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Videoconferencia 12 diciembre - Contenido educativo - Contenido educativo - Contenido educativo

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Subido el 7 de enero de 2024 por Susana A.

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Aquí tenemos ya el PowerPoint que vimos el otro día de electroforesis. 00:00:00
Si os acordáis, la electroforesis era una de las técnicas que se utilizan para analizar 00:00:06
proteínas. 00:00:15
Teníamos la diálisis, la cromatografía y la electroforesis. 00:00:16
Entonces, ¿con la electroforesis qué es lo que conseguimos? 00:00:23
Pues vamos a separar la proteína pura, vamos a identificar también las proteínas, vamos 00:00:28
a conocer también su masa molecular, la masa molecular de las proteínas que tenemos en 00:00:36
una muestra. 00:00:41
¿En qué se basa la electroforesis? 00:00:42
Pues se basa en aplicar un campo eléctrico a nuestra muestra y dependiendo de la carga 00:00:46
que tenga nuestra muestra, los componentes de esa muestra se van a desplazar hacia un 00:00:53
lado o hacia otro. 00:00:59
Hay distintos tipos de electroforesis, en un caso sería, por ejemplo, cuando tenemos 00:01:02
distintas cargas en nuestra muestra, pues las cargas positivas irían hacia el ánodo 00:01:07
y las cargas negativas se desplazan hacia el cátodo y así podemos separar los componentes 00:01:12
de nuestra muestra. 00:01:18
Y el otro día lo que vimos fue la electroforesis en gel de poliacrilamida. 00:01:20
En la electroforesis en gel de poliacrilamida lo que tenemos es un gel que tiene distintos 00:01:25
tamaños de poro por el que vamos a hacer atravesar nuestra muestra y los componentes 00:01:36
de nuestra muestra se van a separar según su masa molecular. 00:01:44
Como veis aquí estas amarillas son más grandes, luego estarían estas negras y luego 00:01:48
estas rojas. 00:01:52
Entonces, vimos que había que preparar, por una parte, el gel de poliacrilamida, es lo 00:01:53
primero que tenemos que preparar. 00:02:03
Para preparar este gel necesitamos primero acrilamida, a partir de la acrilamida, que 00:02:06
es este compuesto de aquí que tiene un doble enlace, a partir de la acrilamida se forma 00:02:14
la poliacrilamida. 00:02:20
La poliacrilamida son uniones de acrilamida, uniones del monómero acrilamida, estas cadenas 00:02:23
aquí en azul. 00:02:30
¿Cómo logramos que se una una acrilamida con otra, con otra, con otra? 00:02:33
Pues lo que hacemos es añadir persulfato amónico que es el iniciador de la reacción. 00:02:37
El iniciador de la reacción lo que va a hacer va a ser, va a romper este doble enlace de 00:02:43
aquí. 00:02:48
Se van a formar dos radicales y así se van a unir una acrilamida con otra. 00:02:49
Pero esta reacción es lenta, por lo que necesitamos un catalizador. 00:02:57
Y el catalizador es este compuesto de aquí que se llama TEMED. 00:03:01
Entonces, una vez que tenemos la poliacrilamida, o sea, polimuchas acrilamidas, lo que tenemos 00:03:07
que hacer es unir una cadena con otra cadena. 00:03:13
Y para eso añadimos bisacrilamida, este otro compuesto, bisacrilamida. 00:03:18
Y esta bisacrilamida se va a unir a una cadena y se va a unir a otra cadena. 00:03:24
Y entonces se nos va a quedar una poliacrilamida entrecruzada se dice, o sea, una poliacrilamida 00:03:30
que va a tener poros. 00:03:36
Teníamos aquí este dibujo, ya de aquí, esta sería la cadena de acrilamida, de poliacrilamida, 00:03:40
otra cadena de poliacrilamida, otra cadena de poliacrilamida y la bisacrilamida estaría 00:03:47
aquí uniendo las cadenas. 00:03:52
Aquí otra bisacrilamida, otra bisacrilamida y se generan poros. 00:03:55
