1
00:00:00,000 --> 00:00:06,379
Bien, vamos a comenzar la segunda parte del tema de clonación molecular.

2
00:00:07,040 --> 00:00:09,700
Esta parte es muy importante y es un pelín compleja.

3
00:00:10,419 --> 00:00:13,740
Vamos a ver las fases del proceso de clonación, ¿de acuerdo?

4
00:00:14,000 --> 00:00:20,359
Os recuerdo que el objetivo fundamental es que queremos introducir un gen en un vector,

5
00:00:20,359 --> 00:00:28,580
en este caso está representado un plásmido, para poder amplificarlo en vivo en células bien prokaryotas o bien eucariotas.

6
00:00:28,580 --> 00:00:33,760
Las fases del proceso de forma genérica son tres.

7
00:00:34,160 --> 00:00:38,000
La primera de ellas es la creación de los vectores recombinantes.

8
00:00:38,600 --> 00:00:43,520
Con todo lo que ya hemos estudiado en los apartados anteriores, sabemos que, por un lado,

9
00:00:43,520 --> 00:00:52,020
hemos de preparar nuestro fragmento, el inserto que queremos clonar, digiriéndolo con enzimas de restricción,

10
00:00:52,120 --> 00:00:56,640
con endonucleasas de restricción, pero al mismo tiempo también hemos de preparar el vector.

11
00:00:56,880 --> 00:00:58,520
En este caso está representado un plásmido.

12
00:00:58,579 --> 00:01:02,879
Y lo deberemos digerir, lo digo ya por primera vez y lo volveré a repetir después,

13
00:01:03,100 --> 00:01:08,579
con el mismo o los mismos enzimas de restricción con los que hemos digerido el inserto.

14
00:01:10,700 --> 00:01:17,480
Después, una vez ya los tenemos preparados, haremos una incubación juntos en un tubo con la ligasa,

15
00:01:17,719 --> 00:01:19,879
para que se produzcan los vectores recombinantes.

16
00:01:20,420 --> 00:01:26,280
Como vais viendo, y ya comentamos en clase y en los apartados anteriores,

17
00:01:26,280 --> 00:01:28,280
vamos a obtener tanto vectores...

18
00:01:28,579 --> 00:01:31,359
Vectores recombinantes, que nos gustaría que todos fueran así,

19
00:01:31,620 --> 00:01:35,700
vectores recombinantes con nuestro fragmento de interés, con el inserto,

20
00:01:35,959 --> 00:01:39,459
pero también habrá un porcentaje, seguramente menor,

21
00:01:39,819 --> 00:01:42,640
pero hay un cierto porcentaje de vectores vacíos.

22
00:01:43,400 --> 00:01:45,359
Sencillamente han recircularizado.

23
00:01:46,420 --> 00:01:46,739
¿De acuerdo?

24
00:01:47,480 --> 00:01:50,280
Una vez ya tenemos nuestro vector recombinante,

25
00:01:51,620 --> 00:01:55,799
que, insisto, tendremos una mezcla de vectores recombinantes y vectores vacíos,

26
00:01:55,799 --> 00:01:58,299
los vamos a introducir en las...

27
00:01:58,299 --> 00:02:02,519
En las células hospedadoras, en la fase 2 del proceso.

28
00:02:03,200 --> 00:02:10,099
En este caso, como estamos en el ejemplo con plásmidos, estos son bacterias, células prokaryotas.

29
00:02:10,800 --> 00:02:13,579
Algunos plasmidos también se pueden introducir en células eukaryotas,

30
00:02:13,680 --> 00:02:18,340
pero en el caso del esquema que tenéis en el libro, son bacterias.

31
00:02:19,259 --> 00:02:25,319
Ya os introduzco que esta fase nos va a producir tres tipos de células.

32
00:02:25,579 --> 00:02:28,280
Como veis, he modificado un poquito el esquema,

33
00:02:28,300 --> 00:02:31,920
respecto al del libro, para representar estos tres tipos de células.

34
00:02:32,160 --> 00:02:35,880
Las primeras, células que no han introducido ningún vector.

35
00:02:36,080 --> 00:02:38,280
Se han quedado tal cual estaban al principio.

36
00:02:38,960 --> 00:02:43,640
Por tanto, son células no transformadas, no transfectadas.

37
00:02:44,500 --> 00:02:48,260
Y después de las células que sí que han introducido el vector,

38
00:02:48,860 --> 00:02:51,740
y que sí que lo han adquirido, tenemos dos tipos.

39
00:02:52,320 --> 00:02:56,300
Las células que han introducido el vector vacío, y por tanto no son células recombinantes,

40
00:02:56,300 --> 00:02:57,160
y las células que han introducido el vector vacío, y por tanto no son células recombinantes,

41
00:02:57,159 --> 00:03:00,659
y las células que han incorporado el vector recombinante,

42
00:03:00,740 --> 00:03:05,139
y por tanto son las que nos interesan de verdad.

43
00:03:05,460 --> 00:03:11,419
Estas de aquí, estos dos tipos de células, de alguna manera tenemos que quitarnos las de en medio.

44
00:03:12,240 --> 00:03:16,560
Eso lo vamos a realizar en la fase 3, que es la fase de selección e identificación.

45
00:03:16,879 --> 00:03:20,340
En esta fase veremos cuatro estrategias que se utilizan.

46
00:03:20,579 --> 00:03:24,099
Algunas son un poquito, digamos, clásicas y están en desuso,

47
00:03:24,099 --> 00:03:27,099
y se han ido sustituyendo.

48
00:03:27,159 --> 00:03:33,159
Y se han ido sustituyendo por otras más efectivas, que son más fáciles de realizar en el laboratorio.

49
00:03:33,159 --> 00:03:35,159
Las veremos.

50
00:03:35,159 --> 00:03:37,159
¿Cuál es el objetivo?

51
00:03:37,159 --> 00:03:39,159
De todos estos tipos de células, de estos tres tipos de células,

52
00:03:39,159 --> 00:03:43,159
tengo que seleccionar e identificar estas,

53
00:03:43,159 --> 00:03:45,159
para poder eliminar estas de aquí,

54
00:03:45,159 --> 00:03:51,159
y quedarme solamente con las células transformadas con vector recombinante.

55
00:03:51,159 --> 00:03:55,159
A partir, una vez ya las he seleccionado y las he identificado,

56
00:03:55,159 --> 00:03:57,159
ya las puedo expandir.

57
00:03:57,159 --> 00:03:59,159
¿De acuerdo?

58
00:03:59,159 --> 00:04:05,159
Esto representa una placa de agar con colonias de cultivo de bacterias en medio sólido.

59
00:04:07,159 --> 00:04:09,159
Bien, vamos a ver la primera fase.

60
00:04:09,159 --> 00:04:13,159
La primera fase, ya hemos dicho que es la creación de un vector recombinante.

61
00:04:13,159 --> 00:04:16,159
Para ello, hay tres subfases.

62
00:04:16,159 --> 00:04:21,159
La primera subfase es la preparación del DNA, del inserto que vamos a clonar.

63
00:04:21,159 --> 00:04:27,159
Y para ello, ya hemos dicho antes que vamos a digerir con endonucleasas de restricción.

64
00:04:27,160 --> 00:04:34,160
Os recuerdo, y tiro para atrás, que este inserto lo podemos obtener de dos maneras.

65
00:04:34,160 --> 00:04:37,160
O directamente de un DNA genómico,

66
00:04:37,160 --> 00:04:42,160
que yo voy a cortar con enzimas de restricción y luego purifico el inserto.

67
00:04:42,160 --> 00:04:47,160
Es decir, este inserto lo he sacado directamente del DNA genómico.

68
00:04:47,160 --> 00:04:52,160
O, actualmente se utiliza muchísimo esta segunda técnica,

69
00:04:52,160 --> 00:04:55,160
que es diseñar unos primers y amplificar por PCR.

70
00:04:55,160 --> 00:05:02,160
De tal manera que yo el DNA genómico lo voy a utilizar solamente como DNA molde.

71
00:05:02,160 --> 00:05:04,160
No lo voy a digerir.

72
00:05:04,160 --> 00:05:09,160
Voy a obtener el amplicón, el amplicón de mi gen de interés, del inserto.

73
00:05:09,160 --> 00:05:14,160
Entonces, después, lo voy a digerir con enzimas de restricción.

74
00:05:14,160 --> 00:05:16,160
¿De acuerdo?

75
00:05:16,160 --> 00:05:18,160
Por tanto, son estas dos estrategias.

76
00:05:18,160 --> 00:05:24,160
O cojo el DNA genómico, lo digiero y obtengo entonces un montón de fragmentos

77
00:05:24,160 --> 00:05:26,160
digeridos.

78
00:05:26,160 --> 00:05:30,160
Y todos esos fragmentos los voy a clonar en vectores.

79
00:05:30,160 --> 00:05:36,160
Este método, esta estrategia la utilizamos cuando queremos crear bibliotecas de DNA.

80
00:05:36,160 --> 00:05:39,160
Lo veremos en apartados posteriores.

81
00:05:39,160 --> 00:05:44,160
Pero la que más se utiliza actualmente es a partir de un amplicón.

82
00:05:44,160 --> 00:05:45,160
¿De acuerdo?

83
00:05:45,160 --> 00:05:48,160
Cogemos nuestro DNA genómico como DNA molde,

84
00:05:48,160 --> 00:05:53,160
hacemos una PCR con primers específicos, amplificamos un gen, el inserto,

85
00:05:53,160 --> 00:05:56,160
y por tanto vamos a clonar un solo fragmento.

86
00:05:56,160 --> 00:06:01,160
Esta, digamos que es una estrategia más, entre comillas, quirúrgica.

87
00:06:01,160 --> 00:06:02,160
¿Sí?

88
00:06:02,160 --> 00:06:05,160
Vamos a mucho más dirigida, un solo fragmento.

89
00:06:05,160 --> 00:06:08,160
Y es la que más se utiliza, sobre todo en investigación.

90
00:06:13,160 --> 00:06:17,160
Por tanto, una vez yo ya tengo el inserto, o bien por la primera estrategia,

91
00:06:17,160 --> 00:06:21,160
o bien por la segunda estrategia, ahora lo tengo que digerir.

92
00:06:21,160 --> 00:06:25,160
Y lo tengo que digerir con endonucleasas de restricción.

93
00:06:25,160 --> 00:06:32,160
Os he puesto aquí, bueno, unas diapositivas, ya lo vimos en el tema 2,

94
00:06:32,160 --> 00:06:35,160
pero a modo de recordatorio sobre los enzimas de restricción,

95
00:06:35,160 --> 00:06:37,160
las endonucleasas de restricción.

96
00:06:37,160 --> 00:06:44,160
Ya hemos dicho, estos enzimas, como ya sabemos, reconocen una secuencia específica, concreta.

97
00:06:44,160 --> 00:06:47,160
Es lo que llamamos la diana de restricción.

98
00:06:47,160 --> 00:06:50,160
Por tanto, en nuestro inserto, en nuestro DNA,

99
00:06:50,160 --> 00:06:56,160
irán chequeando todo el DNA y cuando encuentren su diana de restricción, cortarán.

100
00:06:56,160 --> 00:07:01,160
Mientras que respetan toda el resto de secuencia, a derecha e izquierda,

101
00:07:01,160 --> 00:07:04,160
porque no hay diana de restricción.

