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Videoconferencia martes 28 de noviembre - Contenido educativo - Contenido educativo - Contenido educativo

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Subido el 5 de diciembre de 2023 por Susana A.

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Vale, pues continuamos con el tema de proteínas. Bien, vamos a repasar primero un poco lo que 00:00:00
hemos visto ya, que son las estructuras de las proteínas. Bueno, me oís, ¿verdad? 00:00:46
Sí, Susana. Gracias. Vale, como las proteínas están formadas 00:01:03
por aminoácidos, la unión de esos aminoácidos da lugar, o sea, esos aminoácidos están 00:01:16
unidos por enlaces peptídicos, son enlaces de amidas, y esas uniones de aminoácidos 00:01:24
van a dar lugar a la estructura primaria. Ya vimos como si hay un cambio en algún aminoácido, 00:01:31
esa estructura primaria va a cambiar y por lo tanto va a cambiar también la función 00:01:38
de la proteína. Y esa estructura primaria es la que va a determinar cómo va a ser la 00:01:43
estructura secundaria, ¿os acordáis de alfa hélice? La hélice de colágeno que era parecida 00:01:50
al alfa hélice y la conformación beta. Y después estaba la estructura terciaria 00:01:56
que se forma a partir de esta estructura secundaria, y de estructuras terciarias teníamos las proteínas 00:02:02
filamentosas o fibrosas que están formadas por una única estructura secundaria. Y después 00:02:10
teníamos las proteínas globulares que están formadas por varias de las estructuras secundarias, 00:02:17
y las proteínas globulares son esféricas y en concreto vimos unas proteínas globulares 00:02:25
que eran las enzimas, que son unas proteínas globulares muy importantes, ¿os acordáis 00:02:32
que eran biocatalizadores? Porque catalizaban reacciones químicas que tienen lugar en la 00:02:38
célula, y bueno, sin enzimas la vida no existiría. Y por último teníamos la estructura cuaternaria 00:02:44
que dijimos también que no la tenían todas las proteínas, solamente algunas, y eran 00:02:55
uniones de varios péptidos. Y después continuamos con, una vez que ya sabemos cómo están formadas 00:03:00
las proteínas, también vimos cómo de la célula tenemos que extraer solamente la parte 00:03:11
que sea que corresponda a las proteínas, porque en las células vamos a tener lípidos, 00:03:18
vamos a tener hidratos de carbono, vamos a tener ácido nucleico, pues de esa célula 00:03:24
tenemos que extraer lo que solamente sea proteínas. Y vimos cómo hacíamos esto, que se podía 00:03:31
hacer por lisis celular, esto si os acordáis era por choque osmótico, lo que hacíamos 00:03:40
era poner la célula en una disolución más diluida y entonces el agua penetra en la célula, 00:03:48
la célula se hincha y se rompe la célula. Y después teníamos la destrucción mecánica, 00:03:58
la destrucción mecánica que se hacía simplemente con un mortero con arena o se podía hacer 00:04:09
también por sonicación, aplicando ultrasonidos a las células o con un molino de perlas de 00:04:20
vidrio. Y por último teníamos la descongelación, que consistía en enfriar las células a menos 00:04:31
196 grados con nitrógeno líquido y después subir a 25 grados centígrados muy rápido, 00:04:40
de forma rápida y así también podemos obtener el extracto proteico. Y el último día vimos 00:04:47
también cómo se cuantifica, nosotros ya tenemos el extracto proteico, pues vamos a ver ahora qué 00:04:58
cantidad de proteínas tenemos en nuestra muestra. Y esto se podía hacer de tres formas, 00:05:04
con tres técnicas diferentes. Vamos a ver aquí la cuantificación. Entonces había tres formas 00:05:13
diferentes, una de ellas era, nos basábamos en que las propias proteínas absorben luz ultravioleta, 00:05:28
pues bueno, hoy he añadido esta diapositiva para que veáis un poco cómo se hace. Aquí 00:05:36
tendríamos una cubeta, esto se llama cubeta, este envase, esto sería una cubeta y aquí 00:05:43
pondríamos nuestra disolución de proteína. Entonces aplicamos una radiación ultravioleta 00:05:51
visible, dependiendo de la longitud de onda que necesitemos. O sea, aplicamos una radiación 00:05:57
y las proteínas van a absorber parte de esa radiación y entonces vamos a detectar la 00:06:04
radiación transmitida que va a ser menor. Y eso es lo que detectamos en el espectrofotómetro. 00:06:10
Vale, entonces, si os acordáis el otro día lo que hacíamos era, bueno, por una parte 00:06:19
el primer método, que es el método en el que se mide la absorbancia de las proteínas tal cual, 00:06:24
las proteínas absorben a 280 nanómetros y medimos en el espectrofotómetro las proteínas directamente, 00:06:35
simplemente disolviendo las proteínas se miden. Y luego teníamos los otros dos métodos que era 00:06:47
el método de Lowry y el método de Bradford, el método de Lowry. En el método de Lowry lo que 00:06:52
hacíamos era dos reacciones seguidas. En la primera reacción mezclábamos las proteínas con 00:07:02
iones de cobre, el medio alcalino, y entonces se nos formaba este compuesto de aquí. El cobre se 00:07:08
queda aquí en medio. Esta sería una cadena de proteína, otra cadena de proteína. El cobre se 00:07:15
queda aquí en medio. Esta sería la primera reacción. Y la segunda reacción sería añadir el reactivo 00:07:20
de Follin, que es este de aquí, el reactivo de Follin. Entonces, el reactivo de Follin reacciona 00:07:27
con los OHs de los aminoácidos que tengan estos OHs. El reactivo de Follin se reduce y se forma 00:07:33
un compuesto de color azul. Pues la idea es que nosotros preparamos distintas disoluciones de 00:07:42
