1
00:00:00,880 --> 00:00:05,280
Esto sería electroforesis en gel de poliacrilamida.

2
00:00:10,460 --> 00:00:22,440
Entonces lo primero que hay que hacer es preparar el gel.

3
00:00:23,420 --> 00:00:27,160
Y para preparar el gel tenemos este dispositivo de aquí.

4
00:00:27,719 --> 00:00:31,399
Aquí podríamos preparar dos gels, aquí uno y aquí otro.

5
00:00:32,359 --> 00:00:34,560
Y para ello necesitamos dos cristales.

6
00:00:34,560 --> 00:00:38,380
Estos dos cristales, uno es más grande que el otro

7
00:00:38,380 --> 00:00:41,000
Entonces se pone uno encima del otro

8
00:00:41,000 --> 00:00:44,920
Y el grande tiene aquí en los dos laterales

9
00:00:44,920 --> 00:00:46,039
Tiene como un reborde

10
00:00:46,039 --> 00:00:49,460
Para que cuando introduzcamos la disolución

11
00:00:49,460 --> 00:00:52,479
Entre los dos cristales pueda entrar

12
00:00:52,479 --> 00:00:54,259
¿Vale? Entonces

13
00:00:54,259 --> 00:01:04,170
¿Veis? Ponemos un cristal sobre el otro

14
00:01:04,170 --> 00:01:07,609
Y lo colocamos en el dispositivo

15
00:01:07,609 --> 00:01:10,049
Cerramos el dispositivo

16
00:01:10,049 --> 00:01:15,329
para que se queden bien fijos los cristales y lo ponemos en este otro dispositivo.

17
00:01:18,120 --> 00:01:27,340
Y ahora ya lo que vamos a hacer es, vamos a ir preparando la disolución para que se forme el gel de poliacrilamida.

18
00:01:28,340 --> 00:01:35,560
Entonces, para preparar esta disolución necesitamos una disolución de acrilamida y bisacrilamida,

19
00:01:35,560 --> 00:01:52,640
Se necesita agua, se necesita SDS y luego se va a necesitar también el persulfato, acordaros, el persulfato es el iniciador y se va a necesitar también el TEMED, que es el catalizador.

20
00:01:52,640 --> 00:02:33,659
Entonces ahora va a ir mezclando todos los componentes de la disolución, el agua, a la disolución tampón también se necesita una disolución tampón, que es un tampón de tris y clorhídrico, ahora la disolución de acrilamida y bisacrilamida y el SDS.

21
00:02:33,659 --> 00:02:49,819
Vale, ahora se añade el persulfato de amonio, que es el iniciador de la reacción, y ahora se añade el TEMED, que es el catalizador.

22
00:02:50,939 --> 00:03:03,379
Una vez que se añada el TEMED, enseguida ya hay que introducir la disolución entre los dos cristales que tenemos aquí, porque el TEMED lo que hace es catalizar la reacción.

23
00:03:03,379 --> 00:03:12,020
Entonces, si no lo introducimos rápido, pues se nos va a polimerizar aquí en el vasito.

24
00:03:17,610 --> 00:03:29,610
Lo mezcla un poco y ya con una pipeta Pasteur, lo mezcla un poco con la pipeta y ya va a ir introduciendo entre los dos cristales.

25
00:03:29,610 --> 00:03:41,250
Veis que se va llenando los dos cristales. Este sería el gel separador, donde se van a separar las proteínas.

26
00:03:41,250 --> 00:03:49,830
Ahora tenemos que añadir por arriba, vamos a añadir una capa de agua

27
00:03:49,830 --> 00:03:56,229
Y esta capa de agua lo que hace es aislar a la poliacrilamida

28
00:03:56,229 --> 00:04:01,490
Porque si no, con el oxígeno del aire no gelifica, no polimeriza

29
00:04:01,490 --> 00:04:07,330
Por lo tanto añadimos una capa de agua en el borde superior para que polimerice

30
00:04:07,330 --> 00:04:14,250
Si os fijáis aquí en el vial ya había empezado a polimerizar, por eso hay que hacerlo un poco rápido.

