1 00:00:02,930 --> 00:00:13,589 Hola a todos, vamos a seguir con las presentaciones y hoy vamos a hablar de, vamos a seguir con 2 00:00:13,589 --> 00:00:22,269 el tema 4 y vamos a ver el punto 4.5 que aquí lo llaman clonación, aislamiento de clones 3 00:00:22,269 --> 00:00:32,170 y amplificación. Bien, pues si os acordáis ya estuvimos viendo que dentro de la ingeniería 4 00:00:32,170 --> 00:00:42,289 genética que se podía hacer con el ADN. Por una parte podemos cortar el ADN en fragmentos, 5 00:00:42,369 --> 00:00:48,609 el ADN es una molécula muy larga, acordaros que hasta 1970 era muy difícil trabajar con 6 00:00:48,609 --> 00:00:55,909 el ADN por su gran longitud y que a partir de ese año se encontraron unas endonucleasas 7 00:00:55,909 --> 00:01:01,990 de restricción o enzimas de restricción con las que podíamos cortar el ADN y así analizarlo 8 00:01:01,990 --> 00:01:11,730 más fácilmente. Y aparte de cortar el ADN, también se podía unir el ADN. Recordad los 9 00:01:11,730 --> 00:01:22,230 fragmentos cohesivos y fragmentos romos. También vimos la técnica de hibridación, 10 00:01:23,230 --> 00:01:29,569 vimos un poco la técnica CRISPR, que consistía en modificar una secuencia, o sea, introducir 11 00:01:29,569 --> 00:01:37,629 una secuencia de ADN diferente. Vimos también la técnica de la PCR, de la reacción en cadena 12 00:01:37,629 --> 00:01:44,450 de la polimerasa. Si os acordáis, consistía en amplificar un fragmento de ADN y hacer 13 00:01:44,450 --> 00:01:50,890 miles de copias. Y nos quedaba por ver secuenciación, que eso lo veremos el próximo día, y hoy 14 00:01:50,890 --> 00:02:01,489 vamos a ver la técnica del ADN recombinante. ¿En qué consiste esta técnica del ADN recombinante? 15 00:02:02,189 --> 00:02:10,789 Pues principalmente es una clonación celular, o sea, vamos a hacer copias de un fragmento 16 00:02:10,789 --> 00:02:20,849 de ADN, pero esas copias de ADN las vamos a hacer en una célula, en células, y por 17 00:02:20,849 --> 00:02:26,629 eso es una clonación celular. Acordaros que en la PCR lo que hacíamos era una clonación 18 00:02:26,629 --> 00:02:32,449 pero es a celular, porque es una clonación, nosotros ponemos el ADN en el termociclador 19 00:02:32,449 --> 00:02:40,729 y ahí a través de las diferentes etapas logramos obtener una gran cantidad de un fragmento 20 00:02:40,729 --> 00:02:47,469 de ADN, pero aquí lo que vamos a utilizar son células para hacer las copias de ese 21 00:02:47,469 --> 00:02:54,569 fragmento de ADN. Bueno, pues vamos a ver primero qué significa esto de ADN recombinante. 22 00:02:55,509 --> 00:03:01,810 Bueno, pues el ADN recombinante es la unión de dos fragmentos de ADN, pero que provienen 23 00:03:01,810 --> 00:03:09,030 de orígenes diferentes. Aquí en el dibujo lo tenéis, este sería el ADN de un fragmento 24 00:03:09,030 --> 00:03:15,229 de ADN de un organismo y este es otro fragmento de ADN. Pues lo que hacemos es unir estos 25 00:03:15,229 --> 00:03:21,270 Estos son los dos fragmentos de ADN y esta sería la técnica del ADN recombinante. 26 00:03:24,860 --> 00:03:32,060 Antes de empezar con la técnica, vamos a recordar también las células prokaryotas. 27 00:03:33,199 --> 00:03:41,819 Recordad que contienen un ADN bacteriano, un ADN cromosómico, 28 00:03:41,819 --> 00:03:57,039 pero aparte también estas células prokaryotas pueden tener un ADN de tipo circular y estos fragmentos de ADN se denominan plasmidos. 