1
00:00:00,940 --> 00:00:07,419
Bien, vamos a empezar la última parte del tema 3 sobre las técnicas de visualización de microorganismos.

2
00:00:08,140 --> 00:00:12,300
En concreto vamos a ver las técnicas de tinción y de observación de bacterias.

3
00:00:12,720 --> 00:00:22,079
Hemos ido viendo en los apartados anteriores que es muy importante para poder identificar qué bacteria está causando la patología de un paciente

4
00:00:22,079 --> 00:00:27,300
observar microscópicamente las bacterias en las muestras biológicas,

5
00:00:27,300 --> 00:00:33,640
biológicas, observar los agrupamientos, la morfología que tienen las bacterias, si existe o no existe

6
00:00:33,640 --> 00:00:40,320
movilidad. Vamos a ver también que es muy importante las propiedades tintoriales. Dependiendo de las

7
00:00:40,320 --> 00:00:48,119
propiedades tintoriales de la bacteria las podremos clasificar según si son positivas o negativas para

8
00:00:48,119 --> 00:00:54,820
determinadas tinciones y todo esto nos va a ayudar a identificar qué bacterias están produciendo la

9
00:00:54,820 --> 00:01:00,520
enfermedad del paciente. Por tanto, en este apartado vamos a ver las técnicas de tinción

10
00:01:00,520 --> 00:01:10,480
que nos van a permitir observar microscópicamente los agentes etiológicos de la patología del

11
00:01:10,480 --> 00:01:21,040
paciente. Para observar las bacterias existen dos aproximaciones fundamentales. La primera es lo que

12
00:01:21,040 --> 00:01:27,340
llamamos el examen en fresco. El examen en fresco es preparaciones sin teñir, no vamos a aplicar

13
00:01:27,340 --> 00:01:34,060
ninguna tinción y vamos a observar las bacterias tal cual son. Normalmente las bacterias están

14
00:01:34,060 --> 00:01:43,040
vivas, no hay que fijarlas y por tanto podremos observar una serie de características que poseen

15
00:01:43,040 --> 00:01:48,719
las bacterias vivas, por ejemplo la movilidad, si poseen o no flagelos, si se pueden o no se pueden

16
00:01:48,719 --> 00:01:56,900
mover etcétera etcétera normalmente para hacer exámenes en fresco añadimos entre porta y cubre

17
00:01:56,900 --> 00:02:03,840
un o entre porta y cubre una gota de la muestra del paciente que contiene las bacterias también

18
00:02:03,840 --> 00:02:10,159
se puede utilizar lo que llamamos la gota pendiente la gota la técnica de la gota colgante

19
00:02:10,159 --> 00:02:16,860
o gota pendiente lo que hacemos es sobre el cubre objetos añadimos una gota de la muestra del

20
00:02:16,860 --> 00:02:24,520
paciente y la ponemos boca abajo sobre un porta excavado. Todo esto lo veremos en prácticas,

21
00:02:24,659 --> 00:02:29,699
¿de acuerdo? Los exámenes en fresco que nos permiten sobre todo observar la morfología,

22
00:02:30,539 --> 00:02:36,599
la cantidad de microorganismos y principalmente se utiliza para estudiar la movilidad de los

23
00:02:36,599 --> 00:02:44,699
microorganismos. Normalmente el examen en fresco no se suele realizar y se suele abordar la

24
00:02:44,699 --> 00:02:50,759
observación de las bacterias en preparaciones coloreadas, es decir, vamos a utilizar

25
00:02:50,759 --> 00:02:58,819
colorantes. Estos colorantes pueden ser de dos tipos, pueden ser colorantes vitales, de tal manera

26
00:02:58,819 --> 00:03:05,860
que se van a introducir dentro de las bacterias, las bacterias van a estar vivas y coloreadas, o

27
00:03:05,860 --> 00:03:14,400
sobre las bacterias fijadas, previamente fijadas, a las cuales les aplicamos una serie de colorantes

28
00:03:14,400 --> 00:03:19,719
y tinciones, técnicas de tinciones para aumentar el contraste.

29
00:03:20,060 --> 00:03:25,099
Tanto la coloración vital como las técnicas de tinción que vamos a ver ahora

30
00:03:25,099 --> 00:03:29,780
se utilizan eso para aumentar el contraste del medio que rodea a las bacterias

31
00:03:29,780 --> 00:03:34,599
y por tanto mejorar la calidad de visualización de las bacterias.

32
00:03:35,819 --> 00:03:39,199
Es verdad que también se pueden utilizar otros tipos de microscopía

33
00:03:39,199 --> 00:03:43,639
aparte de la microscopía normal, la microscopía óptica normal

34
00:03:43,639 --> 00:03:49,020
como es la microscopía de fluorescencia, la microscopía de contraste de fases o incluso

35
00:03:49,020 --> 00:03:56,560
la microscopía electrónica, pero lo normal es realizar tinciones específicas y observar

36
00:03:56,560 --> 00:04:05,719
en el microscopio óptico. Para poder realizar el examen microscópico de una bacteria normalmente

37
00:04:05,719 --> 00:04:12,000
todos los protocolos siguen tres pasos. El primer paso es la preparación del frotis,

38
00:04:12,000 --> 00:04:22,980
Es decir, vamos a hacer una extensión de la muestra del paciente que contiene los microorganismos y una vez ya tengamos la extensión la vamos a fijar.