31
00:04:16,629 --> 00:04:25,829
Aquí habría que esperar 45 minutos a que gelifique y el siguiente paso sería quitar el agua que hemos puesto aquí arriba.

32
00:04:37,459 --> 00:04:47,680
Ya quitamos el agua, tendríamos ya ahí el gel separador y ahora va a preparar el gel concentrador, que es la parte de arriba del gel.

33
00:04:48,180 --> 00:04:55,779
Se mezclan los mismos reactivos, lo que pasa que en concentraciones diferentes y a un pH diferente.

34
00:04:57,920 --> 00:05:07,459
Ese sería, aquí ya tendríamos el témed, se mezcla y ya se introduce con la pipeta entre los cristales.

35
00:05:09,740 --> 00:05:17,459
Ahora se introduce el peine, esto de aquí es el peine y esto lo que va a hacer va a generar pocillos.

36
00:05:18,180 --> 00:05:32,180
Va a generar unos huecos, cuando gelifique el gel se van a generar unos huecos aquí y por aquí en estos huecos pues va a ser donde introduzcamos después nuestras muestras.

37
00:05:32,180 --> 00:05:44,040
muestras. Ahora ya lo está introduciendo en la cubeta de electroforesis. Una vez introducido

38
00:05:44,040 --> 00:05:49,240
en la cubeta ya va a aplicar el campo eléctrico. Aquí ya vamos a empezar la electroforesis

39
00:05:49,240 --> 00:05:57,680
como tal. Esta cubeta tiene dos electrodos. Hay que colocar el negro, hay que enchufarlo

40
00:05:57,680 --> 00:06:29,970
al negro y el rojo al rojo. Esta es la cubeta de electroforesis. Y ahora lo que se hace

41
00:06:29,970 --> 00:06:47,470
es añadir aquí a esta cubeta una disolución tampón. Se añade una disolución tampón

42
00:06:47,470 --> 00:07:02,230
por dentro y luego se va a añadir también por fuera y se quita el peine. Ya nos habrán

43
00:07:02,230 --> 00:07:13,290
quedado ahí los pocillos. Ahora tenemos este sistema en amarillo que nos va a ayudar a

44
00:07:13,290 --> 00:07:19,149
introducir las muestras porque si no es difícil ver los pocillos. Entonces se pone este sistema

45
00:07:19,149 --> 00:07:32,860
y así es más fácil introducir las muestras. Veis que tenemos varios pocillos, ocho, entonces

46
00:07:32,860 --> 00:07:50,319
En uno de ellos, ya está introduciendo una muestra, esta podría ser la de referencia, se van llenando los pocillos y entonces aquí vamos a ir poniendo distintas muestras.

47
00:07:50,319 --> 00:08:01,519
Pueden ser, por ejemplo, muestras de distintos pescados, de atún, de lubina, de salmón y luego vamos a poder ver qué proteínas tienen esos pescados.

48
00:08:01,519 --> 00:08:11,379
Nos van a salir aquí diferentes proteínas y vamos a poder comparar, pues igual hay dos pescados que son parecidos y nos aparecen proteínas también parecidas.

49
00:08:20,600 --> 00:08:49,220
Y ya la última, y ahora ya, bueno esta sería ya la última, y ya conectaríamos la cubeta al campo, o sea aplicaríamos ya el campo eléctrico.

50
00:08:49,220 --> 00:08:58,549
Cerramos la cubeta, el cable negro con el cable negro y el rojo con el rojo

51
00:08:58,549 --> 00:09:00,690
Le vamos a aplicar aquí un voltaje

52
00:09:00,690 --> 00:09:09,750
Y ahí hay que esperar a que las proteínas se vayan desplazando a través del gel separador

53
00:09:09,750 --> 00:09:25,659
¿Vale? ¿Veis? Ahora las proteínas se van a dirigir hacia el cátodo

54
00:09:25,659 --> 00:09:30,840
Y se van a ir empezando a separar

55
00:09:30,840 --> 00:09:40,480
Ahora ya termina la electroforesis

56
00:09:40,480 --> 00:09:44,649
Y ya vamos a obtener nuestro gel

57
00:09:44,649 --> 00:09:57,190
Lo que pasa es que el gel, lo que os comentaba antes, ahora mismo no se van a ver bien las proteínas y lo tenemos que teñir y se tiñe con una disolución de azul de como así.