102
00:07:04,160 --> 00:07:10,160
Para la mayoría de enzimas, esta diana de restricción es un fragmento muy chiquitín,

103
00:07:10,160 --> 00:07:14,160
una secuencia de 4 a 8 nucleótidos.

104
00:07:14,160 --> 00:07:18,160
Lo normal es que sean unos 5 o 6 nucleótidos, por tanto es una secuencia muy pequeña,

105
00:07:18,160 --> 00:07:20,160
primera característica.

106
00:07:20,160 --> 00:07:22,160
Y segunda característica.

107
00:07:22,160 --> 00:07:27,160
Estas dianas de restricción son secuencias que tienen simetría palindrómica,

108
00:07:27,160 --> 00:07:29,160
son secuencias palindrómicas.

109
00:07:29,160 --> 00:07:31,160
¿Eso qué significa?

110
00:07:31,160 --> 00:07:33,160
Aquí tenemos un ejemplo.

111
00:07:33,160 --> 00:07:38,160
Un palíndromo, o una secuencia palindrómica,

112
00:07:38,160 --> 00:07:45,160
es aquella que se lee igual de izquierdas a derechas que de derechas a izquierdas.

113
00:07:45,160 --> 00:07:49,160
Como la secuencia de DNA son bicatenarias, de doble cadena,

114
00:07:49,160 --> 00:07:56,160
si leemos la secuencia siempre en dirección 5'-3', por supuesto,

115
00:07:56,160 --> 00:08:02,160
aquí tenemos un ejemplo, esta secuencia de izquierda a derecha es GGGCCC.

116
00:08:02,160 --> 00:08:09,160
Leída de derecha a izquierda, como tengo que leer la 5'-3', es la misma secuencia, GGGCCC.

117
00:08:09,160 --> 00:08:16,160
Esta es una secuencia palindrómica, de tal manera que el enzima reconoce esta secuencia específica

118
00:08:16,160 --> 00:08:18,160
porque además es palindrómica.

119
00:08:18,160 --> 00:08:26,160
En el ejemplo del esquema que tenemos aquí, esta secuencia también es palindrómica, GATTCC.

120
00:08:26,160 --> 00:08:33,160
Leída de izquierda a derecha, leída de derecha a izquierda, lo mismo, GATTCC.

121
00:08:33,160 --> 00:08:38,160
Siempre leída, repito, de 5'-3'.

122
00:08:38,160 --> 00:08:44,160
Tercera característica de estos enzimas de restricción y sus dianas de restricción,

123
00:08:44,160 --> 00:08:46,160
dentro de la secuencia,

124
00:08:46,159 --> 00:08:51,159
no cortan al azar, sino que cortan siempre en un punto específico.

125
00:08:51,159 --> 00:08:54,159
En concreto, este enzima que nos representan,

126
00:08:54,159 --> 00:08:59,159
cortaría detrás de la guanina y la adenina, en una cadena,

127
00:08:59,159 --> 00:09:04,159
y detrás de la guanina y la adenina, entre la guanina y la adenina, en la otra cadena también.

128
00:09:04,159 --> 00:09:08,159
Por tanto, dentro de la secuencia de la diana de restricción,

129
00:09:08,159 --> 00:09:12,159
no cortan al azar, sino que cortan en un punto específico.

130
00:09:12,159 --> 00:09:14,159
Esa es la tercera característica

131
00:09:14,159 --> 00:09:19,159
de las dianas de restricción y sus endonucleasas.

132
00:09:19,159 --> 00:09:22,159
Aquí os pongo una tabla con algunos ejemplos.

133
00:09:22,159 --> 00:09:27,159
Por ejemplo, todas estas enzimas de restricción se utilizan muchísimo en el laboratorio.

134
00:09:27,159 --> 00:09:31,159
ALU-1, VAMACHE-1, ECORRE-1, ECORRE-5, GINDE-3,

135
00:09:31,159 --> 00:09:34,159
también se utiliza mucho, PISTEL-1...

136
00:09:34,159 --> 00:09:36,159
Ya veis, cada una tiene su secuencia.

137
00:09:36,159 --> 00:09:39,159
Aquí han representado solo la secuencia de una de las cadenas,

138
00:09:39,159 --> 00:09:42,159
en dirección 5'-3'.

139
00:09:42,159 --> 00:09:44,159
Si os dais cuenta, y os dais cuenta,

140
00:09:44,159 --> 00:09:48,159
si hacéis la complementaria, os saldrá la secuencia palindrómica.

141
00:09:48,159 --> 00:09:50,159
Y dentro de esta secuencia,

142
00:09:50,159 --> 00:09:53,159
de cada una de estas secuencias de restricción,

143
00:09:53,159 --> 00:09:57,159
el enzima en concreto corta en un punto específico.

144
00:09:57,159 --> 00:10:02,159
Esta, pues justo en medio, está entre las dos guaninas.

145
00:10:02,159 --> 00:10:04,159
Está entre la guanina y la adenina,

146
00:10:04,159 --> 00:10:06,159
como hemos visto en el ejemplo de antes.

147
00:10:06,159 --> 00:10:11,159
Y así, etc., etc., cada una de las endonucleasas de restricción.

148
00:10:14,159 --> 00:10:20,159
Cuarta característica de las endonucleasas de restricción.

149
00:10:20,159 --> 00:10:23,159
Cuando cortan, como ya hemos visto,

150
00:10:23,159 --> 00:10:24,159
vuelvo para atrás,

151
00:10:24,159 --> 00:10:27,159
hay algunas enzimas que cortan justo en medio

152
00:10:27,159 --> 00:10:31,159
de la secuencia de la diana de restricción.

153
00:10:31,159 --> 00:10:33,159
Y otras, más hacia el extremo.

154
00:10:33,159 --> 00:10:38,159
Por ejemplo, JAE-3 y ALU-1 cortan justo en medio.

155
00:10:38,159 --> 00:10:42,159
Mientras que BAMACHE-1, ECORRE-1 y GINDE-3

156
00:10:42,159 --> 00:10:46,159
cortan al principio de la secuencia.

157
00:10:46,159 --> 00:10:48,159
¿Esto qué implicación tiene?

158
00:10:48,159 --> 00:10:52,159
Pues que pueden generar dos tipos de extremos después de cortar.

159
00:10:52,159 --> 00:10:55,159
Los tenemos aquí representados.

160
00:10:55,159 --> 00:10:57,159
Pueden generar extremo romo,

161
00:10:57,159 --> 00:11:01,159
cuando el enzima de restricción corta justo en medio de la secuencia

162
00:11:01,159 --> 00:11:04,159
de la diana de restricción, genera extremo romo.

163
00:11:04,159 --> 00:11:05,159
¿Qué es un extremo romo?

164
00:11:05,159 --> 00:11:10,159
Un extremo justo que parece como un tabique.

165
00:11:10,159 --> 00:11:11,159
Dos muros.

166
00:11:11,159 --> 00:11:13,159
No tiene nada, ninguna secuencia colgando.

167
00:11:13,159 --> 00:11:18,159
Mientras que ECORRE-1, por ejemplo, corta dejando extremos cohesivos.

168
00:11:18,159 --> 00:11:21,159
Como corta al principio de la secuencia de restricción

169
00:11:21,159 --> 00:11:25,159
en cada una de las dos hebras, entre guanina y adenina,

170
00:11:25,159 --> 00:11:32,159
cuando corta aquí, corta aquí y se rompen todos los puentes de hidrógeno,

171
00:11:32,159 --> 00:11:35,159
los extremos que deja son cohesivos.

172
00:11:35,159 --> 00:11:39,159
Eso significa que queda una cola en una de las cadenas,

173
00:11:39,159 --> 00:11:40,159
una cola colgando.

174
00:11:40,159 --> 00:11:41,159
¿De acuerdo?

175
00:11:41,159 --> 00:11:43,159
Esto es muy importante.

176
00:11:43,159 --> 00:11:45,159
¿Por qué?

177
00:11:45,159 --> 00:11:48,159
Porque si después la liga se tiene que actuar,

178
00:11:48,159 --> 00:11:53,159
estos dos extremos solamente se pueden ligar nuevamente

179
00:11:53,159 --> 00:11:57,159
de la misma manera en la que estaban ligados.

180
00:11:57,159 --> 00:12:01,159
Mientras que este, si yo corto y dejo un extremo romo,

181
00:12:01,159 --> 00:12:04,159
lo veremos en algún ejemplo,

182
00:12:04,159 --> 00:12:08,159
puede ligar así o podría ligar al revés.

183
00:12:08,159 --> 00:12:10,159
Entonces el inserto puede entrar,

184
00:12:10,159 --> 00:12:13,159
de derecha a izquierda o de izquierda a derecha.

185
00:12:13,159 --> 00:12:16,159
Esto lo veremos un poquito mejor más adelante.

186
00:12:18,159 --> 00:12:19,159
¿De acuerdo?

187
00:12:19,159 --> 00:12:20,159
Muy bien.

188
00:12:20,159 --> 00:12:24,159
Hemos cortado el DNA, el inserto que queremos clonar.

189
00:12:24,159 --> 00:12:28,159
Y lo normal es cortar con dos enzimas de restricción,

190
00:12:28,159 --> 00:12:30,159
es decir, y tiro para atrás.

191
00:12:32,159 --> 00:12:34,159
Aquí lo tenemos, el inserto.

192
00:12:34,159 --> 00:12:37,159
Lo normal es cortar con dos enzimas de restricción,

193
00:12:37,159 --> 00:12:39,159
una encima al principio y otra encima al final.

194
00:12:40,159 --> 00:12:42,159
¿Para qué?

195
00:12:42,159 --> 00:12:46,159
Para que este fragmento entre sí o sí en esa dirección,

196
00:12:46,159 --> 00:12:48,159
en el plásmido.

197
00:12:48,159 --> 00:12:50,159
Si no, se podría...

198
00:12:50,159 --> 00:12:53,159
Imaginaos que este es el principio y este es el final, ¿sí?

199
00:12:53,159 --> 00:12:56,159
Si yo corto aquí con ecoR1, ecoR1,

200
00:12:56,159 --> 00:12:58,159
este fragmento puede entrar así,

201
00:12:58,159 --> 00:13:01,159
aquí principio y final,

202
00:13:01,159 --> 00:13:03,159
o podría entrar final-principio.

203
00:13:03,159 --> 00:13:05,159
Se puede dar la vuelta.

204
00:13:05,159 --> 00:13:08,159
Entonces, claro, cambio la pauta de lectura.

205
00:13:08,159 --> 00:13:11,159
Si yo corto con una encima de restricción,

206
00:13:11,159 --> 00:13:14,159
este fragmento puede entrar principio-final

207
00:13:14,159 --> 00:13:17,159
o puede entrar al revés, final-principio.

208
00:13:17,159 --> 00:13:19,159
Pero si yo corto con dos enzimas de restricción,

209
00:13:19,159 --> 00:13:22,159
ecoR1, bamH1,

210
00:13:22,159 --> 00:13:25,159
y aquí igual, ecoR1, bamH1,

211
00:13:25,159 --> 00:13:29,159
este fragmento sólo puede entrar en dirección eco-bam.

212
00:13:29,159 --> 00:13:32,159
Nunca podrá entrar bam-eco.

213
00:13:32,159 --> 00:13:33,159
¿De acuerdo?

214
00:13:33,159 --> 00:13:35,159
Bueno, espero que se entiende.

215
00:13:35,159 --> 00:13:37,159
Si no, en clase lo... lo... lo...

216
00:13:38,159 --> 00:13:39,159
lo vemos.