concentración conocida de proteínas. Aquí vamos a poner una concentración conocida de proteínas. 00:07:51
Y hacemos esta reacción. Le añadimos el reactivo de Follin. Cuanto más color azul nos aparezca, 00:07:58
esto significará que hay más cantidad de proteínas. Entonces, lo que hacemos es medir en el 00:08:06
espectrofotómetro, medimos cuánto absorben todas estas proteínas que tenemos aquí en distintas 00:08:14
concentraciones y realizamos la recta. La recta que sería, bueno, aquí este es el método de Bradford, 00:08:21
pero lo que es la recta es lo mismo. Haríamos una recta en la que vamos representando la 00:08:29
concentración de proteína conocida frente a la absorbancia que nos ha dado en el ultravioleta. 00:08:35
La otra concentración de proteína frente a la absorbancia. Otra concentración de proteína frente 00:08:41
a la absorbancia. Y así hacemos la recta que la ajustamos por mínimos cuadrados. Hacemos esta 00:08:47
recta y cuando midamos en el espectrofotómetro nuestra muestra, pues vamos a medir la absorbancia 00:08:53
de nuestra muestra. Por ejemplo, si la absorbancia nos sale 0,3, vamos a interpolar en la recta y 00:09:01
vamos a saber qué concentración tenemos de nuestra proteína. Entonces, en el método de Lowry, 00:09:09
lo que os decía, se añade el reactivo de Follin y en el método de Bradford lo que se añade es 00:09:17
un colorante que es el azul de coma sí, que este colorante es de color rojo y cuando se adhiere a 00:09:22
la proteína cambia a color azul y cambia también el máximo de absorción que es de 465 a 595. 00:09:30
Entonces, lo que haríamos sería eso, añadir a cada disolución de proteína de concentración 00:09:40
conocida le añadimos reactivo, en este caso reactivo de Bradford. Vamos, añadimos reactivo 00:09:48
de Bradford, cuanto más color azul se nos forme, más cantidad de proteína tenemos en nuestra muestra. 00:09:54
Entonces, medimos en el espectrofotómetro ultravioleta visible, medimos la absorción de 00:10:01
cada una de nuestras disoluciones patrón y luego medimos, o sea, hacemos la representación, 00:10:07
medimos nuestra muestra, la absorbancia y la interpolamos y sacamos la cantidad de proteína. 00:10:14
Entonces, el método de Bradford, esta sería nuestra proteína, le añadimos el azul de coma sí, 00:10:22
preparamos varias disoluciones patrón de concentración conocida y la medimos en el espectrofotómetro. 00:10:31
Bueno, no sé si esto queda clara la cuantificación, no sé si tenéis alguna duda de esto. 00:10:41
Si no, pues, seguimos. 00:10:52
Vale, pues entonces, eso sería la cuantificación de las proteínas, para saber cuánta proteína tenemos en total en nuestra muestra. 00:11:00
Y ahora, una vez que ya tenemos la cantidad, que ya sabemos la cantidad de proteínas 00:11:08
y tenemos las proteínas separadas del resto de componentes de la célula, 00:11:16
lo que queremos hacer es purificar estas proteínas. 00:11:22
Entonces, para purificar y separar estas proteínas, lo que tenemos son tres formas. 00:11:27
Voy a volver a la, aquí la tenemos. 00:11:36
Tenemos tres formas de separar y de purificar el extracto proteico que hemos obtenido. 00:11:39
Una es la diálisis, otra forma es la cromatografía y la última sería la electroforesis. 00:11:46
Pues vamos a empezar por la diálisis. 00:11:54
Vale, pues la diálisis es un proceso en el que separamos las moléculas de una disolución 00:12:00
y nos basamos en la diferencia de sus índices de difusión a través de una membrana semipermeable. 00:12:09
Entonces, qué importante, pues separamos moléculas y a través de, nos basamos en la difusión de esas moléculas a través de una membrana semipermeable. 00:12:16
Entonces, esta técnica se utiliza de forma habitual en el laboratorio y el principio es parecido al de la diálisis médica. 00:12:27
Entonces, lo que tenemos es una disolución en la que vamos a tener nuestras moléculas. 00:12:40
Las moléculas que van a tener diferente tamaño, diferente masa molecular. 00:12:51
Y esta disolución de nuestras moléculas se introduce en un bolso o saco, que sería esto de aquí, un bolso semipermeable que suele ser de celulosa. 00:12:57
Y este bolso semipermeable tiene unos poros. 00:13:13
Entonces, este bolso se coloca en un envase en el que tenemos una disolución de concentración diferente, que sería esto de aquí azul. 00:13:20
Puede ser una disolución que esté más concentrada o menos concentrada que la del interior. 00:13:31
Si la disolución está menos concentrada, las moléculas pequeñas, estas de aquí verdes, van a pasar a través de los poros de la membrana y van a salir de esa membrana. 00:13:39
Aquí tenemos ya todas las moléculas más pequeñas. 00:13:54
Y en cambio, las moléculas más grandes, como podrían ser, por ejemplo, si tuviéramos proteínas o ácido nucleico o polisacáridos, las moléculas más grandes se van a quedar en el interior del saco o del bolso. 00:13:58
Entonces, la dirección de las moléculas es hacia la disolución de concentración más baja. 00:14:18
Por eso, en este caso, como en la parte de fuera tenemos una disolución de menor concentración, las moléculas más pequeñas salen hacia afuera. 00:14:27
Entonces, una de las utilidades de la diálisis es para purificar las proteínas, para eliminar las sales de las proteínas, se utiliza esta técnica de diálisis. 00:14:38
También tenemos otras técnicas que solamente las vamos a citar, que serían la ultrafiltración y la centrifugación. 00:14:52
La centrifugación es hacer girar nuestra disolución a una velocidad muy alta y por la fuerza centrífuga el sólido precipita abajo de la disolución. 00:15:02
Y luego la ultrafiltración es parecido a la diálisis, lo que pasa es que las membranas son de tamaño de poro muy, muy, muy reducido. 00:15:18