58
00:10:09,919 --> 00:10:14,120
Ahí tendríamos los dos cristales que los tenemos que separar.

59
00:10:14,220 --> 00:10:22,600
Primero se le añade agua para limpiar de la disolución tampón y ahora vamos a separar los dos cristales.

60
00:10:22,600 --> 00:10:25,980
Separamos los dos cristales con esta cuña verde

61
00:10:25,980 --> 00:10:29,340
Y en uno de los dos cristales se nos quedará el gel

62
00:10:29,340 --> 00:10:34,039
¿Veis? Ahí tenemos el gel

63
00:10:34,039 --> 00:10:35,259
Este sería el gel

64
00:10:35,259 --> 00:10:39,139
Y ahora tenemos que teñirlo

65
00:10:39,139 --> 00:10:43,429
Se lava primero con agua

66
00:10:43,429 --> 00:10:48,529
¿Veis cómo es el gel?

67
00:10:53,299 --> 00:10:53,820
¿Vale?

68
00:10:54,159 --> 00:10:57,519
Y entonces ahora lo ponemos en una disolución de azul de coma

69
00:10:57,519 --> 00:11:06,250
Y se deja ahí un tiempo agitando

70
00:11:06,250 --> 00:11:15,870
se pone un balancín en este aparato y ahí se deja agitando

71
00:11:15,870 --> 00:11:21,360
y lo siguiente que tendremos que hacer es desteñir el gel

72
00:11:21,360 --> 00:11:27,720
para que solamente veamos las proteínas porque si no ahora no veríamos nada

73
00:11:27,720 --> 00:11:33,289
guardamos la disolución de tinción

74
00:11:33,289 --> 00:11:40,370
¿Veis? Ahora se nos ha quedado todo el gel azul y ahora tenemos que lavarlo

75
00:11:40,370 --> 00:11:46,009
Y ya nos aparecerán las bandas de las proteínas

76
00:11:46,009 --> 00:12:12,409
Tendríamos que quitar la parte del gel concentrador

77
00:12:12,409 --> 00:12:18,110
Para contar a partir del gel separador

78
00:12:20,659 --> 00:12:25,559
Ahora está añadiendo la disolución que va a desteñir

79
00:12:25,559 --> 00:12:35,200
lo vuelvo a poner ahí en el balancín

80
00:12:35,200 --> 00:12:54,519
y veis ya empiezan a aparecer las bandas de proteínas

81
00:12:54,519 --> 00:13:02,759
hay que sacar el gel con cuidado que no se rompa

82
00:13:02,759 --> 00:13:05,740
y ahí ya tendríamos las bandas

83
00:13:05,740 --> 00:13:09,000
y entonces ahí ya mediríamos los RFs

84
00:13:09,000 --> 00:13:12,759
compararíamos con nuestra muestra de referencia

85
00:13:12,759 --> 00:13:17,279
y mediríamos los RFs de nuestras muestras

86
00:13:17,279 --> 00:13:19,879
vale, pues este es el vídeo

87
00:13:19,879 --> 00:13:25,580
Ya os digo que hay otros dos vídeos de la Universidad de Valencia y de Sevilla que también están muy bien.

88
00:13:26,320 --> 00:13:35,379
Y ahora vamos a ver de la página de Biomodel, vamos a ver una simulación de electroforesis.

89
00:13:37,750 --> 00:13:45,009
Entonces, en esta página entráis en Biomodel, en la página de la Universidad de Alcalá de Henares

90
00:13:45,330 --> 00:13:51,009
y aquí tendríamos, esto en gris sería el gel, lo que pasa es que aquí solamente tenemos dos pocillos

91
00:13:51,190 --> 00:14:11,710
Y lo que tenemos que hacer es, bueno aquí hay unos ejercicios, vamos a entrar aquí, entonces aquí lo que nos pregunta es la influencia de la diferencia de potencial aplicada, o sea si ponemos más voltaje o menos, ¿qué es lo que ocurre?