39
00:04:22,980 --> 00:04:38,759
Esta fijación puede ser de varios tipos. Normalmente suele ser con calor, vamos a flamear el porta debajo de la llama del mechero y así se va a fijar al porta, pero también puede ser utilizando agentes químicos.

40
00:04:38,759 --> 00:04:45,139
Pueden ser alcoholes, por ejemplo, el etanol o algunas cetonas como la acetona.

41
00:04:45,139 --> 00:04:57,160
Y una vez ya hemos hecho la extensión y hemos realizado la fijación de la muestra al portaobjetos, entonces realizamos el protocolo de tinción más idóneo para nuestro estudio.

42
00:04:57,160 --> 00:05:04,500
dependiendo de la muestra si tenemos las bacterias por ejemplo en medio líquido

43
00:05:04,500 --> 00:05:11,939
lo que se suele hacer la extensión el frotis se suele hacer cogiendo con el asa de siembra

44
00:05:11,939 --> 00:05:17,720
después de flamearla y esterilizarla cogemos una pequeña cantidad del medio de cultivo del

45
00:05:17,720 --> 00:05:23,680
medio líquido y la extendemos haciendo pequeños movimientos circulares sobre la superficie del

46
00:05:23,680 --> 00:05:32,939
portaobjetos la extendemos para posteriormente fijarla. Si en lugar de proceder de un medio

47
00:05:32,939 --> 00:05:39,519
líquido viene de un medio sólido por ejemplo una colonia crecida en agar en medio sólido lo que

48
00:05:39,519 --> 00:05:46,639
hacemos es con el asa recogemos la colonia la diluimos un poquito en suero fisiológico del

49
00:05:46,639 --> 00:05:53,600
que preparamos el otro día en el laboratorio esa solución salina 0,9% y realizamos nuevamente

50
00:05:53,600 --> 00:06:01,500
con el mismo asa con movimientos circulares hacemos la extensión del frotis una vez conseguida

51
00:06:01,500 --> 00:06:07,160
la extensión le hemos dicho que el siguiente paso es la fijación la fijación podemos realizar en el

52
00:06:07,160 --> 00:06:13,459
mechero acordaos que tenemos unas pinzas de madera para coger el porta y por tanto aumentando así

53
00:06:13,459 --> 00:06:20,399
nuestra seguridad dependiendo del protocolo de tensión fijaremos con calor o fijamos bien

54
00:06:20,399 --> 00:06:30,560
secando al aire o utilizando compuestos químicos, alcoholes o acetona. Una vez fijada, ya fijadas

55
00:06:30,560 --> 00:06:38,420
las muestras, se puede decir que el porta está preparado para las técnicas de tinción. Tenemos

56
00:06:38,420 --> 00:06:45,360
dos tipos de técnicas de tinción, pero las que más se utilizan son las tinciones cromogénicas.

57
00:06:45,360 --> 00:06:58,579
Las tinciones cromogénicas se denominan así porque vamos a utilizar colorantes, o sea, compuestos químicos que suelen ser orgánicos, que son cromogénicos, es decir, aportan color.

58
00:06:59,759 --> 00:07:06,699
Los colorantes que más se utilizan son derivados de unas moléculas con anillos aromáticos llamadas anilinas.

59
00:07:06,699 --> 00:07:11,480
Y estas anilinas pueden ser de varios tipos dependiendo de la carga.

60
00:07:11,480 --> 00:07:16,360
tenemos colorantes ácidos o aniónicos con carga negativa

61
00:07:16,360 --> 00:07:18,180
y como tienen carga negativa

62
00:07:18,180 --> 00:07:22,819
se van a unir y van a teñir estructuras de la célula

63
00:07:22,819 --> 00:07:25,379
con carga positiva

64
00:07:25,379 --> 00:07:27,720
por ejemplo las proteínas citoplasmáticas

65
00:07:27,720 --> 00:07:29,540
¿de acuerdo?

66
00:07:30,759 --> 00:07:34,860
de tal manera que en concreto para las bacterias

67
00:07:34,860 --> 00:07:37,579
estos colorantes ácidos o aniónicos

68
00:07:37,579 --> 00:07:41,379
van a teñir muy bien el citoplasma de las bacterias

69
00:07:41,379 --> 00:07:46,379
pero tienen un problema. El problema es que no se unen muy bien a la pared bacteriana.

70
00:07:47,819 --> 00:07:57,319
Ejemplos de colorantes tipo anilinas ácidos son el rojo congo, la fucsina ácida, la eosina y el

71
00:07:57,319 --> 00:08:03,180
rosa de bengala. Va bien conocerlos porque los utilizaremos en el laboratorio. Los cuatro, rojo

72
00:08:03,180 --> 00:08:11,529
congo, fucsina ácida, la eosina y el rojo de bengala. Por otro lado, hablamos de colorantes

73
00:08:11,529 --> 00:08:17,490
básicos o cationicos aquellos que están cargados positivamente por tanto se unirán muy bien e

74
00:08:17,490 --> 00:08:23,209
interaccionarán y tiñirán muy bien aquellos componentes de la célula que tengan carga

75
00:08:23,209 --> 00:08:30,750
negativa especialmente los ácidos nucleicos y la pared celular algunos colorantes básicos que

76
00:08:30,750 --> 00:08:37,990
también nos suenan de prácticas son el cristal violeta el azul de metileno la fucsina básica

77
00:08:37,990 --> 00:08:46,070
la safranina y el verde malaquita también hay que conocerlos todos ellos y después tenemos una serie

78
00:08:46,070 --> 00:08:53,049
de colorantes que llamamos neutros o anfóteros que normalmente suelen ser mezclas de un componente