217
00:13:39,159 --> 00:13:40,159
¿De acuerdo?

218
00:13:40,159 --> 00:13:41,159
Muy bien.

219
00:13:41,159 --> 00:13:42,159
He preparado mi DNA,

220
00:13:42,159 --> 00:13:44,159
lo he cortado con enzimas de restricción

221
00:13:44,159 --> 00:13:47,159
y tengo que hacer lo mismo con el vector de clonación.

222
00:13:47,159 --> 00:13:50,159
Y debo digerirlo con el mismo enzima,

223
00:13:50,159 --> 00:13:53,159
con las mismas enzimas endonucleases de restricción.

224
00:13:53,159 --> 00:13:56,159
Las mismas, porque si no, es imposible que entre el inserto.

225
00:13:56,159 --> 00:13:59,159
Y el libro nos pone que hay varios casos.

226
00:13:59,159 --> 00:14:02,159
Dependiendo de cómo es el vector,

227
00:14:02,159 --> 00:14:04,159
si corto con una enzima de restricción,

228
00:14:04,159 --> 00:14:06,159
obtengo un fragmento,

229
00:14:06,159 --> 00:14:09,159
es decir, lo linearizo el plásmido.

230
00:14:09,159 --> 00:14:12,159
Si corto con dos, linearizo el plásmido,

231
00:14:12,159 --> 00:14:14,159
pero obtengo también un pequeño fragmento.

232
00:14:14,159 --> 00:14:16,159
Pero si es lineal,

233
00:14:16,159 --> 00:14:20,159
pues cortando con... con una enzima de restricción,

234
00:14:20,159 --> 00:14:21,159
obtengo dos fragmentos,

235
00:14:21,159 --> 00:14:23,159
cortando con dos enzimas de restricción,

236
00:14:23,159 --> 00:14:24,159
obtengo tres fragmentos.

237
00:14:24,159 --> 00:14:26,159
Esto es muy sencillo.

238
00:14:26,159 --> 00:14:29,159
¿De acuerdo?

239
00:14:29,159 --> 00:14:34,159
Por tanto, ya he digerido con enzimas de restricción el inserto,

240
00:14:34,159 --> 00:14:35,159
he digerido el vector,

241
00:14:35,159 --> 00:14:38,159
y ahora los voy a incubar con la ligasa.

242
00:14:38,159 --> 00:14:41,159
¿De acuerdo?

243
00:14:41,159 --> 00:14:43,159
Yo tenía mi inserto,

244
00:14:43,159 --> 00:14:48,159
imaginaos que este inserto viene de un producto de PCR,

245
00:14:48,159 --> 00:14:53,159
he amplificado el gen de la insulina por PCR,

246
00:14:53,159 --> 00:14:56,159
lo he digerido con enzimas de restricción,

247
00:14:56,159 --> 00:14:59,159
ECOBAM, por ejemplo,

248
00:14:59,159 --> 00:15:01,159
he cogido mi plásmido,

249
00:15:01,159 --> 00:15:03,159
lo he digerido con los mismos enzimas de restricción,

250
00:15:03,159 --> 00:15:07,159
por tanto, aquí tenemos un extremo ECO y un extremo BAM,

251
00:15:07,159 --> 00:15:09,159
y ahora lo que hago es,

252
00:15:09,159 --> 00:15:11,159
los voy a incubar con la ligasa.

253
00:15:11,159 --> 00:15:14,159
Y pueden ocurrir dos cosas.

254
00:15:14,159 --> 00:15:17,159
Si yo he cortado con una enzima de restricción,

255
00:15:17,159 --> 00:15:20,159
este plásmido puede recircularizar.

256
00:15:20,159 --> 00:15:23,159
Si yo he cortado con dos enzimas de restricción,

257
00:15:23,159 --> 00:15:25,159
y esto es muy importante,

258
00:15:25,159 --> 00:15:27,159
este inserto, consigo dos cosas.

259
00:15:27,159 --> 00:15:32,159
Una, este inserto solo puede entrar ECO, ECO, BAM, BAM.

260
00:15:33,159 --> 00:15:36,159
Nunca puede entrar este extremo BAM con el de ECO.

261
00:15:36,159 --> 00:15:38,159
Imposible, ¿de acuerdo?

262
00:15:38,159 --> 00:15:40,159
No se puede dar la vuelta.

263
00:15:40,159 --> 00:15:43,159
Y segundo, que consigo, es que

264
00:15:43,159 --> 00:15:46,159
solamente después de la ligación voy a obtener

265
00:15:46,159 --> 00:15:48,159
vectores recombinantes.

266
00:15:48,159 --> 00:15:50,159
Y muy pocos van a recircularizar.

267
00:15:50,159 --> 00:15:51,159
¿Por qué?

268
00:15:51,159 --> 00:15:54,159
Porque este extremo es ECO y este extremo es BAM.

269
00:15:54,159 --> 00:15:57,159
Dejan extremos cohesivos diferentes,

270
00:15:57,159 --> 00:15:59,159
es decir, tiro para atrás.

271
00:15:59,159 --> 00:16:02,159
Acordaos, estos extremos cohesivos son diferentes,

272
00:16:02,159 --> 00:16:04,159
no son complementarios,

273
00:16:04,159 --> 00:16:07,159
y por tanto el plásmido no puede recircularizar.

274
00:16:07,159 --> 00:16:09,159
¿De acuerdo?

275
00:16:14,159 --> 00:16:17,159
Bien, una vez acaba la fase 1,

276
00:16:17,159 --> 00:16:21,159
y yo ya tengo, he acabado la fase de ligación,

277
00:16:21,159 --> 00:16:24,159
ya he hecho el tratamiento con la ligasa,

278
00:16:24,159 --> 00:16:30,159
la segunda fase es, voy a introducir el vector recombinante

279
00:16:30,159 --> 00:16:32,159
en células hospedadoras.

280
00:16:32,159 --> 00:16:36,159
Y aquí tenemos varios casos.

281
00:16:36,159 --> 00:16:39,159
Podemos introducirlo en células prokaryotas

282
00:16:39,159 --> 00:16:41,159
o en células eukaryotas.

283
00:16:41,159 --> 00:16:43,159
Si lo introducimos en células bacterianas,

284
00:16:43,159 --> 00:16:45,159
en células prokaryotas,

285
00:16:45,159 --> 00:16:48,159
hemos de utilizar como vector siempre plásmidos.

286
00:16:48,159 --> 00:16:51,159
Primero, y eso es muy importante.

287
00:16:51,159 --> 00:16:55,159
Segundo, la introducción de un vector en bacterias

288
00:16:55,159 --> 00:16:58,159
se denomina transformación.

289
00:16:58,159 --> 00:17:00,159
Por tanto, cuando hablamos de transformación,

290
00:17:00,159 --> 00:17:02,159
es transformación bacteriana.

291
00:17:02,159 --> 00:17:05,159
La introducción de un vector en otra,

292
00:17:05,159 --> 00:17:08,159
en células eukaryotas, recibe otro nombre.

293
00:17:08,159 --> 00:17:09,159
¿De acuerdo?

294
00:17:09,159 --> 00:17:11,159
Importante, para poder transformar,

295
00:17:11,159 --> 00:17:14,159
tercera idea fundamental de células prokaryotas,

296
00:17:14,159 --> 00:17:17,159
para poder transformar bacterias,

297
00:17:17,159 --> 00:17:20,159
debo realizarlo en bacterias competentes.

298
00:17:20,159 --> 00:17:22,159
¿Esto qué significa?

299
00:17:22,159 --> 00:17:25,159
Son bacterias que están preparadas

300
00:17:25,159 --> 00:17:28,159
para poder admitir el plásmido.

301
00:17:28,159 --> 00:17:30,159
Y van a estar preparadas

302
00:17:30,160 --> 00:17:33,160
siguiendo un tratamiento específico

303
00:17:33,160 --> 00:17:35,160
que va a abrir pequeños poros

304
00:17:35,160 --> 00:17:37,160
en su pared y membrana.

305
00:17:37,160 --> 00:17:39,160
De tal manera que va a ser mucho más fácil

306
00:17:39,160 --> 00:17:41,160
que admitan el vector recombinante,

307
00:17:41,160 --> 00:17:43,160
el plásmido recombinante.

308
00:17:43,160 --> 00:17:46,160
Ya vimos dos cepas que se utilizan mucho

309
00:17:46,160 --> 00:17:48,160
de bacterias competentes.

310
00:17:48,160 --> 00:17:52,160
Las DH5-alfa y las CK14, creo.

311
00:17:52,160 --> 00:17:54,160
Me parece las K14.

312
00:17:57,160 --> 00:18:00,160
Bueno, las tenéis en las diapositivas anteriores.

313
00:18:00,160 --> 00:18:01,160
¿De acuerdo?

314
00:18:01,160 --> 00:18:03,160
Este proceso de competencia

315
00:18:03,160 --> 00:18:05,160
lo tenemos que realizar en nuestras bacterias.

316
00:18:05,160 --> 00:18:09,160
Se suele utilizar muchísimo Escherichia coli.

317
00:18:09,160 --> 00:18:12,160
Y el proceso de transformación

318
00:18:12,160 --> 00:18:14,160
debe estar precedido siempre

319
00:18:14,160 --> 00:18:18,160
de un proceso de competencia.

320
00:18:18,160 --> 00:18:20,160
Hemos de hacer nuestras bacterias competentes.

321
00:18:20,160 --> 00:18:23,160
Y este proceso lo podemos hacer de dos maneras.

322
00:18:23,160 --> 00:18:28,160
Uno, utilizando un tratamiento físico,

323
00:18:28,160 --> 00:18:29,160
es decir, un choque térmico,

324
00:18:29,160 --> 00:18:31,160
un choque térmico.

325
00:18:31,160 --> 00:18:33,160
¿Cómo lo realizamos?

326
00:18:33,160 --> 00:18:35,160
Ponemos nuestras bacterias

327
00:18:35,160 --> 00:18:37,160
a cuatro grados,

328
00:18:37,160 --> 00:18:39,160
en hielo, a cuatro grados.

329
00:18:39,160 --> 00:18:43,160
Por tanto, ocurre lo mismo

330
00:18:43,160 --> 00:18:46,160
que cuando hace hielo por la mañana.

331
00:18:46,160 --> 00:18:50,160
Su pared, digamos que se retrae,

332
00:18:50,160 --> 00:18:52,160
el péptido glicano de su pared se retrae

333
00:18:52,160 --> 00:18:56,160
y rápidamente lo pongo a 42 grados.

334
00:18:56,160 --> 00:18:58,160
Eso es lo que hace, es que se dilate

335
00:18:58,160 --> 00:19:00,160
el péptido glicano de forma muy brusca

336
00:19:00,160 --> 00:19:03,160
y que la pared bacteriana se resquebraje

337
00:19:03,160 --> 00:19:07,160
y aparezcan pequeñas fisuras, pequeños poros.

338
00:19:07,160 --> 00:19:09,160
Tratamiento físico.

339
00:19:09,160 --> 00:19:11,160
Puedo hacerlo también con un tratamiento químico.

340
00:19:11,160 --> 00:19:13,160
El tratamiento químico clásico

341
00:19:13,160 --> 00:19:16,160
que se utiliza muchísimo es el cloruro cálcico.

342
00:19:16,160 --> 00:19:19,160
Un tratamiento con cloruro cálcico muy concentrado

343
00:19:19,160 --> 00:19:22,160
que produce lo mismo que el tratamiento físico.

