1
00:00:00,000 --> 00:00:04,219
En este vídeo vamos a ver la última parte del tema 4

2
00:00:04,219 --> 00:00:08,679
y nos vamos a centrar fundamentalmente en el estudio de las sondas.

3
00:00:09,380 --> 00:00:13,179
Qué tipos de sondas se suelen utilizar, características de las sondas,

4
00:00:13,380 --> 00:00:17,719
luego veremos los tipos de marcaje y las bases de las técnicas de hibridación.

5
00:00:18,539 --> 00:00:24,260
En cuanto a las sondas, todas las sondas deben tener dos características fundamentales.

6
00:00:24,859 --> 00:00:27,480
Para que podamos utilizarla en las técnicas de hibridación,

7
00:00:27,480 --> 00:00:32,359
por un lado deben ser muy específicas y por otro lado muy sensibles.

8
00:00:33,259 --> 00:00:37,000
Especificidad. La especificidad se refiere a la capacidad que va a tener la sonda

9
00:00:37,000 --> 00:00:43,659
de discriminar la secuencia diana entre montones de secuencias

10
00:00:43,659 --> 00:00:48,439
que vamos a tener, por ejemplo, en un genoma completo de una célula eucariota.

11
00:00:49,100 --> 00:00:52,859
Es decir, vamos a decir que la sonda es muy específica

12
00:00:52,859 --> 00:00:58,880
siempre y cuando sea capaz de reconocer su secuencia diana de forma exclusiva.

13
00:00:59,659 --> 00:01:10,859
Para que una sonda tenga una elevada especificidad, cuanto mayor sea, cuanta mayor longitud tenga la sonda, más específica suele ser.

14
00:01:10,859 --> 00:01:23,379
Un tamaño mínimo de 16 bases son las sondas menos específicas, es decir, todas las sondas deben tener un tamaño mínimo de 16 bases.

15
00:01:23,939 --> 00:01:32,299
A partir de aquí, todas las bases suelen tener 20, 24, pueden tener incluso hasta centenares de bases, como vamos a ver ahora.

16
00:01:32,579 --> 00:01:36,719
Cuanta mayor longitud de la sonda, mayor especificidad.

17
00:01:36,719 --> 00:01:41,260
En segundo lugar, las ondas deben ser muy sensibles

18
00:01:41,260 --> 00:01:46,959
La sensibilidad hace referencia a la capacidad que tenemos de detectarla

19
00:01:46,959 --> 00:01:51,900
Es decir, es la probabilidad de detectar cantidades mínimas sonda diana

20
00:01:51,900 --> 00:01:57,540
Imaginaos que en la muestra del paciente tengo muy poquita secuencia diana

21
00:01:57,540 --> 00:02:03,599
O he podido purificar muy poco DNA del paciente para hacer la técnica de hibridación

22
00:02:03,599 --> 00:02:09,520
diremos que la sonda es muy sensible si aunque tenga poco material de partida

23
00:02:09,520 --> 00:02:14,460
cantidades mínimas voy a ser capaz, soy capaz de detectarla

24
00:02:14,460 --> 00:02:19,639
entonces la sensibilidad no depende del tamaño de la sonda

25
00:02:19,639 --> 00:02:25,680
sino que depende del número de moléculas marcadoras que puedo poner por cada sonda

26
00:02:25,680 --> 00:02:29,280
para poder detectar la sonda vamos a ver ahora después

27
00:02:29,280 --> 00:02:34,180
que tengo que ponerle un marcador que me permita visualizar dónde está la sonda.

28
00:02:35,020 --> 00:02:37,439
Entonces, hay sondas que admiten un solo marcador.

29
00:02:38,259 --> 00:02:41,860
Si admiten un solo marcador, me va a ser complicado detectarlas.

30
00:02:41,860 --> 00:02:46,319
Y hay sondas que admiten decenas de marcadores.

31
00:02:46,840 --> 00:02:49,599
Esas sondas son mucho más sensibles. ¿Por qué?

32
00:02:49,719 --> 00:02:52,300
Porque las voy a detectar con muchísima más facilidad.

33
00:02:55,740 --> 00:02:57,240
¿Qué tipos de sondas tenemos?

34
00:02:57,240 --> 00:03:03,599
Pues tenemos sondas de DNA, sondas de RNA y sondas de síntesis artificial, síntesis química.