79
00:08:53,049 --> 00:09:00,090
ácido y un componente cationico de acuerdo de tal manera que estos neutros o anfóteros van a teñir

80
00:09:00,090 --> 00:09:06,730
tanto estructuras ácidas como estructuras básicas es decir cargadas positiva como negativamente de

81
00:09:06,730 --> 00:09:14,450
acuerdo? Es importante recalcar que además de los colorantes en estas cinciones cromogénicas vamos

82
00:09:14,450 --> 00:09:20,230
a utilizar en muchas ocasiones lo que llamamos compuestos que llamamos mordientes. Los mordientes

83
00:09:20,230 --> 00:09:28,070
no son colorantes en sí, son sustancias químicas que vamos a utilizar para potenciar y favorecer

84
00:09:28,070 --> 00:09:35,029
la unión del colorante a las estructuras de la célula. Entonces, gracias a los mordientes el

85
00:09:35,029 --> 00:09:45,659
colorante va a teñir mucho mejor la muestra. ¿Qué tipos de tinciones se suelen utilizar en

86
00:09:45,659 --> 00:09:52,600
bacteriología? Pues todas estas que tenemos aquí y las tenemos que conocer. Las vamos a ir estudiando

87
00:09:52,600 --> 00:09:57,759
aunque sea de pasada, muchas de ellas las haremos en prácticas. Por un lado tenemos las tinciones

88
00:09:57,759 --> 00:10:02,799
simples. Una tinción simple es aquella tinción en la que voy a utilizar un único colorante.

89
00:10:02,799 --> 00:10:09,600
por ejemplo podemos hacer la tinción con azul de metileno que se utiliza muchísimo

90
00:10:09,600 --> 00:10:12,960
o la tinción con nigrosina, la tinción con nigrosina

91
00:10:12,960 --> 00:10:17,159
esta de aquí, la de azul de metileno es una tinción positiva

92
00:10:17,159 --> 00:10:19,000
vamos a teñir las bacterias

93
00:10:19,000 --> 00:10:23,320
la tinción con nigrosina es parecida a la tinción con tinta china, tinta Parker

94
00:10:23,320 --> 00:10:25,220
que son tinciones negativas

95
00:10:25,220 --> 00:10:29,500
se va a teñir muy bien el fondo pero no las bacterias

96
00:10:29,500 --> 00:10:31,460
de tal manera que vamos a poder distinguir

97
00:10:31,460 --> 00:10:38,940
Por ejemplo, con nigrosina se utiliza mucho para distinguir flagelos, flagelos y las cápsulas de las bacterias.

98
00:10:39,820 --> 00:10:40,639
Tinciones simples.

99
00:10:41,620 --> 00:10:43,960
En segundo lugar tenemos las tinciones diferenciales.

100
00:10:43,980 --> 00:10:50,659
Las tinciones diferenciales vamos a utilizar más de un colorante, normalmente dos, uno básico y otro ácido.

101
00:10:51,399 --> 00:10:59,059
Un colorante, que es el colorante importante, y una contratinción, para contrateñir el resto de estructuras.

102
00:10:59,059 --> 00:11:00,360
Las vamos a ver ahora.

103
00:11:00,360 --> 00:11:09,139
¿Por qué se le llaman diferenciales? Porque nos va a permitir diferenciar unas bacterias de otras dependiendo de su estructura.

104
00:11:10,360 --> 00:11:16,899
Tinciones diferenciales, las más importantes son la tinción gram, que nos va a dividir las bacterias en gram positivas y gram negativas,

105
00:11:17,379 --> 00:11:24,240
la extinción de cialnísel, que ya la hemos oído y ya la hemos visto en clase, aunque sea de pasada,

106
00:11:24,240 --> 00:11:30,340
que va a atendir las bacterias BAAR, las bacterias ácido-alcohol resistentes.

107
00:11:30,360 --> 00:11:35,120
Estas tinciones las haremos en el laboratorio y las vamos a detallar a continuación

108
00:11:35,120 --> 00:11:39,659
Por otro lado, además de las tinciones simples y tinciones diferenciales

109
00:11:39,659 --> 00:11:41,779
tenemos las tinciones estructurales

110
00:11:41,779 --> 00:11:44,460
Estas tinciones no se suelen utilizar de rutina

111
00:11:44,460 --> 00:11:49,460
y nos permiten colorear determinadas estructuras

112
00:11:49,460 --> 00:11:53,399
y ver si las bacterias tienen determinadas estructuras en su interior

113
00:11:53,399 --> 00:11:59,639
Tenemos la tinción de cápsulas, la tinción de flagelos, la tinción de endosforas, etc.

114
00:11:59,639 --> 00:12:15,519
Y por último tenemos las tinciones fluorescentes. A diferencia de las anteriores, no vamos a utilizar compuestos colorantes cromogénicos, sino que vamos a utilizar colorantes fluorescentes.

115
00:12:16,820 --> 00:12:27,059
Utilizaremos colorantes fluorescentes para aumentar mucho la sensibilidad. Los ejemplos son la tinción de auramina y la tinción de naranja de acridina.

116
00:12:27,059 --> 00:12:44,240
¿De acuerdo? Vamos a ir detallando una a una estas cinciones, viendo un poco el protocolo por encima, porque luego la realizaremos en prácticas, pero sí haciendo hincapié en los puntos clave de cada una de estas cinciones.

