Técnicas de Separación. Electroforesis | Mediateca de EducaMadrid

Vale, ya estoy grabando, así que ya sabéis que ya sale foto, sale voz y sale todo. 00:00:00

Este tema es un poquito más cortito por lo que os decía, que dentro de las técnicas de separación 00:00:06

sí están repartidas entre los módulos de instrumental y de biotecnología un poco 00:00:11

y instrumental se queda un poco más con la parte de cromatografía HPLC o cromatografía de gases 00:00:16

y biotecnología se queda más con la cromatografía de capa fina, con la cromatografía en placa, 00:00:21

la cromatografía en papel y la electroforesis, que sigue siendo otra técnica de separación. 00:00:27

Pero bueno, como son técnicas de separación y las estamos viendo y como cada uno vais a un ritmo 00:00:33

y tenéis unos módulos y otros no, pues aunque al final, si queréis titular, 00:00:37

biotecnología va a caer en un año o en otro, pero bueno, en instrumental también lo tenemos puesto un poquito. 00:00:41

Pero es un tema que es bastante corto respecto a los anteriores. 00:00:48

La electroforesis al final sigue siendo una técnica que al final sí se usa en muchos laboratorios, 00:00:52

sobre todo los que más han dedicado a la biotecnología porque sí estamos orientados a separarle el ADN, el ARN, moléculas, proteínas. 00:00:58

Las proteínas por ejemplo en función de su tamaño se separan muy bien por electroforesis y también en función de la carga eléctrica. 00:01:08

Entonces por eso esa parte se queda un poquito más con biotecnología. 00:01:17

Pero bueno, vamos a empezar un poquillo con la parte del fundamento de la técnica y ya vamos viendo un poco los diferentes tipos que hay y todo lo que se puede utilizar. 00:01:22

Entonces, si es verdad que casi todas las moléculas al final van a tener una carga eléctrica y la magnitud va a depender del pH y del medio en el que se encuentran. 00:01:35

Esto nos va a permitir hacer las separaciones y distinguir las diferentes moléculas para poder separarlas, identificarlas y cuantificarlas. 00:01:47

Entonces, como tienen diferente carga en función del pH que nosotros tengamos, se van a desplazar cuando nosotros las vamos a someter a un campo eléctrico. 00:01:56

Nosotros lo ponemos en medio de un campo eléctrico, como hacíamos con las muestras en pH y en conductividad, 00:02:05

que nosotros utilizamos un compás eléctrico para poder hacer esa identificación, para obtener la información. 00:02:11

Aquí lo que vamos a hacer es una separación por la diferente movilidad que tienen en el campo eléctrico en el que se encuentran. 00:02:17

Y eso va a depender de la carga que tengan, del tamaño y del pH del medio en el que se encuentran. 00:02:23

Entonces una partícula normalmente cuando está cargada, creo que la mayoría de las biomoléculas tienen carga, pues las moléculas que están cargadas están en una región donde hay un campo eléctrico y aquí van a experimentar una fuerza que va a ser igual al producto de su carga por la intensidad del campo eléctrico. 00:02:27

Esta sería la fórmula en la que se basa la electroforesis. Igual que en las técnicas ópticas tenemos la ley de Lambert-Bier, pues aquí tendríamos esta fórmula. 00:02:49

Bueno, yo lo que decía que hemos quedado en que la electroforesis al final va a ser el proceso en el que se separan los elementos de un compuesto por medio de la electricidad. 00:03:02

Hago referencia a biotecnología porque creo que ya la habéis terminado de ver. 00:03:15

Lo que hacemos al final es aplicar una corriente eléctrica mediante un par de electrodos que están conectados a una fuente de alimentación eléctrica y están sumergidos en una disolución. 00:03:20

El electrodo que está conectado al polipositivo lo llamamos ánodo. 00:03:32

Y el electrodo que está conectado al polo negativo se le llama cátodo. 00:03:37

Esto también lo hemos visto en la parte de pH, potencial y todo eso. 00:03:41

Que yo en su tiempo os dije que ahí no os liarais con eso. 00:03:45

Ahora, igual si nos sirve, necesitamos saber quién es el cátodo, quién es el ánodo, quién es positivo y quién es negativo. 00:03:49

Para ver el desplazamiento de las proteínas. 00:03:56

proteínas. Entonces, el polo positivo es el ánodo, el polo negativo es el cátodo. 00:03:58

Ahora, cada uno de estos dos electrodos, sean ánodo o cátodo, van a atraer a los iones 00:04:04

de la carga opuesta. Por lo tanto, el ánodo, que hemos dicho que es el polo positivo, va 00:04:09

a atraer a los negativos, que son los aniones. Al final, más que llevan el nombre del polo 00:04:15

que son, llevan el nombre de lo que atraen. Entonces, los aniones, que son negativos, 00:04:20

o los iones negativos 00:04:27

los aniones o iones negativos 00:04:28

son atraídos hacia el ánodo 00:04:30

que es el polo positivo 00:04:32

mientras que los iones positivos 00:04:33

o cationes 00:04:35

son atraídos hacia el cátodo 00:04:36

que era el electrodo negativo 00:04:38

es decir, cargas opuestas van 00:04:40

en la parte que hacíamos de separación 00:04:42

bueno, no lo digo por hacer lo del HPLF 00:04:45

que es lo último que hicimos 00:04:48

pero con cualquier disolución que hayáis tenido 00:04:49

cualquier separación que hayáis visto 00:04:52

en muestreo también lo tenéis 00:04:53

que lo polar va con lo polar 00:04:55

y lo apolar con lo apolar, ahí teníamos igualdad como de condiciones, aquí cuando 00:04:56

hablamos de cargas va al revés, lo positivo atrae a lo negativo y lo negativo atrae a 00:05:01

lo positivo. Entonces bueno, por lo positivo y por lo negativo cada uno atrae al contrario. 00:05:05

Además de la carga eléctrica esta que tengamos, el movimiento de las moléculas también va 00:05:12

a estar influido por otras dos fuerzas que son extras que no teníamos en cuenta hasta 00:05:16

ahora, que sería la fricción con el solvente, esta fricción sería como una especie de 00:05:21

rozamiento y lo que va a hacer es dificultar el movimiento, va a frenar el desplazamiento 00:05:27

de estas moléculas que están yendo hacia el electrodo y al hacer una repulsión o al 00:05:33

ir frenando se va a originar una fuerza que es opuesta. Entonces la fricción, eso sería 00:05:39

que es la fuerza de rozamiento, la fuerza de frenado, que va en sentido opuesto al desplazamiento. 00:05:45

Y luego, por otro lado, las moléculas también tienen que moverse de una forma aleatoria, ¿vale? 00:05:52

Por la energía cinética que tienen. 00:05:57

Entonces, bueno, este movimiento es el que se denomina difusión. 00:05:59

Ahora, ¿cómo favorecemos uno u otro o hacia dónde van o quién tira más, quién tira menos? 00:06:03

Bueno, pues, por ejemplo, la energía cinética, que es la de la difusión, 00:06:09

Aquí la podemos aumentar con la temperatura 00:06:13

Por ejemplo, la mayor temperatura tenemos mayor difusión 00:06:17

Y vamos a facilitar el desplazamiento hacia el polo que nosotros queremos 00:06:21

Si enfriamos, disminuye esta difusión 00:06:26

Y no es que aumente la fricción 00:06:29

Pero bueno, como la difusión disminuye 00:06:31

Pues va teniendo más peso la fricción que la difusión 00:06:35

Y parece que cuesta más que se muevan 00:06:37

Cuesta más este desaplazamiento 00:06:40

El que existan estas dos fuerzas es lo que nosotros vamos a aprovechar para obtener toda la información que necesitamos 00:06:42

Lo que aprovechamos nosotros para el análisis 00:06:50

Ya que la suma de estas dos fuerzas va a provocar que las moléculas no emigren de una manera homogénea 00:06:52

Decíamos que en función de la situación en la que tenemos, de la muestra que tengamos, de la carga que tenga 00:07:00

Pues tira para un lado o para otro, más o menos 00:07:05

Entonces no va a ser de la misma manera y eso es lo que nosotros vamos a utilizar para hacer la separación. 00:07:08

Nosotros podemos ir regulando el movimiento de las moléculas según nos interese a nosotros y ahí vamos a ir pudiendo separar las moléculas. 00:07:14

Por eso lo vamos a utilizar la electroforesis como una técnica de separación. 00:07:23

Antes toda esta parte de las propiedades eléctricas lo utilizábamos para las propiedades físicas, pH, conductividad 00:07:27

y ahora vamos a utilizar estas propiedades eléctricas para separar a las diferentes moléculas que hay en una muestra. 00:07:34

Como siempre, bueno que no lo he dicho, pero igual que en HPLC, al ser una técnica de separación, 00:07:41

para separar tiene que haber más de una cosa, que sean interferentes, lo que sea, 00:07:46

que nosotros pongamos una sustancia que supuestamente es pura, pues para, como decíamos aquí con la cafeína, 00:07:50

pues para verificar que es pura, solamente tiene que verse un pico, pues aquí tendríamos un desplazamiento 00:07:54

y todo iría a la misma velocidad y para el mismo sitio. 00:08:00

Vale, entonces eso, nosotros regulamos el movimiento de las moléculas en función de lo que nos convenga según la información que vayamos a obtener. 00:08:04

Una forma muy común de hacer este movimiento sería utilizar un soporte de gel, que es el que hicisteis vosotros en betonología. 00:08:13

¿Qué va a ser el gel? 00:08:22

Pues el gel es un polímero que es soluble de un alto pase molecular que va a atrapar las moléculas de agua y va a actuar como si fuera un tamiz. 00:08:23

Ese tamiz lo que va a hacer es dificultar el movimiento de los diferentes solutos que lo atraviesan y por eso la migración de las moléculas va a ser más lenta. 00:08:35

En función de los huequecitos que deje este gel, nosotros vamos a ir viendo cómo se van colando las moléculas, van avanzando más o menos. Cuanto más pequeño sea el poro, más cuesta pasar, entonces se van a quedar más retenidas. 00:08:44