35
00:03:03,919 --> 00:03:09,620
Las sondas de DNA van a ser moléculas de DNA y las puedo obtener de tres maneras diferentes.

36
00:03:10,000 --> 00:03:17,240
Por síntesis química en el laboratorio, por síntesis artificial, por DNA recombinante, es decir, voy a utilizar bacterias,

37
00:03:18,400 --> 00:03:25,240
voy a meter el gen de la sonda dentro del genoma de las bacterias y voy a utilizar las bacterias como biofactorías.

38
00:03:25,240 --> 00:03:31,659
factorías. Las bacterias van a producir la sonda y yo luego lisaré las bacterias y purificaré la

39
00:03:31,659 --> 00:03:38,699
sonda. Y también las podemos obtener por PCR, que es el método que más se utiliza actualmente. Es

40
00:03:38,699 --> 00:03:44,419
muy sencillo, se diseñan unos primers, todo esto lo veremos en el tema 6, y diseño la sonda de

41
00:03:44,419 --> 00:03:54,099
forma muy rápida y puedo tener la sonda en 3-4 horas. Las ondas de DNA de síntesis química tienen

42
00:03:54,099 --> 00:04:00,719
dos características fundamentales. Son sondas monocatenarias y, por tanto, si son sondas ya

43
00:04:00,719 --> 00:04:08,080
monocatenarias, la ventaja que tienen es que no requieren un paso previo de desnaturalización.

44
00:04:09,000 --> 00:04:15,259
Y, por otro lado, y esta es una desventaja, son sondas de tamaño reducido. Es decir, en el

45
00:04:15,259 --> 00:04:22,879
laboratorio por síntesis química no puedo sintetizar sondas de DNA muy largas. Esto, la

46
00:04:22,879 --> 00:04:27,959
ventaja que tiene es que penetran mucho mejor en los tejidos entonces las de síntesis química se

47
00:04:27,959 --> 00:04:33,620
suelen utilizar en hibridación in situ cuando la sonda tiene que entrar dentro de las células al

48
00:04:33,620 --> 00:04:40,139
ser de tamaño reducido penetran mucho mejor dentro de las células hasta llegar al núcleo sin embargo

49
00:04:40,139 --> 00:04:49,540
al ser de tamaño reducido tienen menor sensibilidad porque le puedo colgar menos marcadores y menor

50
00:04:49,540 --> 00:04:56,139
especificidad por su tamaño reducido. Es decir, como son tan pequeñitas, se van a unir a su

51
00:04:56,139 --> 00:05:02,480
secuencia diana, pero tienen mayor probabilidad de unirse de forma inespecífica en otros sitios

52
00:05:02,480 --> 00:05:12,360
del genoma. Las ondas que sintetizamos por DNA recombinante, ya hemos dicho que vamos a meterlas

53
00:05:12,360 --> 00:05:17,959
en el genoma de una bacteria. Todo esto, cómo se producen estas ondas, lo entenderemos mejor

54
00:05:17,959 --> 00:05:27,379
cuando veamos el tema 7 con la clonación de genes, vamos a clonar el gen de esa sonda dentro de un plásmido,

55
00:05:27,860 --> 00:05:35,100
el plásmido lo vamos a transformar y lo vamos a meter dentro de bacterias y utilizaremos las bacterias como biofactorías

56
00:05:35,100 --> 00:05:37,600
de las cuales purificaremos la sonda.

57
00:05:38,660 --> 00:05:44,480
Las características de estas sondas es que son bicatenarias porque están producidas por bacterias

58
00:05:44,480 --> 00:05:51,079
y por tanto requieren un paso previo de desnaturalización antes de realizar la hibridación.

59
00:05:52,339 --> 00:06:00,040
Al ser producidas por bacterias puedo sintetizar, las bacterias pueden sintetizar sondas de gran tamaño,

60
00:06:00,120 --> 00:06:02,699
y hablamos de centenares de bases, ¿de acuerdo?

61
00:06:03,000 --> 00:06:11,540
En este sentido suelen ser sondas muy específicas, por tanto las sondas de DNA recombinante son muy sensibles

62
00:06:11,540 --> 00:06:15,819
porque les voy a poder colgar a cada sonda muchos marcadores

63
00:06:15,819 --> 00:06:19,319
porque son muy largas y al ser muy largas son muy específicas

64
00:06:19,319 --> 00:06:24,740
porque va a ser muy difícil que estas sondas se unan de forma inespecífica

65
00:06:24,740 --> 00:06:26,379
y se peguen por ahí por el genoma.