117
00:12:44,600 --> 00:12:48,059
Las cinciones que más se utilizan de forma rutinaria son las cinciones diferenciales.

118
00:12:51,649 --> 00:12:55,210
Las cinciones simples, ya hemos dicho, se utiliza un solo colorante.

119
00:12:55,850 --> 00:12:56,169
¿De acuerdo?

120
00:12:56,169 --> 00:13:24,309
Bien, en solución acuosa o en solución alcohólica, dependiendo del colorante. ¿Para qué se utilizan? Se utilizan para estudiar en general qué bacteria hay ahí, es decir, la morfología individual, son bacilos, son cocos, son vibrios, espirilos, espiroquetas, si hay algún tipo de agrupamiento, son estreptos, son estafilo, porque forman, tenemos arcinas, etc., etc.

121
00:13:24,309 --> 00:13:40,570
Y si existe más de un tipo de bacterias distintas en la muestra, por ejemplo, cocos y bacilos. Más allá de la morfología y los agrupamientos, este tipo de tinciones simples no nos permiten más información.

122
00:13:40,570 --> 00:14:01,080
Las que más se utilizan son la tinción con azul de metileno y la tinción con fucsina. La de azul de metileno tiñe las bacterias de un color púrpura, oscuro, azul oscuro, púrpura, y la fucsina de un rojo, rosaceo, fucsia, que se ven muy bien.

123
00:14:01,080 --> 00:14:19,460
Aquí, por ejemplo, tenemos en la imagen de la izquierda, esta es una tinción con azul de metileno y se observa claramente que son cocos y yo diría que son diplococos, parece que van en grupos de dos, diplococos, ¿de acuerdo? Si os acordáis del otro día, los diplococos son típicos del género Neisseria.

124
00:14:19,460 --> 00:14:27,100
en cambio aquí tenemos la tinción con nigrosina que ya hemos dicho que es una tinción negativa

125
00:14:27,100 --> 00:14:31,980
por tanto aquí la nigrosina tiñe el fondo no puede penetrar dentro de las bacterias

126
00:14:31,980 --> 00:14:38,179
y esto nos permite por ejemplo distinguir que tenemos bacterias de tipo coco pero que además son capsulados

127
00:14:38,179 --> 00:14:43,360
si veis este borde refulgente que hay alrededor de estas bacterias es la cápsula

128
00:14:43,360 --> 00:14:49,379
por tanto la nigrosina al ser un colorante aniónico no puede penetrar en las bacterias

129
00:14:49,379 --> 00:15:05,460
Es repelido por la pared celular y constituye una, bueno, pues una tensión negativa que se utiliza mucho para visualizar cápsulas, flagelos u otras bacterias que son difíciles de teñir, ¿vale?

130
00:15:05,480 --> 00:15:12,519
Como por ejemplo los espirilos, que no se teñen bien ni con la tensión Gram, ni con la tensión Ciel-Missel, etcétera, etcétera.

131
00:15:13,059 --> 00:15:14,440
Tensiones simples.

132
00:15:14,440 --> 00:15:21,960
Entrando en las cinciones diferenciales, ya hemos dicho que al menos esas cinciones van a utilizar un par de colorantes

133
00:15:21,960 --> 00:15:27,100
Y la mayoría de ellos, además de los dos colorantes, van a utilizar un mordiente

134
00:15:27,100 --> 00:15:34,179
De esta manera, gracias a la utilización de dos colorantes

135
00:15:34,179 --> 00:15:43,740
Podemos diferenciar grupos de bacterias aunque la morfología y los agrupamientos sean idénticos

136
00:15:43,740 --> 00:15:52,720
Podemos tener dos tipos de cocos que los vamos a poder diferenciar si unos son cocos gram positivo y los otros son gram negativo.

137
00:15:52,899 --> 00:15:59,879
Por tanto, vamos a poder diferenciar grupos de bacterias en función de sus propiedades tintoriales.

138
00:16:01,740 --> 00:16:09,600
La tinción gram se utiliza muchísimo y la haremos en el laboratorio y tenemos que dominarla.

139
00:16:09,600 --> 00:16:16,080
De hecho, es el primer paso en los protocolos de identificación bacteriana.

140
00:16:16,139 --> 00:16:22,279
Lo primero que hacemos con una muestra es una extensión y un gram, para ver si son gram positivos o son gram negativos.

141
00:16:22,639 --> 00:16:29,919
Gracias a esta tinción gram, se pueden dividir el 80% aproximadamente de las bacterias en dos grandes grupos.

142
00:16:30,840 --> 00:16:37,980
Las bacterias gram positivas, que se van a teñir de un color púrpura, violaceo oscuro, azul,

143
00:16:37,980 --> 00:16:42,320
y las gran negativas de un color rosáceo rojizo intenso, ¿de acuerdo?

144
00:16:43,659 --> 00:16:51,980
Es muy importante esta tinción porque una incorrecta interpretación puede hacer variar el número de pruebas

145
00:16:51,980 --> 00:16:55,039
que tengamos que realizar a la muestra del paciente.

146
00:16:55,519 --> 00:17:01,120
Es decir, ya hemos dicho que es el primer paso en la identificación de la bacteria, es la tinción gram.

