 96 00:17:15,980 --> 00:17:27,940 Que ahí va a terminar la cadena de copiarse. Ya no puede seguir copiando la ADN polimerasa porque no hay grupo OH al que se pueda unir el siguiente nucleótido. 97 00:17:28,259 --> 00:17:32,599 Entonces ahí va a terminar la reacción. 98 00:17:34,019 --> 00:17:43,200 En el siguiente tubo va a ocurrir algo parecido, lo que pasa es que aquí lo que tenemos es la citosina, la di-desoxi-citosina. 99 00:17:43,200 --> 00:17:47,279 Entonces, la ADN polimerasa va a ir copiando, va copiando, va copiando. 100 00:17:47,799 --> 00:17:54,799 Cuando llegue a una base nitrogenada que haya guanina, la ADN polimerasa copiará como citosina. 101 00:17:55,859 --> 00:18:02,019 Sigue copiando, sigue copiando, si hay otra guanina, pues coge otro nucleótido que sea citosina. 102 00:18:02,019 --> 00:18:15,099 Pero va a haber un momento en el que en vez de coger la citosina normal, el desoxinucleotido normal, con OH, pues va a coger este otro, el didesoxi. 103 00:18:15,420 --> 00:18:27,740 Bueno, pues cuando coja este didesoxinucleotido, ¿qué va a pasar? Que ahí se va a cortar la cadena aquí, ahí ya va a terminar de copiar la ADN polimerasa, ya no se va a poder copiar más. 104 00:18:27,740 --> 00:18:31,819 Vale, entonces aquí tenéis un ejemplo 105 00:18:31,819 --> 00:18:36,079 Bueno, esto es más o menos lo que os he explicado 106 00:18:36,079 --> 00:18:39,759 Para iniciar la secuenciación se deben realizar cuatro mezclas 107 00:18:39,759 --> 00:18:46,380 Cada una de ellas debe contener el ADN a secuenciar, los cuatro nucleótidos, la ADN polimerasa y el cebador 108 00:18:46,380 --> 00:18:51,880 Además, en cada una de las mezclas se debe introducir un nucleótido de disoxi distinto 109 00:18:52,720 --> 00:18:59,940 El proceso que se lleva a cabo se inicia con la adhesión de los cebadores en la parte correspondiente de la cadena de ADN. 110 00:19:00,619 --> 00:19:06,299 Acordaros que siempre tiene que haber un cebador para que pueda empezar a copiar la ADN polimerasa. 111 00:19:07,319 --> 00:19:11,420 Entonces se inicia la replicación del ADN molde gracias a la acción de la enzima. 112 00:19:11,900 --> 00:19:21,759 En el orden en que la cadena molde vaya informando, la enzima añadirá los nucleótidos necesarios para completar la cadena de nueva creación. 113 00:19:21,880 --> 00:19:45,740 Esto es lo que ya os he contado. Ahora, este proceso se va realizando simultáneamente en una gran cantidad de moléculas de ADN, por lo que estadísticamente cada vez que se deba añadir una nueva base, alguna de esas moléculas no añadirán un nucleótido, sino que añadirán un nucleótido di-desoxi. 114 00:19:45,740 --> 00:19:53,319 Estos últimos tienen la particularidad de haber perdido el grupo OH del carbono 3 115 00:19:53,319 --> 00:19:57,759 por lo que en el momento en que se incorporan en la cadena que se está formando 116 00:19:57,759 --> 00:20:03,720 finalizan la reacción, puesto que no disponen de la capacidad de introducir el siguiente nucleótido 117 00:20:03,720 --> 00:20:10,539 Así pues, la cadena se irá replicando al mismo tiempo los cuatro recipientes 118 00:20:10,539 --> 00:20:14,700 de tal forma que en cada uno van quedando algunas cadenas finalizadas 119 00:20:14,700 --> 00:20:20,539 cuando se incorpora un nucleótido correspondiente al didesoxi introducido en ese recipiente. 120 00:20:23,259 --> 00:20:28,380 Bueno, pues vamos a ver el ejemplo que tenéis aquí en el documento. 121 00:20:28,380 --> 00:20:32,059 Tenemos, por ejemplo, esta secuencia que se quiere replicar. 122 00:20:32,240 --> 00:20:41,059 Citosina, adenina, citosina, guanina, timina, adenina, adenina, guanina, citosina, timina, guanina, guanina, timina, adenina y guanina. 123 00:20:42,180 --> 00:20:43,700 Esto es ADN. 124 00:20:43,700 --> 00:21:02,519 Pues ahora, la cadena complementaria que se va a copiar, que se va a replicar, pues sería, si aquí tenemos citosina, guanina, adenina, timina, guanina, citosina, adenina, timina, timina, citosina, guanina, adenina, citosina, ¿ves? 125 00:21:03,039 --> 00:21:09,900 Si tenemos aquí guanina, pues citosina, guanina, citosina, timina, adenina, adenina, timina, guanina, citosina. 