29 00:03:58,120 --> 00:04:07,080 Y estos plasmidos tienen la característica de que se replican independientemente del ADN cromosómico y además son muy fáciles de manipular. 30 00:04:07,080 --> 00:04:17,500 Entonces vamos a ver cómo se aplican estos plásmidos en esta técnica. 31 00:04:18,600 --> 00:04:25,490 Bueno, aquí os he puesto un poco en qué consiste esta tecnología. 32 00:04:25,990 --> 00:04:33,069 La tecnología del ADN recombinante nos permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas. 33 00:04:33,069 --> 00:04:48,170 Y además, este fragmento de ADN va a contener un gen, y este gen es un gen que se va a expresar, por ejemplo, en una proteína que nos interesa. 34 00:04:49,470 --> 00:04:54,529 Entonces, por ejemplo, nosotros queremos fabricar insulina en grandes cantidades. 35 00:04:54,529 --> 00:05:08,290 pues ¿qué hacemos? Cortamos el gen, un gen de un ADN, ese gen es el que luego se va a codificar en la proteína insulina, 36 00:05:09,670 --> 00:05:15,889 entonces ese gen que hemos cortado lo vamos a introducir en una bacteria y esa bacteria lo que vamos a hacer es, 37 00:05:15,889 --> 00:05:34,509 Al crecer, al multiplicarse, esa bacteria va a generar más fragmentos de ese ADN que a nosotros nos interesa, de ese gen que nos interesa y ese gen de ADN se va a codificar en la insulina. 38 00:05:34,509 --> 00:05:37,709 Entonces vamos a obtener grandes cantidades de insulina. 39 00:05:39,810 --> 00:05:45,089 Ahora os parecerá esto un poco complicado, pero vamos a ir viéndolo paso a paso. 40 00:05:46,569 --> 00:05:57,410 Bueno, tenemos varias etapas en esta técnica, las vamos a ver ahora un poco por encima y luego ya las explicamos individualmente. 41 00:05:58,370 --> 00:06:03,290 Por un lado tenemos el ADN con el fragmento que nosotros queremos copiar. 42 00:06:03,290 --> 00:06:17,290 Bueno, pues este fragmento de ADN lo vamos a cortar y lo vamos a unir a otro ADN y este ADN lo vamos a denominar vector de clonación. 43 00:06:19,269 --> 00:06:25,350 Vamos a unir esos dos ADN, lo que vamos a obtener es el ADN recombinante. 44 00:06:25,350 --> 00:06:41,129 Y ahora este ADN recombinante lo vamos a introducir en una bacteria. La bacteria se va a crecer, se va a multiplicar y vamos a obtener grandes cantidades de la proteína que nos interesa. 45 00:06:41,129 --> 00:06:48,850 que puede ser, por ejemplo, la hormona del crecimiento o, pues eso, lo que hemos dicho, la insulina. 46 00:06:50,410 --> 00:06:55,350 De esta parte ahora no os preocupéis porque luego lo vamos a explicar. 47 00:06:57,050 --> 00:07:02,129 Entonces, tenemos las etapas, aquí os las he explicado. 48 00:07:03,970 --> 00:07:07,889 Ahora las vamos a ver con más detalle. 49 00:07:07,889 --> 00:07:32,370 Vamos a empezar por la primera etapa, que sería reconocer la secuencia que a nosotros nos interesa cortar. ¿Y cómo vamos a cortar esa secuencia de interés? Pues con las enzimas de restricción, con las endonucleasas de restricción, que ya vimos en el tema anterior. 50 00:07:32,370 --> 00:07:40,449 En el punto 4.1 creo que es de este tema. 51 00:07:41,730 --> 00:07:46,410 Bien, pues entonces primero localizamos el gen que a nosotros nos interesa cortar. 52 00:07:46,990 --> 00:07:55,250 Porque este gen va a codificar a la característica que nosotros queremos que exprese el nuevo organismo. 