344
00:19:22,160 --> 00:19:26,160
Es decir, produce fisuras en la pared de la bacteria.

345
00:19:26,160 --> 00:19:28,160
Son pequeñas fisuras, es decir,

346
00:19:28,160 --> 00:19:30,160
si fueran muy grandes la bacteria lixaría

347
00:19:30,160 --> 00:19:32,160
y eso no nos interesa.

348
00:19:32,160 --> 00:19:34,160
Muy bien.

349
00:19:34,160 --> 00:19:36,160
Por tanto, con mis bacterias ya competentes

350
00:19:36,160 --> 00:19:39,160
o bien por un método físico o por un método químico

351
00:19:39,160 --> 00:19:41,160
la voy a transformar.

352
00:19:41,160 --> 00:19:43,160
¿De acuerdo?

353
00:19:51,160 --> 00:19:53,160
Si en lugar de células prokaryotas

354
00:19:53,160 --> 00:19:56,160
yo quiero introducir el vector en células eukaryotas

355
00:19:56,160 --> 00:19:58,160
tenemos dos tipos.

356
00:19:58,160 --> 00:20:00,160
Si utilizamos virus,

357
00:20:00,160 --> 00:20:04,160
es decir, voy a meter mi inserto dentro de un virus

358
00:20:04,160 --> 00:20:07,160
y el virus va a infectar las células eukaryotas.

359
00:20:07,160 --> 00:20:11,160
Esto a veces se utiliza mucho sobre todo si son células en cultivo

360
00:20:11,160 --> 00:20:14,160
porque los virus tienen una tasa de infección,

361
00:20:14,160 --> 00:20:16,160
infectividad muy elevada

362
00:20:16,160 --> 00:20:19,160
y en un periodo corto de tiempo

363
00:20:19,160 --> 00:20:22,160
puedo tener muchas células en cultivo infectadas

364
00:20:22,160 --> 00:20:24,160
y con mi inserto.

365
00:20:24,160 --> 00:20:26,160
Este proceso lo llamamos transducción.

366
00:20:26,160 --> 00:20:30,160
O puedo utilizar células eukaryotas

367
00:20:30,160 --> 00:20:32,160
pero que no están mediadas por virus.

368
00:20:32,160 --> 00:20:35,160
Por ejemplo, puedo introducir plásmidos o cósmidos.

369
00:20:35,160 --> 00:20:37,160
Y hablamos entonces de transfección.

370
00:20:37,160 --> 00:20:40,160
Podemos transfectar de dos maneras diferentes.

371
00:20:40,160 --> 00:20:42,160
Bien.

372
00:20:42,160 --> 00:20:46,160
Utilizando un tratamiento químico con fosfato cálcico

373
00:20:46,160 --> 00:20:50,160
el fosfato cálcico va a obligar a las células

374
00:20:50,160 --> 00:20:54,160
a introducir los plásmidos por un proceso de endocitosis

375
00:20:54,160 --> 00:20:55,160
los que...

376
00:20:55,160 --> 00:20:59,160
Esto os debe sonar de la biología celular

377
00:20:59,160 --> 00:21:01,160
que visteis en segundo de bachillerato

378
00:21:01,160 --> 00:21:02,160
por endocitosis.

379
00:21:02,160 --> 00:21:05,160
Los que no lo podéis buscar en Youtube

380
00:21:05,160 --> 00:21:07,160
pero es un proceso por el cual las células

381
00:21:07,160 --> 00:21:10,160
internalizan componentes de gran tamaño

382
00:21:10,160 --> 00:21:12,160
al interior de la célula.

383
00:21:12,160 --> 00:21:14,160
O podemos utilizar liposomas.

384
00:21:14,160 --> 00:21:19,160
Entonces, los liposomas son vesículas lipídicas

385
00:21:19,160 --> 00:21:23,160
en las que dentro van a incluir nuestro vector

386
00:21:23,160 --> 00:21:27,160
y van a introducirlo dentro de la célula eucariota

387
00:21:27,160 --> 00:21:29,160
por fusión con la membrana.

388
00:21:29,160 --> 00:21:31,160
Son dos procesos diferentes.

389
00:21:31,160 --> 00:21:32,160
¿De acuerdo?

390
00:21:32,160 --> 00:21:34,160
Podemos transformar las bacterias

391
00:21:34,160 --> 00:21:37,160
por un método físico o por un método químico.

392
00:21:37,160 --> 00:21:38,160
Ya hemos visto.

393
00:21:38,160 --> 00:21:40,160
Y la transfección también la llevamos a cabo

394
00:21:40,160 --> 00:21:42,160
normalmente por métodos químicos

395
00:21:42,160 --> 00:21:45,160
utilizando liposomas o con fosfato cálcico

396
00:21:45,160 --> 00:21:49,160
que es muy barato y funciona muy bien.

397
00:21:51,160 --> 00:21:52,160
Por tanto, transformación.

398
00:21:52,160 --> 00:21:54,160
Células prokaryotas.

399
00:21:54,160 --> 00:21:59,160
Transfección y transducción en células eucariotas.

400
00:21:59,160 --> 00:22:01,160
Pero hay un cuarto método

401
00:22:01,160 --> 00:22:03,160
que es la electroporación.

402
00:22:03,160 --> 00:22:05,160
¿A qué os suena esto de electroporación?

403
00:22:05,160 --> 00:22:08,160
Pues sí, vamos a someter las células

404
00:22:08,160 --> 00:22:10,160
a un choque eléctrico.

405
00:22:10,160 --> 00:22:11,160
¿De acuerdo?

406
00:22:11,160 --> 00:22:14,160
Las vamos a electroporar, electrocutar entre comillas.

407
00:22:14,160 --> 00:22:15,160
¿De acuerdo?

408
00:22:15,160 --> 00:22:19,160
Con una corriente eléctrica de bajo voltaje

409
00:22:19,160 --> 00:22:22,160
de tal manera que esta electroporación

410
00:22:22,160 --> 00:22:24,160
va a hacer que vibren las membranas,

411
00:22:24,160 --> 00:22:26,160
las paredes bacterianas

412
00:22:26,160 --> 00:22:28,160
y también va a producir fisuras.

413
00:22:28,160 --> 00:22:29,160
¿De acuerdo?

414
00:22:29,160 --> 00:22:31,160
¿Cuál es la gran ventaja de la electroporación?

415
00:22:31,160 --> 00:22:33,160
Bueno, porque lo podemos utilizar

416
00:22:33,160 --> 00:22:34,160
en cualquier tipo de célula,

417
00:22:34,160 --> 00:22:36,160
tanto prokaryotas como eucariotas.

418
00:22:36,160 --> 00:22:37,160
La electroporación.

419
00:22:37,160 --> 00:22:38,160
¿De acuerdo?

420
00:22:38,160 --> 00:22:40,160
Y la segunda característica

421
00:22:40,160 --> 00:22:43,160
es que es un método de gran eficiencia.

422
00:22:43,160 --> 00:22:45,160
Por tanto, por electroporación

423
00:22:45,160 --> 00:22:47,160
se va a introducir muchísima mayor cantidad

424
00:22:47,160 --> 00:22:49,160
de vector en la célula.

425
00:22:49,160 --> 00:22:51,160
El inconveniente que tiene la electroporación

426
00:22:51,160 --> 00:22:53,160
es que tengo que controlar muy bien

427
00:22:53,160 --> 00:22:55,160
el tiempo de electroporación,

428
00:22:55,160 --> 00:22:58,160
la intensidad de la corriente

429
00:22:58,160 --> 00:22:59,160
y el voltaje.

430
00:22:59,160 --> 00:23:00,160
Porque si no,

431
00:23:00,160 --> 00:23:04,160
bueno, puedo romper las células y les salvas.

432
00:23:04,160 --> 00:23:07,160
¿De acuerdo?

433
00:23:07,160 --> 00:23:09,160
Muy bien.

434
00:23:09,160 --> 00:23:11,160
Una vez ya hemos introducido,

435
00:23:11,160 --> 00:23:13,160
os recuerdo,

436
00:23:13,160 --> 00:23:17,160
una vez ya obtuvimos los clones recombinantes

437
00:23:17,160 --> 00:23:20,160
y ahora hemos introducido en células hospedadoras,

438
00:23:20,160 --> 00:23:22,160
tenemos tres casos.

439
00:23:22,160 --> 00:23:24,160
De todas esas células,

440
00:23:24,160 --> 00:23:27,160
unas no habrán incorporado nada

441
00:23:27,160 --> 00:23:30,160
y serán células que están tal cual

442
00:23:30,160 --> 00:23:32,160
como antes, como al principio.

443
00:23:32,160 --> 00:23:34,160
Células que han incorporado el vector,

444
00:23:34,160 --> 00:23:36,160
pero el vector vacío

445
00:23:36,160 --> 00:23:38,160
y células que han incorporado

446
00:23:38,160 --> 00:23:40,160
el vector recombinante.

447
00:23:40,160 --> 00:23:43,160
De tal manera que ahora en la tercera fase,

448
00:23:43,160 --> 00:23:45,160
que es quizá un poquito conceptualmente

449
00:23:45,160 --> 00:23:47,160
la más compleja,

450
00:23:47,160 --> 00:23:49,160
vamos a llevar a cabo el proceso

451
00:23:49,160 --> 00:23:51,160
de selección y el proceso

452
00:23:51,160 --> 00:23:54,160
de identificación de todos estos clones

453
00:23:54,160 --> 00:23:56,160
para poder quedarnos solamente

454
00:23:56,160 --> 00:23:58,160
con los clones recombinantes

455
00:23:58,160 --> 00:24:00,160
y estos expandirlos in vitro.

456
00:24:03,160 --> 00:24:05,160
Hemos dicho, podemos obtener células

457
00:24:05,160 --> 00:24:07,160
no transformadas,

458
00:24:07,160 --> 00:24:09,160
tal y como está aquí en el ejemplo,

459
00:24:09,160 --> 00:24:11,160
como estamos utilizando plásmidos

460
00:24:11,160 --> 00:24:12,160
en el ejemplo y bacterias,

461
00:24:12,160 --> 00:24:14,160
vamos a hablar de transformación

462
00:24:14,160 --> 00:24:15,160
como si fueran bacterias.

463
00:24:15,160 --> 00:24:16,160
¿De acuerdo?

464
00:24:16,160 --> 00:24:17,160
Células no transformadas

465
00:24:17,160 --> 00:24:19,160
y luego células transformadas.

466
00:24:19,160 --> 00:24:20,160
O con vector recombinante

467
00:24:20,160 --> 00:24:21,160
o con vector vacío,

468
00:24:21,160 --> 00:24:23,160
no recombinante.

469
00:24:23,160 --> 00:24:25,160
La selección, ya decíamos,

470
00:24:25,160 --> 00:24:26,160
el proceso de selección

471
00:24:26,160 --> 00:24:27,160
me va a permitir eliminar

472
00:24:27,160 --> 00:24:29,160
las células no transformadas

473
00:24:29,160 --> 00:24:32,160
y quedarme sólo con las transformadas.

474
00:24:32,160 --> 00:24:33,160
Importante.

475
00:24:33,160 --> 00:24:36,160
Y el proceso de identificación

476
00:24:36,160 --> 00:24:38,160
me va a permitir quedarme

477
00:24:38,160 --> 00:24:41,160
con las células transformadas recombinantes

478
00:24:41,160 --> 00:24:43,160
y eliminar las transformadas

479
00:24:43,160 --> 00:24:45,160
no recombinantes.