Entonces, se necesita presión para que esas moléculas pequeñas salgan. 00:15:26
O sea, que la ultrafiltración, aparte de que tiene baja la disolución, tiene baja la concentración. 00:15:31
Sí. 00:15:37
También, aparte, hay cambios de presión, dice usted. 00:15:38
Sí, eso es. Como los poros son muy, muy pequeños, la ultrafiltración es una variedad de diálisis. 00:15:43
Lo que pasa, entonces, es que la membrana semipermeable tiene unos poros muy, muy, muy pequeños. 00:15:51
Entonces, para conseguir que esas moléculas pequeñas salgan de dentro, aparte de que por fuera tengamos una disolución menos concentrada, 00:15:56
también hay que aplicar ahí presión para que salgan las moléculas más pequeñas. 00:16:06
Porque los poros que hay aquí en la membrana semipermeable son muy, muy pequeños. 00:16:11
No sé si te he respondido. 00:16:16
Sí, sí, sí, gracias. 00:16:18
Vale. 00:16:20
Bueno, pues aquí tenéis una autoevaluación. 00:16:25
En la página 21, que aquí no la he puesto, pero yo os la digo. 00:16:28
En el proceso de diálisis, la mezcla a purificar se coloca en un bolso, 00:16:34
o saco, y se introduce en una disolución de muy baja concentración, salina. 00:16:40
¿Qué ocurre con las proteínas en el proceso? 00:16:45
Y entonces nos da dos respuestas. 00:16:48
Una nos dice, no son capaces de atravesar la membrana, quedando retenidas en el interior del saco. 00:16:51
Y la segunda es, salen difundidas al exterior, quedando en el interior del saco. 00:16:57
Y la segunda es, salen difundidas al exterior, quedando otros residuos en el interior. 00:17:04
A ver, pensadlo un poco. 00:17:14
Vale, ¿sabríais cuál es? 00:17:23
Las proteínas quedarían dentro, porque hablamos de que las partículas son las que van a salir 00:17:27
y las proteínas son las que van a quedar adentro, porque son de mayor peso, ¿no? 00:17:32
Eso es, como son más grandes, son de mayor masa molecular, las proteínas quedan dentro. 00:17:36
Las proteínas, los ácidos nucleicos, los polisacláridos, las moléculas que son más pequeñas, 00:17:42
salen al exterior, a la parte de la disolución más diluida. 00:17:47
Bien, pues, otra de las técnicas que hemos visto para fraccionar o separar las proteínas 00:17:54
que hemos aislado de nuestra célula es la cromatografía. 00:18:05
Vale, pues, vamos a ver qué es la cromatografía. 00:18:11
Bueno, pues, la cromatografía es el método con el que se denomina un conjunto de métodos analíticos 00:18:24
para separar los componentes de una muestra. 00:18:33
Entonces, mediante la cromatografía podemos separar análitos que sean muy parecidos entre sí 00:18:36
en cuanto a sus propiedades físico-químicas. 00:18:42
Por ejemplo, podemos separar mezclas de aminoácidos o mezclas de proteínas. 00:18:45
También mezclas de ácidos grasos, pigmentos, pesticidas, ¿vale? 00:18:50
Pero lo que nos interesa a nosotros es separar o aminoácidos o mezclas de proteínas. 00:18:54
Pues, vamos a ver qué es la cromatografía. 00:19:02
Bueno, ya hemos visto que se utiliza para separar y purificar proteínas. 00:19:05
Bueno, pues, la primera vez que se utilizó la cromatografía se utilizó para separar pigmentos vegetales. 00:19:12
Se utilizó un extracto de hojas y entonces lo hizo este científico, Schwedt, en 1903. 00:19:20
Entonces, puso un extracto de hojas y lo hizo pasar a través de una fase que llamó fase estacionaria 00:19:31
que sería esto de aquí en gris y esto de aquí en negro sería la muestra, la mezcla de pigmentos. 00:19:44
Y entonces, ¿cómo hizo pasar esa muestra a través de esta fase estacionaria? 00:19:51
Esta fase estacionaria sería un sólido. 00:19:56
Pues, hizo pasar la muestra mediante una mezcla de disolventes. 00:19:59
Entonces, la muestra fue pasando a través de, esto sería una columna, esto de aquí. 00:20:06
La muestra va pasando a través de la fase estacionaria y los componentes de la muestra van reaccionando o uniéndose a la fase estacionaria. 00:20:11
Van pasando unos más rápidos que otros. 00:20:24
Si os fijáis aquí ya la muestra empieza a separarse. 00:20:28
Aquí empieza ya un poquito el rojo, aquí una parte negra y aquí una verde. 00:20:31
Entonces, la muestra según va pasando a través de la fase estacionaria se va separando 00:20:36
y esa muestra, que en este caso sería una mezcla de, o sea, el extracto de hojas, se van separando sus pigmentos. 00:20:42
Primero aparece el pigmento de color rojo, después aparecería el pigmento de color gris, negro y por último aparecería el pigmento de color verde. 00:20:52
Por eso se dice que es una técnica de separación. 00:21:02
Porque aquí tenemos nuestra muestra del extracto de hojas. 00:21:06
Lo hacemos pasar a través de una fase estacionaria. 00:21:11
Aquí tendríamos, bueno, puede ser un sólido, puede ser un líquido, puede ser un gas, pero en este caso imaginaos que esto es un sólido. 00:21:17
Va pasando nuestra muestra y para que atraviese nuestra muestra a través de la fase estacionaria necesitamos una fase que se llama fase móvil. 00:21:24
Y esta fase móvil es una mezcla de disolventes que vamos a añadir aquí. 00:21:35
Y así, según los pigmentos se van adhiriendo un poco más, un poco menos a la fase estacionaria, pues se van separando. 00:21:41
Y así podemos obtener los tres pigmentos separados. 00:21:53
Este sería, así a grandes riesgos, lo que es el método de cromatografía. 00:21:57
Cuando se descubrió que se obtenían pigmentos de diferentes colores, pues por eso se dice que el término cromatografía viene del griego. 00:22:06
El color, el cromato significa color y de ahí viene cromatografía. 00:22:18
Entonces lo importante es eso, que tenemos una fase estacionaria. 00:22:26