147
00:17:01,379 --> 00:17:04,500
Entonces es muy importante que la hagamos bien y que digamos,

148
00:17:04,500 --> 00:17:07,720
identifiquemos si realmente son gran positivas o gran negativas

149
00:17:07,720 --> 00:17:09,920
porque de ese resultado

150
00:17:09,920 --> 00:17:13,279
dependen las pruebas que tenemos que hacer posteriormente

151
00:17:13,279 --> 00:17:16,799
para llegar a la identificación final de las bacterias

152
00:17:16,799 --> 00:17:23,119
también es muy útil realizar las sobre extensiones

153
00:17:23,119 --> 00:17:25,400
obtenidas directamente de la propia muestra

154
00:17:25,400 --> 00:17:29,420
muchas veces la muestra extraemos el paciente

155
00:17:29,420 --> 00:17:31,180
intentamos hacer un cultivo puro

156
00:17:31,180 --> 00:17:34,019
lo cultivamos y luego lo teñimos

157
00:17:34,019 --> 00:17:48,700
Pero muchas veces directamente de la propia muestra, por ejemplo un esputo de un paciente o de un exudado, obtenemos una muestra y hacemos rápidamente una tinción gram que pueda guiar el diagnóstico al patólogo.

158
00:17:48,700 --> 00:18:00,380
Por ejemplo, esto es una muestra sanguínea, si os dais cuenta estos son neutrófilos y esto es Neisseria gonorrae que está dentro de unos neutrófilos porque es un parásito intracelular.

159
00:18:00,380 --> 00:18:02,220
sabiendo ya que son

160
00:18:02,220 --> 00:18:04,019
Neisseria es

161
00:18:04,019 --> 00:18:05,839
gran negativa

162
00:18:05,839 --> 00:18:07,980
sabiendo que tenemos cocos

163
00:18:07,980 --> 00:18:10,059
gran negativos dentro de los

164
00:18:10,059 --> 00:18:12,079
neutrófilos, esto ya es una pista muy

165
00:18:12,079 --> 00:18:14,059
clara para que el patólogo

166
00:18:14,059 --> 00:18:15,819
pueda empezar a

167
00:18:15,819 --> 00:18:18,259
elucubrar un diagnóstico

168
00:18:18,259 --> 00:18:19,720
y las pruebas posteriores

169
00:18:19,720 --> 00:18:22,400
aquí tenemos Streptococcus pneumoniae

170
00:18:22,400 --> 00:18:24,019
por ejemplo el líquido cefalorraquídeo

171
00:18:24,019 --> 00:18:24,980
también formando

172
00:18:24,980 --> 00:18:27,819
diplococos

173
00:18:27,819 --> 00:18:29,440
en este caso, ¿de acuerdo?

174
00:18:29,440 --> 00:18:34,799
¿Cuál es el procedimiento de la tensión gram?

175
00:18:35,440 --> 00:18:38,680
Una vez realizada la extensión y la fijación de la muestra

176
00:18:38,680 --> 00:18:41,099
lo que hacemos es añadir el primer colorante

177
00:18:41,099 --> 00:18:42,500
que es el cristal violeta

178
00:18:42,500 --> 00:18:48,119
El cristal violeta tiene la capacidad de penetrar en el interior de las bacterias

179
00:18:48,119 --> 00:18:51,519
de tal manera que todas las bacterias que tengamos en el porta

180
00:18:51,519 --> 00:18:53,700
todas se van a teñir de color violeta

181
00:18:53,700 --> 00:18:54,759
¿De acuerdo?

182
00:18:55,319 --> 00:18:58,200
El segundo paso es añadir el mordiente

183
00:18:58,200 --> 00:18:59,440
El mordiente es el Lugol

184
00:18:59,440 --> 00:19:01,619
El Lugol que es una solución de yodo

185
00:19:01,619 --> 00:19:13,460
Este luego lo que va a hacer es que el colorante cristal violeta se una íntimamente a las estructuras de la célula y no difunda fuera de ellas, sino que quede en el interior.

186
00:19:14,319 --> 00:19:18,599
En el tercer paso, el tercer paso es un paso de decoloración.

187
00:19:19,039 --> 00:19:20,880
Vamos a decolorar las bacterias.

188
00:19:20,880 --> 00:19:31,140
Y las únicas bacterias que se van a poder decolorar son aquellas bacterias que tienen la pared débil, mucho más débil.

189
00:19:31,140 --> 00:19:45,759
es decir, la pared de las gram negativas. Si os acordáis, tiene una capa de peptidoglicano muchísimo más delgada, de tal manera que con esta solución de decoloración, que es la que preparamos en prácticas hace unos días,

190
00:19:45,759 --> 00:19:49,299
alcohol acetona, si os acordáis

191
00:19:49,299 --> 00:19:53,920
va a producir que aquellas bacterias que son gram negativas

192
00:19:53,920 --> 00:19:59,019
se produzca su decoloración

193
00:19:59,019 --> 00:20:02,940
y el cristal violeta sale

194
00:20:02,940 --> 00:20:06,059
fuera de las células, pierden

195
00:20:06,059 --> 00:20:11,140
esta coloración púrpura, mientras que las que sean gram positivas

196
00:20:11,140 --> 00:20:14,859
no pierden la coloración, ¿de acuerdo? y mantienen su

197
00:20:14,859 --> 00:20:22,559
coloración púrpura el último paso es una la aplicación de una contratinción para teñir

198
00:20:22,559 --> 00:20:29,079
estas bacterias gran negativas y poderlas distinguir también y añadimos safran safranino

199
00:20:29,079 --> 00:20:35,859
de tal manera que el resultado final es aquellas bacterias que sean gran positivas tendrán esta

200
00:20:35,859 --> 00:20:42,460
coloración púrpura aquí estamos viendo cocos gran positivos que están mezclados con vacilos