126 00:21:09,900 --> 00:21:22,119 Bueno, pues si solamente tuviéramos los nucleótidos normales, los de soxinucleótidos, pues esta cadena se copiaría tal cual. 127 00:21:23,200 --> 00:21:32,839 Pero, lo que os digo, en esta tecnología, tecnología Sanger, utilizamos cuatro tubos diferentes. 128 00:21:32,839 --> 00:21:51,200 Entonces, en este tenemos la didesoxiadenina y entonces cuando la cadena, cuando la ADN polimerasa empieza a copiar, pues empieza a copiar, ¿no? La citosina, pues pone guanina, adenina, timina, citosina, guanina, guanina, citosina. 129 00:21:51,200 --> 00:22:06,059 Ahora, llega aquí timina y tiene que poner una adenina. Pues resulta que esta adenina que ha cogido es la didesoxi, por lo tanto ya no puede continuar la cadena copiándose. 130 00:22:06,579 --> 00:22:16,960 Aquí termina este fragmento de ADN que se copia. Entonces, estadísticamente se van formando todas estas secuencias. 131 00:22:16,960 --> 00:22:25,299 Habrá otro momento en el que la adenopolimerasa va copiando, va copiando, va copiando, va copiando 132 00:22:25,299 --> 00:22:28,700 hasta que llega, por ejemplo, aquí a esta timina 133 00:22:28,700 --> 00:22:35,680 Entonces, en esta timina, en vez de coger la adenina normal, la desoxiadenina con el grupo H 134 00:22:35,680 --> 00:22:37,680 coge la didesoxi 135 00:22:37,680 --> 00:22:46,859 Por lo tanto, aquí, si se une una adenina didesoxi, pues aquí termina la cadena de copiarse 136 00:22:46,859 --> 00:22:57,799 En cambio, en este tubo de aquí, que tenemos la didesoxicitosina, pues la ADN polimerasa va copiando. 137 00:22:58,099 --> 00:23:02,480 Copia citosina, guanina, adenina, timina, citosina, guanina. 138 00:23:02,900 --> 00:23:06,079 Ahora, aquí por ejemplo, guanina, citosina. 139 00:23:06,319 --> 00:23:11,359 Pues aquí es probable que en vez de coger una citosina normal, coja la didesoxi. 140 00:23:11,359 --> 00:23:16,259 Pues aquí se pararía de copiar la ADN polimerasa. 141 00:23:16,259 --> 00:23:24,640 ya no puede continuar de copiar. Luego se va a formar otro fragmento que llegue hasta 142 00:23:24,640 --> 00:23:31,660 aquí, hasta esta citosina que se copia y ya aquí pare. En este caso de aquí que tenemos 143 00:23:31,660 --> 00:23:41,640 la didesoxiguanina, puede ser que en el primer nucleótido que tenemos citosina y que lo 144 00:23:41,640 --> 00:23:47,519 copiamos con la ADN polimerasa, tiene que poner guanina, puede ser que la ADN polimerasa 145 00:23:47,519 --> 00:23:57,799 ya coja el didesoxi y entonces ya la cadena para de copiarse. Y así sucesivamente. En 146 00:23:57,799 --> 00:24:03,740 este de aquí tenemos la didesoxi timina, pues la ADN polimerasa copia citosina, guanina, 147 00:24:03,859 --> 00:24:10,460 adenina, timina. Pues aquí timina, aquí ya ha cogido la timina, la didesoxi, aquí 148 00:24:10,460 --> 00:24:19,279 ya se para de copiar la cadena. Para analizar todos estos fragmentos de ADN, lo que se hace 149 00:24:19,279 --> 00:24:25,180 es una electroforesis en gel de agarosa. A los que habéis hecho las prácticas ya habéis 150 00:24:25,180 --> 00:24:35,119 visto cómo es la técnica. Entonces, prepararíamos el gel de agarosa y le haríamos, si os acordáis, 151 00:24:35,119 --> 00:24:42,319 le hacíamos una serie de pocillos, aquí hacemos 4 pocillos y en cada uno de los pocillos 152 00:24:42,319 --> 00:24:49,039 lo que vamos a introducir es cada una de estas disoluciones, entonces en cada una de 153 00:24:49,039 --> 00:24:55,319 estas disoluciones vamos a tener diferentes fragmentos de ADN y además cada uno de ellos 154 00:24:55,319 --> 00:25:04,200 tiene diferente masa molecular, acordaros los de mayor masa molecular quedan retenidos 155 00:25:04,200 --> 00:25:14,119 arriba, porque el gel de agarosa tiene una serie de poros, y por esos poros, los de mayor 156 00:25:14,119 --> 00:25:20,140 peso molecular no pueden atravesar esos poros y el ADN queda retenido arriba. En cambio 157 00:25:20,140 --> 00:25:28,079 los de menor peso molecular, que serían estos, la guanina, guanina timina, esos sí que van 158 00:25:28,079 --> 00:25:33,920 a ir atravesando los poros y nos aparecerán en la parte de abajo del gel. Bueno, pues 159 00:25:33,920 --> 00:25:45,640 Entonces, como hemos introducido en cada pocillo, introducimos