480
00:24:45,160 --> 00:24:46,160
¿De acuerdo?

481
00:24:46,160 --> 00:24:48,160
Para ello vamos a utilizar,

482
00:24:48,160 --> 00:24:50,160
si recordáis,

483
00:24:50,160 --> 00:24:51,160
dos elementos que tienen

484
00:24:51,160 --> 00:24:53,160
los vectores de clonación.

485
00:24:53,160 --> 00:24:55,160
El marcador de selección

486
00:24:55,160 --> 00:24:58,160
y el marcador de identificación.

487
00:24:58,160 --> 00:25:02,160
Hay cuatro estrategias fundamentales

488
00:25:02,160 --> 00:25:04,160
para poder llevar a cabo

489
00:25:04,160 --> 00:25:06,160
la selección e identificación.

490
00:25:06,160 --> 00:25:08,160
Vamos a empezar por la técnica más clásica

491
00:25:08,160 --> 00:25:10,160
y prácticamente está en desuso.

492
00:25:10,160 --> 00:25:11,160
¿De acuerdo?

493
00:25:11,160 --> 00:25:12,160
Y pasaremos después

494
00:25:12,160 --> 00:25:13,160
a la segunda y la tercera

495
00:25:13,160 --> 00:25:14,160
para la última,

496
00:25:14,160 --> 00:25:16,160
que es la más novedosa

497
00:25:16,160 --> 00:25:17,160
y más rápida.

498
00:25:18,160 --> 00:25:20,160
La primera estrategia

499
00:25:20,160 --> 00:25:21,160
vamos a utilizar

500
00:25:21,160 --> 00:25:23,160
genes de resistencia antibióticos.

501
00:25:23,160 --> 00:25:24,160
Es decir,

502
00:25:24,160 --> 00:25:26,160
el gen de selección

503
00:25:26,160 --> 00:25:29,160
y el gen de...

504
00:25:29,160 --> 00:25:31,160
tanto el gen de selección

505
00:25:31,160 --> 00:25:33,160
como el gen de identificación

506
00:25:33,160 --> 00:25:36,160
son genes de resistencia antibióticos.

507
00:25:36,160 --> 00:25:37,160
¿Vale?

508
00:25:37,160 --> 00:25:39,160
Aquí nos han representado,

509
00:25:39,160 --> 00:25:41,160
este es el esquema del vector,

510
00:25:41,160 --> 00:25:43,160
para que lo podamos entender mejor,

511
00:25:43,160 --> 00:25:46,160
del vector que vamos a utilizar

512
00:25:46,160 --> 00:25:47,160
en nuestra clonación,

513
00:25:47,160 --> 00:25:49,160
el que pone en el libro.

514
00:25:49,160 --> 00:25:51,160
Tenemos un gen de resistencia ampicilina,

515
00:25:51,160 --> 00:25:52,160
que es un antibiótico,

516
00:25:52,160 --> 00:25:54,160
y un gen, aquí morado,

517
00:25:54,160 --> 00:25:56,160
de resistencia tetraciclina.

518
00:25:56,160 --> 00:25:57,160
¿De acuerdo?

519
00:25:57,160 --> 00:25:58,160
La ampicilina y la tetraciclina

520
00:25:58,160 --> 00:25:59,160
son dos antibióticos,

521
00:25:59,160 --> 00:26:00,160
de tal manera que,

522
00:26:00,160 --> 00:26:02,160
si yo en el medio de cultivo

523
00:26:02,160 --> 00:26:05,160
de mis bacterias pongo ampicilina,

524
00:26:05,160 --> 00:26:07,160
o tienen este gen

525
00:26:07,160 --> 00:26:09,160
que hace que la bacteria resista la ampicilina,

526
00:26:09,160 --> 00:26:13,160
o la bacteria se muere.

527
00:26:13,160 --> 00:26:14,160
De la misma manera,

528
00:26:14,160 --> 00:26:16,160
si yo en el medio de cultivo pongo tetraciclina,

529
00:26:16,160 --> 00:26:19,160
o mis bacterias tienen este gen,

530
00:26:19,160 --> 00:26:21,160
o las bacterias se mueren.

531
00:26:21,160 --> 00:26:22,160
¿De acuerdo?

532
00:26:22,160 --> 00:26:23,160
Como estáis viendo,

533
00:26:23,160 --> 00:26:25,160
igual que en todos los vectores,

534
00:26:25,160 --> 00:26:28,160
además del gen de selección

535
00:26:28,160 --> 00:26:30,160
y el marcador de identificación,

536
00:26:30,160 --> 00:26:32,160
tenemos un origen de replicación,

537
00:26:32,160 --> 00:26:33,160
pero ahora,

538
00:26:33,160 --> 00:26:35,160
en esta estrategia,

539
00:26:35,160 --> 00:26:37,160
vamos a utilizar un vector

540
00:26:37,160 --> 00:26:39,160
en el que el polilínquer,

541
00:26:39,160 --> 00:26:40,160
y esto es muy importante,

542
00:26:40,160 --> 00:26:41,160
el polilínquer,

543
00:26:41,160 --> 00:26:42,160
el multiclone inside,

544
00:26:42,160 --> 00:26:44,160
no está fuera.

545
00:26:44,160 --> 00:26:45,160
En cualquier caso,

546
00:26:45,160 --> 00:26:47,160
en cualquier sitio del plásmido,

547
00:26:47,160 --> 00:26:49,160
sino que lo tenemos dentro,

548
00:26:49,160 --> 00:26:52,160
dentro del gen de identificación.

549
00:26:52,160 --> 00:26:53,160
Y esto es muy importante.

550
00:26:53,160 --> 00:26:54,160
¿Por qué?

551
00:26:54,160 --> 00:26:56,160
Fijaos,

552
00:26:56,160 --> 00:26:58,160
una bacteria que haya introducido

553
00:26:58,160 --> 00:26:59,160
el vector vacío,

554
00:26:59,160 --> 00:27:00,160
bueno,

555
00:27:00,160 --> 00:27:02,160
lo primero que tenemos que tener claro es que,

556
00:27:02,160 --> 00:27:04,160
cuando nosotros,

557
00:27:04,160 --> 00:27:05,160
en la primera fase,

558
00:27:05,160 --> 00:27:08,160
hemos introducido el inserto

559
00:27:08,160 --> 00:27:10,160
dentro del vector,

560
00:27:10,160 --> 00:27:11,160
ese inserto,

561
00:27:11,160 --> 00:27:14,160
en este vector en concreto,

562
00:27:14,160 --> 00:27:15,160
se va a insertar aquí,

563
00:27:15,160 --> 00:27:16,160
block,

564
00:27:16,160 --> 00:27:17,160
¿sí?

565
00:27:17,160 --> 00:27:18,160
Por ejemplo,

566
00:27:18,160 --> 00:27:22,160
hemos cortado HINT-ECO-R1,

567
00:27:22,160 --> 00:27:23,160
cortará aquí,

568
00:27:23,160 --> 00:27:26,160
y el inserto entrará aquí dentro.

569
00:27:26,160 --> 00:27:27,160
¿Qué es lo que ocurre

570
00:27:27,160 --> 00:27:31,160
si el vector no es recombinante

571
00:27:31,160 --> 00:27:32,160
y está vacío?

572
00:27:32,160 --> 00:27:34,160
La bacteria que lo introduzca

573
00:27:34,160 --> 00:27:37,160
podrá expresar el gen de ampicilina,

574
00:27:37,160 --> 00:27:39,160
y será resistente a ampicilina,

575
00:27:39,160 --> 00:27:42,160
y expresará el gen de tetraciclina,

576
00:27:42,160 --> 00:27:44,160
de resistencia tetraciclina,

577
00:27:44,160 --> 00:27:46,160
porque lo tiene completo.

578
00:27:46,160 --> 00:27:48,160
Pero si os dais cuenta,

579
00:27:48,160 --> 00:27:51,160
si la bacteria ha introducido

580
00:27:51,160 --> 00:27:53,160
el vector recombinante,

581
00:27:53,160 --> 00:27:57,160
este gen de tetraciclina está roto.

582
00:27:57,160 --> 00:27:58,160
En una primera parte,

583
00:27:58,160 --> 00:28:01,160
tendremos una primera parte

584
00:28:01,160 --> 00:28:02,160
del gen de tetraciclina,

585
00:28:02,160 --> 00:28:04,160
tendremos nuestro inserto,

586
00:28:04,160 --> 00:28:07,160
y a continuación la segunda parte

587
00:28:07,160 --> 00:28:09,160
del gen de resistencia tetraciclina.

588
00:28:09,160 --> 00:28:10,160
Por tanto,

589
00:28:10,160 --> 00:28:13,160
cuando esta bacteria quiera,

590
00:28:13,160 --> 00:28:17,160
expresar el gen de la tetraciclina,

591
00:28:17,160 --> 00:28:18,160
empezará a expresar

592
00:28:18,160 --> 00:28:20,160
la proteína de resistencia tetraciclina,

593
00:28:20,160 --> 00:28:22,160
pero llega un momento que se para,

594
00:28:22,160 --> 00:28:23,160
y se corta.

595
00:28:23,160 --> 00:28:24,160
¿Por qué?

596
00:28:24,160 --> 00:28:25,160
Porque tenemos el inserto,

597
00:28:25,160 --> 00:28:26,160
que es gigante.

598
00:28:26,160 --> 00:28:27,160
Y por tanto,

599
00:28:27,160 --> 00:28:29,160
la bacteria que tiene

600
00:28:29,160 --> 00:28:31,160
el vector recombinante,

601
00:28:31,160 --> 00:28:33,160
será resistente a ampicilina,

602
00:28:33,160 --> 00:28:36,160
pero no será resistente a tetraciclina.

603
00:28:36,160 --> 00:28:39,160
No sé si me explico.

604
00:28:39,160 --> 00:28:40,160
¿De acuerdo?

605
00:28:40,160 --> 00:28:42,160
Espero que se entienda bien.

606
00:28:44,160 --> 00:28:45,160
Ya hemos dicho,

607
00:28:45,160 --> 00:28:46,160
vamos a utilizar vectores

608
00:28:46,160 --> 00:28:48,160
que tienen dos genes de resistencia.

609
00:28:48,160 --> 00:28:49,160
En este caso,

610
00:28:49,160 --> 00:28:50,160
os he puesto como ejemplo

611
00:28:50,160 --> 00:28:51,160
a ampicilina y tetraciclina,

612
00:28:51,160 --> 00:28:53,160
pero podría ser también la canamicina,

613
00:28:53,160 --> 00:28:54,160
la neomicina...

614
00:28:54,160 --> 00:28:57,160
Hay muchos genes de resistencia a antibióticos

615
00:28:57,160 --> 00:28:59,160
que se utilizan en investigación.

616
00:29:01,160 --> 00:29:02,160
De tal manera que,

617
00:29:02,160 --> 00:29:05,160
cuando introducimos el vector en las bacterias,

618
00:29:05,160 --> 00:29:08,160
tenemos que utilizar bacterias competentes

619
00:29:08,160 --> 00:29:10,160
y sensibles tanto a ampicilina

620
00:29:10,160 --> 00:29:12,160
como a tetraciclina.

621
00:29:12,160 --> 00:29:13,160
Es decir,

622
00:29:13,160 --> 00:29:15,160
estas bacterias por sí mismas

623
00:29:15,160 --> 00:29:17,160
no resisten a los antibióticos.