En la parte de HPLC, cuando hablábamos de la columna y hablábamos de la exclusión molecular, decíamos que las moléculas que eran más grandes pasaban primero porque no se iban metiendo por los poros del gel o por el poro de la partícula. 00:08:59

En cromatografía de columna no sería gel como aquí, pero que no iba pasando por los poros de la columna o por el diámetro de la partícula, sino que iba buscando los huecos que había entre las diferentes partículas que hay. 00:09:15

Aquí es un gel que tiene que ser más homogéneo y si tenemos esos poros. Por lo tanto, cuanto más pequeño sea el poro, más tarda la molécula en pasar. Las moléculas más grandes, en principio, según lo que está diciendo el fundamento teórico, las moléculas más grandes tendrían un desplazamiento más lento y les costaría más pasar, entonces se quedarían más atrás, se quedarían al final. 00:09:31

De forma general, para ver un poco del principio con cierta perspectiva, la separación de la electroforesis se va a basar en la diferente velocidad de migración de las moléculas con carga diferente dentro de un campo eléctrico. 00:09:53

vale lo que estábamos diciendo a ver cómo se va a mover cuando nosotros aplicamos este campo 00:10:09

eléctrico y también va a depender de la movilidad electroforetica de una partícula que va a depender 00:10:13

de su carga su masa el medio en el que tiene lugar la separación del campo eléctrico vale 00:10:19

la movilidad electroforetica sería este sube que tenemos aquí él es el campo eléctrico y 00:10:26

y la UV será la velocidad, entonces por eso tenemos esas dos dependientes. 00:10:34

Lo que digo, no sé si lo habéis visto en biotecnología, por eso digo que es a modo de recordatorio, 00:10:39

que más o menos sirva como recordatorio para los que lo habéis visto, 00:10:45

sino de introducción para los que no tengáis el módulo, 00:10:49

pero bueno, que ese sería el fundamento general, en lo que se basaría la electroforesis de forma general, 00:10:53

tengamos el gel que tengamos 00:11:00

y el campo eléctrico que tengamos 00:11:02

y luego las condiciones que pongamos 00:11:03

entonces sería la teoría general 00:11:06

de la electroforesis 00:11:08

y ahora sí vamos a ver un poco de particularidades 00:11:09

porque bueno claro 00:11:13

según lo que queramos conseguir 00:11:14

según la información que nos hayan pedido 00:11:16

pues tenemos que montar el equipo 00:11:18

tenemos que montar todo el montaje 00:11:20

y luego el material que debemos utilizar 00:11:23

de una forma diferente 00:11:24

o que es mismamente 00:11:26

las propiedades del gel son diferentes 00:11:28

¿vale? aunque el montaje sea el mismo 00:11:30

pero las propiedades que tengamos del gel 00:11:32

van a ser diferentes, igual que 00:11:34

en HPLC, si os acordáis 00:11:36

los que vinisteis, decíamos que teníamos 00:11:38

varios tipos de columnas, ¿vale? 00:11:40

y varios rellenos, pues 00:11:42

que yo escojo en cada uno en función 00:11:44

de lo que quiera separar, pues ahora pasaría 00:11:46

lo mismo, ¿vale? yo me planteo el material 00:11:48

los equipos, los instrumentos, ¿vale? 00:11:50

como queráis llamarlo, en función 00:11:52

del objetivo que yo tenga, es decir 00:11:54

yo primero tengo que saber qué es lo que quiero conseguir y luego ya pues yo voy 00:11:56

seleccionando las herramientas que yo tengo para poder conseguirlo entonces 00:12:02

nosotros vamos a diferenciar la electroforesis en dos vamos a hacer dos 00:12:06

tandas de electroforesis la electroforesis convencional o clásica y 00:12:11

la electroforesis capilar que sería más la parte instrumental vale la una sería 00:12:15

la clásica como análisis químico hemos separado un clásico instrumental pues 00:12:20

Tenemos la electroforesis convencional y la electroforesis capilar, que la capilar sería la que se denomina electroforesis instrumental o sea seleccionado o clasificado como una técnica instrumental. 00:12:24

La electroforesis clásica, pues más o menos es la que habréis visto en biotecnología. 00:12:37

Dentro de la electroforesis convencional, pues sí, vamos a hacer otra mini clasificación en función del soporte que vayamos a utilizar. 00:12:43

Es decir, en función de lo que utilicemos para que se desplacen las moléculas, ya que cada soporte tiene unas características especiales que le hacen más adecuados para un determinado uso. 00:12:52

En principio, ahí tenemos que ver si queremos hacer una separación analítica o una separación preparativa, y si son moléculas grandes o moléculas pequeñas. 00:13:04

Por ejemplo, en la parte de la separación analítica, nuestro objetivo sería la identificación y la caracterización física de los componentes de una muestra. 00:13:16

Y para una separación preparativa, en este caso queremos separar los componentes de una muestra. 00:13:29

Es decir, nosotros queremos obtener pequeñas cantidades de los diferentes componentes de una muestra y luego esos componentes ya los iremos utilizando para lo que sea, ¿vale? Para lo que utilicemos, porque si a lo mejor es para purificar, para añadir a algún sitio, para preconcentrar, pues no sé qué. 00:13:37

Bueno, nosotros separamos, tenemos los componentes separados y ya le damos el uso que queramos. 00:13:54

Para hacer la separación, pues sí podemos utilizar diferentes soportes, ¿no? 00:13:59

Pues, por ejemplo, sería el papel, ¿vale? 00:14:06

El papel es una técnica que es bastante sencilla, ¿vale? 00:14:08

Lo que pasa, como desventaja, sería que tiene una elevada absorción, ¿vale? 00:14:12

Debido a los grupos hidroxilo que tiene la celulosa, ¿vale? 00:14:18

Se hace en papel de celulosa. 00:14:21

este fue el primero por facilidad por sencillez por lo que queráis fue el de 00:14:23

las primeras electroforesis que se hizo pues se utilizaba en papel igual que en 00:14:28

cromatografía tenía la cromatografía de placa que es el gel de sílice donde 00:14:31

pone que es luego sale con la anidrina sale así el rosita y luego la 00:14:36

electroforesis de papel perdón la cromatografía de papel creo que coges 00:14:40

un papel hacéis un punto con un rotulador y lo ponéis mojado en agua y 00:14:44

y se ven los diferentes colores que forman ese color del rotulador, que sería lo más básico. 00:14:51

Entonces aquí el de papel fue de las primeras electroforesis, 00:14:57

pero sí es verdad que como se ha ido automatizando todo, se han ido mejorando, 00:15:00

la de papel casi no se usa. 00:15:04

En este caso las moléculas que son pequeñas, tipo aminoácidos, se separan en papel. 00:15:06

A lo mejor sería la excepción que tendríamos, porque como es un soporte muy fino, 00:15:12

Pues si no, va a dejar detectar con más facilidad las sustancias pequeñas o las pequeñas manchas que se hayan producido. 00:15:17

Otro tipo que tendríamos, sería en vez del papel, sería el acetato de celulosa. 00:15:26

Por ejemplo, que aquí sí tiene un bajo poder de absorción, a diferencia del papel. 00:15:31

También en agarosa. No sé si dijisteis el de agarosa o el de poliacrilamida. 00:15:36

Pero bueno, el agarosa es un polisacárido que viene de las algas, sería algo parecido al agar, que es de los medios de microbiología, el agar-agar. Aquí la preparación sería igual, tú lo disuelves en agua que esté caliente, no hace falta que hierva, a 50-60 grados y ahí nosotros disolvemos que quede homogéneo y al enfriar se va a solidificar formando un gel. Este gel tiene una elevada porosidad. 00:15:41

para que utilizamos los de agarosa pues por ejemplo para la separación de los ácidos nucleicos 00:16:07

porque los poros del gel va a hacer como también como un colador y va a permitir que las moléculas 00:16:12

que sean más pequeñas se muevan más rápido que las grandes que lo que decíamos a las grandes 00:16:20

les cuesta más no pueden pasar por él por los poros del gel las condiciones que pongamos de 00:16:25

campo eléctrico de velocidad de tiempo pues si las podemos ir ajustando las podemos ir poniendo 00:16:32

en función de lo que nosotros queramos, en función de la separación que queramos hacer 00:16:37

en un rango que nosotros tengamos que utilizar, que queramos. 00:16:41

Y el otro que también se utiliza, que en vez de ser un gel de agarosa, sería un gel de poliacrilamida. 00:16:46

El gel de poliacrilamida viene de la polidermalización química de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. 00:16:52

Por eso he preguntado, que no sé si hicisteis el de agarosa o el de poliacrilamida, 00:17:00

porque esta acrilamida hay una que es más tóxica, mutagénica, teratogénica, todo lo malo que queráis 00:17:04

y si hay como que desactivar esa peligrosidad, por eso que no sé cuál hicisteis, pero bueno, al final se hace un gel también 00:17:10

y en función de la concentración que tengamos de acrilamida y bisacrilamida, pues vamos a conseguir distintas porosidades del gel. 00:17:18

Entonces, este poro siempre va a ser más pequeño que el de agarosa, por eso que en función de lo que queramos separar 00:17:27

utilizamos el de agarosa o el de 00:17:33

poliacrilamida 00:17:35

al final el de poliacrilamida aunque tenga esa parte 00:17:36

de toxicidad que os digo que luego para 00:17:39

los residuos y todo pues si 00:17:41

hay que tomarlo como residuos peligrosos 00:17:43

pues al final es con lo que 00:17:45

con lo que mejor se van a 00:17:47

lograr las separaciones electroforeticas 00:17:49

el poro es muy pequeño 00:17:51

y tenemos una mejor separación 00:17:53

y bueno pues aquellas cosas que tengan 00:17:55

poro similar o que no 00:17:57

pudiera separarlos un gel de agarosa con el de 00:17:59

poliacrilamida si se consigue 00:18:01

Por ejemplo, pues las proteínas se pueden separar con un rango de un 5 a un 15%, ¿vale? Entonces, cuanto menos porcentaje, mayor tamaño de poro vamos a conseguir y esto, bueno, pues para proteínas de gran tamaño, pues tendríamos que ir variando este porcentaje. 00:18:03