estas disoluciones, esta aquí, esta por aquí, esta por aquí y esta aquí en el 4, 160 00:25:45,920 --> 00:26:01,500 pues por ejemplo, en el pocillo 3, en el que teníamos la didesoxi guanina, pues en este pocillo nos va a aparecer una banda en la que solamente vamos a tener guanina, que será esta de aquí. 161 00:26:01,500 --> 00:26:04,960 tendremos otra banda en la que vamos a tener 162 00:26:04,960 --> 00:26:06,759 guanina, timina y guanina 163 00:26:06,759 --> 00:26:08,140 que sería esta de aquí 164 00:26:08,140 --> 00:26:11,200 otra banda en la que vamos a tener 165 00:26:11,200 --> 00:26:14,119 estas hasta aquí 166 00:26:14,119 --> 00:26:17,619 hasta este fragmento 167 00:26:17,619 --> 00:26:22,420 en este de aquí que sería la timina 168 00:26:22,420 --> 00:26:23,720 pues algo parecido 169 00:26:23,720 --> 00:26:26,099 en el primero tendremos guanina, timina 170 00:26:26,099 --> 00:26:27,420 este de aquí 171 00:26:27,420 --> 00:26:43,420 El siguiente sería guanina timina, guanina citosina, adenina timina. Pues sería este de aquí, guanina timina, guanina citosina, adenina timina. Y así sucesivamente, acordaros, los de mayor peso molecular arriba. 172 00:26:43,420 --> 00:26:50,220 Pues así vamos a poder saber la secuencia de nucleótidos de nuestro ADN. 173 00:26:52,799 --> 00:27:07,460 Bueno, pues esta técnica nos sirve para secuencias de ADN más bien cortas, entre comillas, como hasta 500 fragmentos. 174 00:27:07,460 --> 00:27:22,880 Pero claro, si queremos, por ejemplo, para el estudio del genoma humano, que la longitud es de 3.000 millones de bases, pues lo que tenemos que, claro, no podemos hacer tantas secuencias de este tipo, sería muy difícil. 175 00:27:22,880 --> 00:27:26,619 Y entonces lo que se hace es una técnica Sanger modificada. 176 00:27:27,980 --> 00:27:35,400 Pero antes de eso, vamos a ver, bueno, aquí tenemos en resumen, cada vez que se introduce un nucleótido, 177 00:27:36,180 --> 00:27:44,539 existe la probabilidad, y de hecho sucede, de que en alguna de las cadenas, en lugar de desoxi-X, lo que sea, 178 00:27:44,960 --> 00:27:47,319 se introduzca la di-desoxi-X. 179 00:27:47,319 --> 00:27:49,920 y esto es lo que ya os he dicho 180 00:27:49,920 --> 00:27:52,619 a continuación se colocan muestras de los cuatro recipientes 181 00:27:52,619 --> 00:27:54,440 en cuatro carriles distintos del gel 182 00:27:54,440 --> 00:27:56,859 y se separan por electrofloresis 183 00:27:56,859 --> 00:27:59,779 las posiciones relativas entre las cuatro calles 184 00:27:59,779 --> 00:28:01,880 se utilizan entonces para leer de abajo a arriba 185 00:28:01,880 --> 00:28:03,940 la secuencia de ADN como se indica 186 00:28:03,940 --> 00:28:06,779 de esta manera se puede deducir el orden 187 00:28:06,779 --> 00:28:09,460 y la composición de la cadena que se ha sintetizado 188 00:28:09,460 --> 00:28:12,539 a su vez esta es la cadena complementaria 189 00:28:12,539 --> 00:28:13,940 de la cadena inicial 190 00:28:13,940 --> 00:28:31,569 Vale, entonces vamos a ver este vídeo que hay aquí, a ver, lo tenía aquí abierto. 191 00:28:31,569 --> 00:28:44,400 Veis en la pantalla, ahora he puesto, voy a poner un vídeo de Youtube. 192 00:28:44,400 --> 00:28:46,400 Vale, gracias. 193 00:28:46,400 --> 00:28:52,039 Vale, pues entonces voy a poner este vídeo que dura poquito, son dos minutos, para que 194 00:28:52,039 --> 00:29:04,319 entendáis como no tiene voz, sólo tiene música, porque así no lo escucha. 195 00:29:04,319 --> 00:29:11,319 Ahora hay que desnaturalizar el ADN. 196 00:29:11,319 --> 00:29:18,849 Y ahora lo que se escucha sería la secuencia que queremos copiar. 197 00:29:18,849 --> 00:29:37,329 Añadimos el timer y ponemos lo común. 198 00:29:37,329 --> 00:29:44,329 Añadimos también los dióxidos, los óxidos dióxidos. 