201
00:20:42,460 --> 00:20:52,420
gram-negativos. ¿De acuerdo? Esta tabla es importante. No está en los apuntes, pero la

202
00:20:52,420 --> 00:20:58,700
tenéis aquí. Esta tabla es muy importante, de tal manera que tendríamos que saber qué géneros de

203
00:20:58,700 --> 00:21:04,380
bacterias, que los vamos a ir viendo a lo largo de todo el curso, habría que aprenderse ya cuáles

204
00:21:04,380 --> 00:21:09,099
de estos géneros son gram-positivo y cuáles son gram-negativo. Gram-positivo, estafilococcus,

205
00:21:09,099 --> 00:21:18,240
Streptococcus, Colirnebacterium, Lactobacillus, Listeria, Clostridium, Enterococcus, Bacillus, Nocardia, Actinomyces y Propinebacterium.

206
00:21:18,980 --> 00:21:36,079
Las gran negativas, prácticamente todas las enterobacterias que ya las veremos, Escherichia coli, Enterobacter, Sigela, Salmonella, Proteus, Citrobacter, Yersinia, Hemophilus, Influenza, por ejemplo, Klebsiella, Serratia helicobacter

207
00:21:36,079 --> 00:21:45,819
Y otras, legionela, campylobacter, francisela, bordetela, pasterela, las pseudomonas, brucela y neisseria.

208
00:21:46,279 --> 00:21:48,519
¿De acuerdo? Todas estas son gram negativas.

209
00:21:49,059 --> 00:21:54,740
Hay que conocerlas y hay que saber cuáles son gram positivas y cuáles son gram negativas.

210
00:21:55,940 --> 00:22:05,220
Pero ya sabemos que hay alrededor de un 10-15-20% de las bacterias que no se tiñen con la tinción gram.

211
00:22:06,079 --> 00:22:11,319
Por tanto, no son ni gran positivas ni gran negativas debido a que tienen otro tipo de pared celular.

212
00:22:11,920 --> 00:22:16,400
Son las que llamamos las bacterias ácido-alcohol resistentes.

213
00:22:16,880 --> 00:22:20,460
Para poder visualizar las bacterias ácido-alcohol resistentes,

214
00:22:20,880 --> 00:22:24,859
utilizaremos una tinción diferencial que es la tinción de Ciel-Missel.

215
00:22:24,859 --> 00:22:34,859
Nos va a permitir distinguir este tipo de bacterias que son resistentes a la decoloración por una solución ácido-alcohol,

216
00:22:34,859 --> 00:22:41,440
alcohol, que también la preparamos el otro día en el laboratorio si recordáis. ¿Qué bacterias ácido

217
00:22:41,440 --> 00:22:50,779
alcohol resistente importantes? Tenemos que saber, mycobacterium, tuberculosis y leprae,

218
00:22:51,640 --> 00:22:58,980
el mycobacterium es el causante de la tuberculosis y de la lepra, pero también tenemos

219
00:22:58,980 --> 00:23:05,440
la enocardias y actinomices que son bar ácido alcohol resistentes y algunos protozoos como

220
00:23:05,440 --> 00:23:12,160
cristosporidium de acuerdo hay que conocerlos también y hay que saber que son ácido alcohol

221
00:23:12,160 --> 00:23:21,950
resistentes ya vimos cuando estuvimos viendo las estructuras de las paredes que la característica

222
00:23:21,950 --> 00:23:28,109
fundamental de la pared de estas bacterias es que tiene una elevada proporción de ácidos micólicos

223
00:23:28,109 --> 00:23:41,190
que son ácidos grasos ramificados muy largos, de 50 a 90 átomos de carbono, o sea que son muy grandes, muy muy largos, y están mezclados también en su pared con determinadas ceras, ¿de acuerdo?

224
00:23:41,390 --> 00:23:52,589
De tal manera que esta elevada cantidad de ácidos grasos, de ceras, hacen que la pared sea muy grasa, y por tanto se tiña muy mal con la tinción Gram, ¿de acuerdo?

225
00:23:52,589 --> 00:23:59,470
Del mismo modo que la tinción gram, la tinción ciel-níxel también tiene tres fases.

226
00:23:59,950 --> 00:24:04,430
La primera es una tinción en caliente, en caliente con fucsina fenicada.

227
00:24:05,329 --> 00:24:14,230
De tal manera que al aumentar la temperatura, las grasas se licúan, las grasas de la pared se licúan,

228
00:24:14,289 --> 00:24:19,589
las ceras se licúan y permiten que la fucsina fenicada entre con más facilidad.

229
00:24:20,630 --> 00:24:20,970
¿De acuerdo?

230
00:24:20,970 --> 00:24:36,829
El siguiente paso es la decoloración en frío con una solución ácido-alcohol, de tal manera que todas las bacterias que no tengan ácidos micólicos y ceras se van a decolorar, ¿de acuerdo?

231
00:24:36,829 --> 00:24:59,730
Y por último haremos la tensión de contraste con azul de metileno, de tal manera que aquí lo tenemos en un esquemita, vamos a producir una primera coloración inicial, todas ellas con fucsina, ¿de acuerdo? Entonces todas las bacterias se van a teñir de este color fucsia, rosáceo, tanto las ácidos alcohol resistentes como las que no son ácidos alcohol resistentes.