92
00:14:11,710 --> 00:14:16,289
Entonces, se separan más los patrones, se separan menos, avanzan más rápido o avanzan más lento.

93
00:14:17,090 --> 00:14:18,389
Entonces, lo vamos a comprobar.

94
00:14:19,230 --> 00:14:24,950
Esto de aquí serían los patrones de nuestra muestra de referencia.

95
00:14:24,950 --> 00:14:31,929
Entonces, son distintas proteínas que conocemos su masa molecular.

96
00:14:32,850 --> 00:14:39,909
Las marcamos y las introducimos en el pocillo, en el primer pocillo.

97
00:14:39,909 --> 00:15:00,250
Vale, aquí, a añadir patrón, que no lo veía. Vale, pues añadimos el patrón. Esta sería nuestra muestra de referencia.

98
00:15:01,509 --> 00:15:10,950
Y ahora vamos a añadir nuestra muestra y de las muestras tenemos 10 problemas. Pues vamos a hacer el 2, por ejemplo.

99
00:15:10,950 --> 00:15:18,669
vale pues le damos a añadir muestra y aquí se nos añade nuestra muestra

100
00:15:18,669 --> 00:15:26,289
vamos a ponerle por ejemplo un voltaje muy bajo de 50 y le damos a comenzar

101
00:15:26,289 --> 00:15:31,450
lo demás lo dejamos igual la velocidad y el tanto por ciento de acrilamida lo dejamos igual

102
00:15:31,450 --> 00:15:33,850
y ahora le vamos a dar a comenzar

103
00:15:33,850 --> 00:15:41,990
¿Veis? Esta sería nuestra muestra de referencia, cómo se van separando las proteínas.

104
00:15:42,690 --> 00:15:50,210
Lo que hay que hacer es parar cuando justo esté llegando casi al final, lo paramos.

105
00:15:51,110 --> 00:15:58,370
Y esto de aquí, la banda esta aquí morada, es el disolvente, que es el bromofenol.

106
00:15:58,850 --> 00:16:04,070
Y este es el que nos va a servir para calcular el RF.

107
00:16:04,070 --> 00:16:12,230
Pues entonces, en este caso hemos aplicado un voltaje de 50 y ahora vamos a aplicar un voltaje de 200

108
00:16:12,230 --> 00:16:19,789
Y vamos a ver si va más... Ah bueno, tendríamos que volver a introducir nuestras muestras

109
00:16:19,789 --> 00:16:25,409
Añadimos el patrón, añadimos la muestra a muestra que era la muestra 2

110
00:16:25,409 --> 00:16:34,159
Y le damos a comenzar y vamos a ver que diferencia hay

111
00:16:34,159 --> 00:16:42,350
vale, pues si os fijáis estaba bastante más rápido que la anterior

112
00:16:42,350 --> 00:16:44,549
vamos a ver otra vez la de 50

113
00:16:44,549 --> 00:16:55,379
añadimos patrón, añadimos muestra

114
00:16:55,379 --> 00:17:04,000
y le damos, estaba bastante más lenta que a 200

115
00:17:04,000 --> 00:17:08,700
entonces el voltaje influye en la rapidez de separación

116
00:17:08,700 --> 00:17:14,940
Y después tendríamos la influencia de la concentración de acrilamida.

117
00:17:15,920 --> 00:17:25,480
Entonces, dependiendo de la concentración, puede ser que los patrones se separan más, se separan menos, tienen mayor movilidad o tienen menor movilidad.

118
00:17:25,960 --> 00:17:34,240
Bueno, pues vamos a verlo. Tenemos aquí concentraciones de acrilamida que van del 7,5% al 15%.

119
00:17:34,240 --> 00:17:37,480
Pues vamos a empezar por la de 7,5%.

120
00:17:37,480 --> 00:17:54,640
Vamos a hacerlo con la muestra 4, por ejemplo. Los patrones los ponemos igual, el voltaje vamos a ponerlo a 150 y le vamos a añadir el patrón.