199 00:29:44,329 --> 00:29:46,750 y añadimos los didesoxi en cada uno 200 00:29:46,750 --> 00:29:50,069 y otro referente 201 00:29:50,069 --> 00:29:51,250 didesoxi 202 00:29:51,250 --> 00:29:55,220 voy a echar el volumen 203 00:29:55,220 --> 00:29:57,680 vale, hemos añadido 204 00:29:57,680 --> 00:29:59,259 entonces aquí tenemos 205 00:29:59,259 --> 00:30:01,380 un segundo, vuelvo atrás 206 00:30:01,380 --> 00:30:04,279 aquí tenemos la cadena 207 00:30:04,279 --> 00:30:05,940 el primer que ya se 208 00:30:05,940 --> 00:30:07,740 ha hibridado a la cadena 209 00:30:07,740 --> 00:30:10,380 tenemos los nucleótidos 210 00:30:10,380 --> 00:30:11,900 normales y el 211 00:30:11,900 --> 00:30:14,480 y el didesoxi en cada uno 212 00:30:14,480 --> 00:30:16,039 en cada tubo uno diferente 213 00:30:16,039 --> 00:30:39,819 Ahora la ADN polimerasa va copiando, va copiando hasta que por ejemplo en este caso ha llegado esta base nitrogenada que no tiene grupo H, esto lo identifican así, pues ahí ya para de copiar la ADN polimerasa, ahí ya para, ahí ya tendríamos un fragmento. 214 00:30:39,819 --> 00:31:05,190 donde se van formando diferentes fragmentos en cada tubo 215 00:31:05,190 --> 00:31:09,490 luego haríamos la gel, bueno aquí lo hacen en gel de poliacrilamida 216 00:31:09,490 --> 00:31:19,700 se aplica una carga, acordaros como el ADN tiene carga negativa debido a los grupos fosfato 217 00:31:19,700 --> 00:31:24,599 pues la carga negativa se va a dirigir hacia el polo positivo 218 00:31:24,599 --> 00:31:29,519 y así obtenemos los diferentes fragmentos 219 00:31:29,519 --> 00:31:46,160 cuando más pequeño pues van a aparecer más abajo 220 00:31:46,160 --> 00:31:49,299 menor masa molecular más abajo 221 00:31:49,299 --> 00:31:51,900 y así 222 00:31:51,900 --> 00:31:54,019 vemos todos los 223 00:31:54,019 --> 00:31:57,380 podemos obtener 224 00:31:57,380 --> 00:32:00,079 el ADN, la secuencia 225 00:32:00,079 --> 00:32:08,319 aquí en este caso 226 00:32:08,319 --> 00:32:10,140 la primera es adenina 227 00:32:10,140 --> 00:32:11,140 luego anina 228 00:32:11,140 --> 00:32:14,019 bueno aquí lo ponen un poco 229 00:32:14,019 --> 00:32:15,140 diferente 230 00:32:15,140 --> 00:32:21,470 y así podemos conocer 231 00:32:21,470 --> 00:32:24,289 la secuencia de este fragmento 232 00:32:24,289 --> 00:32:26,069 de ADN 233 00:32:26,069 --> 00:32:35,710 vale, pues lo que os decía 234 00:32:35,710 --> 00:32:50,910 vale, lo que os decía 235 00:32:50,910 --> 00:32:52,569 esto nos sirve pues para 236 00:32:52,569 --> 00:32:53,730 diferenciar 237 00:32:53,730 --> 00:32:55,549 como unos 500 238 00:32:55,549 --> 00:32:57,529 fragmentos 239 00:32:57,529 --> 00:33:00,640 pero para el 240 00:33:00,640 --> 00:33:04,039 para el, por ejemplo 241 00:33:04,039 --> 00:33:05,619 para el estudio del genoma humano 242 00:33:05,619 --> 00:33:08,140 si necesitamos analizar 243 00:33:08,140 --> 00:33:09,720 unos 3.000 millones de bases 244 00:33:09,720 --> 00:33:11,539 esto no es viable 245 00:33:11,539 --> 00:33:22,170 Se ha hecho una técnica de Sanger modificada. ¿En qué consiste esta técnica modificada? 246 00:33:23,329 --> 00:33:33,480 Pues mirad, hay dos formas. Una sería la secuenciación utilizando colorantes que se acoplan al cebador. 247 00:33:33,480 --> 00:33:42,319 y este cebador se puede marcar en su extremo 5' mediante un colorante fluorescente 248 00:33:42,319 --> 00:33:48,920 y así luego puedes detectar las secuencias de ADN. 249 00:33:49,740 --> 00:33:57,660 Pero la técnica más novedosa sería esta, que es la secuenciación por terminador fluorescente. 250 00:33:57,660 --> 00:34:08,840 La ventaja que tiene esta técnica es que en una sola reacción se obtiene la secuencia de ADN 251 00:34:08,840 --> 00:34:14,880 Es decir, no necesitamos poner los cuatro didesoxinucleótidos en cada tubo 252 00:34:14,880 --> 00:34:19,699 Sino que en un mismo tubo se puede hacer toda la reacción 253 00:34:19,699 --> 00:34:27,460 Y ahora lo que se hace es marcar cada uno de los cuatro didesoxinucleótidos con un colorante fluorescente diferente 254 00:34:27,460 --> 00:34:31,219 y luego se separan por cromatografía. 255 00:34:32,440 --> 00:34:40,019 Entonces, de esta técnica, simplemente saber eso que es una técnica mejorada, de la técnica Sanger, 256 00:34:40,960 --> 00:34:48,960 vamos a ver este vídeo de Javier Novo, de este científico, para que lo entendáis. 257 00:34:48,960 --> 00:34:57,099 Pero lo que quiero que sepáis es lo que es la técnica Sanger, la sencilla, 258 00:34:57,460 --> 00:35:05,579 Y luego esta, simplemente saber que hay una técnica mejor, que se utilizan colorantes florescentes. 