Esto sí que lo tenéis que saber, una fase estacionaria y una fase móvil. 00:22:31
Y esta fase móvil es la que va a arrastrar a la muestra a través de la fase estacionaria. 00:22:36
Y que de esta forma vamos a obtener los componentes de nuestra muestra de forma separada. 00:22:42
¿Y en la fase estacionaria qué es? ¿Un líquido? 00:22:52
La fase estacionaria es que puede ser un sólido, puede ser un líquido, sólido o líquido. 00:22:56
Entonces la fase estacionaria, esto los que estudiéis análisis instrumental lo vais a ver con más detenimiento. 00:23:04
Y ahora en las próximas, ahora vamos a ver algún tipo de cromatografía y ya vamos a ver algún ejemplo. 00:23:10
Vale, gracias. 00:23:18
Entonces mirad, hay dos vídeos del CSIC que son igual un poco infantiles, pero para que os hagáis una idea. 00:23:20
Aunque esto solo tiene música, o sea que no nos importa que no se escuche. 00:23:31
A ver si lo pongo así. 00:23:37
Pues no se escucha nada. 00:23:51
Bueno, parece que no va, pero a ver si lo puedo poner. 00:24:05
Aquí está. 00:24:16
Vale, ¿lo veis? 00:24:21
Ah, pero no se ve entero. 00:24:24
Sí, sí se ve. 00:24:26
Pero no se ve entero, ¿verdad? Se ve solo una parte. 00:24:28
Bueno, lo pongo así en pequeño. 00:24:36
Esa sería nuestra... Ay, no, perdón, que me he confundido. No quería poneros esta. 00:24:51
A ver... 00:24:57
Es esta. 00:25:03
Vale, pues ya está. 00:25:06
Bueno, pues ya está. 00:25:08
Bueno, pues ya está. 00:25:10
Bueno, pues ya está. 00:25:12
Bueno, pues ya está. 00:25:14
Bueno, pues ya está. 00:25:16
Es esta. 00:25:18
Vale, esta sí. 00:25:44
Vale, si os fijáis, aquí está la fase estacionaria. 00:25:49
Aquí tenemos nuestra muestra. 00:25:54
Esta sería nuestra muestra, con toda la mezcla de componentes de la muestra. 00:26:00
Bueno, pues ya está. 00:26:06
Bueno, pues ya está. 00:26:08
Bueno, pues ya está. 00:26:10
Bueno, pues ya está. 00:26:12
Bueno, pues ya está. 00:26:14
Y ahora añadimos la fase móvil, que normalmente puede ser un gas o puede ser un líquido, una mezcla de disolventes. 00:26:17
Entonces, según va pasando la muestra, se van separando los componentes de nuestra muestra. 00:26:25
Vale, pues así podemos separar los componentes de una muestra. 00:26:33
Bueno, pues vamos a volver a la presentación. 00:26:39
Vale, entonces eso es importante. 00:26:47
Es un mecanismo de separación de los componentes de una muestra. 00:26:50
Vale, entonces eso es importante. 00:26:57
Es un método de separación, la cromatografía, en la que tenemos una fase en reposo, que es la fase estacionaria, 00:27:00
y otra que se mueve a través de esta fase estacionaria, que es la fase móvil. 00:27:08
Y entonces las muestras, los componentes de la muestra, se separan porque van interaccionando con la fase estacionaria. 00:27:13
Vale, entonces... 00:27:26
Bueno, aquí esta es la gráfica que exponen aquí en el aula virtual, pero bueno, es lo mismo. 00:27:31
Se introduce la muestra, aquí en este caso la columna dice que está rellenada de material sólido. 00:27:38
Vale, y entonces el eluyente se llama a la mezcla de disolventes, que sería la fase móvil. 00:27:46
Se introduce la muestra, se introduce la fase móvil, y los componentes se van separando. 00:27:56
Entonces, el extracto crudo se aplica en la parte superior de la columna y va poco a poco entrando en la columna con la fase móvil. 00:28:04
Cada proteína migrará a distinta velocidad según su grado de afinidad por la fase estacionaria. 00:28:12
La fase móvil se hace pasar a la columna a través de una bomba peristática y un colector de fracciones 00:28:19
que va a ir recogiendo el eluyente que sale de la columna. 00:28:26
Vale, lo que sale de aquí se denomina eluyente. 00:28:30
Este colector hace que el tubo vaya cambiando cada cierto número de gotas o de volumen. 00:28:36
Vale, pues esta sería la idea de la cromatografía. 00:28:43
Ahora vamos a ver qué tipos de cromatografía tenemos. 00:28:46
Bueno, aquí os he puesto esta diapositiva simplemente para que veáis que hay dos tipos de cromatografía 00:28:49
que son, fijaros qué diferencia. 00:28:56
Esta sería la cromatografía en capa fina, que es simplemente una cubeta de vidrio y una placa. 00:28:59
Esta sería la fase estacionaria. 00:29:07
Luego lo vamos a ver con detalle. 00:29:09
Y fijaros este otro tipo de cromatografía. 00:29:12
Este es un cromatógrafo HPLC. 00:29:15
Bueno, pues simplemente esta diapositiva os la he puesto para que veáis las diferencias. 00:29:17
Las dos son cromatografías, pero las diferencias son considerables. 00:29:22
Entonces vamos a ver los tipos de cromatografía. 00:29:29
Bueno, esto también os lo he puesto. 00:29:32
No lo tenéis en los apuntes, pero solamente os lo he puesto para que veáis. 00:29:34
Lo mismo que tenemos cromatografía en capa fina. 00:29:38
Y en la cromatografía en capa fina la fase móvil asciende. 00:29:41
Y luego la cromatografía en columna la fase móvil desciende. 00:29:46
Va desde arriba, la fase móvil va cayendo. 00:29:51
Y el soporte que se utiliza es una columna. 00:29:55
Y aquí en cambio el soporte es esta cubeta de vidrio y es un soporte plano. 00:29:58
Bueno, pues vamos a ver ahora primero tres tipos de cromatografía en columna. 00:30:04
Entonces tenemos, bueno, según el mecanismo físico-químico por el que se produce la separación de los analitos 00:30:09
tenemos la cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad. 00:30:18
Estas tres serían cromatografía en columna. 00:30:26
Y luego tendríamos la cromatografía en capa fina. 00:30:30
Esta es cromatografía en capa fina y aquí cromatografía en columna. 00:30:34
Serían estas tres, filtración en gel, intercambio iónico y cromatografía de afinidad. 00:30:39