232
00:24:59,730 --> 00:25:02,990
después tenemos el paso de decoloración

233
00:25:02,990 --> 00:25:05,970
de manera que estas bacterias van a perder la fucsina

234
00:25:05,970 --> 00:25:08,650
pero las ácido-alcohol resistentes no

235
00:25:08,650 --> 00:25:11,430
y después la coloración de contraste

236
00:25:11,430 --> 00:25:15,309
que lo vamos a realizar con azul de metileno

237
00:25:15,309 --> 00:25:17,970
de tal manera que estas bacterias que se han decolorado

238
00:25:17,970 --> 00:25:23,170
van a adquirir esta coloración violácea oscura

239
00:25:23,170 --> 00:25:24,690
azul oscuro, ¿de acuerdo?

240
00:25:25,690 --> 00:25:28,490
ya sabemos que la solución de decoloración

241
00:25:28,490 --> 00:25:36,650
es una solución al 3% de ácido clorhídrico concentrado en etanol, ¿de acuerdo?

242
00:25:36,890 --> 00:25:38,970
Aquí tenemos un ejemplo, ¿de acuerdo?

243
00:25:39,069 --> 00:25:46,130
Esto es una muestra de un esputo y a mí me parece que estos son Mycobacterium tuberculosis, ¿de acuerdo?

244
00:25:51,549 --> 00:25:56,869
Ya hemos visto las tensiones simples, hemos visto las tensiones diferenciales.

245
00:25:56,869 --> 00:26:04,089
En cuanto a las finciones estructurales, aquí lo que buscamos es una estructura concreta.

246
00:26:04,309 --> 00:26:11,730
Identificar si la bacteria tiene o no tiene una estructura concreta que nos ayude en el proceso de identificación.

247
00:26:12,650 --> 00:26:18,609
Los flagelos. Los flagelos son difíciles de teñir porque son muy delgados, muy finos.

248
00:26:18,769 --> 00:26:24,369
Además, en el proceso de fijación se suelen retraer y se suelen pegar a la pared.

249
00:26:24,369 --> 00:26:29,630
De tal manera que es difícil observar estos flagelos que vemos aquí en estas bacterias de la imagen.

250
00:26:30,609 --> 00:26:38,009
Para ello, lo que se suelen utilizar son compuestos químicos que van a recubrir el flagelo aumentando su grosor.

251
00:26:38,650 --> 00:26:41,630
Aumentan su grosor para que se pueda visualizar mejor.

252
00:26:42,890 --> 00:26:46,369
Este es el caso de la tinción de Leifson, que utiliza el ácido tánico.

253
00:26:46,369 --> 00:26:57,930
el ácido tánico se va a unir al flagelo aumentando su grosor y va a permitir que la fucsina tiña mejor ese flagelo, ¿de acuerdo?

254
00:26:58,210 --> 00:27:05,789
Para la tinción de Leifson utilizamos el colorante de Leifson, que bueno, no es ni más ni menos que una mezcla de fucsina en etanol

255
00:27:05,789 --> 00:27:12,769
junto con ácido tánico y sal clorosódico en agua destilada, ¿de acuerdo?

256
00:27:12,769 --> 00:27:30,769
Luego tenemos también la tinción de Rhodes, pero en este caso en lugar de ácido tánico utilizamos nitrato de plata y en lugar de fucsina utilizamos nitrato de plata y un mordiente también, de tal manera que los flagelos se van a ver de color oscuro, de color negro, negruzco.

257
00:27:30,769 --> 00:27:58,309
¿De acuerdo? Las endosporas, muy importante. Si queremos saber si tenemos bacterias con endosporas, os recuerdo algunas de ellas, ya las estuvimos viendo en diapositivas anteriores y tenemos que conocer por lo menos algunas de las que tienen, por ejemplo, el Clostridium, tiene endosporas, Clostridium botulinum, ya sabemos que las esporas poseen unas cubiertas muy impermeables.

258
00:27:58,309 --> 00:28:06,710
Ya estuvimos viendo su estructura, por lo que requieren de tinciones con calor que favorezcan que los colorantes puedan entrar.

259
00:28:06,829 --> 00:28:09,410
La que más se utiliza, la tinción de Birch Calkin.

260
00:28:10,369 --> 00:28:18,369
La tinción de Birch Calkin utiliza como colorante una solución de verde malaquita al 5%, ¿de acuerdo?

261
00:28:18,369 --> 00:28:39,549
Y la vamos a teñir sobre el mechero, el frotis, lo vamos a ir teñiendo sobre el mechero hasta que veamos que se emiten vapores, ¿de acuerdo? Cuando se empiezan a emitir vapores significa que eso nos indica, es indicativo de que el verde malaquita ha penetrado, está penetrando dentro de las endosporas.

262
00:28:39,549 --> 00:28:47,390
lo que se puede hacer además es lavar la muestra después de la tinción con verde malaquita

263
00:28:47,390 --> 00:28:50,230
y hacer una contratinción con safranina

264
00:28:50,230 --> 00:28:56,369
es una tinción de contraste de tal manera que las esporas van a quedar de un color verde

265
00:28:56,369 --> 00:29:00,890
muy bonito y el citoplasma de las bacterias va a quedar de un color rosace

266
00:29:00,890 --> 00:29:03,069
de acuerdo a las formas vegetativas

267
00:29:03,069 --> 00:29:05,829
aquí vemos un ejemplo de tinción

268
00:29:05,829 --> 00:29:09,410
estas son ya endosporas libres que las han liberado

269
00:29:09,410 --> 00:29:16,589
pero si nos fijamos aquí hay bacterias que todavía la tienen dentro la endospora

270
00:29:16,589 --> 00:29:23,210
y gracias a la tinción con safranina podemos ver la localización de las endosporas.