259 00:35:06,800 --> 00:35:08,699 Y mirad, vamos a ver este vídeo. 260 00:35:09,500 --> 00:35:11,280 Creo que lo tengo aquí abierto también. 261 00:35:27,139 --> 00:35:28,159 Voy a poner... 262 00:35:34,010 --> 00:35:36,769 La secuenciación consta de un cebador. 263 00:35:37,849 --> 00:35:41,489 Voy a poner los subtítulos, que de paso no lo escucháis. 264 00:35:41,889 --> 00:35:43,429 Una reacción de secuenciación... 265 00:35:43,429 --> 00:35:44,570 A ver, paro. 266 00:35:46,050 --> 00:36:02,920 Una reacción de secuenciación consta de un cebador, una cadena de ADN molde que queremos secuenciar, 267 00:36:03,820 --> 00:36:13,940 obsérvese la dirección 5'-3' de esta cadena y del cebador, nucleótidos libres y una molécula de ADN polimerasa que es la que va a llevar a cabo la síntesis. 268 00:36:13,940 --> 00:36:39,760 El cebador se une a la cadena molde por complementariedad de bases y la ADN polimerasa va a sintetizar ADN extendiendo el cebador a partir de su extremo 3', incorporando los nucleótidos complementarios a cada una de las posiciones de la cadena molde que queremos secuenciar. 269 00:36:39,760 --> 00:36:49,159 La reacción comienza cuando los nucleótidos se van incorporando por acción de la polimerasa a la cadena molde que se quiere secuenciar 270 00:36:49,159 --> 00:36:54,900 En la mezcla de nucleótidos hay algunos que están marcados con un fluorocromo 271 00:36:54,900 --> 00:36:58,960 y a su vez terminan la síntesis de la cadena 272 00:36:58,960 --> 00:37:03,920 Cuando uno de estos nucleótidos se incorpora, la extensión de la cadena se termina 273 00:37:03,920 --> 00:37:08,920 como sucede en este caso con esta adenina que va marcada con un fluorocromo específico 274 00:37:08,920 --> 00:37:14,780 específico y que termina la cadena. Lógicamente hay cuatro tipos de moléculas terminadoras, 275 00:37:14,880 --> 00:37:20,099 cada una de ellas marcadas con un fluorocromo distinto, de manera que al final de la reacción 276 00:37:20,099 --> 00:37:27,760 tenemos cadenas que han sido extendidas en todos los posibles tamaños, cada una de ellas terminada 277 00:37:27,760 --> 00:37:34,420 por un fluorocromo distinto. Así se pueden obtener lecturas de unos 500-800 nucleótidos de longitud. 278 00:37:34,420 --> 00:37:56,340 Todos estos fragmentos hay que introducirlos después en un aparato especial, un secuenciador, que hace una electroforesis en un capilar para separar cada uno de estos fragmentos por tamaños, de manera que los fragmentos más pequeños migran más rápido que los fragmentos de tamaños mayores. 279 00:37:56,340 --> 00:38:08,539 Esto lo vemos aquí ejemplificado muy bien con todos los fragmentos que hemos obtenido al ir leyendo esta secuencia molde, cada uno de ellos terminado por un fluorocromo distinto. 280 00:38:09,239 --> 00:38:18,179 Cuando todos estos fragmentos se introducen en el capilar donde tiene lugar la electroforesis, la migración es distinta. 281 00:38:18,280 --> 00:38:21,880 Los fragmentos más pequeños avanzan más rápido que los fragmentos mayores. 282 00:38:22,619 --> 00:38:47,820 Por tanto llegan antes al final del capilar donde hay un láser que excita los fluorocromos que emiten una luz en una longitud de onda distinta y de esta forma podemos ir viendo la secuencia de nucleótidos que se han ido incorporando en la reacción, que no es otra que la secuencia complementaria a la de la cadena molde original que queríamos secuenciar. 283 00:38:47,820 --> 00:38:56,400 Al final obtenemos archivos de este tipo con una gran cantidad de picos que indican la secuencia de nucleótidos de la molécula original. 284 00:38:58,929 --> 00:39:01,329 Si quieres un café con leche, no pidas café con leche. 