624
00:29:17,160 --> 00:29:19,160
Pongo ampicilina y pongo tetraciclina

625
00:29:19,160 --> 00:29:20,160
y se mueren.

626
00:29:20,160 --> 00:29:22,160
Son sensibles.

627
00:29:22,160 --> 00:29:23,160
¿De acuerdo?

628
00:29:23,160 --> 00:29:26,160
Ya hemos dicho que vamos a obtener células no transformadas.

629
00:29:26,160 --> 00:29:29,160
Si las células no son transformadas,

630
00:29:29,160 --> 00:29:32,160
en el medio de cultivo yo voy a poner ampicilina

631
00:29:32,160 --> 00:29:34,160
y voy a poner tetraciclina,

632
00:29:34,160 --> 00:29:36,160
junto con todos los nutrientes.

633
00:29:36,160 --> 00:29:37,160
Por tanto,

634
00:29:37,160 --> 00:29:39,160
las células no transformadas se mueren,

635
00:29:39,160 --> 00:29:41,160
porque van a ser sensibles a ampicilina

636
00:29:41,160 --> 00:29:43,160
y a tetraciclina.

637
00:29:43,160 --> 00:29:45,160
Las células transformadas

638
00:29:45,160 --> 00:29:49,160
con el vector no recombinante

639
00:29:49,160 --> 00:29:51,160
serán resistentes

640
00:29:51,160 --> 00:29:53,160
tanto a ampicilina como a tetraciclina,

641
00:29:53,160 --> 00:29:54,160
porque,

642
00:29:54,160 --> 00:29:55,160
vuelvo para atrás,

643
00:29:58,160 --> 00:30:00,160
han incorporado este vector

644
00:30:00,160 --> 00:30:02,160
tal cual lo tenemos aquí dibujado

645
00:30:02,160 --> 00:30:04,160
y tienen el gen de resistencia a ampicilina

646
00:30:04,160 --> 00:30:06,160
y el gen de tetraciclina

647
00:30:06,160 --> 00:30:07,160
lo tienen completo,

648
00:30:07,160 --> 00:30:08,160
no está roto.

649
00:30:08,160 --> 00:30:09,160
Sin embargo,

650
00:30:09,160 --> 00:30:10,160
las células,

651
00:30:10,160 --> 00:30:13,160
las células transformadas con el vector recombinante

652
00:30:13,160 --> 00:30:15,160
serán resistentes a ampicilina

653
00:30:15,160 --> 00:30:17,160
pero serán sensibles a tetraciclina

654
00:30:17,160 --> 00:30:18,160
y esto es muy importante,

655
00:30:18,160 --> 00:30:20,160
que lo tengamos claro.

656
00:30:20,160 --> 00:30:22,160
Sabiendo esto,

657
00:30:22,160 --> 00:30:24,160
nosotros ponemos,

658
00:30:24,160 --> 00:30:26,160
vamos a llevar a cabo una estrategia

659
00:30:26,160 --> 00:30:28,160
en dos pasos.

660
00:30:28,160 --> 00:30:32,160
Cogemos nuestras bacterias,

661
00:30:32,160 --> 00:30:34,160
hemos hecho la transformación

662
00:30:34,160 --> 00:30:36,160
y las vamos a poner en una plaquita con agar,

663
00:30:36,160 --> 00:30:38,160
esto lo haréis el año que viene en microbiología,

664
00:30:38,160 --> 00:30:39,160
y,

665
00:30:39,160 --> 00:30:41,160
en medio de cultivo con ampicilina,

666
00:30:41,160 --> 00:30:42,160
sólo ampicilina,

667
00:30:42,160 --> 00:30:44,160
de tal manera que

668
00:30:44,160 --> 00:30:47,160
van a producirse colonias de bacterias,

669
00:30:47,160 --> 00:30:48,160
estas de aquí,

670
00:30:48,160 --> 00:30:50,160
al cabo de 24 horas de incubación,

671
00:30:50,160 --> 00:30:52,160
las células que crezcan

672
00:30:52,160 --> 00:30:54,160
son células transformadas.

673
00:30:54,160 --> 00:30:55,160
Tiro para atrás.

674
00:30:55,160 --> 00:30:57,160
Hemos dicho que las no transformadas

675
00:30:57,160 --> 00:30:59,160
son sensibles a ampicilina,

676
00:30:59,160 --> 00:31:01,160
por tanto estas se mueren,

677
00:31:01,160 --> 00:31:03,160
directamente no crecen,

678
00:31:03,160 --> 00:31:04,160
pero las transformadas,

679
00:31:04,160 --> 00:31:05,160
tanto estas como estas,

680
00:31:05,160 --> 00:31:07,160
son resistentes a ampicilina.

681
00:31:07,160 --> 00:31:08,160
¿Por qué?

682
00:31:08,160 --> 00:31:10,160
Porque tienen el vector.

683
00:31:10,160 --> 00:31:11,160
Muy bien.

684
00:31:11,160 --> 00:31:13,160
¿Qué es lo que hago ahora?

685
00:31:13,160 --> 00:31:18,160
Cojo un fragmento de terciopelo estéril,

686
00:31:18,160 --> 00:31:21,160
y lo que hago es una imprimación.

687
00:31:21,160 --> 00:31:23,160
Imprimo,

688
00:31:23,160 --> 00:31:26,160
lo dejo caer sobre la plaquita,

689
00:31:26,160 --> 00:31:28,160
de tal manera que en el terciopelo

690
00:31:28,160 --> 00:31:30,160
me voy a llevar unas cuantas bacterias

691
00:31:30,160 --> 00:31:32,160
pegadas en la misma posición

692
00:31:32,160 --> 00:31:34,160
en la que estaban en la placa,

693
00:31:34,160 --> 00:31:37,160
me las voy a llevar pegadas en el terciopelo,

694
00:31:38,160 --> 00:31:41,160
unas cuantas bacterias de cada una de las colonias.

695
00:31:41,160 --> 00:31:43,160
¿Y qué es lo que hago ahora?

696
00:31:43,160 --> 00:31:45,160
Esta es la placa original,

697
00:31:45,160 --> 00:31:47,160
esta de aquí con ampicilina.

698
00:31:47,160 --> 00:31:51,160
Lo que hago ahora es cojo una placa nueva,

699
00:31:51,160 --> 00:31:53,160
y en este caso esta placa

700
00:31:53,160 --> 00:31:55,160
va a tener el medio de cultivo

701
00:31:55,160 --> 00:31:58,160
y voy a incluir la tetraciclina,

702
00:31:58,160 --> 00:32:00,160
el segundo antibiótico.

703
00:32:00,160 --> 00:32:03,160
Y cojo mi terciopelo y vuelvo a imprimir.

704
00:32:03,160 --> 00:32:05,160
¿De acuerdo? De la misma manera que he hecho aquí,

705
00:32:05,160 --> 00:32:07,160
lo bajo y me llevo bacterias,

706
00:32:07,160 --> 00:32:09,160
lo que hago ahora es lo bajo

707
00:32:09,160 --> 00:32:11,160
que contacte con el medio de cultivo

708
00:32:11,160 --> 00:32:13,160
y deposito las bacterias

709
00:32:13,160 --> 00:32:15,160
en la misma posición en la que estaban

710
00:32:15,160 --> 00:32:18,160
en la placa anterior.

711
00:32:18,160 --> 00:32:20,160
¿De acuerdo? Incubo 24 horas

712
00:32:20,160 --> 00:32:24,160
y veis, si os dais cuenta,

713
00:32:24,160 --> 00:32:27,160
hay alguna colonia que desaparece,

714
00:32:27,160 --> 00:32:29,160
es decir, era resistente a ampicilina

715
00:32:29,160 --> 00:32:32,160
pero ahora ya no es resistente a tetraciclina.

716
00:32:32,160 --> 00:32:34,160
Vuelvo para atrás.

717
00:32:34,160 --> 00:32:36,160
Las que son resistentes a ampicilina,

718
00:32:36,160 --> 00:32:38,160
pero son sensibles a tetraciclina,

719
00:32:38,160 --> 00:32:40,160
llevan el vector recombinante.

720
00:32:40,160 --> 00:32:43,160
Estas son las que me interesan.

721
00:32:43,160 --> 00:32:45,160
Por tanto, estas de aquí,

722
00:32:45,160 --> 00:32:48,160
que son resistentes a ampicilina

723
00:32:48,160 --> 00:32:51,160
y a tetraciclina, no me interesan.

724
00:32:51,160 --> 00:32:55,160
Como yo he mantenido la disposición topográfica,

725
00:32:55,160 --> 00:32:58,160
es decir, la localización de las colonias,

726
00:32:58,160 --> 00:33:00,160
yo sé que esta colonia que tendría que estar aquí

727
00:33:00,160 --> 00:33:02,160
es la que me interesa.

728
00:33:02,160 --> 00:33:04,160
Entonces, vuelvo a la primera plaquita,

729
00:33:04,160 --> 00:33:06,160
a esta de aquí, cojo,

730
00:33:06,160 --> 00:33:09,160
esta colonia, cojo sus bacterias

731
00:33:09,160 --> 00:33:12,160
y las crezco aparte sabiendo que esas

732
00:33:12,160 --> 00:33:15,160
son las bacterias con el clon recombinante.

733
00:33:15,160 --> 00:33:17,160
¿De acuerdo?

734
00:33:17,160 --> 00:33:20,160
Esta estrategia es una estrategia clásica.

735
00:33:20,160 --> 00:33:23,160
En dos pasos tengo que hacer dos incubaciones

736
00:33:23,160 --> 00:33:25,160
en dos placas, una con ampicilina,

737
00:33:25,160 --> 00:33:27,160
otra con tetraciclina.

738
00:33:27,160 --> 00:33:29,160
Es larga y laboriosa.

739
00:33:29,160 --> 00:33:32,160
Por eso, realmente está en desuso.

740
00:33:32,160 --> 00:33:35,160
La segunda estrategia intenta mejorar

741
00:33:35,160 --> 00:33:38,160
esta estrategia para intentar hacerlo todo en un paso.

742
00:33:38,160 --> 00:33:40,160
¿De acuerdo?

743
00:33:40,160 --> 00:33:42,160
¿Cómo lo conseguimos?

744
00:33:42,160 --> 00:33:45,160
Lo vamos a conseguir, en primer lugar,

745
00:33:45,160 --> 00:33:49,160
porque vamos a utilizar bacterias

746
00:33:49,160 --> 00:33:52,160
que son defectivas en lactosa.

747
00:33:52,160 --> 00:33:55,160
Son lo que llamamos LAC negativas.

748
00:33:55,160 --> 00:33:57,160
¿LAC negativas qué significa?

749
00:33:57,160 --> 00:34:02,160
Significa que no poseen el gen LACZ.

750
00:34:02,160 --> 00:34:04,160
El gen LACZ es el gen

751
00:34:04,160 --> 00:34:07,160
que codifica para este enzima,

752
00:34:07,160 --> 00:34:09,159
la beta-galactosidasa.

753
00:34:09,159 --> 00:34:13,159
Este enzima, la beta-galactosidasa,

754
00:34:13,159 --> 00:34:15,159
es muy importante para muchas bacterias.