271
00:29:23,769 --> 00:29:30,410
Acordaos que podemos clasificar las bacterias dependiendo de la localización de las endosporas en varios tipos.

272
00:29:33,839 --> 00:29:36,640
Por último tenemos las tinciones fluorescentes.

273
00:29:36,640 --> 00:29:41,279
Las tinciones fluorescentes las vamos a utilizar cuando necesitemos mayor sensibilidad.

274
00:29:41,940 --> 00:29:49,960
Porque la fluorescencia, a diferencia de los compuestos cromogénicos, tienen con mucha mayor especificidad

275
00:29:49,960 --> 00:29:55,180
y se observan con mucha mayor nitidez y sensibilidad, ¿de acuerdo?

276
00:29:56,319 --> 00:30:01,720
Podemos utilizar tinciones directas o tinciones indirectas.

277
00:30:01,720 --> 00:30:07,039
Las tinciones directas, vamos a utilizar colorantes fluorescentes, ponemos el colorante,

278
00:30:07,039 --> 00:30:14,380
el colorante se une a determinadas estructuras de tal manera que esas estructuras ahora las vamos

279
00:30:14,380 --> 00:30:20,740
a ver en un microscopio de fluorescencia y las veremos fluorescentes. Dos ejemplos son la tinción

280
00:30:20,740 --> 00:30:27,940
de auramina y la tinción con naranja de acridina que se utilizan mucho en microbiología. ¿De acuerdo?

281
00:30:28,259 --> 00:30:36,160
Ambos compuestos son fluorescentes. Podemos hacer también tinciones indirectas en las cuales no

282
00:30:36,160 --> 00:30:42,299
vamos a utilizar colorantes fluorescentes directamente sino que vamos a utilizar anticuerpos

283
00:30:42,299 --> 00:30:48,599
marcados es decir vamos a utilizar también se le llaman técnicas de inmunofluorescencia

284
00:30:48,599 --> 00:30:55,819
inmunofluorescencia porque utilizamos anticuerpos que van a reconocer epítopos concretos estructuras

285
00:30:55,819 --> 00:31:01,759
concretas dentro de la bacteria y son los anticuerpos los que van marcados con fluorocromos

286
00:31:01,759 --> 00:31:10,000
De tal manera que empleando anticuerpos podemos detectar cualquier tipo de epítopo de la bacteria, ¿de acuerdo?

287
00:31:12,650 --> 00:31:32,109
La uramina, la tensión con la uramina se une muy bien a los ácidos micólicos y por tanto se utiliza mucho, se utiliza muchísimo en comparación con la tensión Ciel-Missel para la identificación de bacterias ácido-alcohol resistentes.

288
00:31:32,109 --> 00:31:42,769
La uramina se va a unir a los ácidos micólicos y se utiliza mucho para las micobacterias, sobre todo para el diagnóstico de micobacterium tuberculosis.

289
00:31:43,390 --> 00:31:47,609
Ya sabemos que la uramina también va a resistir la decoloración con ácido de alcohol.

290
00:31:48,690 --> 00:31:57,630
¿De acuerdo? Como en este caso, como tinción de contraste, se va a utilizar una solución de permanganato potásico al 0,5%.

291
00:31:57,630 --> 00:32:02,009
el permanganato además de eliminar la fluorescencia de fondo

292
00:32:02,009 --> 00:32:05,890
nos va a producir un fondo oscuro, casi negro

293
00:32:05,890 --> 00:32:08,789
de tal manera que se va a observar muy bien la uramina

294
00:32:08,789 --> 00:32:13,750
si conseguimos muestras con micobacterias

295
00:32:13,750 --> 00:32:16,410
vamos a realizar esta tinción de uramina

296
00:32:16,410 --> 00:32:18,390
en el microscopio de fluorescencia

297
00:32:18,390 --> 00:32:19,789
porque se ve muy bien y es muy bonita

298
00:32:19,789 --> 00:32:22,910
para decir que una muestra es negativa

299
00:32:22,910 --> 00:32:27,529
tenemos que observar al menos 30 campos consecutivos

300
00:32:27,529 --> 00:32:47,589
Si en los 30 campos no detectamos fluorescencia, pues entonces diremos que el paciente es negativo, ¿de acuerdo? Muy bien. Así se vería el campo, ¿de acuerdo? Esto es un campo del microscopio y así se verían las bacterias, de este color amarillento verdoso.

301
00:32:47,589 --> 00:32:52,289
a diferencia de la uramina que se une a los ácidos micólicos

302
00:32:52,289 --> 00:33:00,170
el naranja de acridina se utiliza como tinción selectiva y diferencial de los ácidos nucleicos

303
00:33:00,170 --> 00:33:03,910
el naranja de acridina se va a unir a los ácidos nucleicos

304
00:33:03,910 --> 00:33:11,349
y tiene esta coloración fluorescente naranja muy característica

305
00:33:11,349 --> 00:33:18,069
De tal manera que los microorganismos se van a observar con este color anaranjado

306
00:33:18,069 --> 00:33:24,849
Mientras que las células de otros tejidos o células que estén contaminando la muestra

307
00:33:24,849 --> 00:33:28,769
Se van a ver de este color amarillento-verdoso

308
00:33:28,769 --> 00:33:29,750
¿De acuerdo?

309
00:33:34,019 --> 00:33:41,099
Y bien, con estas técnicas de tinción fluorescente damos por concluido el tema 3