Pero bueno, que tampoco, como van a depender de la separación que queráis hacer y del procedimiento, pues tampoco para mí, para Instrumental, no hace falta que os aprendáis porcentaje ni nada de eso. 00:18:24

Pero como decía eso, que en función del objetivo que tengamos, en función de la información que necesitamos obtener, tenemos que elegir el soporte que más nos convenga. 00:18:37

Entonces, si quiero separar ácidos nucleicos, cojo uno, si quiero proteínas grandes, cojo otro, si quiero proteínas pequeñas, cojo el otro. 00:18:45

y si quiero pues ácidos nucleicos o aminoácidos pues como otra cosa antes va a depender un poco 00:18:52

del procedimiento y del objetivo que nosotros tengamos vale no cerréis en banda a los 00:18:58

procedimientos o las técnicas de solo para esto vale igual que en otra violeta visible yo os 00:19:03

digo el visible es de 380 a 780 nanómetros pues es más o menos no hay una pared a un paredón que 00:19:09

no deje pasar la luz 380 350 400 ahí los rangos se van moviendo un poquito vale 00:19:16

pero más o menos es un rango para el que nos acordemos que hay seguro seguro y 00:19:23

por ahí van bajando las cosas 00:19:28

otras partes del equipo vale que no tenemos solamente soporte otras partes 00:19:32

del equipo pues tendríamos la fuente de alimentación por ejemplo la fuente 00:19:35

alimentación es la que nos va a proporcionar el campo eléctrico y para 00:19:39

eso vamos a quitar dos electrodos entre los dos electrodos establecemos una diferencia de potencial 00:19:43

y con esa diferencia potencial pues conseguimos que se muevan los electrones que pasen la corriente 00:19:49

eléctrica y que se muevan todo lo que tengamos dentro del soporte de la cubeta de lo que sea 00:19:54

luego tenemos la cubeta que va a ser el recipiente donde vamos a poner nosotros la muestra el gel o 00:19:59

lo que sea y aquí en los extremos de la cubeta es donde van a estar conectados los electrodos 00:20:07

donde vamos a conectarlos para que pase la corriente eléctrica y bueno los 00:20:12

electrodos lo que decía que es la conexión entre la cubeta y la fuente de 00:20:18

alimentación y luego ya aparte una vez que tenemos 00:20:22

todo esto puesto ahora es como lo monto lo monto de forma horizontal lo monto de 00:20:26

forma vertical inclinado diagonal las dos que hay sería en la horizontal y la 00:20:31

vertical de momento inclinado tipo de slam no hay ninguno no se suele utilizar 00:20:36

que yo sepa. La parte que se hace, yo creo que la que veis aquí es horizontal, si no 00:20:42

recuerdo mal los equipos que hay, pero al final es una cubeta de dos electrodos y lo 00:20:48

pones de pie, lo pones tumbado y ya está. En la horizontal el soporte se va a impregnar 00:20:54

por capilaridad de una disolución tampón. Este tampón va a disolver la muestra y además 00:20:59

también va a mantener el contacto eléctrico 00:21:09

también se aplica 00:21:11

la muestra 00:21:13

depositándola con una pipeta 00:21:13

o con un capilar 00:21:17

o un aplicador que sea específico 00:21:18

con una pipeta, micropipeta 00:21:20

con la punta de una micropipeta, de las pequeñas 00:21:22

como una gota de agua 00:21:24

sobre el soporte, ya sea 00:21:26

de papel, de acetato, de celulosa 00:21:28

ahí sería 00:21:30

parecido a la parte 00:21:33

de cromatografía en placa 00:21:34

de papel o acetato sería parecida 00:21:36

la cromatografía en placa. Y luego si utilizamos geles como el agarosa o el de poliacrilamida, 00:21:38

pues lo que se hacen son unos pocillos donde nosotros depositamos la muestra. Ahora vemos 00:21:44

cómo se hace. Y luego tenemos la deposición vertical. Aquí normalmente la vertical va 00:21:50

solamente con el gel, papel no. Para papel en vertical mejor la cromatografía en placa. 00:21:57

Aquí se utiliza casi siempre con el gel, sobre todo de poliacrilamida 00:22:03

Porque es más resistente, no se desliza tanto como la agarosa 00:22:07

Y bueno, pues aquí se suele utilizar para proteínas, para ácidos nucleicos 00:22:15

Que son de pequeño tamaño 00:22:20

La muestra la ponemos con una micropipeta en un pocillo 00:22:22

Igual que en el horizontal de antes 00:22:26

Y bueno, que el pocillo sea hecho al polimerizar el gel 00:22:29

Ahora, ¿cómo trabajamos? Ya sabemos que vamos a hacer un gel de agarosa, que lo vamos 00:22:33

a poner en disposición horizontal, porque queremos separar, pues lo que sea. Me da igual 00:22:40

la muestra que tengamos. Pues tenemos que organizarnos. Es muy importante que nosotros 00:22:46

tengamos organización en el laboratorio. Una vez que ya nosotros sabemos un poco de 00:22:52

qué va todo esto, de cuál es el fundamento, de qué material voy a utilizar, qué disposición 00:22:57

voy a hacer, pues tenemos que organizarnos para poder trabajar, ¿vale? Acordaos, ¿vale? 00:23:02

No tengamos que llevar al laboratorio, empezar a coger el material al tuntún y a ver qué 00:23:08

sale. En el laboratorio siempre es imprescindible la organización, ¿vale? Y que sepamos qué 00:23:13

estamos haciendo y para qué, ¿vale? No tiene sentido que nosotros cojamos ahí una cubeta, 00:23:19

ahora un pocillo, lo hago más grande, más pequeño, qué punta cojo, pongo un capilar 00:23:24

y nosotros no sepamos la marcha que lleva eso ni cuál es el sentido, ¿vale? 00:23:29

Digo que el gel, el porcentaje que pongamos de acrilamida, bisacrilamida, 00:23:32

va a depender de, o sea, en función del porcentaje que pongamos, 00:23:37

va a depender del tamaño del poro y en función del tamaño del poro 00:23:41

voy a separar unas cosas u otras, pues tendré que saber 00:23:43

qué es lo que quiero separar para ver la mezcla que hago. 00:23:46

¿Qué lo dice el procedimiento? Muy bien, pero que nosotros podamos ir viendo por qué, ¿vale? 00:23:50

Que interpretemos el procedimiento y sepamos por qué va a ser todo esto. 00:23:54

Luego ya muchos equipos que sí, que están automatizados y le damos a un botón y ya, pero al botón hay que darle con cabeza, que sepamos qué es lo que pasa. 00:23:59

Ahora, ya sabemos que vamos a hacer una electroforesis en un gel y vamos a prepararlo. 00:24:08

¿Cómo lo hacemos? Pues bueno, lo primero sería la preparación del gel, según la concentración requerida y según lo que nos hayan dicho en función de lo que vayamos a separar. 00:24:14

¿Qué haríamos? Pues disolveríamos la garosa o la acrilamida y la bisacrilamida, lo que necesitemos, en un tampón. Los que se suelen utilizar más son el TAE y el TBE. 00:24:23

Esto luego final se va a fundir utilizando microondas hasta que tengamos una solución homogénea 00:24:36

Un microondas o un calor, una fuente de calor 00:24:45

Que sea transparente, que sea homogéneo, que no veamos precipitado, ni turbidez, ni nada de eso 00:24:48

Esta disolución que hemos preparado nosotros la vamos a vaciar en un mueble 00:24:54

Y vamos a colocar un peine 00:24:59

el peine es el que va a formar los pozos donde se depositan las muestras 00:25:02

lo tenemos ahí puesto para que sea parte del molde 00:25:08

o de la forma que queramos darle a nosotros 00:25:12

al final, dependiendo si es vertical u horizontal 00:25:14

queda más como la foto en horizontal o un tipo castillo en vertical 00:25:18

con el molde caliente y el peine puesto 00:25:23

dejamos enfriar para que se polimerice 00:25:28

y para formar una matriz porosa 00:25:31

que va a depender, el poro va a depender 00:25:33

del tamaño según la concentración 00:25:35

que hayamos obtenido 00:25:37

no hace falta que sepáis 00:25:38

porcentajes, pero si tenéis que saber 00:25:41

que la concentración de lo que pongamos 00:25:44

nosotros va a influir en el tamaño del poro 00:25:45

eso sí es 00:25:48

importante 00:25:49

además del tamaño del poro y de todo 00:25:50

lo que estoy diciendo del pene y todo eso 00:25:53

pues la migración 00:25:55

o el desplazamiento de estos fragmentos 00:25:57

De ADN, por ejemplo, pues va a variar en función del tamaño, ¿vale? Pues como tenemos diferente poro, pues en función del tamaño del ADN que tengamos, pues será más fácil o menos pasar, ¿vale? También va a depender de la conformación molecular, pues si es un lineal, si es un circular, si está súper enrollado, todo eso también influye. 00:26:00

La concentración de agarosa en el gel, el voltaje que nosotros pongamos, la dirección del campo eléctrico, la presencia de diferentes colorantes que nosotros hayamos añadido y que se fijen o se intercalen en el ADN. 00:26:19

Uno de los que se suele utilizar mucho es el bromuro de tibio, lo que pasa que es igual, que no es muy bueno para la salud, entonces se intentan buscar sustituyentes. 00:26:34

Y luego también va a depender del tampón que nosotros hayamos utilizado, del buffer que tengamos en el gel 00:26:45

Una vez que hayamos formado el gel, nosotros vamos a preparar la muestra 00:26:51

Para preparar la muestra para una electroforesis necesitamos que la muestra esté diluida 00:26:56

Otras veces es verdad que hemos trabajado con sustancias sólidas, con sustancias gaseosas 00:27:02