53 00:07:55,250 --> 00:08:11,009 Entonces, por ejemplo, para producir hormonas de crecimiento buscamos una especie animal que posea ese gen y tenemos que identificar dónde se encuentra en su genoma. 54 00:08:14,240 --> 00:08:23,800 Ahora, este de aquí sería el fragmento de ADN que hemos cortado, que es el que nos interesa multiplicar. 55 00:08:23,800 --> 00:08:31,160 Y ahora vamos a cortar también el vector de clonación, que sería esto de aquí en amarillo. 56 00:08:32,840 --> 00:08:42,279 Y lo vamos a cortar con las mismas endonucleasas de restricción, para que luego se nos formen extremos cohesivos, que luego se puedan unir fácilmente. 57 00:08:42,279 --> 00:08:58,419 Si os acordáis, una endonucleasa de restricción que se utiliza mucho es la ECO-R1 y esta va a cortar, recordad que cortaba segmentos palindrómicos y fijaros, va a cortar la misma secuencia. 58 00:08:58,419 --> 00:09:14,399 Aquí tenemos guanina, adenina, adenina, timina, timina, guanina y la secuencia de la otra cadena, guanina, adenina, adenina, timina, timina, aquí no sé si es, creo que es citosina en vez de guanina, sí es citosina. 59 00:09:15,879 --> 00:09:27,340 Bien, pues entonces la eco R1 va a cortar y se van a formar extremos cohesivos y lo mismo va a cortar el fragmento de ADN que a nosotros nos interesa. 60 00:09:28,419 --> 00:09:45,659 Esto de aquí en amarillo sería lo que hemos denominado antes vector de clonación y esto aquí en azul es el ADN que a nosotros nos interesa, que luego este ADN es el que luego va a codificar a la proteína que a nosotros nos interesa. 61 00:09:45,659 --> 00:09:52,240 Bueno, ya tenemos los dos fragmentos de ADN cortados y ahora los tenemos que unir. 62 00:09:53,899 --> 00:10:00,879 Entonces, para unirlos se utiliza otra enzima que es la ADN ligasa. 63 00:10:01,679 --> 00:10:06,100 Esta ADN ligasa va a unir estos dos fragmentos de ADN. 64 00:10:06,779 --> 00:10:09,759 Así obtenemos el ADN recombinante. 65 00:10:10,700 --> 00:10:16,559 Recordad, ADN recombinante, combinación de dos ADN que provienen de organismos diferentes. 66 00:10:19,899 --> 00:10:23,759 Bueno, pues ahora vamos a ver un poco lo que son estos vectores de clonación. 67 00:10:23,759 --> 00:10:31,019 Antes de seguir en las siguientes etapas vamos a ver qué características tienen que tener estos vectores de clonación. 68 00:10:31,320 --> 00:10:33,720 Esto que hemos puesto aquí en amarillo. 69 00:10:33,720 --> 00:10:44,840 Bueno, pues el vector de clonación es una molécula que tiene que ser pequeña y que tiene que tener capacidad de autorreplicarse. 70 00:10:46,580 --> 00:10:54,179 Entonces, un vector de clonación muy utilizado son los plasmidos que hemos visto antes. 71 00:10:54,179 --> 00:11:09,059 Y así como son moléculas pequeñas, pues luego se pueden introducir fácilmente en la bacteria o en la célula, que vamos a llamar célula hospedadora, y que luego se van a replicar. 72 00:11:10,940 --> 00:11:22,179 Bueno, pues siguiendo con las características de estos vectores de clonación, tienen que poder replicarse independientemente. 73 00:11:22,179 --> 00:11:29,580 Evidentemente, replicarse junto con el ADN que transporten, o sea, junto con el ADN al que se hayan unido. 74 00:11:30,840 --> 00:11:39,980 El plasmido en amarillo con el ADN al que se han unido tienen que poder replicarse fácilmente dentro de la célula hospedadora. 75 00:11:41,440 --> 00:11:51,500 Otra característica que tienen que tener, tienen que tener sitios de corte para las enzimas de restricción y que estén presentes solamente una vez en el vector. 