Bueno, pues vamos a ver cada una de... 00:30:46
Las tres primeras, perdone, las tres primeras cromatografías son en columna. 00:30:49
Sí. 00:30:54
¿Verdad? 00:30:55
Sí. 00:30:56
Ok, vale. 00:30:57
La cromatografía en columna. 00:30:58
Entonces, vamos a ver primero la cromatografía de filtración en gel. 00:31:00
También hay veces que se denomina de exclusión molecular. 00:31:05
No sé si en la presentación igual encontráis que alguna vez he puesto exclusión molecular, ¿vale? 00:31:10
Pero es lo mismo, filtración en gel o exclusión molecular. 00:31:17
Bueno, pues en esta cromatografía lo que vamos a tener es una fase estacionaria 00:31:21
que serían estas bolas de aquí de color amarillo. 00:31:29
Esta sería la fase estacionaria. 00:31:32
Y la fase estacionaria está formada por polímeros. 00:31:35
Esto sería un polímero, ¿vale? 00:31:39
Que tiene unas oquedades, unos huecos. 00:31:42
Si os fijáis aquí, esto de aquí blanco, ¿vale? 00:31:45
Los polímeros son así como bolas esféricas que tienen unos huecos y que son porosos. 00:31:48
Y entonces, las moléculas más pequeñas se van a ir quedando retenidas en esos huecos. 00:31:56
Nuestra muestra va a ser esta, la que tiene estos puntos rojos y estos puntos amarillos. 00:32:05
Vamos a pasar nuestra muestra con la fase móvil 00:32:11
y los componentes más pequeños de masa molecular de nuestra muestra 00:32:14
se van a ir quedando retenidos en esos huecos, en esos poros de nuestra fase estacionaria. 00:32:21
Y en cambio, las moléculas más grandes, las rojas, van a pasar primero, ¿vale? 00:32:28
Se dice van a eluir primero, eluir. 00:32:33
Entonces, os leo lo que pone aquí, que es lo que os he dicho yo. 00:32:38
Las moléculas pequeñas penetran en los pequeños conductos que presentan las bolas de gel, 00:32:44
donde la velocidad de flujo de disolvente es menor. 00:32:50
Las moléculas grandes, incapaces de penetrar en los pequeños conductos de las bolas de gel, 00:32:54
se mueven entre ellas, donde la velocidad de flujo de disolvente es superior. 00:32:59
Como consecuencia, las moléculas de mayor masa molecular son eluidas, ¿vale? 00:33:05
Eluir antes que las de menor peso molecular. 00:33:11
Entonces, esta técnica de cromatografía de filtración de gel 00:33:15
nos sirve para separar moléculas en función de su masa molecular. 00:33:21
Entonces, una de las aplicaciones sería esa, sería la determinación de masas moleculares. 00:33:28
Y otra de las aplicaciones sería purificar las proteínas. 00:33:36
Si tenemos una proteína que está impurificada con algún tipo de sal, 00:33:42
con algún compuesto de tamaño más pequeño, 00:33:48
los compuestos de tamaño más pequeño se van a quedar retenidos en los poros 00:33:53
y, en cambio, las proteínas van a salir primero porque son de mayor masa molecular. 00:33:59
Entonces, nos sirve eso para determinar masas moleculares o para purificar proteínas. 00:34:07
Vamos a ver este vídeo. 00:34:15
¿Vale? Esto sería la columna, la columna que tiene estos, esto de aquí, 00:34:23
serían las esferas de polímero, la fase estacionaria sería. 00:34:53
Y veis que tiene por aquí unos huecos, pues ahora vamos a ver como en estos huecos 00:35:01
se nos van a ir quedando las partículas más pequeñas. 00:35:06
¿Veis? 00:35:16
Y, en cambio, las más grandes salen, eluyen primero. 00:35:18
Las partículas se van quedando en los huecos y salen otra vez. 00:35:22
Se introducen en los huecos y salen. 00:35:28
Eso hace que vayan más despacio y, por lo tanto, podemos separar. 00:35:30
Salen primero las moléculas de mayor tamaño y, al final, van saliendo las moléculas de menor tamaño. 00:35:35
Eso sería la filtración en gel. 00:35:43
O exclusión molecular. 00:35:56
Y aquí en los apuntes tenéis, en una página, la página de Biomodel. 00:35:59
¿Vale? 00:36:13
Vale, aquí tenéis en esta página de Biomodel, que ya lo hemos visto otras veces, 00:36:14
desde la Universidad de Alcalá de Henares han hecho esta simulación. 00:36:43
Y, bueno, nos cuentan lo mismo, ¿no? 00:36:49
El principio de la separación es el siguiente. 00:36:51
El material que llena la columna, que es la fase estacionaria, es un gel o una resina. 00:36:53
Está formado por partículas con poros de un cierto intervalo de tamaños. 00:36:59
Las moléculas mayores que los poros no pueden entrar en ellos, por lo que pasan de largo, 00:37:05
y avanzan por la columna, eluyen con mayor rapidez que las de tamaño menor, 00:37:11
que pueden entrar en los poros y así realizan un recorrido mayor, 00:37:17
progresando más lentamente a lo largo de la columna. 00:37:22
En una cromatografía en columna lo habitual es recoger fracciones del líquido que sale o eluye 00:37:26
para analizarlas individualmente y así trazar el perfil de elución de la cromatografía. 00:37:32
Bueno, pues vamos a ver cómo lo ponen aquí. 00:37:40
Ahí estaríamos introduciendo la muestra. 00:37:48
La muestra va pasando y aquí tenemos, pues, estas serían moléculas pequeñas 00:37:54
que se han quedado dentro de los poros. 00:38:01
A ver si lo pongo más grande. 00:38:04
Y las moléculas más grandes, pues, pasan primero, eluyen primero. 00:38:10
¿Veis esto? Aquí esta sería la columna, la fase estacionaria, 00:38:18
y cómo vamos a ir recogiendo las distintas muestras dependiendo de la masa molecular. 00:38:22
Entonces tenemos, bueno, aquí lo que nos sale solo es la concentración y el número de moléculas. 00:38:29
Pues hay una molécula con esta concentración, y así nos saldría este perfil. 00:38:36
Bueno, este es el perfil de la molécula. 00:38:43
Y aquí tenemos, pues, el número de moléculas. 00:38:46
Bueno, esta se ha entendido. 00:38:49