285 00:39:01,909 --> 00:39:08,949 Vale, pues bueno, como veis, esta técnica es mucho más útil, ¿no? 286 00:39:08,949 --> 00:39:16,849 más rápida sobre todo 287 00:39:16,849 --> 00:39:19,230 en un mismo tubo 288 00:39:19,230 --> 00:39:21,829 ya podemos analizar 289 00:39:21,829 --> 00:39:24,289 toda la secuencia de ADN 290 00:39:24,289 --> 00:39:29,860 bien, pues esto sería la secuenciación 291 00:39:29,860 --> 00:39:31,099 entonces 292 00:39:31,099 --> 00:39:34,380 de este tema de aquí nos quedaría 293 00:39:34,380 --> 00:39:35,980 como hemos saltado 294 00:39:35,980 --> 00:39:39,980 hemos visto, vimos el punto 4-1 295 00:39:39,980 --> 00:39:51,119 que era el corte y unión de moléculas de ADN, luego el 4-2, que era la hibridación, que eso lo vimos ya hace tiempo, 296 00:39:52,219 --> 00:40:02,719 ahora hemos visto la secuenciación, que es el punto 4-3, después está el punto 4-4, que es la PCR, la reacción en cadena de la polimerasa, 297 00:40:02,719 --> 00:40:14,679 De la PCR me faltan un poco las aplicaciones, eso lo vamos a ver el próximo día, eso se me quedó por explicar. 298 00:40:15,639 --> 00:40:26,780 Y luego tenemos el punto 4.5 que es la clonación o la tecnología del ADN recombinante, que eso es lo que os puse la clase grabada. 299 00:40:26,780 --> 00:40:42,280 Y de esta también me queda un poco explicaros un poco mejor la parte final de las aplicaciones y también alguna cosilla, la biobalística también me parece que me faltó por explicar. 300 00:40:42,280 --> 00:41:12,260 Pero yo creo que esto mejor lo vemos el próximo día. 301 00:41:12,260 --> 00:41:20,179 haciendo ese ejercicio, pues aplicamos la bioinformática. Y entonces luego, así ya 302 00:41:20,179 --> 00:41:28,000 terminaríamos este tema. El tema 4.6 nos quedaría también por repasar pues alguna 303 00:41:28,000 --> 00:41:34,440 de las autoevaluaciones que tenéis ahí, que aparecen a lo largo del documento y que 304 00:41:34,440 --> 00:41:45,639 no tenemos hecho. Y bueno, voy a explicaros este punto, el punto 4-6, a ver si nos da 305 00:41:45,639 --> 00:42:05,190 tiempo. Este punto es cortito, ya os digo que tampoco vamos a entrar en demasiado detalle. 306 00:42:05,190 --> 00:42:13,710 Yo creo que es más importante las otras técnicas. Bueno, pues en este punto lo que 307 00:42:13,710 --> 00:42:23,949 nos hablan es identificar microorganismos. Entonces, nosotros normalmente lo que se hace 308 00:42:23,949 --> 00:42:31,210 es, por ejemplo, cuando hay un crimen, lo que se hace es analizar las huellas dactilares, 309 00:42:31,210 --> 00:42:45,070 por ejemplo, o analizar la sangre o saliva y de ahí sacar el ADN de ese posible sospechoso. 310 00:42:46,610 --> 00:42:57,869 Hay veces que no tenemos material biológico para analizar, no hay cantidad suficiente de sangre 311 00:42:57,869 --> 00:43:09,190 o no hay huellas. Entonces, hay una técnica que sería analizar los microorganismos, o sea, las bacterias. 312 00:43:10,789 --> 00:43:18,389 Entonces, en estos casos las bacterias podrían aportar información complementaria. Bueno, voy a leer esto de aquí. 313 00:43:18,469 --> 00:43:25,550 Las huellas dactilares y el estudio del ADN humano son herramientas de probada eficacia en el lugar de un hecho criminal. 314 00:43:25,550 --> 00:43:30,849 sin embargo no siempre es posible disponer de ellas. Hay situaciones en las que por falta de 315 00:43:30,849 --> 00:43:37,409 materiales biológicos tales como por ejemplo sangre o saliva no se tienen posibilidades de 316 00:43:37,409 --> 00:43:44,309 tomar muestras de ADN humano o bien los objetos susceptibles de presentar huellas tienen superficies 317 00:43:44,309 --> 00:43:50,010 en donde no quedan impresas de forma satisfactoria. En estos casos las bacterias podrían aportar 318 00:43:50,010 --> 00:43:55,250 información complementaria. Numerosos estudios en el campo de la microbiología ya habían 319 00:43:55,250 --> 00:44:01,630 dejado clara la gran variabilidad de comunidades de bacterias presentes entre las personas. 320 00:44:02,429 --> 00:44:06,949 No todos los individuos tienen las mismas bacterias en sus manos. Las huellas dactilares 321 00:44:06,949 --> 00:44:11,630 bacterianas dejarán rastros que ayudarán a identificar rápidamente al sospechoso y 322 00:44:11,630 --> 00:44:18,150 resolverán el caso. Es decir, por medio del análisis de las bacterias que se hayan quedado 323 00:44:18,150 --> 00:44:22,289 podemos identificar al sospechoso. 324 00:44:23,349 --> 00:44:29,489 Bueno, pues hay dos métodos de identificación, los métodos fenotípicos y los métodos genotípicos. 