76 00:11:53,159 --> 00:12:04,240 Estos sitios de restricción tienen que ser iguales a los del ADN que queremos insertar para cortarlo con las mismas enzimas de restricción. 77 00:12:05,299 --> 00:12:15,240 Esto más o menos ya lo acabamos de ver. Vamos a cortar el vector de clonación y el ADN con la misma enzima de restricción. 78 00:12:15,240 --> 00:12:32,500 Por lo tanto, si el ADN lo cortamos con la enzima EcoR1, en el vector de clonación tenemos que tener también esta secuencia de bases nitrogenadas para poder cortarlo con esta misma enzima de restricción. 79 00:12:33,419 --> 00:12:44,379 Si lo cortamos con este ADN, que es el que nos interesa, con otra enzima de restricción, pues este vector de clonación tiene que tener esa secuencia. 80 00:12:49,029 --> 00:12:54,210 Entonces, por un lado, tienen que ver lo que hemos visto, tienen que poder replicarse. 81 00:12:54,789 --> 00:12:59,929 Aquí si os fijáis, esto sería un vector de clonación, en concreto es un plásmido. 82 00:13:00,830 --> 00:13:05,450 Pues entonces, aquí si os fijáis, pone origen de replicación. 83 00:13:05,450 --> 00:13:13,450 Bueno, pues aquí debe haber una secuencia del ADN que hace que se pueda replicar fácilmente este plásmido. 84 00:13:13,450 --> 00:13:40,710 Por otro lado, dice que tiene que tener sitios de corte para enzimas de restricción. Pues mirad, si os fijáis aquí, aquí tiene una secuencia con la que podemos cortar con la Eco R1. Aquí tiene otra secuencia con la que podemos cortar con esta otra enzima de restricción. Aquí otra secuencia y esta sería otra enzima de restricción con la que podemos cortar y esta sería otra. 85 00:13:40,710 --> 00:14:00,990 Pero lo importante, si cortamos el ADN que nos interesa con esta enzima, pues este vector de clonación tiene que tener también una secuencia, un sitio de corte con esta enzima. 86 00:14:00,990 --> 00:14:18,350 Bueno, aquí se ve un poquito mejor. Esto de aquí serían las enzimas de restricción, la BAMH1, SAL1, la PVU2. Estas serían las enzimas de restricción con las que se puede cortar este plasmido. 87 00:14:18,350 --> 00:14:34,629 Bueno, pues la siguiente característica que tiene que tener en este vector de clonación es que tiene que tener un marcador de selección. 88 00:14:35,429 --> 00:14:43,409 ¿Por qué es esto? Pues porque nosotros vamos a introducir este vector de clonación en las bacterias. 89 00:14:43,409 --> 00:14:55,409 Pero, ¿qué pasa? Que habrá bacterias en las que sí que se inserte este vector de clonación y otras en las que no se inserte este vector de clonación. 90 00:14:56,549 --> 00:15:03,429 Entonces, tenemos que distinguir entre las bacterias que tienen el vector de clonación y las que no tienen el vector de clonación. 91 00:15:06,269 --> 00:15:09,250 Entonces, deben tener algún marcador de selección. 92 00:15:09,250 --> 00:15:20,419 Por otro lado, se debe introducir de forma fácil en la célula anfitriona y el vector debe ser fácil de recuperar de la célula hospedadora. 93 00:15:22,620 --> 00:15:33,419 Esto que os decía antes de que tiene que tener algún marcador de selección, pues mirad, esto lo podemos ver aquí, en este plasmido de la coli. 94 00:15:33,419 --> 00:15:43,600 Por ejemplo, este plásmido tiene resistencia a la ampicilina y también tiene resistencia a la tetraciclina. 