Bueno, pues vamos a ver qué tal está la presentación. 00:38:59
¿Veis? 00:39:02
¿Veis? 00:39:03
¿Veis? 00:39:04
¿Veis? 00:39:05
¿Veis? 00:39:06
¿Veis? 00:39:07
¿Veis? 00:39:08
¿Veis? 00:39:09
¿Veis? 00:39:10
¿Veis? 00:39:11
¿Veis? 00:39:12
¿Veis? 00:39:13
¿Veis? 00:39:14
¿Veis? 00:39:15
¿Veis? 00:39:16
¿Veis? 00:39:17
Sí. 00:39:19
Sí, es fácil, ¿no? 00:39:20
Ahí está. 00:39:21
Vale. 00:39:31
Pues ahora la siguiente que vamos a ver es la cromatografía de intercambio iónico. 00:39:32
En esta cromatografía la separación de las muestras va a ser según la carga neta de las proteínas. 00:39:39
Bueno, aquí he supuesto esto que sería una columna. 00:39:50
Esto lo tenéis en el aula virtual, en el documento. 00:39:53
Entonces, vamos a separar las proteínas según su carga. 00:39:57
¿Y cómo podemos modificar la carga de una proteína? 00:40:01
¿Os acordáis que veíamos que las proteínas, dependiendo del pH, tenían carga positiva o negativa? 00:40:05
Y que luego también había un valor de pH en el que las proteínas tenían carga cero. 00:40:13
¿Os acordáis que se llamaba el punto isoeléctrico? 00:40:19
Bueno, pues si disolvemos a nuestra proteína en una disolución tampón de pH inferior al punto isoeléctrico, 00:40:22
esa proteína va a estar cargada positivamente. 00:40:34
Y si disolviéramos a la proteína a un pH mayor que el punto isoeléctrico, pues esa proteína estaría cargada negativamente. 00:40:39
Entonces, nosotros en esta cromatografía vamos a tener una fase estacionaria que sería esto de aquí, gris. 00:40:50
Que está cargada positivamente. Esto sería la fase estacionaria. 00:41:01
Y esto de aquí, los puntos rojos que están cargados negativamente y los puntos grises que están cargados positivamente serían nuestras proteínas. 00:41:07
Entonces, las proteínas que tengan carga negativa, las rojas, se van a quedar adheridas a nuestra fase estacionaria. 00:41:19
Y en cambio, las proteínas que tengan carga positiva van a salir de la columna, van a eluir primero. 00:41:29
Esto es cromatografía de intercambio iónico. 00:41:37
Entonces, las partículas cargadas negativamente se unen a la matriz sólida cargada positivamente y son retenidas. 00:41:42
Y las partículas cargadas positivamente son rechazadas por la matriz sólida cargada positivamente y son eluidas. 00:41:52
La elución de las partículas cargadas negativamente, vale, esto lo vamos a leer y ahora os lo explico. 00:42:01
La elución de las partículas cargadas negativamente se consigue cambiando el pH del disolvente hasta igualarlo a su punto isoeléctrico o hasta invertir su carga positiva. 00:42:09
Es decir, su carga neta. 00:42:21
Bueno, vamos a ver qué significa este párrafo. 00:42:23
Nosotros hemos introducido nuestra muestra que tiene proteínas con carga negativa y positiva. 00:42:27
Pasamos nuestra muestra, nuestras proteínas y salen todas las proteínas positivas, eluyen todas las que tienen carga positiva. 00:42:35
Las proteínas negativas, las de color rojo, se quedan ahí adheridas a nuestra fase estacionaria. 00:42:47
Pero claro, nosotros esta columna la vamos a querer utilizar más tarde para otro experimento. 00:42:53
Entonces, ¿cómo hacemos que estas proteínas que están aquí cargadas negativamente, 00:43:00
cómo hacemos que estas proteínas eluyan, cómo hacemos que estas proteínas salgan de la columna y se nos quede la fase estacionaria limpia? 00:43:07
Lo que hacemos es introducir una disolución, tampón, de un pH diferente. 00:43:15
Hacemos que nuestras proteínas que tienen carga negativa al cambiar el pH cambien a carga positiva 00:43:21
y entonces se van a separar de la fase estacionaria y van a eluir, van a salir. 00:43:29
No sé, ¿entendéis esto? 00:43:36
Quizás es un poco complicado. 00:43:38
Yo me quedé un poco perdida en la parte cuando usted estaba hablando de cómo cambiamos lo de la carga, 00:43:41
de que ahí al pH aumentamos el punto isoeléctrico, en esa parte que anteriormente a eso me quedé perdida. 00:43:47
Entonces, lo que pasa es que usted continuó y no la quise interrumpir. 00:43:57
Vale, pero ¿os acordáis cuando vimos las proteínas? 00:44:04
¿Os acordáis que las proteínas tenían un pH en el cual tenían carga neta cero? 00:44:08
¿Os acordáis? 00:44:14
Y entonces, si el pH es menor que ese punto isoeléctrico donde la carga neta es cero, 00:44:16
las proteínas se cargan positivamente. 00:44:24
Y si el pH es mayor que ese punto isoeléctrico, las proteínas se cargan negativamente. 00:44:27
A ver si tengo la presentación. 00:44:37
Bueno, quedaros con eso, que dependiendo del pH, si os miráis la primera parte de la presentación de proteínas, 00:44:42
la del primer día, la parte 1, ahí veréis que las proteínas, dependiendo del pH, 00:44:54
si a pH más bajo que el punto isoeléctrico, las proteínas se van a cargar positivamente. 00:45:00
Y a pH mayor que el punto isoeléctrico, las proteínas se van a cargar negativamente. 00:45:08
Entonces, si nosotros tenemos aquí, hemos pasado la muestra y han salido ya las proteínas con carga positiva. 00:45:15
Imaginaos que aquí ya no tenemos proteínas con carga positiva. 00:45:23
Solo nos quedan las proteínas con carga negativa que están adheridas a la fase estacionaria. 00:45:27
¿Cómo separamos estas proteínas que tienen carga negativa? 00:45:33
Pues lo que hacemos es cambiar el pH. 00:45:37
Y si cambiamos el pH, estas proteínas van a cambiar a carga positiva. 00:45:40
Y entonces ya no van a interaccionar con la fase estacionaria y van a eluir. 00:45:47
Si acaso en la presentación, el próximo día os meto aquí lo que es lo del punto isoeléctrico y así lo vais a entender mejor. 00:45:55
Vale, pues esta sería la cromatografía de intercambio iónico. 00:46:07