O yo os he dicho, pues hay pH metros para sólidos 00:27:07

O hay espectrofotómetros de ultravioleta visible para sólidos 00:27:10

o el infrarrojo 00:27:14

infrarrojo nosotros hemos trabajado con sólidos 00:27:16

pero también hemos visto 00:27:18

la celda de llenado que tienen 00:27:20

para el infrarrojo para líquidos 00:27:22

bueno pues aquí no 00:27:24

aquí siempre tenemos que 00:27:25

trabajar con una muestra que esté diluida 00:27:28

para electroforesis tiene que estar 00:27:30

diluida y además tiene que estar diluida 00:27:32

en el mismo tampón 00:27:35

que en el que se va a desarrollar la electroforesis 00:27:36

esto sería algo similar 00:27:38

a lo que hicimos en HPLC 00:27:40

vamos a disolver la muestra 00:27:42

en la misma fase móvil 00:27:44

para ver su comportamiento en la fase móvil 00:27:45

pues aquí la muestra tiene que estar 00:27:48

disuelta, tiene que estar 00:27:50

diluida también, en el mismo 00:27:51

tampón en el que vamos a utilizar nosotros para 00:27:54

la electroforesis 00:27:55

además aquí 00:27:57

tenemos que tener una precaución 00:27:59

un punto crítico o una llamada 00:28:02

de atención, como queráis 00:28:04

para evitar la evaporación del tampón 00:28:05

¿qué pasa si se 00:28:08

evapora el tampón? cuando nosotros pasamos 00:28:10

la corriente eléctrica, al final queramos 00:28:11

o no, pues se genera calor y se puede ir evaporando del tampón poco a poco. No sé si habéis 00:28:14

visto algún vídeo porque la electroforesis me habéis dicho que no la habéis visto correr. 00:28:21

¿Tampoco visteis el principio de la electroforesis de cómo corría? Ni el principio ni el final, 00:28:24

no visteis solo el revelado. Es que cuando ponéis la electroforesis, bueno, sobre todo 00:28:29

al principio porque como hay calor se evapora, se empiezan a ver como unas burbujitas en 00:28:33

el tampón. Esas burbujitas son de la hidrólisis del agua, la ruptura del agua que alguna vez 00:28:39

la hemos visto en la parte de las técnicas electroquímicas nosotros. Entonces se van 00:28:49

viendo las burbujitas y eso es porque el agua se está rompiendo debido al campo eléctrico. 00:28:55

Si se genera calor, se forma un vaho, si se evapora el gel aumentaría la concentración 00:29:01

de sal, ¿vale? Del tampón que tengamos nosotros. Se va el agua, pues se queda el sólido, queda 00:29:07

como más concentrado. Entonces, para evitarlo, pues se pone una tapa. Entonces, quitamos 00:29:12

la tapa, pues si vemos el calor saliendo, por eso ponemos la tapa, para evitar la evaporación. 00:29:16

Vale, entonces, nosotros conectamos la cubeta a la fuente de alimentación y ya seleccionaríamos 00:29:23

las condiciones de la electroforesis, las condiciones de procedimiento, del desarrollo, 00:29:29

y ya lo conectamos a la fuente de alimentación. 00:29:34

Queremos 100 milivoltios o 1,5 voltios o 100 minutos 00:29:39

o lo que sea en función de lo que queramos separar. 00:29:44

Una vez que nosotros eso lo programamos 00:29:48

y una vez que haya pasado el tiempo de desarrollo 00:29:50

pues desconectamos la corriente eléctrica 00:29:52

y ya vamos viendo las bandas. 00:29:55

Que las bandas, ya las he visto, 00:29:58

pues sí quedaría algo similar a esto. 00:30:00

entonces tenemos que ir localizando 00:30:02

las bandas que queramos 00:30:04

ver, que queramos detectar o que nos sirvan 00:30:06

a nosotros, sería como una especie 00:30:08

de revelado 00:30:10

en el que parte del soporte 00:30:11

sabemos en qué parte del soporte 00:30:13

y en qué cantidad se encuentran las sustancias 00:30:16

que nos interesan a nosotros 00:30:18

que supuestamente están separadas 00:30:19

y nosotros podemos separarlas y cuantificarlas 00:30:22

más o menos 00:30:24

si medimos el área de la banda 00:30:26

más o menos, pues podríamos 00:30:28

hacer una cuantificación 00:30:30

pero bueno, estas son 00:30:33

casi todo técnicas 00:30:34

cualitativas para ver 00:30:36

entonces ponemos una muestra que sea patrón 00:30:38

y ponemos la muestra problema 00:30:40

y vamos identificando los fragmentos que tiene 00:30:42

o los que no 00:30:44

esta 00:30:45

determinación que estamos hablando 00:30:48

pues si se puede hacer 00:30:50

midiendo alguna propiedad física de la molécula 00:30:52

pues como por ejemplo la absorción 00:30:55

de luz, esta revelación, esta 00:30:57

identificación se puede hacer mediante un detector por absorción de luz como 00:30:58

hacíamos el ultravioleta el visible también se puede hacer por el índice de 00:31:03

refracción o mediante una reacción química vale que también se suele 00:31:07

utilizar mucho vale con una atención pues se intercala el tinte o el 00:31:12

colorante en la enfermedad que nosotros queramos y así lo podemos identificar 00:31:17

para verlo, porque si no 00:31:22

esto es porque 00:31:24

tienen alguna tinción 00:31:26

en este caso, tienen alguna 00:31:28

tinción, o yo creo que lo visteis con 00:31:30

la campana de ultravioleta 00:31:32

creo que lo visteis vosotros 00:31:34

o se suele ver aquí el gel 00:31:35

se ve la ultravioleta 00:31:37

o con una linterna de ultravioleta y se van viendo 00:31:39

las bandas mejor 00:31:41

entonces bueno, es una forma en la que nosotros 00:31:43

tenemos que verlo 00:31:45

que normalmente se hace la 00:31:47

tinción, porque 00:31:49

Porque no todas las sustancias de una misma familia, por ejemplo las proteínas, tienen su máximo de absorción, su longitud de onda máxima a la misma longitud de onda. 00:31:51

Entonces, trabajar con un detector de ultravioleta visible con una longitud de onda fija sería difícil. 00:32:04

Por eso se suelen tener y ver las bandas, porque aparecen negras, azules y con colorantes que no sean malos para nosotros. 00:32:10

Las bandas que nosotros obtenemos, estas de aquí, una vez que nosotros hemos terminado la electroforesis 00:32:18

Pues si se ensanchan por difusión, dentro del soporte 00:32:26

Entonces este sería otro de los puntos críticos, que no podamos dejar ahí el gel y verlo dentro de tres meses 00:32:30

Porque si puede que se nos solapen algunas 00:32:37

Entonces, bueno, para evitar esta difusión y ese ensanchamiento, lo que podemos hacer es, antes de hacer la atención, antes de la coloración, pues secar el papel, secar el soporte con el que estamos trabajando, ¿vale? 00:32:40

Si estamos trabajando, por ejemplo, con proteínas en gel, pues tenemos que hacer que precipiten con ácido acético, ¿vale? 00:32:57

O con alguna cosa, algo de TCA, algo que ayude a que precipite para evitar la difusión, ¿vale? 00:33:05

Pero yo le digo que va todo en función del procedimiento, yo os hablo de cosas generales. 00:33:12

Y luego, bueno, pues esto es, lo que hagamos para que precipiten, pues a veces llevan colorantes también. 00:33:16

una vez que ya hemos terminado 00:33:20

la electroforesis 00:33:23

para ver las batas 00:33:25

se sumerge el gel 00:33:26

en un recipiente que tiene una disolución 00:33:28

del colorante, esperemos a que 00:33:31

se impregne, creo que está aquí 00:33:33

en el este que hay como 00:33:35

un balanceo que tiene que estar 00:33:37

ahí el gel un rato 00:33:39

y está balanceándose 00:33:41

para que sea homogéneo 00:33:43

y el colorante lo que hace es unirse a las moléculas 00:33:44

que están ya separadas 00:33:47

en el gel, luego lavamos el gel 00:33:49

y al lavar el gel lo que se hace 00:33:51

es eliminar el exceso de 00:33:52

tinción, y ya observaríamos 00:33:54

se elimina igual que 00:33:57

las tensiones del micro 00:33:58

pues eliminamos los 00:34:01

extras y ya quedaría solamente 00:34:02

unido a las bandas que nos interesan 00:34:05

que más o menos se vería como esto de aquí 00:34:07

a lo mejor si, si un poco más azulado 00:34:09

esta parte de aquí más oscura 00:34:11

pero bueno, se distinguen bien las 00:34:12

bandas por las que nosotros queremos trabajar 00:34:14

y ahora 00:34:16

Hay un tipo dentro de la electroforesis clásica, hay un tipo especial, una variante de esta electroforesis clásica que sería la electroforesis bidimensional, porque vamos a hacer la separación en dos sentidos, en dos direcciones. 00:34:18

Este tipo de electroforesis lo que hace es mezclar dos técnicas, para hacer esa separación que digo yo en dos direcciones vamos a utilizar el isoelectroenfoque o el enfoque isoeléctrico o el IEF del inglés también, entonces esta parte del isoelectroenfoque es una variante de la electroforesis en gel, sobre todo el gel de poliacrilamida. 00:34:37

entonces lo que se va a hacer es trabajar con un gradiente 00:35:03

nosotros vamos a tener en el gel un gradiente de pH que esté fijado 00:35:07

ponemos el gel y empezamos por el pH 3 y el otro pH 10 00:35:11

ahora si no lo vemos un momento en dibujo 00:35:16

este gradiente lo vamos a conseguir poniendo en la preparación del gel 00:35:21

además de la clamida, biseclamida y todo lo que queramos 00:35:26

vamos a añadir moléculas que son ionizables 00:35:29

que además tienen valores de pk diferentes vale no sé si os acordáis del pk del punto 00:35:33

isoeléctrico y todo eso del año pasado pero si no le damos un repaso ahora al tener estas diferentes 00:35:40

este gradiente diferente y todo esto pues al avanzar los componentes de la muestra a lo largo 00:35:51

del gel se va a encontrar con ph diferentes en función de donde esté pues 00:35:58

unas veces tendrá ph 4 otras 5 otras ph 7 vale y bueno pues ahí eso va a 00:36:03

regular la separación entonces cuando la sustancia que estoy separando con la 00:36:08

molécula la muestra alcanza una región en la que el ph es igual al punto 00:36:14

isoeléctrico de la molécula muestra de una parte de una molécula de la muestra 00:36:20

o de un analito que yo estoy trabajando, en este punto la molécula se va a detener, se va a parar. 00:36:24