95 00:15:44,740 --> 00:15:54,419 Pues esto es lo que va a dar, con lo que podemos identificar si nuestra bacteria se ha modificado, 96 00:15:55,179 --> 00:16:00,840 o sea, si se ha introducido en la bacteria o en la célula hospedadora, si se ha introducido este plásmido. 97 00:16:00,840 --> 00:16:12,840 Luego vamos a ver cómo se comprueba esto, pero ahora recordad que este plásmido tiene resistencia a la ampicilina y resistencia a la tetraciclina. 98 00:16:15,179 --> 00:16:22,840 Entonces, como resumen, los vectores de clonación tienen que tener un origen de replicación para que se puedan replicar fácilmente, 99 00:16:22,840 --> 00:16:30,840 fácilmente, tienen que tener zonas de corte para que puedan cortarles las enzimas de restricción 100 00:16:30,840 --> 00:16:38,500 y estas zonas de estos sitios de corte tienen que ser iguales al corte que se haga en el 101 00:16:38,500 --> 00:16:44,860 ADN que a nosotros nos interesa, tienen que ser pequeños, o sea moléculas pequeñas 102 00:16:44,860 --> 00:16:51,440 y además tienen que tener algo con lo que se les pueda identificar. 103 00:16:53,620 --> 00:16:56,919 Y esta sería la resistencia a la ampicilina o a la tetraciclina. 104 00:16:57,500 --> 00:17:02,519 Esto luego lo vamos a ver con más detalle. 105 00:17:04,200 --> 00:17:09,559 Estos tipos de vectores de clonación, ¿cuáles pueden ser? 106 00:17:09,559 --> 00:17:27,940 Pueden ser plásmidos, que son los más utilizados, pero pueden ser también bacteriófagos. Un bacteriófago es un virus que infecta a una bacteria. Estos bacteriófagos también se pueden utilizar como vectores de clonación. 107 00:17:27,940 --> 00:17:43,940 Pueden ser cósmidos. Los cósmidos son híbridos entre un plásmido y un bacteriófago. Entonces, se pueden insertar fragmentos de ADN más largos, de 35 a 45 kilobases. 108 00:17:43,940 --> 00:17:46,059 kilobases. 109 00:17:46,059 --> 00:17:52,470 Aquí tenéis un ejemplo de cósmido y bacteriófago. 110 00:17:52,470 --> 00:17:56,750 Por otra parte pueden ser cromosomas bacterianos artificiales 111 00:17:56,750 --> 00:17:59,390 y se llaman BAC. 112 00:17:59,390 --> 00:18:04,210 Estos cromosomas son plásmidos que se diseñan en el laboratorio 113 00:18:04,210 --> 00:18:10,109 y nos van a servir para clonar fragmentos de ADN más largos 114 00:18:10,109 --> 00:18:14,789 y se introducen en las bacterias por electroporación. 115 00:18:14,789 --> 00:18:28,349 Estos vectores de clonación pueden ser también cromosomas artificiales de levadura, que son los YAC, o hay otro tipo de vectores de clonación que se llaman vectores lanzadera. 116 00:18:29,490 --> 00:18:43,069 Estos son plásmidos que tienen múltiples orígenes de replicación y otros elementos que hacen posible su uso en más de una especie. Se pueden introducir en una levadura o en una bacteria. 117 00:18:44,789 --> 00:19:00,069 Vale, pues entonces tipos de vectores de clonación serían plásmidos, bacteriófagos, cósmidos, los BAC, los JAK, cromosomas artificiales de levadura y vectores lanzadera. 118 00:19:00,690 --> 00:19:16,910 Vale, bueno, en los apuntes tenéis un ejercicio que esto lo vemos si queréis, mirad, hacedlo en casa y el próximo día lo corregimos en clase. 119 00:19:17,509 --> 00:19:28,869 Ya tenemos el vector de clonación unido al ADN de interés, que es el ADN recombinante. 120 00:19:29,950 --> 00:19:36,009 Ahora este ADN recombinante lo vamos a introducir en una célula hospedadora. 121 00:19:38,190 --> 00:19:39,710 Esta sería la etapa 3. 