66
00:06:27,180 --> 00:06:30,560
De tal manera que reconocerán su secuencia diana con mucha facilidad.

67
00:06:31,740 --> 00:06:34,779
Y las sondas de PCR también van a ser bicatenarias,

68
00:06:34,939 --> 00:06:38,160
por tanto requieren un paso previo a la hibridación,

69
00:06:38,160 --> 00:06:44,060
un paso de desnaturalización, tendré que poner toda la muestra y las ondas a 95 grados

70
00:06:44,060 --> 00:06:50,459
y en este caso las ondas de PCR suelen ser de tamaño intermedio,

71
00:06:50,920 --> 00:06:55,980
desde una veintena, treintena de pares de bases, aquí sí que hablamos de pares de bases

72
00:06:55,980 --> 00:07:02,319
porque son bicatenarias, a unos 100-150 pares de bases, como mucho, ¿de acuerdo?

73
00:07:02,519 --> 00:07:07,240
Por tanto, la sensibilidad y la especificidad de las ondas de PCR están intermedias, ¿vale?

74
00:07:08,160 --> 00:07:15,459
Son más sensibles que las de síntesis química y más específicas, pero son menos sensibles y menos específicas que las de ADN recombinante.

75
00:07:17,079 --> 00:07:27,160
Además de las ondas de ADN tenemos ondas de RNA. Como son ondas de RNA, ya sabemos que una característica fundamental es que siempre van a ser monocatenarias.

76
00:07:27,339 --> 00:07:34,439
Por tanto, aquí nunca tendremos, cuando utilicemos una sonda de RNA, un paso de desnaturalización.

77
00:07:34,439 --> 00:07:42,319
De nuevo, estas ondas de RNA las puedo sintetizar en el laboratorio por síntesis química

78
00:07:42,319 --> 00:07:47,740
Es decir, por un proceso químico puedo ir haciendo que un nucleótido se enganche a otro

79
00:07:47,740 --> 00:07:50,920
Y obtener la sonda en el laboratorio de forma artificial

80
00:07:50,920 --> 00:07:55,019
O nuevamente puedo meterla en un plasmido y meterla en bacterias

81
00:07:55,019 --> 00:08:02,579
Y hacer que la bacteria del gen de DNA transcriba el mensajero de ese DNA, de ese gen

82
00:08:02,579 --> 00:08:07,660
y ese mensajero va a ser mi sonda de RNA que luego purifico.

83
00:08:12,689 --> 00:08:18,850
Y por último tenemos sondas químicas, pero sintéticas, ¿vale?

84
00:08:19,209 --> 00:08:25,670
De tal manera que en el laboratorio yo voy a crear una estructura sintética química

85
00:08:25,670 --> 00:08:28,829
diferente a los ácidos nucleicos, pero parecida.

86
00:08:28,829 --> 00:08:35,409
Es decir, este es un ejemplo, tenemos dos tipos, peptídicos y lo que son los ácidos nucleicos bloqueados.

87
00:08:35,409 --> 00:08:49,929
Aquí tenemos el ejemplo, tenemos nuestro DNA con su esqueleto azúcar fosfato y lo que hacemos por síntesis química es sustituir el esqueleto azúcar fosfato por un esqueleto artificial.

88
00:08:49,929 --> 00:09:06,610
En este caso, en los PNA, son los ácidos nucleicos peptídicos, vamos a sustituir el azúcar fosfato, el esqueleto azúcar fosfato, por un esqueleto peptídico formado por unidades de aminoetilglicina.

89
00:09:06,610 --> 00:09:24,370
¿Qué característica tiene este compuesto aminoetilglicina? Cuando uno, un aminoetilglicina con el siguiente, la distancia que queda entre este grupo acetilo y el siguiente es idéntica a la distancia que queda entre las dos pentosas.

90
00:09:24,370 --> 00:09:46,710
De tal manera que lo puedo utilizar como un esqueleto sintético al cual en el grupo acetilo le voy a enganchar las bases nitrogenadas y de una manera muy sencilla por síntesis química puedo obtener ácidos nucleicos sintéticos, ¿de acuerdo? Sondas sintéticas que pueden ser peptídicas o bloqueadas.