755
00:34:15,159 --> 00:34:18,159
¿Por qué? Porque les permite coger la lactosa,

756
00:34:18,159 --> 00:34:21,159
la lactosa ya sabéis que es un disacárido,

757
00:34:21,159 --> 00:34:26,159
coge la lactosa, rompe el enlace glucosídico,

758
00:34:26,159 --> 00:34:30,159
liberando los dos monosacáridos que la forman,

759
00:34:30,159 --> 00:34:32,159
glucosa y galactosa.

760
00:34:32,159 --> 00:34:36,159
De tal manera que las bacterias LAC positivas

761
00:34:36,159 --> 00:34:39,159
producen beta-galactosidasa

762
00:34:39,159 --> 00:34:42,159
y tienen la capacidad de coger lactosa,

763
00:34:42,159 --> 00:34:48,159
romperla y obtienen glucosa como fuente de energía.

764
00:34:48,159 --> 00:34:50,159
¿De acuerdo?

765
00:34:50,159 --> 00:34:53,159
Las bacterias LAC negativas, como no lo pueden hacer,

766
00:34:53,159 --> 00:34:56,159
o le ponemos en el medio de cultivo glucosa directamente,

767
00:34:56,159 --> 00:34:58,159
o si solo le ponemos lactosa, se mueren.

768
00:34:58,159 --> 00:35:01,159
¿Por qué? Porque no tienen beta-galactosidasa,

769
00:35:01,159 --> 00:35:03,159
no pueden romper la lactosa

770
00:35:03,159 --> 00:35:07,159
y no pueden obtener glucosa a partir de lactosa.

771
00:35:07,159 --> 00:35:09,159
¿De acuerdo? Muy importante.

772
00:35:09,159 --> 00:35:11,159
Por tanto, primer punto.

773
00:35:11,159 --> 00:35:16,159
Necesitamos como células hospedadoras bacterias LAC negativas,

774
00:35:16,159 --> 00:35:19,159
bacterias competentes LAC negativas,

775
00:35:19,159 --> 00:35:22,159
que no produzcan beta-galactosidasa.

776
00:35:22,159 --> 00:35:25,159
¿Sí? Muy bien.

777
00:35:27,159 --> 00:35:29,159
Segunda idea importante de esta estrategia.

778
00:35:29,159 --> 00:35:31,159
Nosotros, en el medio de cultivo,

779
00:35:31,159 --> 00:35:33,159
no vamos a poner lactosa.

780
00:35:33,159 --> 00:35:35,159
Pondremos glucosa directamente.

781
00:35:35,159 --> 00:35:38,159
Porque en esta estrategia queremos que crezcan las bacterias.

782
00:35:38,159 --> 00:35:41,159
Las bacterias LAC negativas queremos que crezcan.

783
00:35:41,159 --> 00:35:45,159
Pero, en el medio de cultivo vamos a poner una análogo.

784
00:35:45,159 --> 00:35:48,159
No es la lactosa, pero estructuralmente se le parece.

785
00:35:48,159 --> 00:35:50,159
¿Y qué gracia tiene? Fijaros.

786
00:35:50,159 --> 00:35:52,159
Vamos a poner X-gal.

787
00:35:52,159 --> 00:35:54,159
¿Qué gracia tiene el X-gal?

788
00:35:54,159 --> 00:35:58,159
Si os dais cuenta, contiene una galactosa.

789
00:35:58,159 --> 00:35:59,159
¿De acuerdo?

790
00:35:59,159 --> 00:36:03,159
Pero, en lugar de estar unida esa galactosa a una glucosa,

791
00:36:03,159 --> 00:36:07,159
está unida a un compuesto químico muy raro,

792
00:36:07,159 --> 00:36:10,159
cuya estructura y nombre no nos interesa.

793
00:36:10,159 --> 00:36:12,159
¿Qué gracia tiene?

794
00:36:12,159 --> 00:36:15,159
Que si este X-gal...

795
00:36:15,159 --> 00:36:19,159
La gracia que tiene el X-gal es que,

796
00:36:19,159 --> 00:36:22,159
estructuralmente, es muy parecido a la lactosa.

797
00:36:22,159 --> 00:36:25,159
De tal manera que podemos engañar a la beta-galactosidasa.

798
00:36:25,159 --> 00:36:27,159
Si la beta-galactosidasa

799
00:36:27,159 --> 00:36:32,159
coge el X-gal, es capaz de romper este enlace,

800
00:36:32,159 --> 00:36:35,159
liberar la galactosa

801
00:36:35,159 --> 00:36:38,159
y liberar este compuesto raro.

802
00:36:38,159 --> 00:36:40,159
¿Qué gracia tiene este compuesto?

803
00:36:40,159 --> 00:36:45,159
Que si yo, además, le añado un catalizador,

804
00:36:45,159 --> 00:36:49,159
que se suele utilizar mucho el IPTG,

805
00:36:49,159 --> 00:36:52,159
se une al IPTG, se oxida

806
00:36:52,159 --> 00:36:55,159
y produce una molécula

807
00:36:55,159 --> 00:36:59,159
que precipita y que está coloreada,

808
00:36:59,159 --> 00:37:02,159
de un color así oscuro, ¿de acuerdo?

809
00:37:02,159 --> 00:37:04,159
Azul oscuro, muy oscuro.

810
00:37:04,159 --> 00:37:07,159
Ahora diréis, bueno, ¿y qué gracia tiene todo esto?

811
00:37:07,159 --> 00:37:11,159
Pues fijaos, las bacterias lactonegativas

812
00:37:11,159 --> 00:37:13,159
no van a poder hacer este proceso,

813
00:37:13,159 --> 00:37:16,159
porque no tienen beta-galactosidasa.

814
00:37:16,159 --> 00:37:20,159
Las colonias que van a dar van a ser de color blanco.

815
00:37:20,159 --> 00:37:24,159
Las bacterias que son lactonegativas

816
00:37:24,159 --> 00:37:27,159
y que incorporan la beta-galactosidasa

817
00:37:27,159 --> 00:37:30,159
entonces van a dar colonias de color azul.

818
00:37:30,159 --> 00:37:33,159
Fijaos, aquí han hecho ese experimento.

819
00:37:33,159 --> 00:37:36,159
Aquellas colonias,

820
00:37:36,159 --> 00:37:38,159
esto para lo general ya lo habéis visto nunca,

821
00:37:38,159 --> 00:37:41,159
es una placa petri, esto amarillento es el medio de cultivo,

822
00:37:41,159 --> 00:37:43,159
el agar debe ser un agar nutritivo, ¿de acuerdo?

823
00:37:43,159 --> 00:37:45,159
Lo veréis el año que viene en microbiología

824
00:37:45,159 --> 00:37:47,159
y os dais cuenta, hay dos tipos de colonias.

825
00:37:47,159 --> 00:37:49,159
Unas colonias blancas,

826
00:37:49,159 --> 00:37:52,159
las blancas corresponden a las células lactonegativas,

827
00:37:52,159 --> 00:37:53,159
que no tienen beta-galactosidasa,

828
00:37:53,159 --> 00:37:58,159
y las azules son las que tienen beta-galactosidasa,

829
00:37:58,159 --> 00:37:59,159
¿de acuerdo?

830
00:37:59,159 --> 00:38:03,159
De tal manera que cultivando en una única placa

831
00:38:03,159 --> 00:38:05,159
soy capaz de diferenciar las bacterias

832
00:38:05,159 --> 00:38:08,159
lac menos de las lac más, lac positivas,

833
00:38:08,159 --> 00:38:10,159
¿de acuerdo?

834
00:38:10,159 --> 00:38:13,159
Espero que se haya entendido esta introducción

835
00:38:13,159 --> 00:38:16,159
de esta estrategia que llamamos cromogénica.

836
00:38:16,159 --> 00:38:20,159
¿Qué gracia tiene esta estrategia?

837
00:38:20,159 --> 00:38:22,159
Entendiendo esto, ahora podemos,

838
00:38:22,159 --> 00:38:26,159
podemos entender que vamos a utilizar vectores de clonación

839
00:38:26,159 --> 00:38:30,159
en los cuales, si os dais cuenta,

840
00:38:30,159 --> 00:38:32,159
es idéntico al de la estrategia anterior,

841
00:38:32,159 --> 00:38:34,159
vamos a tener el gen de selección,

842
00:38:34,159 --> 00:38:36,159
que es un gen de resistencia a ampicilina,

843
00:38:36,159 --> 00:38:38,159
pero en este caso hemos sustituido

844
00:38:38,159 --> 00:38:41,159
el gen de la tetraciclina por el gen lacZ,

845
00:38:41,159 --> 00:38:44,159
ya hemos dicho que el lacZ es el gen

846
00:38:44,159 --> 00:38:46,159
que produce beta-galactosidasa,

847
00:38:46,159 --> 00:38:48,159
que codifica para la beta-galactosidasa,

848
00:38:48,159 --> 00:38:50,159
¿de acuerdo?

849
00:38:50,159 --> 00:38:52,159
Muy bien, ¿qué es lo que hacemos ahora?

850
00:38:52,159 --> 00:38:54,159
Ojo, si os dais cuenta,

851
00:38:54,159 --> 00:38:58,159
nuevamente el poli-linker está dentro del gen lacZ,

852
00:38:58,159 --> 00:39:01,159
de tal manera que el vector vacío,

853
00:39:01,159 --> 00:39:03,159
aquella bacteria que tenga el vector vacío

854
00:39:03,159 --> 00:39:06,159
va a ser capaz de producir beta-galactosidasa,

855
00:39:06,159 --> 00:39:09,159
pero la que incorpore el gen,

856
00:39:09,159 --> 00:39:12,159
el inserto,

857
00:39:12,159 --> 00:39:15,159
va a tener el gen lacZ interrumpido,

858
00:39:15,159 --> 00:39:18,159
roto, y no va a poder producir beta-galactosidasa

859
00:39:18,159 --> 00:39:21,159
aunque tenga el gen, porque está roto.

860
00:39:22,159 --> 00:39:24,159
De tal manera que ahora

861
00:39:24,159 --> 00:39:26,159
lo que hacemos es,

862
00:39:26,159 --> 00:39:29,159
después de la transformación,

863
00:39:29,159 --> 00:39:31,159
incubamos nuestras células,

864
00:39:31,159 --> 00:39:32,159
tiro para atrás,

865
00:39:32,159 --> 00:39:34,159
en un medio de cultivo que tiene

866
00:39:34,159 --> 00:39:36,159
1. ampicilina

867
00:39:36,159 --> 00:39:39,159
y 2. x-gal,

868
00:39:39,159 --> 00:39:42,159
de tal manera que ahora voy a ser capaz

869
00:39:42,159 --> 00:39:45,159
de diferenciar en un único paso

870
00:39:45,159 --> 00:39:48,159
qué bacterias dan colonias blancas

871
00:39:48,159 --> 00:39:50,159
y qué bacterias dan colonias azules.

872
00:39:50,159 --> 00:39:51,159
Las colonias azules son de base,

873
00:39:51,159 --> 00:39:53,159
son de bacterias que han incorporado

874
00:39:53,159 --> 00:39:56,159
el vector no recombinante

875
00:39:56,159 --> 00:39:58,159
y que por tanto tienen el gen completo,

876
00:39:58,159 --> 00:40:03,159
tal cual las colonias blancas

877
00:40:03,159 --> 00:40:05,159
proceden de bacterias que tienen

878
00:40:05,159 --> 00:40:07,159
el vector recombinante.

879
00:40:07,159 --> 00:40:09,159
No producen beta-galactosidasa.

880
00:40:09,159 --> 00:40:10,159
¿Por qué?