122 00:19:39,710 --> 00:19:59,230 El vector con el ADN lo introducimos en una célula que se llama células hospedadoras y esta célula hospedadora se va a replicar y entonces se van a producir copias de este ADN que nos interesa. 123 00:19:59,230 --> 00:20:11,950 Ahora, ¿cómo seleccionamos la célula hospedadora? ¿Qué células pueden actuar como células hospedadoras? 124 00:20:11,950 --> 00:20:24,230 Pues tienen que ser células que crezcan rápidamente, que crezcan en un medio de cultivo que sea económico, que no sea muy caro. 125 00:20:24,230 --> 00:20:39,089 Estas células no tienen que ser patógenas, que se puedan transformar fácilmente, o sea, que se les pueda introducir el vector de clonación fácilmente, y además tienen que ser estables en el cultivo. 126 00:20:43,460 --> 00:20:49,519 Bueno, pues vamos a ver qué tipos de células hospedadoras podemos tener. 127 00:20:49,519 --> 00:21:06,940 Bueno, pues estas células hospedadoras pueden ser células prokaryotas, que suelen ser las más utilizadas, porque se replican a muy alta velocidad, el mantenimiento de las colonias es bajo y además son fáciles de manipular. 128 00:21:06,940 --> 00:21:22,380 Esta sería la más utilizada, es la célula de E. coli, porque se conoce, es de fácil manejo, no es patógena y además crece rápidamente. 129 00:21:22,380 --> 00:21:28,779 También podemos tener como célula hospedadora una célula eucariota 130 00:21:28,779 --> 00:21:34,119 Podemos tener una levadura, que más se utiliza es la Saccharomyces cerevisae 131 00:21:34,119 --> 00:21:42,079 Porque también es muy conocida, es fácil de manejar, crece a gran velocidad y además no es patógena 132 00:21:42,079 --> 00:21:48,480 Y también podemos tener como células hospedadoras células de plantas o células de animales 133 00:21:48,480 --> 00:22:12,599 Entonces, lo más común es tener como vector de clonación un plásmido y como célula hospedadora una bacteria. Y cuando tenemos esto, se denomina transformación del ADN. 134 00:22:12,599 --> 00:22:22,119 A la transferencia de este vector de clonación en la bacteria se denomina transformación en este caso. 135 00:22:23,180 --> 00:22:53,220 ¿Cómo introducimos este plásmido en la bacteria, en la célula prokaryota? Hay varias formas. Puede ser por competencia natural, es decir, simplemente mezclamos la bacteria con este ADN recombinante y el ADN recombinante se introduce en la bacteria. 136 00:22:53,220 --> 00:23:12,140 Puede ser por competencia artificial, esto lo hacemos en el laboratorio y utilizamos, bueno, sería este proceso, sería mezclar la bacteria con una disolución de cloruro de calcio, 137 00:23:12,140 --> 00:23:23,279 introducir el plásmido y se pone en hielo y luego se le da un shock térmico, se calienta a 42 grados 138 00:23:23,279 --> 00:23:32,160 y con este método introduciríamos el ADN recombinante en la bacteria. 139 00:23:32,160 --> 00:23:59,940 Y luego hay otra técnica que es la electroporación, que simplemente es aplicando electricidad a la célula, pues creamos agujeros y se introduce el plasmido con el ADN, es decir, el ADN recombinante se introduce en la célula. 140 00:23:59,940 --> 00:24:05,680 podéis ver este vídeo para ver cómo es esta técnica 141 00:24:05,680 --> 00:24:15,789 entonces hemos dicho cuando es un plásmido que se introduce en una bacteria 142 00:24:15,789 --> 00:24:20,430 lo llamamos transformación 143 00:24:20,430 --> 00:24:27,210 y ahora si lo que tenemos es un bacteriófago, o sea un virus 144 00:24:27,210 --> 00:24:30,630 y la célula hospedadora es una bacteria 145 00:24:30,630 --> 00:24:34,630 pues a este proceso se le llama infección. 