121
00:17:54,640 --> 00:18:00,680
añadimos patrón y añadimos muestra

122
00:18:00,680 --> 00:18:13,059
y le damos a comenzar

123
00:18:13,059 --> 00:18:25,450
pues fijaros, quedaros con esta imagen

124
00:18:25,450 --> 00:18:29,390
fijaros la azul, la amarilla, la banda azul

125
00:18:29,390 --> 00:18:32,609
está bastante separada de la amarilla, estas un poquito más juntas

126
00:18:32,609 --> 00:18:37,230
y estas un poquito más separadas, pues vamos a quedarnos con esta

127
00:18:37,230 --> 00:18:41,490
imagen y ahora vamos a cambiar la concentración

128
00:18:41,490 --> 00:18:57,599
de acrilamida y vamos a poner el máximo 15. Volvemos a introducir el patrón, introducimos

129
00:18:57,599 --> 00:19:14,579
la muestra y le damos a comenzar. Como hemos puesto mucha acrilamida, aquí estas bandas

130
00:19:14,579 --> 00:19:20,900
si os fijáis están más pegadas, las bandas de mayor masa molecular están aquí más

131
00:19:20,900 --> 00:19:26,900
pegadas antes nos salían más separadas. Pues dependiendo de qué zona queramos ver,

132
00:19:27,460 --> 00:19:34,740
pues vamos a elegir un tanto por ciento de acrilamida mayor o menor. Y ahora vamos a

133
00:19:34,740 --> 00:19:50,420
ver la gráfica, cómo se analiza la gráfica. Pues en este caso, bueno, vamos a volver a

134
00:19:50,420 --> 00:20:02,230
hacer la anterior si vamos a volver a hacerla vamos a volver a hacer a 10 por

135
00:20:02,230 --> 00:20:29,180
ejemplo añadimos patrón añadimos muestra no se separa este vamos a coger otra

136
00:20:29,180 --> 00:20:35,000
porque aquí no sé por qué no se separa este se necesitará a verla vamos a

137
00:20:35,000 --> 00:20:55,549
hacer la 1. La 1, vamos a hacer al 12%, añadimos patrón, añadimos muestra y le damos a comenzar.

138
00:21:10,119 --> 00:21:17,180
Bien, pues le damos a detener y ahora vamos a ver la gráfica. Esta sería la gráfica,

139
00:21:17,339 --> 00:21:23,240
esta sería la representación de estas bandas, de estas proteínas que tenemos en la muestra

140
00:21:23,240 --> 00:21:29,720
de referencia. La movilidad relativa es el RF que yo os comentaba antes, que es la distancia

141
00:21:29,720 --> 00:21:37,579
desde aquí hasta la primera banda dividida entre la distancia desde aquí hasta lo que

142
00:21:37,579 --> 00:21:42,980
recorre el disolvente y se va representando frente al logaritmo de la masa molecular.

143
00:21:43,980 --> 00:21:50,779
En este caso nos sale una recta cuya pendiente es menos 0,94 y la ordenada en el origen es

144
00:21:50,779 --> 00:22:14,779
4,81. Pues entonces tendríamos que medir esta distancia de aquí, la distancia de nuestra muestra, que si pinchamos aquí la tenemos, tenemos aquí la movilidad relativa, que es, o sea, esto sería el avance en milímetros, son 3,08, dividido entre lo que ha recorrido el disolvente, nos va a dar la movilidad relativa, que son 0,05, ¿vale?

145
00:22:14,779 --> 00:22:23,759
pues este valor de movilidad relativa lo metemos en la recta y de ahí vamos a sacar la masa molecular.

146
00:22:26,829 --> 00:22:33,710
Vale, entonces si pinchamos aquí, vale, no, pues eso ya habría que calcularlo.

147
00:22:36,740 --> 00:22:43,500
Bueno, pues esta es una simulación de la electroforesis, de lo que se hace,

148
00:22:43,500 --> 00:22:47,519
cómo se lleva a cabo

149
00:22:47,519 --> 00:22:48,779
una electroforesis

150
00:22:48,779 --> 00:22:50,900
en gel de poliacrilamida

151
00:22:50,900 --> 00:22:53,119
si queréis vosotros

152
00:22:53,119 --> 00:22:54,299
en casa podéis

153
00:22:54,299 --> 00:22:56,059
también practicar