91
00:09:47,710 --> 00:09:48,450
¿De acuerdo?

92
00:09:49,450 --> 00:09:51,570
Los peptídicos, ¿qué ventaja tienen?

93
00:09:51,929 --> 00:09:54,929
Son sondas no cargadas, son sondas neutras.

94
00:09:55,230 --> 00:09:57,070
Recordamos las sondas de DNA y del RNA,

95
00:09:57,669 --> 00:10:02,269
por la estructura de polifosfato, del esqueleto polifosfato,

96
00:10:02,590 --> 00:10:03,909
tiene siempre una carga negativa.

97
00:10:04,309 --> 00:10:07,950
En algunos casos, para algunas técnicas, la carga negativa me viene mal.

98
00:10:08,389 --> 00:10:11,710
Entonces puedo sustituirla por una sonda que no tenga carga eléctrica,

99
00:10:12,269 --> 00:10:13,809
de síntesis química.

100
00:10:13,809 --> 00:10:34,490
Y por otro lado, una ventaja, una segunda ventaja es que no se degradan por nucleasas, ya que las nucleasas no rompen los enlaces peptídicos, ¿de acuerdo? Los bloqueados, la de síntesis química, ácidos nucleicos bloqueados, os lo podéis mirar en el libro, no se utilizan tanto, ¿de acuerdo?

101
00:10:34,490 --> 00:10:53,029
Una vez yo ya he obtenido mi sonda, debo marcar la sonda. ¿Qué es el marcaje? Es el procedimiento por el cual le voy a enganchar a la sonda algo, un compuesto químico, que me va a permitir visualizar si se ha formado o no se ha formado el híbrido.

102
00:10:53,850 --> 00:11:04,370
Tenemos dos tipos de marcadores. Unos marcadores que me permiten detectar directamente el híbrido, es decir, hago la hibridación y después revelo.

103
00:11:04,490 --> 00:11:24,250
Y ya directamente veo la sonda, gracias a estos marcadores. Y marcadores indirectos, en los cuales son marcadores que no los puedo detectar directamente y por tanto necesito un proceso de revelado un poquito más laborioso y más largo.

104
00:11:24,250 --> 00:11:39,389
Los marcadores directos de detección directa más utilizados son los isótopos radioactivos clásicos aunque están en desuso y se están intentando retirar por el hecho de que son, utiliza isótopos radioactivos y su peligrosidad.

105
00:11:39,389 --> 00:11:46,389
Los que más se utilizan son marcadores con fósforo 32 y con tritio, que es un isótopo del hidrógeno.

106
00:11:47,370 --> 00:11:54,350
Y estas ondas marcadas con isótopos radioactivos se utilizan mucho en las técnicas de Southern Blot y Northern Blot,

107
00:11:54,429 --> 00:11:57,110
que nos las explicaréis en el tema 5.

108
00:11:57,950 --> 00:12:04,210
Actualmente la tendencia es sustituir los isótopos radioactivos por fluorocromos.

109
00:12:04,210 --> 00:12:32,269
Los fluorocromos son compuestos químicos que cuando yo hago incidir sobre ellos una luz ultravioleta emiten luz en el rango del visible, luz azul, luz verde, roja, de tal manera que una vez ha formado el híbrido cojo la muestra, la irradio con luz ultravioleta y puedo detectar la fluorescencia gracias a la presencia de los fluorocromos.

110
00:12:32,269 --> 00:12:53,750
Por otro lado, los marcadores indirectos normalmente se utilizan lo que llamamos aptenos. ¿Qué son los aptenos? Van a ser moléculas pequeñas, de pequeño tamaño, que las vamos a acoplar a la sonda y que no alteran su unión, la unión de la sonda a la secuencia diana.

111
00:12:53,750 --> 00:12:57,830
¿cuál es la diferencia entre los anteriores marcadores y estos?