146 00:24:41,259 --> 00:24:53,759 Bien, pues la siguiente etapa, nosotros ya hemos introducido el ADN recombinante en la célula, en la célula hospedadora 147 00:24:53,759 --> 00:25:09,819 Y ahora tenemos que saber en qué células se ha introducido este vector de clonación, perdón, este ADN recombinante. 148 00:25:11,759 --> 00:25:20,039 Entonces, podemos tener células en las que no tengamos el ADN recombinante. 149 00:25:20,039 --> 00:25:36,319 Este es el ADN de la bacteria, pero aquí no tenemos ADN recombinante. Esto por un lado, tenemos que distinguir las células que no tienen el ADN recombinante de las que sí que tienen. Esta sí que tiene, esta también y esta también. 150 00:25:36,319 --> 00:25:50,819 Entonces, identificar las células que han adquirido el plasmido. Cuando hablo aquí de plasmido, significa también el plasmido junto con el ADN de interés. 151 00:25:50,819 --> 00:25:59,960 Ahora, de las que sí que tienen el plásmido, tenemos que saber cuáles tienen el ADN de interés. 152 00:26:00,579 --> 00:26:11,799 Estas, si os fijáis, tienen aquí una parte en rojo. Este sería el vector de clonación o el plásmido con el ADN que se ha insertado. 153 00:26:11,799 --> 00:26:19,980 Este también tendría el vector de clonación, el plásmido, con el ADN en rojo. 154 00:26:20,259 --> 00:26:22,880 Esta también lo tiene, pero sin embargo esta no. 155 00:26:23,079 --> 00:26:28,799 Esta sí que se ha introducido el plásmido, pero este plásmido no tiene el ADN. 156 00:26:30,599 --> 00:26:35,019 El ADN de interés es todo azul, es solamente el plásmido. 157 00:26:35,119 --> 00:26:38,579 Aquí no se ha unido el plásmido con el ADN que nos interesa. 158 00:26:38,579 --> 00:26:47,400 Entonces, lo que os digo, tenemos que hacer dos análisis. 159 00:26:48,660 --> 00:27:00,579 Aquí tenemos el vector con el inserto, se introduce en la célula, pero fijaros, aquí esta sí que tiene el vector con el inserto, 160 00:27:00,579 --> 00:27:04,579 sin embargo, aquí no, esta célula no se ha transformado. 161 00:27:04,579 --> 00:27:14,559 Entonces tenemos que distinguir primero estas dos. Esta sí que tiene el plásmido, en cambio esta célula aquí no hay plásmido. 162 00:27:16,259 --> 00:27:30,720 Y por otra parte tenemos que distinguir si nuestras células tienen solamente el plásmido o tienen el vector, el ADN recombinante, o sea el plásmido con el ADN de interés. 163 00:27:30,720 --> 00:27:42,769 Bien, pues ¿cómo hacemos esta distinción? Primero vamos a identificar las células que sí que tienen el plasmido. 164 00:27:43,309 --> 00:28:01,609 Pues si os acordáis, antes hemos hablado de que estos plasmidos tienen que tener un sistema de selección y hemos hablado de que este plasmido, por ejemplo, tiene un gen que le da resistencia a la ampicilina. 165 00:28:01,609 --> 00:28:10,690 que es un antibiótico y también tiene otro gen, o sea, otra secuencia de ADN que le da resistencia a la tetraciclina. 166 00:28:11,869 --> 00:28:19,369 Bueno, pues entonces vamos a poner estas células en ampicilina o en tetraciclina. 