Cuando pasa esto, pues se alcanzaría un equilibrio. 00:36:31

Y lo que vamos a conseguir al final es la separación de los componentes de la muestra según su punto es eléctrico. 00:36:34

Y este punto es eléctrico, pues además lo podemos medir, ya que nosotros podemos conocer, 00:36:42

el gradiente de pH lo hemos puesto nosotros, nosotros lo conocemos. 00:36:46

Tendríamos por ejemplo a lo mejor una proteína que nosotros queremos separar que tiene una proteína que tenemos el punto isoeléctrico sería 6,5 y nosotros la queremos separar. 00:36:49

Para eso vamos a hacer un gel que hemos dicho que tiene un gradiente de pH. 00:37:05

Entonces empezamos por pH 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, ¿vale? Ya, no cabe más. 00:37:12

Entonces nosotros tenemos el gradiente pH en cada zona. 00:37:23

esta zona de aquí 00:37:26

pues tendría pH 10 00:37:29

esta de aquí pH 9 00:37:30

esta pH 8, 7 00:37:32

esta de aquí pH 4 00:37:34

si la proteína va en este sentido 00:37:36

pues se va encontrando con diferentes pH 00:37:38

y en función 00:37:41

de su punto S eléctrico 00:37:42

y si coincide con el pH 00:37:44

pues vamos a ir bien 00:37:46

cuando el pH es superior al punto S eléctrico 00:37:47

pues la proteína va a tener una carga negativa 00:37:51

es decir, cuando estamos 00:37:53

en esta parte de aquí, cuando la proteína está en esta parte de aquí, pues la proteína 00:37:54

va a tener una carga negativa, porque el pH, pH 10, es superior al punto isoeléctrico 00:38:03

que es de 6,5. En un terno que tengamos el pH que sea más pequeño que el punto isoeléctrico, 00:38:09

por aquí por ejemplo, pues la proteína tiene una carga positiva 00:38:18

y bueno, si la proteína va avanzando por aquí 00:38:22

pues la carga va a hacer que las moléculas de la proteína se vayan desplazando 00:38:29

nosotros generamos la corriente eléctrica o el potencial 00:38:34

y vamos a hacer que la proteína se mueva 00:38:37

a ver aquí dibujado, por si la proteína en vez de entrar por aquí sigue este camino 00:38:40

entonces en función del voltaje que hayamos puesto nosotros y del campo eléctrico que hayamos puesto 00:38:46

la proteína va a avanzar, al moverse pues va cambiando el pH de su entorno 00:38:52

aquí empezamos por pH 9, luego pasa a pH 10, pH 9, pH 8, pH 7, se va moviendo 00:38:58

cuando la proteína va en esta dirección y ahí lo que va haciendo es que va perdiendo carga neta 00:39:05

La carga va a hacer que las moléculas de la proteína sigan desplazándose y al alcanzar el pH igual al punto isoeléctrico, por ejemplo, más o menos por aquí, pues la proteína ya no tiene carga neta, se tendría una carga nula y ya no se mueve más. 00:39:13

si entra por aquí 00:39:38

iría pasando de negativo 00:39:41

carga neta, si entra por aquí 00:39:44

sería de carga positiva 00:39:45

a carga 0 00:39:48

eso sería más o menos 00:39:49

lo que pasa en esta parte 00:39:51

del isoelectroenfoque 00:39:53

una vez que ya hemos 00:39:55

una vez que hacemos eso 00:39:57

pues nosotros tendríamos 00:39:58

si nosotros tenemos 00:40:01

aquí nuestro gel 00:40:02

y tenemos aquí el pH 10 00:40:05

y aquí tenemos el pH 3 ahí hemos puesto, pues tendremos proteínas que estén puestas en diferentes sitios 00:40:07

en función de su punto isoeléctrico, pues aquí tengo una proteína, aquí tengo otra, 00:40:15

van a ir separándose, voy a ponerlas a la misma altura, entonces nosotros vamos añadiendo las proteínas 00:40:23

y las vamos separando en función de su punto isoeléctrico, pues aquí por ejemplo tendríamos 3. 00:40:32

entonces una vez que hemos hecho esta separación 00:40:41

esta primera separación 00:40:44

lo que hayamos obtenido que es esa línea de proteínas 00:40:45

que he hecho yo, pues se va a someter 00:40:48

a otra 00:40:50

electroforesis o a otra separación 00:40:51

que va a utilizar otro 00:40:54

mecanismo, que se hará 00:40:55

en otra dirección, va a ser 00:40:58

en dirección perpendicular, entonces normalmente 00:41:00

la primera parte es un 00:41:02

electro 00:41:04

electroisofoque o un enfoque 00:41:04

isoeléctrico, en un gel 00:41:07

que es cilíndrico, normalmente en vez de ser tan, yo lo he puesto así encuadrado porque a lo mejor es más fácil de ver, 00:41:10

pero bueno, suele ser un gel que es cilíndrico, que es estrecho y luego esto lo ponemos como muestra para una electroforesis 00:41:16

que va separada por el peso molecular. 00:41:25

Una vez que tenemos eso, pues separaríamos en función del peso molecular, por ejemplo, esto, 00:41:27

luego ya pasaría a hacer la separación en este sentido. 00:41:33

En este sentido va el peso molecular, en este sentido va el punto isoeléctrico 00:41:40

y ya tendríamos eso en las moléculas. 00:41:46

A lo mejor queda esta por aquí arriba, que la teníamos en el medio, 00:41:48

esta queda más abajo y esta azul queda por aquí intermedia. 00:41:53

La separamos en función del peso molecular. 00:42:03

Haciendo esto, pues sí, quedan cosas que parece que es follón, 00:42:06

que son mapas que son muy complejos 00:42:10

o estructuras muy 00:42:12

complejas, pero bueno, que son 00:42:13

características de cada muestra 00:42:16

y nos da bastante información, son muy 00:42:17

útiles para comparar 00:42:20

con una muestra similar 00:42:22

con patrones 00:42:24

así de primeras no nos dice nada, pero 00:42:25

hacer una comparación con algún patrón 00:42:28

si se va a conseguir algo 00:42:29

entonces esto sería 00:42:31

lo que, por lo menos la 00:42:33

normal, la de diferencia 00:42:35

según el campo eléctrico 00:42:37

y todo eso sería, o por separado, me da igual, aunque no sea el nivel dimensional, 00:42:39

sería más o menos lo que habéis visto en biotecnología. 00:42:44

Y luego quedaría, que no sé si lo habéis visto, 00:42:47

quedaría la parte de la electroforesis instrumental o la electroforesis capilar. 00:42:49

En este caso, lo que digo que es la versión instrumental de la electroforesis clásica. 00:42:55

Entonces aquí sigue siendo una técnica analítica, que es de separación, 00:43:01

que se basa en la diferente velocidad de desplazamiento, 00:43:05

la diferente velocidad de desplazamiento 00:43:08

que tienen las diferentes proteínas 00:43:12

dentro de un medio líquido 00:43:15

y aquí lo que hacemos es que 00:43:16

lo tenemos todo dentro de nuestro soporte 00:43:20

o todo va a estar dentro de un tubo capilar 00:43:22

y aquí este tubo capilar está sometido 00:43:26

a un campo eléctrico 00:43:29

a los dos electrodos que forman el campo eléctrico 00:43:31

¿Cómo vamos a hacer la separación? 00:43:35

Bueno, pues lo tenemos. La separación, la parte de separación, lo que antes hemos puesto el gel, aquí sería el capilar este que está aquí en forma de U invertida. Entonces todo tiene lugar dentro de un capilar. ¿Cómo son de grandes los capilares? Pues depende de lo que queramos hacer. 00:43:37

Yo digo que tenemos de diámetro interno, pues entre 10 y 75 micras, por ejemplo, ¿vale? Es igual que las columnas, que cuánto tienen de partícula, de largo, de ancho, todo. 00:43:54

¿Vale? Aquí, pues entre 10 y 75 micras, que es pequeño, el capilar es pequeño, pues sí, suele ser el diámetro interno. 00:44:05

¿De grande cómo son los capilares? Pues aquí entre 20 y 100 centímetros. Fijaos que son, o sea, un metro puede ser también el capilar, entre 20 centímetros y un metro, más o menos puede ser, ¿vale? 00:44:11

En función de lo que yo haga. 00:44:23

Normalmente los capilares sí están hechos de sílice fundida. 00:44:25

Y bueno, dentro lo que tenemos es el tampón, ¿vale? 00:44:29

Igual que teníamos la electroferencia normal, un tampón. 00:44:32

Aquí dentro también tenemos un tampón que lo que va a hacer es el soporte o el medio donde va a tener lugar la separación. 00:44:35

¿Vale? 00:44:44

Y también tenemos una serie de viales que están situados en los extremos del capilar. 00:44:44