La fase estacionaria está formada por polímeros que pueden ser sintéticos o naturales. 00:46:14
Y esta fase estacionaria, dependiendo si la carga de la fase estacionaria es positiva o negativa, 00:46:19
se llama cromatografía de intercambio aniónico, cuando la fase estacionaria tiene carga positiva. 00:46:26
Y cromatografía de intercambio catiónico, cuando la fase estacionaria tiene carga negativa. 00:46:34
Bien, pues lo que os digo, ya el próximo día pongo aquí lo del punto isoeléctrico. 00:46:43
Y yo creo, de todas formas, mirároslo. 00:46:48
Y yo creo que el próximo día ya lo vais a entender mejor. 00:46:51
Y ya nos quedaría, bueno, aquí os he puesto lo del punto isoeléctrico. 00:46:56
A pH mayor que el punto isoeléctrico, la proteína tiene carga negativa. 00:47:02
Y a pH menor que el punto isoeléctrico, la proteína tiene carga positiva. 00:47:07
Las proteínas tienen carga positiva. 00:47:12
Entonces, si modificamos el pH de nuestra disolución, pues vamos a hacer que las proteínas tengan una carga u otra. 00:47:14
Aquí os he puesto este vídeo para ver un poquito, porque es un poco complicado, pero para ver un poquito esto. 00:47:24
Está en inglés. 00:47:38
Vale, vamos a ver a partir del minuto 3. 00:47:53
Bueno, aquí nos habla de los aminoácidos. 00:48:08
Veis que los aminoácidos, lo mismo, la carga puede ser positiva o negativa. 00:48:12
Este sería el punto isoeléctrico, donde tenemos el mismo número de cargas positivas que negativas. 00:48:18
A pH por debajo del punto isoeléctrico, la proteína o el aminoácido tienen carga positiva. 00:48:23
Y a pH por encima tienen carga negativa. 00:48:29
Entonces, aquí lo que nos cuentan es que tenemos tres proteínas, cuyo punto isoeléctrico, el punto isoeléctrico ponen pHI. 00:48:32
Entonces, el punto isoeléctrico en esta proteína, el punto isoeléctrico es 3. 00:48:41
Esta proteína es 7 y esta proteína, el punto isoeléctrico es 9. 00:48:45
Y tenemos una disolución, tampón, que se llama buffer también en inglés. 00:48:49
Una disolución tampón es una disolución que no se modifica. 00:48:54
Una disolución tampón es una disolución que no se modifica su pH aunque añadamos ácidos o bases. 00:48:58
Entonces, estas proteínas las tenemos disueltas en una disolución de pH 5. 00:49:05
Bueno, pues la proteína esta que tiene un punto isoeléctrico menor que el pH, pues tendrá carga negativa. 00:49:11
Esta también, el punto isoeléctrico es mayor que el pH, tiene carga positiva. 00:49:26
Y esta también tiene carga positiva. 00:49:33
Entonces, esta sería la fase móvil con nuestra muestra y esta sería la columna. 00:49:36
Esta sería la fase estacionaria. 00:49:42
Y, bueno, aquí es un poquito jaleo la fase estacionaria. 00:49:45
Quedaros con estas bolas de color azul, o sea, la fase estacionaria sería positiva. 00:49:48
Y por aquí van pasando nuestras proteínas, por las que tenían carga... 00:49:53
No, perdón, quedaros con que la fase estacionaria es negativa. 00:50:00
Quedaros con que la fase estacionaria es negativa. 00:50:07
Y entonces, las proteínas con carga positiva se van a quedar adheridas a la fase estacionaria. 00:50:10
Y las proteínas con carga positiva van a eluir primero. 00:50:17
Esta tiene carga positiva, pues eluye primero. 00:50:21
A ver, creo que lo he dicho al revés. 00:50:30
La fase estacionaria tiene carga negativa y entonces las proteínas con carga positiva se van a quedar adheridas. 00:50:33
Y las proteínas con carga negativa van a salir las primeras. 00:50:41
Vale, entonces este vídeo es un poco complicado, pero simplemente para que vierais eso. 00:50:46
Vale, entonces esta cromatografía de intercambio iónico se utiliza para separar compuestos pequeños, 00:51:00
como mezclas de aminoácidos, pequeños péptidos, para oligonucleótidos, 00:51:06
o para eliminar también impurezas de reactivos o cationes metálicos de disoluciones tampón y de disolventes. 00:51:12
Entonces la cromatografía de intercambio iónico sirve para separar compuestos pequeños. 00:51:21
Y por último vamos a ver la cromatografía de afinidad. 00:51:30
En la cromatografía de afinidad tenemos una fase estacionaria que tiene una sustancia que se denomina ligando 00:51:35
y con esta sustancia la proteína va a interaccionar. 00:51:45
Entonces aquí la fase estacionaria está dibujada en amarillo y vamos a añadir una mezcla de proteínas 00:51:49
que serían estos puntos azules, los verdes y los rojos. 00:51:58
Pues solamente hay una serie de proteínas que interaccionan con esta fase estacionaria. 00:52:02
Entonces esta cromatografía, este tipo de cromatografía es muy específica. 00:52:09
¿Por qué? Porque ¿os acordáis cuando vimos las enzimas que reaccionaban solo con un tipo de sustrato? 00:52:17
Pues entonces aquí lo que podemos tener es una serie de enzimas 00:52:25
y aquí le podemos estar añadiendo varios sustratos 00:52:33
y podemos estar viendo que solamente hay un tipo de sustrato que va a reaccionar con esa enzima. 00:52:36
Entonces la cromatografía de afinidad tenemos una sustancia que se llama ligando en la fase estacionaria 00:52:43
y añadiríamos nuestra mezcla. 00:52:59
Pues solamente hay una serie de proteínas que reaccionan específicamente con esa fase estacionaria. 00:53:02
Entonces para luego, como antes, para dejar la columna limpia y que se pueda volver a utilizar otra vez 00:53:14
lo que se hace es pasar una disolución rica en un compuesto que también sea afín a ese ligando 00:53:22
y así desplaza a la proteína que se nos había quedado ahí unida. 00:53:29
De este modo se expulsa la proteína de interés de la fase estacionaria que saldrá por el fondo de la columna 00:53:34