112
00:12:58,330 --> 00:13:00,570
por ejemplo la digoxigenina y la biotina

113
00:13:00,570 --> 00:13:02,090
que hay que conocer los nombres

114
00:13:02,090 --> 00:13:05,450
la digoxigenina y la biotina no son fluorescentes

115
00:13:05,450 --> 00:13:07,289
no son radioactivos

116
00:13:07,289 --> 00:13:10,809
y por tanto no los puedo detectar directamente

117
00:13:10,809 --> 00:13:13,429
he de utilizar en este caso

118
00:13:13,429 --> 00:13:17,090
un procedimiento inmunohistoquímico

119
00:13:17,090 --> 00:13:20,169
es decir, aquí en este ejemplo que os pongo

120
00:13:20,169 --> 00:13:22,289
han sintetizado una sonda

121
00:13:22,289 --> 00:13:27,830
y cuando han sintetizado, esta sonda es de RNA porque queremos detectar un RNA mensajero,

122
00:13:28,830 --> 00:13:32,850
cuando han sintetizado la sonda han incluido un nucleótido, en este caso el uracilo,

123
00:13:32,850 --> 00:13:41,470
que lo han marcado con digoxigenina. Es un nucleótido modificado que lleva colgando una pequeña bolita

124
00:13:41,470 --> 00:13:48,710
que es la digoxigenina, de tal manera que cuando se produzca la transcripción donde haya un uracilo

125
00:13:48,710 --> 00:13:55,269
voy a tener una digoxigenina. Esta digoxigenina después del proceso de hibridación se formarán

126
00:13:55,269 --> 00:13:59,789
los híbridos. Yo no la puedo detectar porque no emite color, no emite fluorescencia, no emite

127
00:13:59,789 --> 00:14:07,029
radioactividad, no emite nada. Entonces para poder detectarla necesito un segundo componente y se

128
00:14:07,029 --> 00:14:14,610
suele utilizar mucho anticuerpos. Anticuerpos específicos contra la digoxigenina. ¿Qué

129
00:14:14,610 --> 00:14:18,909
¿Qué característica tienen estos anticuerpos? Que a estos anticuerpos les he acoplado un segundo

130
00:14:18,909 --> 00:14:24,649
marcador, que no es la digoxigenina porque no es un apteno. Este marcador es un enzima,

131
00:14:25,230 --> 00:14:31,330
un enzima que es la fosfatasa alcalina. De tal manera que después de la hibridación incubo con

132
00:14:31,330 --> 00:14:37,210
el anticuerpo marcado. ¿Dónde haga ya? Digoxigenina se unirá específicamente y quedará anclado el

133
00:14:37,210 --> 00:14:43,289
anticuerpo y por tanto quedará anclado el enzima. ¿Qué gracia tiene este enzima? La fosfatasa

134
00:14:43,289 --> 00:14:49,210
alcalina que después yo lo incubo con unos reactivos que son compuestos que llamamos

135
00:14:49,210 --> 00:14:57,330
cromógenos. Estos sustratos cromogénicos o cromógenos son compuestos químicos que no tienen

136
00:14:57,330 --> 00:15:07,190
ni color ni emiten fluorescencia pero si son metabolizados por una reacción enzimática por

137
00:15:07,190 --> 00:15:15,049
la fosfata salcalina se convierten en compuestos de color azul y producen donde esté la sonda

138
00:15:15,049 --> 00:15:24,970
precipita el nbtbcip que es este compuesto precipita sobre la sonda formando un precipitado de color

139
00:15:24,970 --> 00:15:33,149
azul que sí que lo puedo observar al microscopio. Se entiende por tanto los marcadores que requieren

140
00:15:33,149 --> 00:15:40,549
métodos indirectos son digo oxigenina y biotina no emiten luz no emiten radioactividad no emiten

141
00:15:40,549 --> 00:15:47,029
fluorescencia y necesito un segundo proceso para poder detectarlos en este caso se utilizan

142
00:15:47,029 --> 00:15:53,850
anticuerpos acoplados a una enzima que cuando le pongo su sustrato me va a producir un precipitado

143
00:15:53,850 --> 00:16:00,269
donde esté el híbrido un precipitado de color azul que al microscopio óptico lo puedo observar

144
00:16:00,269 --> 00:16:14,110
Para detectar los isotopos radioactivos utilizaré autoradiografías y para detectar los híbridos que están marcados con fluorocromos utilizaré un microscopio de fluorescencia.

145
00:16:14,110 --> 00:16:17,190
¿Cuándo utilizo isotopos radioactivos?