¿Vale? 00:44:49

Los viales serían estos dos. 00:44:49

¿Vale? 00:44:51

entonces lo sumergimos cada extremo en uno de los viales y ya está 00:44:51

la muestra la vamos a poner en otro vial 00:44:56

en uno de los extremos del capilar pues en vez de estar en el capilar aquí 00:44:58

lo cambiamos aquí en el momento de la inyección o en el momento de análisis de la muestra 00:45:02

pues lo cambiamos a la muestra en vez de al vial 00:45:05

y ya tendríamos la muestra ahí puesta 00:45:09

entonces bueno, ahí aplicaríamos una pequeña sobrepresión 00:45:13

a la hora de poner la muestra o la inyección de la muestra 00:45:18

para conseguir esta separación 00:45:21

que tenemos un ánodo y un cátodo 00:45:24

vamos a generar un campo eléctrico 00:45:26

que lo vamos a conseguir 00:45:28

con una fuente de alimentación 00:45:30

si no, no hacemos nada 00:45:32

también necesitamos una fuente de alimentación 00:45:33

que sea de un voltaje 00:45:36

altillo 00:45:38

y que están en los extremos 00:45:39

del capilar 00:45:41

está unido 00:45:44

a los dos extremos que tenemos 00:45:48

de los viales, en medio del ánodo 00:45:50

y el cátodo, vamos 00:45:51

esta parte de aquí está automatizada 00:45:52

pues sí, casi todo lo podemos hacer desde 00:45:55

el ordenador, teniendo todo 00:45:57

ahí guardaico y bueno 00:45:59

todas las técnicas ya están muy 00:46:01

monitorizadas, vale 00:46:03

entonces la separación si es verdad 00:46:05

que lo que decía, se lleva 00:46:07

en la columna, vale 00:46:08

cuando hay, ponemos 00:46:11

nosotros un detector 00:46:13

en un punto del capilar 00:46:15

pues 00:46:17

normalmente 00:46:18

sirve la que se pone 00:46:20

antes del extremo 00:46:21

tenemos que ponerlo para la detección 00:46:24

que no llegue a salir, sino que se pone 00:46:26

antes, es igual que en la 00:46:28

cromatografía, la de placa 00:46:30

no tenemos que dejar que corra 00:46:32

hasta mañana si quiere 00:46:34

porque si no se va del frente 00:46:36

entonces aquí pasa igual 00:46:38

en el capilar de la columna antes de que salga 00:46:40

el extremo ponemos el sistema de 00:46:42

detección 00:46:44

Entonces, en función de la detección que pongamos, tendrá una forma u otra. Y ya con el ordenador que va unido a este programa o al sistema de detección, ya íbamos controlando todo lo que queramos nosotros. Del voltaje, de la detección, de áreas, de cuantificación, tratamiento de datos, todo eso lo va haciendo con el detector. 00:46:45

La separación al final, aunque esté automatizada, sigue basándose en todo lo tradicional, lo que hemos visto anteriormente 00:47:09

Pero tiene lugar dentro de un capilar 00:47:22

¿Por qué lo hacemos dentro de un capilar? 00:47:24

Pues lo primero porque es más sencillo, parece que es más fácil 00:47:27

También vamos a conseguir más velocidad que en HPLC por ejemplo que es otro de los que la clásica que son otros tipos de separación. 00:47:32

También en HPLC por ejemplo teníamos algunas dificultades a la hora de seleccionar los solventes pues aquí dentro del capilar no, no tenemos estos problemas. 00:47:42

los disolventes 00:47:52

no son tan tóxicos 00:47:57

como otros utilizados en otras técnicas 00:47:58

instrumentales 00:48:01

o en otros tipos de electroforesis 00:48:02

también es más barato 00:48:05

y al final por beneficio 00:48:07

que tengamos lo podemos conseguir 00:48:09

más barato que HPLC sobre todo 00:48:11

que a lo mejor con la cromatografía 00:48:13

clásica pues hay ahí 00:48:15

pero que para HPLC también 00:48:17

y lo que dice que los disolventes 00:48:19

normalmente son casi todos muy acuosos 00:48:21

entonces no necesitamos las mezclas 00:48:23

de metanol con acetonitrilo, exano 00:48:26

y no sé qué que hacíamos en 00:48:28

en HPLC 00:48:29

son muy acuosos 00:48:31

si tienen la concentración única que tienen 00:48:33

es muy bajita 00:48:35

al tener más velocidad también pues el tiempo 00:48:36

de análisis se reduce 00:48:40

entonces bueno, también depende un poco del equipo 00:48:41

que tengamos 00:48:44

que luego ya del equipo con el que trabajéis 00:48:44

pues hay otros que van 00:48:47

muy muy muertos 00:48:49

y otros que van rápido 00:48:51

aquí yo creo que si 00:48:52

ibas a utilizar los dos equipos de ultravioleta 00:48:55

visible, ya habéis visto que 00:48:57

uno se tardaba más que con otro 00:48:59

y la técnica sigue siendo la misma y el fundamento 00:49:00

sigue siendo el mismo 00:49:03

pero bueno, normalmente en un par 00:49:05

de minutillos así ya tenemos 00:49:07

los resultados, podemos trabajar con 00:49:09

ellos y bueno, con la tradicional 00:49:11

se tarda un poco más 00:49:13

un poco bastante más 00:49:14

pero aquí con la capilar pues 00:49:16

nada, en un poquillo de tiempo 00:49:19

lo tenemos. Y luego también la cantidad de muestras que estemos utilizando. Sí es verdad 00:49:21

que en HPLC y en la cromatografía clásica, en la ultrafóresis clásica, perdón, utilizamos 00:49:26

muy pequeño porque utilizamos micropipetas o en HPLC necesitábamos 20-40 microlitros, 00:49:33

pero aquí siguen siendo microlitros pero menos. Entonces también necesitamos menos 00:49:39

cantidad de muestras. Aunque tengamos pocas ya en las anteriores, pero aquí menos. 00:49:44

Y ahora vamos a ver cómo vamos a separar nosotros. Igual que hemos visto un poco de qué dependía antes la biodimensional, cómo hacíamos esa separación en esta electroforesis capilar, cómo interpretamos nosotros los resultados o cómo conseguimos separar. 00:49:51

La separación sí se basa en cosas tradicionales y en los procedimientos, en los fundamentos en los que se basaría sería en la movilidad electroforetica y en el flujo electroosmótico o electroosmótico. 00:50:06

La movilidad electroforetica, pues esa es específica de cada analito, entonces en función de lo que yo vaya a separar, pues tengo que tenerlo en cuenta. 00:50:19

También va a depender, aunque sea específica de cada analito, dentro de cada analito va a depender de la relación carga-tamaño que tengamos. 00:50:29

Dentro de la misma muestra, pues va a depender de la relación carga-tamaño de las sustancias que yo quiera separar. 00:50:36

los cationes por ejemplo pues migran hacia el cátodo 00:50:42

que lo decíamos antes que van hacia el polo negativo 00:50:46

los aniones hacia el ánodo que es el polo positivo 00:50:48

y los neutros pues ahí se dejan llevar un poco 00:50:50

en función de lo que diga el campo eléctrico 00:50:55

eso sería lo que depende de la movilidad electroforetica 00:50:58

carga tamaño sobre todo 00:51:00

y luego tenemos el flujo electroendosmótico 00:51:03

en este caso se mueve el disolvente 00:51:07

desde el molo positivo hasta el polo negativo, que va actuando como si fuera una bomba, como si fuera la fase móvil. 00:51:10

Al poner la corriente eléctrica, pues el disolvente también se va a mover. 00:51:18

Aquí lo que se consigue también es una doble capa eléctrica, que se va a producir entre el espacio que tenemos, 00:51:25

la interfaz que tenemos, la sílice, acordaros que el capilar decíamos que estaba hecho de sílice, 00:51:34

muchos y la disolución, entonces ahí pues esa parte tenemos que tenerla en cuenta para 00:51:38

el flujo y luego el capilar también está cargado negativamente en su superficie y va 00:51:45

a traer a todos los iones positivos del disolvente, entonces tenemos por un lado la parte de la 00:51:51

movilidad de lo que serían las muestras, de la carga tamaño y luego hay que tener 00:51:58

en cuenta la movilidad que tiene este flujo o este disolvente que tengamos nosotros, entonces 00:52:01

Bueno, no es como un blanco que hay que restárselo, pero tenemos que tenerlo en cuenta que también se está moviendo. 00:52:07

Ahora, una vez que ya lo tenemos todo separado, ¿qué vemos nosotros? ¿Cómo lo interpretamos? 00:52:13

¿No? Mejor dicho, ¿qué hacemos con los resultados? ¿Vale? 00:52:19

¿Qué es lo que a nosotros nos está llamando de ahí algo la atención? 00:52:21

Pues este flujo electroosmótico que estamos diciendo del tapón normalmente es más grande o es más alto o es mayor que el flujo electroforetico. 00:52:25

Entonces bueno, el que dependía de los analitos 00:52:36

Entonces bueno, pues también eso lo que nos hace es que los aniones también se muevan hacia el cátodo 00:52:39

Acordaros que hemos dicho que el disolvente se movía hacia el polo positivo 00:52:46

Entonces los aniones que tenían que ir hacia el ánodo 00:52:50

Hay parte del, al moverse el disolvente también está tirando de ellos hacia el cátodo 00:52:53

Entonces van más lentos, por así decir 00:52:58

Los cationes que sean pequeños o que estén cargados serían los primeros en salir 00:53:01

¿Vale? Los cationes que son, o sea, los pequeños y cargados, porque son cationes, pues serían los primeros en salir 00:53:08

¿Vale? Van antes que los que son más grandes, ¿vale? Con el que tienen menos carga 00:53:16

Entonces primero los cationes pequeños, ¿vale? Cargados, con carga pequeña 00:53:22

Después los cationes que son más grandes, ¿vale? O que tienen mayor tamaño 00:53:26

después irían la especie neutra 00:53:30

¿vale? que bueno, las neutras 00:53:33

si es verdad que van todas juntas 00:53:35

¿vale? sale como una banda así 00:53:38

en el medio, luego irían 00:53:39

los aniones que son 00:53:41

grandes ¿vale? que tienen 00:53:43

una carga baja 00:53:45

y luego ya por último irían 00:53:46

los aniones que son pequeños 00:53:49

y que están muy cargados 00:53:51

¿vale? tendrían estos últimos los aniones que son 00:53:52

pequeños y que tienen mucha carga negativa 00:53:55

serían los últimos en salir 00:53:57

entonces bueno, pues si tenemos una mezcla 00:53:59

pues más o menos podríamos saber 00:54:00

por dónde va cada uno 00:54:02

vale, pues ese tema 00:54:04

más o menos ya estaría 00:54:08

lo que os he dicho 00:54:11

que quería hacer un momento un ejercicio 00:54:12

de lo de la normalización 00:54:15

de las áreas 00:54:16

por si había alguna duda 00:54:18

o alguna cosa que podamos verlo 00:54:20

porque a lo mejor yo sola en el vídeo 00:54:22

pues claro, voy hablando yo sola 00:54:25

y no tenéis dudas, no podéis decir nada 00:54:27

aunque no hayáis dicho nada 00:54:29

en los foros, pero 00:54:30

pero bueno, vamos a verlo 00:54:32

entonces bueno, está el 00:54:34

ejercicio que está ahí medio resuelto 00:54:36

y como os digo en el vídeo 00:54:38

que formas de hacerlo, hay varias 00:54:40

al final nosotros 00:54:42

tenemos que seguir un orden 00:54:44

que nosotros entendamos 00:54:46

y yo en el vídeo lo he explicado de una forma diferente 00:54:48

pero porque como si dijéramos 00:54:50

que he ido desglosando 00:54:53

la fórmula que viene en los apuntes 00:54:55

le he ido haciendo paso por paso 00:54:57

en vez de hacerla toda junta 00:54:59

A mí me gusta más paso por paso, más que nada para no liarlo muchas veces de quién iba en el enumerador, quién en el denominador, ahora van cruzados los estos, ahora el espejo de aquí, entonces ir viendo paso por paso qué es lo que quiero hacer yo. 00:55:00