881
00:40:10,159 --> 00:40:12,159
Porque aquí tienen metido el inserto

882
00:40:12,159 --> 00:40:15,159
y el gen de la lacZ lo tienen roto.

883
00:40:15,159 --> 00:40:16,159
¿De acuerdo?

884
00:40:16,159 --> 00:40:19,159
Por tanto,

885
00:40:19,159 --> 00:40:22,159
podemos hacer la selección

886
00:40:22,159 --> 00:40:24,159
y la identificación simultáneamente

887
00:40:24,159 --> 00:40:26,159
en un paso.

888
00:40:26,159 --> 00:40:28,159
Las células no transformadas serán sensibles

889
00:40:28,159 --> 00:40:29,159
al antibiótico,

890
00:40:29,159 --> 00:40:30,159
a la ampicilina

891
00:40:30,159 --> 00:40:31,159
y lacZ.

892
00:40:31,159 --> 00:40:32,159
Por tanto, estas no crecen,

893
00:40:32,159 --> 00:40:33,159
se mueren,

894
00:40:33,159 --> 00:40:35,159
porque yo he puesto ampicilina.

895
00:40:35,159 --> 00:40:36,159
Las células transformadas

896
00:40:36,159 --> 00:40:38,159
con el vector no recombinante

897
00:40:38,159 --> 00:40:40,159
son resistentes a ampicilina

898
00:40:40,159 --> 00:40:41,159
y como son lacZ,

899
00:40:41,159 --> 00:40:43,159
son lac positivas,

900
00:40:43,159 --> 00:40:45,159
producen colonias azules.

901
00:40:45,159 --> 00:40:47,159
Y las que me interesan a mí

902
00:40:47,159 --> 00:40:48,159
son las que producen

903
00:40:48,159 --> 00:40:49,159
colonias blancas

904
00:40:49,159 --> 00:40:51,159
porque son lac negativas.

905
00:40:51,159 --> 00:40:52,159
¿De acuerdo?

906
00:40:52,159 --> 00:40:54,159
De tal manera que

907
00:40:54,159 --> 00:40:56,159
lo único que tengo que hacer ahora

908
00:40:56,159 --> 00:40:58,159
es seleccionar aquellas colonias

909
00:40:58,159 --> 00:41:00,159
blancas

910
00:41:00,159 --> 00:41:01,159
y ponerlas en cultivo

911
00:41:01,159 --> 00:41:02,159
y amplificarlas.

912
00:41:02,159 --> 00:41:03,159
¿De acuerdo?

913
00:41:03,159 --> 00:41:04,159
Todo en un paso.

914
00:41:04,159 --> 00:41:06,159
Selección e identificación

915
00:41:06,159 --> 00:41:07,159
en un único paso.

916
00:41:09,159 --> 00:41:11,159
La tercera estrategia,

917
00:41:11,159 --> 00:41:12,159
todavía más sencilla,

918
00:41:12,159 --> 00:41:13,159
pero es muy parecida a esta.

919
00:41:13,159 --> 00:41:15,159
Y es que en lugar de ser

920
00:41:15,159 --> 00:41:17,159
una estrategia cromogénica,

921
00:41:17,159 --> 00:41:19,159
bueno, esto es una imagen

922
00:41:19,159 --> 00:41:21,159
de un artículo científico

923
00:41:21,159 --> 00:41:22,159
donde también veis

924
00:41:22,159 --> 00:41:23,159
un montón de colonias blancas,

925
00:41:23,159 --> 00:41:25,159
pero también hay colonias azules.

926
00:41:25,159 --> 00:41:26,159
Seleccionamos las blancas,

927
00:41:26,159 --> 00:41:28,159
que son las que nos interesan.

928
00:41:28,159 --> 00:41:30,159
Es la utilización,

929
00:41:30,159 --> 00:41:31,159
en la tercera estrategia,

930
00:41:31,159 --> 00:41:33,159
utilización de proteínas fluorescentes.

931
00:41:33,159 --> 00:41:35,159
De tal manera que es muy sencilla

932
00:41:35,159 --> 00:41:36,159
y muy parecida a la anterior

933
00:41:36,159 --> 00:41:38,159
si es que la hemos entendido bien.

934
00:41:38,159 --> 00:41:40,159
En lugar de tener

935
00:41:40,159 --> 00:41:43,159
como gen de identificación el lacZ,

936
00:41:43,159 --> 00:41:46,159
que va a producir colonias de color azul,

937
00:41:46,159 --> 00:41:49,159
pongo el gen de la GFP,

938
00:41:49,159 --> 00:41:51,159
que es la proteína verde fluorescente.

939
00:41:51,159 --> 00:41:53,159
Green Fluorescent Protein.

940
00:41:53,159 --> 00:41:55,159
¿De acuerdo? Es una proteína fluorescente.

941
00:41:55,159 --> 00:41:58,159
Pero, por lo demás, es idéntico.

942
00:41:58,159 --> 00:42:00,159
Aquellos vectores vacíos

943
00:42:00,159 --> 00:42:03,159
producirán el gen de resistencia a ampicilina

944
00:42:03,159 --> 00:42:05,159
y el gen de GFP.

945
00:42:05,159 --> 00:42:06,159
¿Qué gracia tiene?

946
00:42:06,159 --> 00:42:09,159
Que esas bacterias van a ser fluorescentes.

947
00:42:09,159 --> 00:42:11,159
Porque producen una proteína

948
00:42:11,159 --> 00:42:13,159
que produce fluorescencia por sí misma.

949
00:42:13,159 --> 00:42:15,159
Que es fluorescente.

950
00:42:16,159 --> 00:42:18,159
Y las que hayan introducido

951
00:42:18,159 --> 00:42:19,159
el vector recombinante,

952
00:42:19,159 --> 00:42:21,159
por tanto, tendrán aquí el inserto,

953
00:42:21,159 --> 00:42:23,159
no serán verdes fluorescentes

954
00:42:23,159 --> 00:42:26,159
porque tendrán este gen roto nuevamente.

955
00:42:26,159 --> 00:42:28,159
Por tanto, la selección

956
00:42:28,159 --> 00:42:31,159
se realiza sobre un medio de cultivo

957
00:42:31,159 --> 00:42:34,159
con ampicilina

958
00:42:34,159 --> 00:42:37,159
y la identificación vamos a utilizar

959
00:42:37,159 --> 00:42:40,159
un microscopio de fluorescencia.

960
00:42:40,159 --> 00:42:43,159
Lo pondremos en el microscopio de fluorescencia

961
00:42:43,159 --> 00:42:45,159
en una lupa fluorescente

962
00:42:45,159 --> 00:42:47,159
y aquellas colonias que sean fluorescentes

963
00:42:47,159 --> 00:42:48,159
no nos interesan.

964
00:42:48,159 --> 00:42:51,159
Igual que antes las negras tampoco nos interesaban.

965
00:42:51,159 --> 00:42:52,159
¿De acuerdo?

966
00:42:52,159 --> 00:42:54,159
Así de sencillo.

967
00:42:54,159 --> 00:42:56,159
¿Qué ventaja tiene?

968
00:42:56,159 --> 00:42:59,159
¿O qué diferencia tiene con la estrategia anterior?

969
00:42:59,159 --> 00:43:02,159
Aquí voy a utilizar placas con medio de cultivo

970
00:43:02,159 --> 00:43:05,159
a las que voy a incorporar solamente ampicilina.

971
00:43:05,159 --> 00:43:07,159
En este caso, si os acordáis,

972
00:43:07,159 --> 00:43:11,159
utilizamos, además de poner ampicilina,

973
00:43:11,159 --> 00:43:13,159
tengo que poner X-gal

974
00:43:13,159 --> 00:43:16,159
y tengo que poner el catalizador IPTG.

975
00:43:16,159 --> 00:43:18,159
Por tanto, tres cosas.

976
00:43:18,159 --> 00:43:20,159
Por tanto, es un poquito más cara

977
00:43:20,159 --> 00:43:22,159
porque todos estos compuestos son caros.

978
00:43:22,159 --> 00:43:24,159
Estos reactivos son caros.

979
00:43:24,159 --> 00:43:26,159
En este caso, sencillamente pongo

980
00:43:26,159 --> 00:43:29,159
un medio de cultivo con ampicilina y ya está.

981
00:43:29,159 --> 00:43:32,159
Y luego miro al microscopio.

982
00:43:32,159 --> 00:43:36,159
Y la última estrategia es todavía más sencilla

983
00:43:36,159 --> 00:43:39,159
y es que vamos a sustituir este gen de la GFP,

984
00:43:39,159 --> 00:43:42,159
es lo que llamamos el uso de genes letales,

985
00:43:42,159 --> 00:43:44,159
por un gen letal,

986
00:43:44,159 --> 00:43:47,159
que codifica para una proteína que es letal.

987
00:43:47,159 --> 00:43:49,159
Por ejemplo, una toxina.

988
00:43:49,159 --> 00:43:52,159
De tal manera que aquella bacteria

989
00:43:52,159 --> 00:43:54,159
que exprese la toxina

990
00:43:54,159 --> 00:43:56,159
directamente se muere

991
00:43:56,159 --> 00:43:58,159
y no crece.

992
00:43:58,159 --> 00:44:00,159
Por tanto,

993
00:44:00,159 --> 00:44:02,159
si os dais cuenta,

994
00:44:02,159 --> 00:44:04,159
esta es muy rápida.

995
00:44:04,159 --> 00:44:06,159
¿Por qué? Tiro para atrás.

996
00:44:06,159 --> 00:44:08,159
Muy sencillo.

997
00:44:08,159 --> 00:44:10,159
Voy a poner las bacterias

998
00:44:10,159 --> 00:44:13,159
en un medio de cultivo con ampicilina.

999
00:44:13,159 --> 00:44:14,159
Solo ampicilina.

1000
00:44:14,159 --> 00:44:16,159
Igual que en la estrategia 3.

1001
00:44:16,159 --> 00:44:18,159
¿De acuerdo?

1002
00:44:18,159 --> 00:44:20,159
De tal manera que las células no transformadas

1003
00:44:20,159 --> 00:44:22,159
no crecen.

1004
00:44:22,159 --> 00:44:24,159
Pero,

1005
00:44:24,159 --> 00:44:26,159
¿qué gracia tiene?

1006
00:44:26,159 --> 00:44:28,159
Que aquellas células que hayan incorporado

1007
00:44:28,159 --> 00:44:30,159
el vector no recombinante

1008
00:44:30,159 --> 00:44:32,159
tienen el gen letal intacto

1009
00:44:32,159 --> 00:44:34,159
y por tanto tampoco crecen

1010
00:44:34,159 --> 00:44:36,159
porque van a producir la toxina.

1011
00:44:36,159 --> 00:44:38,159
De tal manera que,

1012
00:44:38,159 --> 00:44:40,159
ahora en la placa de cultivo

1013
00:44:40,159 --> 00:44:42,159
solamente van a crecer

1014
00:44:42,159 --> 00:44:44,159
las células transformadas

1015
00:44:44,159 --> 00:44:46,159
con vector recombinante.

1016
00:44:46,159 --> 00:44:48,159
¿De acuerdo?

1017
00:44:48,159 --> 00:44:50,159
Bueno, pues con esto

1018
00:44:50,159 --> 00:44:52,159
damos por finalizada

1019
00:44:52,159 --> 00:44:54,159
la segunda parte del tema

1020
00:44:54,159 --> 00:44:56,159
de clonación molecular.