146
00:16:17,289 --> 00:16:20,470
Ya lo hemos dicho, las técnicas de Southern Blot y Northern Blot

147
00:16:20,470 --> 00:16:23,950
Utilizo fluorocromos en la técnica del FISH

148
00:16:23,950 --> 00:16:27,149
Es decir, hibridación in situ fluorescente

149
00:16:27,149 --> 00:16:31,649
Y los aptenos se utilizan en todo tipo de técnicas de hibridación

150
00:16:31,649 --> 00:16:33,669
Se utilizan muchísimo

151
00:16:33,669 --> 00:16:38,120
¿Cómo marco las ondas?

152
00:16:38,200 --> 00:16:39,320
Los métodos de marcaje

153
00:16:39,320 --> 00:16:41,539
Este apartado no es importante

154
00:16:41,539 --> 00:16:47,179
O lo podéis mirar, ¿de acuerdo? Pero no es el más importante

155
00:16:47,179 --> 00:16:53,379
No vamos a ver los métodos de marcaje, son complejos y no tiene sentido que los veamos

156
00:16:53,379 --> 00:16:56,879
Porque normalmente las sondas no las sintetizo en el laboratorio

157
00:16:56,879 --> 00:17:03,580
Sino que las compro ya sintetizadas y comerciales o las encargo a un laboratorio para que me las produzca

158
00:17:03,580 --> 00:17:10,619
Tenemos varios métodos de marcaje, es decir, el marcaje es la unión del marcador a la sonda

159
00:17:10,619 --> 00:17:16,059
que no los vamos a ver, los tenéis aquí, los tenéis en el libro por si queréis echarles un vistazo

160
00:17:16,059 --> 00:17:19,539
lo que sí es importante es este apartado

161
00:17:19,539 --> 00:17:22,000
y esto le voy a preguntar seguro

162
00:17:22,000 --> 00:17:26,859
las fases de la hibridación, es decir, cualquier técnica de hibridación

163
00:17:26,859 --> 00:17:29,400
de las que nos vais a explicar en el tema 5

164
00:17:29,400 --> 00:17:33,960
se compone de cuatro fases fundamentales

165
00:17:33,960 --> 00:17:37,779
dependiendo de la técnica se añaden más fases

166
00:17:37,779 --> 00:17:45,180
o hay diferentes procesos dentro de cada fase, pero todas las técnicas de hibridación poseen estas cuatro fases.

167
00:17:45,400 --> 00:17:50,240
La primera fase es una fase de pre-hibridación. No vamos a producir el híbrido aquí.

168
00:17:50,619 --> 00:17:54,339
Aquí lo que vamos a hacer va a ser preparar. ¿Qué preparamos?

169
00:17:54,680 --> 00:17:59,359
Preparamos la muestra, preparamos el soporte, preparamos la sonda.

170
00:18:00,160 --> 00:18:03,519
Si tuviésemos que marcarla nosotros y sintetizarla.

171
00:18:03,519 --> 00:18:09,680
Por ejemplo, imaginaos que queremos hacer una técnica de hibridación in situ

172
00:18:09,680 --> 00:18:16,660
Sobre un corte histológico de, por ejemplo, una biopsia de un paciente

173
00:18:16,660 --> 00:18:21,319
Tenemos que preparar la muestra sobre el portaobjetos

174
00:18:21,319 --> 00:18:23,140
El soporte va a ser el portaobjetos

175
00:18:23,140 --> 00:18:25,420
La muestra es el corte del paciente

176
00:18:25,420 --> 00:18:28,180
Pero la muestra la tenemos que permeabilizar

177
00:18:28,180 --> 00:18:31,720
Es decir, a las células del tejido tenemos que hacerle agujeros

178
00:18:31,720 --> 00:18:33,220
Para que pueda entrar la sonda

179
00:18:33,220 --> 00:18:38,039
Todo este proceso es la fase de pre-hibridación

180
00:18:38,039 --> 00:18:41,119
Dependiendo de la técnica de hibridación que vayamos a hacer

181
00:18:41,119 --> 00:18:42,640
Y del tipo de muestra

182
00:18:42,640 --> 00:18:47,000
La preparación y la pre-hibridación es muy diferente