Antes os decía, voy a hacer un ejemplo si queréis y luego ya si tenéis otras dudas me vais diciendo, pero bueno, está por ver algún ejercicio más. 00:55:15

Para hacer la normalización de las áreas, como os comentaba, se suele hacer sobre todo en la parte de cromatografía. 00:55:24

En las técnicas electroquímicas o en las técnicas ópticas no se suele hacer porque la señal que tenemos y los resultados que obtenemos son diferentes. 00:55:30

En cromatografía, al final, en el cromatograma, nosotros vamos a tener un pico por cada uno de los componentes que tengamos. 00:55:39

Y de ese pico mediamos las áreas. 00:55:45

Entonces vamos a trabajar con las áreas de los picos del cromatograma. 00:55:48

Bien, para trabajar con la normalización del área lo primero es que vamos a suponer que el área va a ser proporcional a la concentración. 00:55:54

Aquí en los que habéis hecho HPLC lo hemos visto, que cuando nosotros buscábamos el pico, buscábamos el área, cuando en los patrones, por ejemplo, el primer patrón era menos concentrado, pues el pico era más pequeño. 00:56:04

La señal o la absorción que teníamos era más pequeña también, sí, pero como luego al final nuestra señal o lo que nos interesa o la relación que hacemos nosotros es relación área-concentración, nosotros cuando hacemos la recta de calibrado no ponemos la absorción. 00:56:18

Igual que en las técnicas ópticas si poníamos la absorbancia frente a la concentración, en las técnicas cromatográficas nuestra señal va a ser el área y nosotros establecemos un área frente a una concentración para poder hacer la recta de calibrado. 00:56:33

Hacemos Y es igual a más BX en una recta normal y en la Y es el área, en las técnicas cromatográficas. 00:56:48

En las técnicas ópticas, en vez de ser el área, nosotros poníamos la absorbancia frente a la concentración para poder hacer la absorbancia o la transmitancia. 00:56:57

Pero bueno, la absorbancia normalmente porque es relación lineal, ¿vale? La transmitancia, acordaros que tiene una relación logarítmica. Entonces en las ópticas utilizamos la absorbancia, en las técnicas cromatográficas se suele utilizar el área con el que vamos a trabajar nosotros. 00:57:12

Y aquí es donde suponemos la relación que hay, que hay una relación de proporcionalidad entre la concentración y el área que medimos. 00:57:29

Proporcional es sí, pero tampoco al 100%. Por eso en las rectas no sale siempre una R de 1. 00:57:37

No es del todo real. Por eso lo digo que al hacer esta suposición de la normalización de las áreas y cualquier recta de calibrado, 00:57:44

al final siempre va a ser una aproximación de acuerdo al que la recta de calibrado bueno pues 00:57:53

coge la recta que más se asemeja a los puntos que tenemos nosotros que mejor nos conviene pero 00:57:57

rectas de uno tampoco salen todas pero bueno en la normalización en parte de las áreas eso suponemos 00:58:03

que la concentración es totalmente proporcional y por eso es aproximado y no es exacto del todo 00:58:12

también pues va a depender de las respuestas que tengamos en el detector no todos los los 00:58:19

analitos van a responder de la misma manera lo que sí necesitamos como requisito de para hacer 00:58:26

la normalización de las áreas es que todos los componentes que tengamos nosotros en la muestra 00:58:33

tienen que eluir necesitamos echar a todos si nosotros en la de la cafeína que hicimos aquí 00:58:39

por HPLC, pues mirábamos solamente la concentración de cafeína, nosotros mirábamos esa área 00:58:46

y lo establecíamos la relación con la concentración y no esperábamos a que hubiera más cosas. 00:58:52

Hacíamos una relación entre esa área y esa concentración. En la normalización de 00:58:59

las áreas necesitamos que todos los componentes que haya eluyan, porque vamos a hacer, dentro 00:59:04

de que es una técnica relativa la normalización de las áreas o la cromatografía, pues esta 00:59:09

es todavía más relativo, es decir, vamos a hacer referencia a otros patrones. Además 00:59:13

de que todos eluyan, también tienen que ser todos detectados, porque si no, no hay señales, 00:59:20

es como si no hubieran eluido. Y que es la parte, y eso a lo mejor podemos decir que 00:59:23

es obvio, pero luego la parte que cae más o que hay más peligro es que todos tienen 00:59:29

que tener la misma sensibilidad. Y aquí es donde ya más se mete la pata, porque el detector 00:59:37

no responde de la misma manera a todos, incluso siendo la misma no va a responder de la misma 00:59:43

forma. Entonces bueno, por eso también son mejores otras calibraciones, pero quiero que 00:59:48

conozcáis esta por si alguna vez os toca, que no os quedéis extrañados y que no la 00:59:55

hayáis hecho nunca. En la parte de aquí es una técnica simple, la normalización va 01:00:00

a ser una técnica simple y bueno, si vamos a obtener la concentración en porcentaje, 01:00:06

No vamos a trabajar en gramo, litro, ni molaridad, ni nada, sino que vamos a tener una concentración en porcentaje. 01:00:11

Entonces vamos a hacer un ejemplo. 01:00:19

Si nosotros tenemos una mezcla y hacemos una cromatografía, me da igual que sea de gases, que sea de líquido, que sea de lo que sea, 01:00:23

y vamos a suponer que hay tres componentes y los tres tienen que eluir. 01:00:33

Vamos a trabajar solamente con una inyección, es un patrón que tengamos, patrón conocido, y vamos a hacer una inyección, es decir, en el mismo vial tenemos la mezcla de metanol, etanol y propanol, que son las tres cosas que vamos a separar. 01:00:39

Si nosotros los separamos, pues tendríamos, este sería uno, este sería el otro y bueno, estoy haciendo picos así, anchos, bandas en vez de picos, pero bueno, y aquí tendríamos el otro. 01:00:57

tiempos de retención 01:01:13

no nos sirven, nosotros acordaros 01:01:16

que nos fijamos en el área, el tiempo me da igual 01:01:18

pero bueno, por detectarlos 01:01:21

por comparar con otros patrones 01:01:23

o por otra cosa que sea, pues si 01:01:24

podríamos hacerlo, este sería de 01:01:26

no sé, 1.34 01:01:28

aquí más o menos 01:01:30

2.84 01:01:33

y aquí 01:01:34

3.53 01:01:36

vale 01:01:38

el tiempo en minutos 01:01:41

y luego nosotros vamos a medir las áreas 01:01:42

que es la parte que nos interesa 01:01:45

este área de aquí que es negra 01:01:47

esta sería la del metanol 01:01:50

entonces el área del metanol 01:01:53

pues vamos a suponer que ha medido 01:01:55

531 en las unidades que sea 01:01:57

que ya sabéis que salen cosas muy grandes aquí en las áreas 01:02:01

entonces en función de las unidades que tengamos 01:02:05

el siguiente en salir 01:02:08

tendría un área, el etanol, de 424 y por último sale el propanol, habíamos dicho, que sería de 201. 01:02:10

Como hemos dicho que nuestra suposición es que el área es proporcional a la concentración, 01:02:29

pues si nosotros sabemos qué relación de proporcionalidad hay entre uno y otro, 01:02:36

pues podremos saber la concentración en la que están cada uno de ellos. 01:02:40

¿Qué vamos a hacer? Pues vamos a sumar todas las áreas. 01:02:45

Nosotros hacemos la suma de todo y tendríamos que la suma de las áreas es de... 01:02:49

Si hacemos 531 más 424 más 201, pues la suma de las áreas es 1156. 01:02:56

Ese es el área total. 01:03:10

Y ahora para ver cuál es cada uno, pues haríamos, ¿qué porcentaje tiene? Sería como el factor gravimétrico, como cuánto hay de metanol en el área total, ¿vale? Sería, os digo que es sencillo. 01:03:11

Para el metanol, por ejemplo, para ver el porcentaje de metanol que hay en la muestra, ¿qué haríamos? Pues el área del metanol entre el área total y multiplicamos por 100 para expresarlo en porcentaje. 01:03:25

Y esto nos da un 45,93%. 01:03:44

Ya sabemos que el metanol va a estar en un 45,93% y esa es la cantidad de metanol que hay respecto a los anteriores. 01:03:50

El etanol, lo pongo por aquí debajo para que se vea, que si no luego con la banda esta no se ve. 01:04:03

El etanol pues lo mismo, su área 424 entre el área total que es 1156 y multiplicado por 100 pues nos va a dar 36,68. 01:04:10

y el otro que teníamos 01:04:26

el propanol 01:04:29

201 que era el área 01:04:30

entre 1156 01:04:37

por 100 01:04:39

y sale 01:04:41

de 17,39 01:04:42

y ya tenemos los porcentajes 01:04:46

en lo que está cada uno 01:04:52

yo he ido directamente a una muestra 01:04:54

que sea desconocida 01:04:56

que no sabíamos nada de ellos 01:04:58

que pasa que si nosotros hacemos 01:05:00

con patrones que tengan una concentración conocida, vemos que esto no es tan real, que 01:05:02

se desplaza un poquito. Que a lo mejor si nosotros hubiéramos puesto un patrón con 01:05:10

una concentración de un 40% de etanol, pues nos hubiera salido un 36,68. Es decir, no 01:05:16

se ajusta 100% a la realidad. Por eso digo que no es una técnica que sea muy exacta 01:05:23

Y que sea muy precisa. Para evitar esta desfase que hay de los resultados que tenemos, se ha hecho una corrección de este método. 01:05:31