más tarde que el resto de proteínas que formaban la mezcla inicial. 00:53:40
Entonces este tipo de cromatografía es de gran especificidad 00:53:44
y podemos detectar reacciones, como os decía, enzima-sustrato 00:53:49
también podemos detectar reacciones hormona-receptor o antígeno-anticuerpo. 00:53:54
Esto de antígeno y anticuerpo ya veremos más adelante lo que es. 00:54:00
Entonces es una cromatografía muy específica. 00:54:05
Vale, pues vamos a ver. En la página esta de Biomodel también viene la cromatografía de afinidad. 00:54:10
Esta resina de afinidad solo interaccionará con moléculas, en este caso circulares. 00:54:32
Estamos metiendo ahí nuestra disolución. 00:54:41
Entonces el principio de la separación es la interacción específica entre moléculas 00:54:47
de uno de los componentes de la muestra y moléculas unidas al soporte. 00:54:53
La fase estacionaria es un gel o resina de afinidad que rellena la columna. 00:54:58
Esta especificidad o afinidad procede de una complementariedad a escala molecular 00:55:07
en la que participan fuerzas de enlace débiles del tipo Van der Waals, 00:55:12
enlaces de hidrógeno, hidrofobicidad, interacciones iónicas. 00:55:16
Ejemplos clásicos son las interacciones encima-sustrato o antígeno-anticuerpo o ligando-receptor. 00:55:21
En el ejemplo mostrado en la película esto se simboliza con la forma circular o no de las moléculas 00:55:30
y de los huecos existentes en la resina. 00:55:36
Las moléculas que han quedado retenidas en la columna debido a su afinidad por la fase estacionaria 00:55:39
se liberan mediante un cambio del medio, el huyente, a condiciones en las que la interacción se debilite. 00:55:46
Generalmente se cambia el pH, lo que afecta al estado de ionización de las biomoléculas 00:55:53
o se modifica la fuerza iónica mediante concentración de sales. 00:55:59
Se carga la muestra que tendrá todas estas partículas y solamente las que tienen forma redonda en este caso 00:56:16
son las que van a quedar unidas a la fase estacionaria. 00:56:36
Entonces va saliendo el resto de partículas y al final salen las circulares. 00:56:42
Aquí ya salen las circulares. 00:56:59
Entonces, cromatografía en columna, tres tipos. 00:57:12
Filtración en gel, lo que hacemos es separar nuestras proteínas en función de su masa molecular. 00:57:24
Tenemos un gel que tiene poros, es un polímero que tiene una serie de poros. 00:57:31
Las moléculas de menor tamaño se van a introducir en esos poros y van a salir las últimas, van a eluir las últimas. 00:57:38
Después tenemos la cromatografía de intercambio iónico. 00:57:48
En esta lo que tenemos la fase estacionaria puede estar cargada o positivamente o negativamente. 00:57:52
Si la fase estacionaria está cargada positivamente, cuando nosotros introduzcamos nuestra mezcla de proteínas 00:57:59
las proteínas con carga negativa se van a quedar adheridas a la fase estacionaria. 00:58:07
En la fase estacionaria positiva las proteínas con carga negativa se quedan adheridas. 00:58:14
Y por último tenemos la cromatografía de afinidad. 00:58:20
La cromatografía de afinidad nos basamos en una reacción que es una reacción específica. 00:58:24
Una reacción, por ejemplo, enzima-sustrato. 00:58:30
¿Os acordáis que vimos que las enzimas solamente interaccionaban con un tipo de sustratos? 00:58:33
O una reacción antígeno-anticuerpo. 00:58:38
Es una reacción muy específica y el resto de proteínas se van a eluir primero, van a salir primero. 00:58:41
Pues estas serían las tres cromatografías en columna. 00:58:49
Y luego quería comentaros también la cromatografía en capa fina. 00:58:52
Pero igual esta la dejamos. Bueno, son menos 25, vamos a verla un poquito. 00:58:59
Bueno, aquí en el aula virtual también nos cuentan cómo estos procesos están ya muy automatizados 00:59:03
y ahora se utilizan cromatógrafos HPLC, que por sus siglas en inglés es 00:59:12
cromatografía líquida de alta eficacia. 00:59:19
High Performance Liquid Chromatography. 00:59:22
Y aquí ya se utilizan bombas de alta presión, columnas con materiales muy específicos 00:59:28
que soportan altas presiones. 00:59:34
Y se utilizan este tipo de sistemas para aumentar la velocidad de la cromatografía. 00:59:37
Bueno, aquí tenéis una autoevaluación y luego esta sería la cromatografía en capa fina 00:59:50
Está no bien explicada en los apuntes, pero sí que quería que la vierais un poco. 00:59:56
En la cromatografía en capa fina, lo que os decía antes, la fase móvil, que es una mezcla de disolventes 01:00:03
se pone aquí, esto es una cubeta de cristal, pues se pone en la parte inferior de la columna. 01:00:09
Y esto de aquí sería la fase estacionaria. 01:00:16
La fase estacionaria es un sólido, es una placa de gel de sílice. 01:00:19
Y esta placa de gel de sílice es polar. 01:00:25
Entonces lo que se hace es que la fase móvil va ascendiendo por capilaridad a través de la fase estacionaria. 01:00:29
Y entonces nosotros, se dice pinchar, pondríamos aquí una gota de nuestra muestra 01:00:40
y dejamos que la fase móvil vaya ascendiendo a través de la fase estacionaria. 01:00:47
Pues, por diferencias de polaridad de nuestra muestra, se van a ir separando los componentes de nuestra muestra. 01:00:53
Los más polares van a quedar en la parte inferior y los más apolares van a quedar en la parte superior. 01:01:02
El próximo día ya os lo explico con más detalle. 01:01:10
Voy a detener la grabación ahora. 01:01:18
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Fecha:
5 de diciembre de 2023 - 19:23
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Centro:
IES VIRGEN DE LA PALOMA
Duración:
1h′ 01′ 24″
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