325 00:44:30,329 --> 00:44:36,670 Los métodos fenotípicos, pues esto seguramente habéis estudiado en biología, ¿no? 326 00:44:37,250 --> 00:44:44,150 ¿Cómo se pueden estudiar? Pues las propiedades bioquímicas o la morfología de los microorganismos, 327 00:44:44,150 --> 00:44:51,329 organismos, el color de las colonias y a partir de estas propiedades podemos tipificar un 328 00:44:51,329 --> 00:44:57,150 tipo de bacteria u otra. Ahora, ¿qué ocurre con estos métodos fenotípicos? Pues que 329 00:44:57,150 --> 00:45:05,130 el poder de tipificar es limitado, no se pueden tipificar todas las bacterias porque cada 330 00:45:05,130 --> 00:45:11,110 uno es aplicable a un número reducido de especies bacterianas. Cada ensayo de estos, 331 00:45:11,110 --> 00:45:15,929 pues cada estudio es aplicable solamente a una serie de especies bacterianas. 332 00:45:16,869 --> 00:45:20,750 Bueno, pues para resolver esto tenemos los métodos genotípicos. 333 00:45:21,750 --> 00:45:26,510 Entonces, en estos, ¿qué se analiza? Pues la genética, genotípico. 334 00:45:26,630 --> 00:45:29,409 Se analiza la estructura genética de ese organismo. 335 00:45:29,409 --> 00:45:34,809 Y estos tienen la ventaja de que se pueden aplicar a cualquier especie bacteriana. 336 00:45:37,679 --> 00:45:41,860 Vale, pues entonces, dentro de estos métodos genotípicos tenemos tres tipos. 337 00:45:41,860 --> 00:46:00,619 Podemos analizar los perfiles plasmídicos, podemos analizar los perfiles de restricción del ADN genómico o podemos analizar, o sea, se puede hacer un perfil de amplificación génica basado en la PCR, la reacción en cadena de la polimerasa. 338 00:46:00,619 --> 00:46:16,599 Bueno, pues por ejemplo, los perfiles plasmídicos. El plasmido, acordaros que es un cromosoma que se replica independiente del cromosoma de la célula, de la bacteria. 339 00:46:16,599 --> 00:46:22,940 ¿Cómo podemos estudiar estos plásmidos? 340 00:46:23,519 --> 00:46:27,219 Haríamos un análisis celular, o sea, romper la membrana plasmática 341 00:46:27,219 --> 00:46:31,159 obtener el ADN plasmídico, o sea, separar el ADN 342 00:46:31,159 --> 00:46:35,539 lo que es el plasmídico del cromosómico, esto ya lo vimos 343 00:46:35,539 --> 00:46:38,840 cuando vimos la obtención de ADN 344 00:46:38,840 --> 00:46:43,440 y después podríamos hacer una electroforesis en gel de agarosa 345 00:46:43,440 --> 00:46:46,340 ¿Cuál es el problema de esta técnica? 346 00:46:46,599 --> 00:47:02,179 Pues es que como los plásmidos tienen su ADN circular, ¿qué pasa? Que pueden presentar diferentes conformaciones. El ADN del plásmido puede estar así, en un círculo, pero puede estar así también, o de esta otra forma, o de esta otra forma. 347 00:47:02,179 --> 00:47:25,500 ¿Qué ocurre? Que cuando hagamos la electroforesis en gel de agarosa, aunque tengamos el mismo plásmido, si este plásmido está en esta conformación y el mismo plásmido está en otra conformación, pues nos van a aparecer bandas en zonas diferentes, por lo que no vamos a poder distinguirse ese plásmido. 348 00:47:25,500 --> 00:47:35,739 Bueno, pues para resolver esto lo que se puede hacer es cortar ese plásmido con enzimas de restricción. 349 00:47:36,340 --> 00:47:49,199 Nosotros tenemos un plásmido que es circular, pues lo cortamos con alguna enzima de restricción y lo que nos va a quedar es un ADN lineal y así ya podemos analizarlo sin problemas con el troforesis en gel de agarosa. 350 00:47:50,000 --> 00:48:06,170 Otra forma de analizar la genética de estas bacterias sería analizar el ADN genómico, no el plasmídico, sino el genómico. 351 00:48:07,309 --> 00:48:14,510 Para ello, que se utilizan por lo mismo endonucleasas de restricción que van a cortar ese ADN genómico en muchos fragmentos. 352 00:48:14,510 --> 00:48:22,230 Y esos fragmentos luego lo mismo, los separamos haciendo una electroforesis en gel de agarosa. 353 00:48:25,260 --> 00:48:35,559 Ahora, una forma de interpretar estos resultados más fácil sería la combinación de este método con el uso de sondas. 354 00:48:36,019 --> 00:48:43,739 Una sonda, acordaros, una sonda es una secuencia de ADN que tiene a lo mejor un grupo fluoróforo que emite radiación. 355 00:48:43,739 --> 00:48:56,739 Y luego se transferiría a una membrana nitrocelulosa, acordaros que esto en la técnica de hibridación lo hemos visto, y después ya se separaría por electroforesis. 