183
00:18:47,000 --> 00:18:50,460
Ya en el tema 5 nos lo iréis contando

184
00:18:50,460 --> 00:18:53,160
La segunda fase es la fase de hibridación

185
00:18:53,160 --> 00:18:56,059
Es decir, aquí voy a poner en contacto la sonda

186
00:18:56,059 --> 00:18:58,480
Para que encuentre su secuencia diana

187
00:18:58,480 --> 00:19:02,039
En el tejido, en las células, en un DNA

188
00:19:02,039 --> 00:19:08,920
que acabo de purificar. En la hibridación, y esto es muy importante, tengo que tener en cuenta dos

189
00:19:08,920 --> 00:19:14,599
parámetros fundamentales. El primero es la temperatura de melting del híbrido. Acordaos

190
00:19:14,599 --> 00:19:21,160
que ya dijimos que cada híbrido, cada híbrido va a tener una temperatura de melting única y

191
00:19:21,160 --> 00:19:29,779
exclusiva, característica. Entonces, ¿cuál es la temperatura óptima para llevar a cabo la

192
00:19:29,779 --> 00:19:36,980
hibridación es la temperatura de melting del híbrido menos 25 grados centígrados. De tal

193
00:19:36,980 --> 00:19:42,440
manera que si esta es la temperatura de melting del híbrido que quiero formar, sonda secuencia

194
00:19:42,440 --> 00:19:49,779
diana, la temperatura óptima para que se lleve a cabo la hibridación estaría aquí, la temperatura

195
00:19:49,779 --> 00:19:58,680
de melting menos 25 grados. Pero tenemos una horquilla, un rango de temperaturas que va desde

196
00:19:58,680 --> 00:20:03,299
de la temperatura de melting menos 32 grados a temperatura de melting menos 16 grados,

197
00:20:03,299 --> 00:20:08,700
en las que dentro de esta temperatura la hibridación es máxima.

198
00:20:08,740 --> 00:20:12,559
Si veis aquí, la eficiencia de hibridación es máxima en esta horquilla.

199
00:20:12,980 --> 00:20:18,440
Es muy importante, por tanto, llevar a cabo la hibridación en este rango de temperaturas.

200
00:20:19,220 --> 00:20:24,359
Y el segundo parámetro que tenemos que controlar en la hibridación

201
00:20:24,359 --> 00:20:30,119
es que se lleve a cabo en condiciones de rigurosidad relajadas.

202
00:20:30,119 --> 00:20:39,579
Es decir, voy a permitir que la sonda se forme el híbrido y se estabilice el híbrido.

203
00:20:39,960 --> 00:20:46,099
Si os acordáis, voy a aumentar, aumentando la fuerza iónica,

204
00:20:46,299 --> 00:20:51,599
es decir, la concentración de cationes, hago que el híbrido sea más estable.

205
00:20:52,119 --> 00:20:52,859
Si os acordáis.

206
00:20:52,859 --> 00:21:02,859
Y si disminuyo la presencia de formamida, que es un agente desnaturalizante, si os acordáis, también hago que el híbrido sea más estable.

207
00:21:03,680 --> 00:21:13,799
De tal manera que en esta fase de hibridación me conviene tener condiciones relajadas para que toda mi sonda encuentre y se una a su secuencia diana.

208
00:21:14,740 --> 00:21:20,299
Como comprenderéis, en estas condiciones de rigurosidad relajadas,

209
00:21:20,460 --> 00:21:25,660
la sonda, son condiciones en las que voy a permitir que la sonda también se una

210
00:21:25,660 --> 00:21:29,799
inespecíficamente en otros puntos del genoma, ¿de acuerdo?

211
00:21:30,200 --> 00:21:35,299
Y se van a producir uniones, en este caso, inespecíficas.

212
00:21:35,980 --> 00:21:37,279
¿Qué es lo que hago?