Se utiliza una normalización de las áreas con un factor de respuesta, que sería parecido al que hemos utilizado otras veces en el tema 1. 01:05:45

Cuando hacemos el factor de respuesta, en vez de hacer una sola inyección como ahora, 01:05:56

que vamos con ciegas, lo que hacemos son dos inyecciones. 01:06:01

En una vamos a poner un patrón que tenga la mezcla de las tres cosas, 01:06:06

del metanol, del etanol y del propanol, creo que los tres que he dicho. 01:06:10

Y luego una muestra desconocida que no sabemos que tiene, 01:06:15

que en este caso nuestra muestra desconocida sería esta. 01:06:19

Vamos a seguir midiendo la concentración en porcentaje, pero es verdad que esta parte tendría menos requisitos que la que no tiene factor de respuesta. 01:06:21

Menos requisitos por parte del detector que he dicho. 01:06:36

Seguimos teniendo el fallo de que no es exactamente directamente proporcional por la diferente respuesta que tenemos del detector de cada analito. 01:06:42

pero bueno, tenemos mejores resultados que el anterior 01:06:51

y bueno, si es más preciso o más exacto que el anterior 01:06:56

pero también es un poco más difícil 01:06:59

bueno, más difícil, que es más elaborado el procedimiento 01:07:01

porque aquí ya habéis visto que sumamos y dividimos 01:07:04

y no tiene mayor dificultad 01:07:06

aquí vamos a calcular varias cosas 01:07:07

vamos a calcular un factor de respuesta absoluto 01:07:10

es decir, un factor de respuesta independiente 01:07:12

para cada uno de los analitos 01:07:15

y un factor de respuesta relativo 01:07:16

Es decir, un factor de respuesta comparable entre los diferentes analitos o que haga referencia al resto de los analitos que nosotros tenemos en la mezcla. 01:07:18

Y con esos dos factores de respuesta vamos a hacer un área corregida. 01:07:29

Entonces, vamos a suponer que tenemos una muestra que tiene cuatro componentes. 01:07:34

pues en vez de, para no poner nombres de metanol, propanol, todo eso, A, B, C y D, ¿vale? 01:07:41

Y están todos en la misma proporción, es decir, pues si tenemos 4 y todos están iguales, pues 25% cada uno, ¿vale? 01:07:47

Entonces tenemos el componente A, B, C y vamos a ver las diferentes cosas que vamos a calcular de cada uno. 01:07:56

Lo primero que tendríamos que tener en cuenta serían las áreas que vamos a medir. 01:08:17

Como es nuestra señal, lo que nosotros utilizamos como referencia, pues tenemos que medir el área de cada uno de ellos. 01:08:22

Tendríamos aquí el área del patrón. 01:08:31

Nosotros medimos experimentalmente y, por ejemplo, esta sería 32,6, esta 42,8, estas son 73,8 y 84,9. 01:08:40

Esas son las áreas que nosotros hemos medido. 01:09:03

Primero, lo que vamos a hacer es calcular el factor absoluto o el factor de respuesta de cada uno de ellos, teniendo en cuenta la desproporción que hay. 01:09:08

Entonces, factor absoluto. 01:09:19

Para calcular el factor absoluto, lo que vamos a hacer es ver la relación entre la concentración y el área. 01:09:24

Es decir, el factor absoluto, sea del que sea, el factor de respuesta absoluto sería la concentración entre el área. 01:09:32

Concentración, sabemos que de todos es el 25% y el área va variando. 01:09:42

Entonces, del primero, que era el A, su factor de respuesta sería la concentración, que hemos dicho que era 25%, entre el área, que era 32,6. 01:09:47

Y sale un factor de respuesta de 0,76687. 01:09:59

Hacemos lo mismo con todos. 01:10:10

Pues el factor de respuesta de B sería el área, o sea, la concentración, perdón, que es 25, entre su área, que es 42,8. 01:10:12

Y nos sale un factor de respuesta de 0,5841, bueno tiene más decimales pero pues no escribir más. 01:10:24

El factor de respuesta de C, pues 25 entre el área y el área de C era 73,8. 01:10:39

Y nos sale un factor de respuesta de 0,33875. 01:10:49

Y hacemos lo mismo con D. 01:11:01

Y 25 entre 84,9. 01:11:06

Y tenemos un factor de respuesta de 0,29446. 01:11:12

Los voy a poner aquí para tenerlo organizado. 01:11:23

Una vez que ya tenemos los factores de respuesta absolutos, vamos a hacer la parte relativa. 01:11:31

Vamos a intentar comparar entre ellos por si ha habido algún error, alguna fluctuación, alguna respuesta al detector que no era la adecuada. 01:11:52

Pues intentar hacer una especie de corrección. 01:12:01

Para eso elegimos A1, el que sea, el que queráis, el factor del que sea, de A, de C, de D, del que queráis 01:12:04

Yo voy a elegir el de D, porque es el más pequeño y así ahora cuando tenga que operar me salen todos superiores a la unidad 01:12:13

Entonces, como es el más pequeño, elijo ese, pero no hay ningún problema en elegir cualquiera de los otros 01:12:24

Y ahora vamos a calcular el factor de respuesta relativo 01:12:30

Vamos a hacer un factor de respuesta más específico. El factor de respuesta relativo sería el factor de respuesta de la muestra entre el factor de respuesta de referencia. 01:12:34

Entonces vamos a operar como teníamos antes. 01:12:48

Para A teníamos un factor de respuesta, el suyo, que era de 0, 7, 6, 6, 8, 7, que es el que estoy utilizando esta columna de aquí, ¿vale? 01:12:53

O esta página de aquí. 01:13:09

Y lo vamos a dividir entre el más pequeño, que habíamos dicho que era el de D. 01:13:12

Pues 0,29446 y nos sale el factor de respuesta relativo de A, que sale 2,6043. 01:13:17

Hacemos el de B y es 0,58411 entre 0,29446 01:13:31

Y sale un factor de respuesta relativo de 1,9836 01:13:44

C, 0,33875, que era el factor de respuesta suyo absoluto, entre 0,29446 y nos sale 1,1504. 01:13:51

Y el de D, que es 0,29446 entre 0,29446, que es el de referencia, y sale 1. 01:14:12

Ya tenemos los factores de referencia relativos. 01:14:26

Por si ha habido alguna fluctuación o alguna respuesta desparejada o que ha habido algún error de respuesta, 01:14:29

pues es la forma de suprimirla, por así decirlo. 01:14:37

Y esto lo estamos trabajando solamente con la primera inyección. Voy a ponerlo aquí. Aquí tendríamos el factor relativo. 01:14:41

y ahora lo siguiente sería trabajar con la segunda inyección 01:14:53

ponemos la segunda inyección 01:15:07

y como es una muestra desconocida 01:15:09

no sabemos en qué concentración está cada uno 01:15:11

lo que sí nos da opción es a ver las áreas 01:15:14

que tenemos de cada uno de ellos 01:15:18

entonces aquí tenemos el área de la muestra 01:15:20

que también se obtiene experimentalmente 01:15:23

como área de la muestra 01:15:28

Pues 35, 22, 44 y 53 01:15:30

Y ahora vamos a aplicar esa frutación que hemos eliminado con los factores de repuesta 01:15:40

Vamos a aplicárselo a la muestra, es decir, vamos a hacer una muestra corregida 01:15:49

Para calcular el área corregida, tenemos que hacer el área de la muestra, la que hayamos puesto nosotros, por el factor de respuesta relativo. 01:15:53

No es de referencia, el factor de respuesta relativo. 01:16:09

Vamos a corregir las áreas. 01:16:13

Empezamos otra vez con A. 01:16:15

A hemos dicho que es el área de 35 por su factor de respuesta que es 260.43 y el área 01:16:17

corregida sale 91,1505. Para B utilizamos el área que era 22 por el factor de respuesta 01:16:27

y el factor de respuesta era 1,9836 y tenemos su área corregida que va a ser 43,6392. 01:16:46

Para C tenemos el área que era 44 por 1,1504 y tenemos su área corregida que es 50,6176. 01:17:02

Y por último D, que es el área que era 53, por el factor de respuesta suyo que era 1. 01:17:24

Entonces tenemos un área de 53. 01:17:36

Me vuelvo aquí y ponemos el área corregida. 01:17:41

Y ahora ya actuaríamos como una normalización de áreas como la que hemos visto antes 01:17:46

Tenemos que sumar todas las áreas y luego ya hacer la proporcionalidad 01:18:08

Si yo sumo todas las áreas, es decir, 91,1505 más 43,6392 más 50,6176 más 53, pues si yo lo sumo me sale 238,4073. 01:18:13

Y ahora para calcular las concentraciones de cada uno de ellos, pues divido su área entre el sumatorio de áreas. 01:18:41

Entonces, para A, para calcular la proporción, pues teníamos su área corregida, ¿vale? 01:18:49

Aquí estoy para calcular la porcentaje, sería el área corregida entre el sumatorio de áreas corregidas. 01:18:58

Entonces A sería 91,1505 entre el sumatorio que era 238,4073 por 100 y me da un porcentaje de A de 38,23%. 01:19:10

Para B, pues tenemos 43,6392 entre 238,4073% y tenemos un área de 18,30%. 01:19:33

Para C era 50,6176 entre 238,4073 multiplicado por 100 para que dé el porcentaje. 01:19:58

Tenemos 21,23% y para D, 53 entre 238,4073 multiplicado por 100 y da un porcentaje de 22,23%. 01:20:19

Y esas serían las proporciones en las que aparece cada uno. 01:20:46

y ahora aquí la concentración de la muestra 01:20:49

y ya está 01:20:52

ya el ejercicio se acabaría aquí 01:21:12

pero aquí sería eso 01:21:15

que normalmente se aplica el factor de respuesta 01:21:17

porque 01:21:19

si hay variabilidad en las respuestas del detector 01:21:21

entonces para 01:21:23

suprimir esa 01:21:24

lo que se hace es calcular el factor de respuesta relativo 01:21:26

y así vamos quitando 01:21:29

y ya 01:21:31

voy a dejar de compartir 01:21:34

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