356 00:48:58,480 --> 00:49:07,059 Entonces los que hayan hibridado con esa secuencia de ADN que teníamos, pues quedarán fijados en la membrana. 357 00:49:07,059 --> 00:49:28,519 Bueno, este sería la técnica de perfiles de restricción de ADN genómico. Cortar el ADN con endonucleasas de restricción y luego hacer una hibridación con sondas y después ya la electroforesis a gel de agarosa. 358 00:49:28,519 --> 00:49:47,309 Y por último tendríamos los perfiles de amplificación génica. ¿En qué consiste? Pues consiste en hacer una PCR, una reacción en cadena de la polimerasa. 359 00:49:47,309 --> 00:50:02,989 Si os acordáis en la PCR, por cada fragmento de ADN que queríamos amplificar, ¿qué utilizábamos? Pues utilizábamos dos cebadores o primers. Esos cebadores o primers eran los que delimitaban la secuencia que queríamos amplificar. 360 00:50:02,989 --> 00:50:16,230 Pues en este caso lo que hacemos es utilizar solamente un único oligogonucleotido, o sea, un único cebador. Normalmente eso de 10 pares de bases. 361 00:50:16,230 --> 00:50:35,730 Y entonces ese único cebador se va a unir aleatoriamente a la cadena de ADN y se van a obtener fragmentos de diferente masa molecular de esa cadena de ADN. 362 00:50:35,730 --> 00:50:47,750 Y esta técnica se denomina RAPD, Random, Aleatorio, Amplification, Polymorphic DNA o ADN. 363 00:50:48,190 --> 00:50:51,690 O sea, se amplifica de forma aleatoria. 364 00:50:52,170 --> 00:50:59,429 Se utiliza solamente un único nucleótido que se va a unir a diferentes zonas del ADN 365 00:50:59,429 --> 00:51:06,769 Y entonces se van a ir amplificando, se van a ir haciendo copias de diferentes fragmentos de ese ADN. 366 00:51:08,550 --> 00:51:25,769 Bueno, pues eso es lo que os decía. Esta técnica la vemos así un poquito más por encima, pero lo importante es eso, que sepáis que hay otras formas de hacer una identificación de ADN que sería eso a través de las bacterias. 367 00:51:25,769 --> 00:51:48,510 Y estas bacterias se pueden analizar con los métodos fenotípicos, pero estos métodos son un poco limitados y luego podemos hacer el análisis por métodos genotípicos, analizar la genética de ese organismo. 368 00:51:48,510 --> 00:52:12,809 ¿Qué podemos analizar de esas bacterias? Pues podemos analizar los plásmidos que tienen, podemos analizar si no el ADN cromosómico o se puede hacer una reacción en cadena de la polimerasa, una PCR, pero ya os digo, utilizando solamente un primer. 369 00:52:12,809 --> 00:52:32,210 Bien, pues entonces de este tema nos quedaría la parte de informática, que haremos un ejercicio el martes que viene y lo que os he comentado antes de ver un poquito más las aplicaciones. 370 00:52:32,210 --> 00:52:55,309 Entonces, pues nos quedaría por ver, el siguiente tema es el 5, el siguiente tema no es tan largo, es bastante más corto que este, este yo creo que es el más largo y tenemos que, nos queda también por ver un tema de proteínas, de identificación de proteínas. 371 00:52:55,309 --> 00:53:03,809 Entonces en este puente intentad miraros este tema de clonación de ácidos nucleicos 372 00:53:03,809 --> 00:53:07,829 Es fundamental primero que hayáis entendido el tema 3 373 00:53:07,829 --> 00:53:13,750 De lo que es un ácido nucleico, de cómo son los enlaces entre las bases nitrogenadas 374 00:53:13,750 --> 00:53:19,809 Lo que es un nucleótido, ese tema lo tenéis que saber bien para poder entender el tema 4 375 00:53:19,809 --> 00:53:22,510 entonces intentad 376 00:53:22,510 --> 00:53:24,150 este puente si podéis 377 00:53:24,150 --> 00:53:25,230 veros 378 00:53:25,230 --> 00:53:27,610 entender 379 00:53:27,610 --> 00:53:30,510 lo que es la hibridación, la secuenciación 380 00:53:30,510 --> 00:53:32,570 la PCR, el ADN 381 00:53:32,570 --> 00:53:33,409 recombinante 382 00:53:33,409 --> 00:53:36,289 y así para el próximo día 383 00:53:36,289 --> 00:53:38,110 si tenéis dudas 384 00:53:38,110 --> 00:53:40,849 que las podamos resolver 385 00:53:40,849 --> 00:53:43,030 y 386 00:53:43,030 --> 00:53:45,369 pues 387 00:53:45,369 --> 00:53:47,809 yo creo que 388 00:53:47,809 --> 00:53:50,090 Que no os tengo que decir nada más. 389 00:53:51,550 --> 00:53:57,730 A ver, voy a cortar la grabación.