213
00:21:38,079 --> 00:21:42,319
Sabiendo que voy a permitir que se forman uniones inespecíficas,

214
00:21:42,319 --> 00:21:51,809
hago una tercera fase que es importantísima que es la fase de lavado pos hibridación esta fase

215
00:21:51,809 --> 00:21:59,990
de lavado es la más importante y la que determina la especificidad de la técnica es decir si yo

216
00:21:59,990 --> 00:22:06,309
quiero que la técnica de hibridación sea muy específica y que la sonda solamente se una a

217
00:22:06,309 --> 00:22:13,529
su secuencia diana he de controlar muy bien el lavado pos hibridación qué característica tiene

218
00:22:13,529 --> 00:22:22,910
que tener el lavado pos hibridación voy a elevar la rigurosidad respecto a la fase de hibridación

219
00:22:22,910 --> 00:22:29,690
si aquí he puesto condiciones relajadas aquí voy a poner condiciones de rigurosidad elevadas ¿cómo

220
00:22:29,690 --> 00:22:36,230
lo hago? aumentando la fuerza iónica perdón disminuyendo la fuerza iónica disminuyendo los

221
00:22:36,230 --> 00:22:43,450
cationes si os acordáis al disminuir los cationes se desestabilizan los híbridos y aumentando

222
00:22:43,450 --> 00:22:49,269
la concentración de forma amida, que es un agente desnaturalizante y, por tanto,

223
00:22:49,750 --> 00:22:54,930
tanto la fuerza iónica baja como la alta concentración de forma amida,

224
00:22:55,509 --> 00:23:02,710
estas dos condiciones hacen que los híbridos sean menos estables.

225
00:23:04,029 --> 00:23:09,809
Y puedo jugar también con la temperatura, de tal manera que voy a poner una temperatura mayor

226
00:23:09,809 --> 00:23:12,150
que en el proceso de hibridación.

227
00:23:12,670 --> 00:23:16,430
La temperatura suele estar en torno a 50-55 grados en la hibridación

228
00:23:16,430 --> 00:23:19,809
y aquí nos vamos a 60-65 grados, ¿de acuerdo?

229
00:23:19,809 --> 00:23:22,589
De tal manera que aumentando la temperatura,

230
00:23:23,390 --> 00:23:26,970
disminuyendo la fuerza iónica y aumentando la concentración de forma mida,

231
00:23:27,329 --> 00:23:32,109
voy a hacer que todas aquellas ondas que había permitido que se uniesen

232
00:23:32,109 --> 00:23:36,450
de forma inespecífica en un montón de sitios del genoma,

233
00:23:36,450 --> 00:23:38,690
que no son la secuencia diana

234
00:23:38,690 --> 00:23:42,190
gracias a esta rigurosidad elevada

235
00:23:42,190 --> 00:23:45,710
aquí se van a despegar porque estarán unidas de forma débil

236
00:23:45,710 --> 00:23:49,009
y estas condiciones van a permitir

237
00:23:49,009 --> 00:23:51,609
que solamente la sonda unida

238
00:23:51,609 --> 00:23:54,089
de forma fuerte, es decir

239
00:23:54,089 --> 00:23:58,029
unida formando todos los puentes de hidrógeno

240
00:23:58,029 --> 00:23:59,269
con su secuencia diana

241
00:23:59,269 --> 00:24:04,150
esos sean los híbridos, los únicos híbridos que permanezcan

242
00:24:04,150 --> 00:24:08,200
después de la hibridación

243
00:24:08,200 --> 00:24:13,680
y los lavados pos hibridación, que repito que es la fase más importante y de la que depende la

244
00:24:13,680 --> 00:24:19,579
especificidad de la técnica, llevamos a cabo el revelado. Ahora tengo que detectar si ha habido

245
00:24:19,579 --> 00:24:25,559
o no ha habido híbrido y dónde está el híbrido, por ejemplo en una hibridación in situ. El revelado,

246
00:24:26,220 --> 00:24:32,019
la detección, ya depende del tipo de marcador. Si el marcaje es radioactivo, ya hemos dicho que

247
00:24:32,019 --> 00:24:38,579
vamos a revelar con autoradiografía. Si he utilizado fluorocromos necesitaría un microscopio

248
00:24:38,579 --> 00:24:44,480
de fluorescencia pero si he utilizado aptenos utilizaremos métodos inmunohistoquímicos es

249
00:24:44,480 --> 00:24:50,880
decir necesito anticuerpos que reconozcan los aptenos y que vayan marcados con enzimas etcétera

250
00:24:50,880 --> 00:24:56,279
etcétera que es lo que hemos explicado antes. Por tanto todas las técnicas de hibridación

251
00:24:56,279 --> 00:25:09,559
El procedimiento tiene cuatro fases, una fase de prehibridación, una fase de hibridación, los lavados pos hibridación que son muy importantes y por último el revelado o la detección del híbrido.