167 00:28:20,549 --> 00:28:29,069 Pues solamente las células que contengan este plásmido, que tiene resistencia a la ampicilina, 168 00:28:29,069 --> 00:28:39,309 solamente estas células van a crecer. En cambio aquí estas células que no tienen el plasmido, o sea, no resisten a la ampicilina, no van a crecer. 169 00:28:40,410 --> 00:28:52,950 Lo mismo va a ocurrir si nosotros ponemos estas células en tetraciclina, pues las que contengan este plasmido sí que van a crecer porque tienen resistencia a la tetraciclina 170 00:28:52,950 --> 00:29:01,490 y en cambio las que no tienen el plasmido no van a crecer porque no tienen el plasmido con resistencia a la tetraciclina. 171 00:29:03,230 --> 00:29:08,450 Por lo tanto vamos a poder distinguir las células que contienen el plasmido. 172 00:29:09,210 --> 00:29:20,390 Ahora, una vez que hemos distinguido estas células que contienen el plasmido, tenemos que distinguir si estas células tienen el ADN recombinante. 173 00:29:20,390 --> 00:29:27,670 Ese sería el ADN del vector de clonación más el ADN que nosotros queremos, que nos interesa. 174 00:29:30,309 --> 00:29:41,009 ¿Cómo hacemos esto? Hay varias formas, pero una de las formas es que el plásmido contiene una secuencia 175 00:29:41,009 --> 00:29:54,750 Y esta secuencia de ADN codifica a una proteína que produce colonias de color azul. 176 00:29:55,950 --> 00:30:04,730 Esta secuencia de aquí de ADN codifica a una proteína que produce colonias de color azul. 177 00:30:04,730 --> 00:30:16,589 Pues ¿qué hacemos? Insertamos el ADN de interés, el ADN que nosotros queremos copiar, lo insertamos en esta secuencia. 178 00:30:17,589 --> 00:30:26,130 O sea que rompemos este gen. Si rompemos este gen ya las proteínas ya no se van a producir colonias de color azul. 179 00:30:26,130 --> 00:30:36,210 porque ya no se va a codificar en esa proteína. Por lo tanto, se nos producirán colonias de color blanco. 180 00:30:36,529 --> 00:30:41,829 Pues estas colonias de color blanco son las que tienen el ADN recombinante. 181 00:30:41,829 --> 00:31:02,779 Un ejemplo de aplicación del ADN recombinante sería en el caso de que para producir maíz que resista el ataque de insectos. 182 00:31:02,779 --> 00:31:12,700 Por una parte tenemos el organismo dador que es la bacteria del suelo que es esta, Bacillus zurigensis, la BT. 183 00:31:13,779 --> 00:31:21,900 De estas se extraen genes que van a sintetizar proteínas que tienen carácter insecticida 184 00:31:21,900 --> 00:31:28,960 y estos genes se introducen en la planta de maíz. 185 00:31:33,089 --> 00:31:40,750 Cuando lo que estamos modificando son plantas o células animales, 186 00:31:40,750 --> 00:31:59,009 O sea, cuando la célula hospedadora es eucariota se denomina transfección. Y podemos modificar lo que os decía, plantas o células de animales o podemos modificar levaduras y hongos. 187 00:31:59,009 --> 00:32:25,539 Esto se modifica con acetato de litio por congelación, por biolística o por electroporación. Electroporación acordaros que era darle un choque eléctrico y se crean poros en las células y por ahí se introduce el ADN recombinante. 188 00:32:25,539 --> 00:32:42,960 Y ahora por biolística o biovalística, vale, pues esto os lo enseño el próximo día, lo de la biolística. 189 00:32:42,960 --> 00:33:11,240 Y ahora como aplicaciones, pues se pueden obtener proteínas recombinantes, podemos obtener vacunas recombinantes, enzimas recombinantes, plantas transgénicas, que sería por el método que os he explicado del maíz, o otra aplicación sería como para terapia génica.