Bueno, pues dependiendo de la cantidad de acrilamida y bisacrilamida que pongamos, vamos 00:03:59
a tener unos poros más pequeños o más grandes. 00:04:05
Vale, pues el gel de poliacrilamida puede ser de dos tipos. 00:04:09
A ver dónde lo teníamos. 00:04:17
Puede ser de dos tipos, uno que es todo el gel es igual, todo el gel, no hay variación 00:04:23
en el gel y luego el que se utiliza es un gel que se divide en dos partes. 00:04:31
Por una parte vamos a tener, en la parte de arriba del gel vamos a tener el gel que se 00:04:38
llama gel concentrador, que también se puede llamar gel de carga o acumulador o de compactación. 00:04:45
Esto va a ser en la parte de arriba del gel y la parte de abajo del gel va a ser el gel 00:04:54
separador. 00:05:00
Aquí lo tenemos mejor. 00:05:02
La parte de arriba gel concentrador o acumulador y abajo gel separador. 00:05:04
¿Y por qué se llama gel separador? 00:05:10
Pues porque a partir de aquí es donde van a empezar a separarse nuestras proteínas 00:05:11
según su tamaño. 00:05:17
Veis aquí, estos se llaman los pocillos, aquí es donde vamos a introducir nuestra 00:05:19
muestra. 00:05:25
Nuestras proteínas van a atravesar el gel concentrador y lo que hace el gel concentrador 00:05:27
es que todas las proteínas comiencen a separarse desde la misma posición. 00:05:33
Y a partir de aquí ya van a atravesar el gel separador y se van a ir separando. 00:05:39
Y el resultado es este que veis aquí, así, son rayas lo que vamos a ver, luego vamos 00:05:46
a ver cómo se analizan estas rayas. 00:05:52
Entonces, lo que diferencia a un gel de otro es la cantidad de acrilamida, también el 00:05:56
pH y esto lo que va a hacer es que el gel separador va a tener menor tamaño de poro 00:06:04
y entonces por eso aquí se van a separar las proteínas. 00:06:13
Sin embargo aquí el gel concentrador tiene más tamaño de poro, un poro más grande 00:06:19
y por aquí pasan todas las proteínas prácticamente del mismo, por igual, a la misma velocidad. 00:06:23
Sin embargo aquí, por la diferencia de poro, pues se van a separar unas proteínas de otras, 00:06:29
las de mayor peso molecular quedan arriba y las de menor peso molecular quedan abajo. 00:06:35
Vale, pues esto sería el gel. 00:06:40
Bueno, acordaros que dijimos que la acrilamida es tóxica, es neurotóxica y por lo tanto 00:06:45
hay que trabajar con mucho cuidado. 00:06:51
Una vez que ya tenemos al gel de poliacrilamida ya no es tóxica, lo único que, bueno, pues 00:06:54
puede quedar por ahí alguna acrilamida y entonces, bueno, tenemos que seguir trabajando con guantes. 00:07:00
Vale, eso era la parte del gel, cómo se prepara el gel. 00:07:07
Y ahora sobre ese gel, que tenemos unos pocillos como habéis visto, pues sobre ese gel vamos 00:07:13
a ir introduciendo nuestras muestras. 00:07:20
Suele haber como ocho pocillos o así y entonces vamos a ir introduciendo las diferentes muestras. 00:07:23
¿Cómo se introducen estas muestras? 00:07:31
Pues lo normal es que las muestras se introduzcan en condiciones desnaturalizantes, es decir, 00:07:34
condiciones desnaturalizantes significa que nuestra proteína ha perdido la estructura, 00:07:41
si tenía estructura cuaternaria la ha perdido, pierde la estructura terciaria y pierde la 00:07:47
estructura secundaria y se queda solo con la estructura primaria, es decir, la cadena 00:07:52
lineal. 00:08:01
¿Y qué quiere decir que pierda estas estructuras? 00:08:02
Lo que quiere decir es que hemos añadido algún compuesto o hemos calentado la muestra 00:08:08
y se han roto los enlaces que había por los puentes de hidrógeno, los puentes de 00:08:14
sulfuro, las atracciones electrostáticas, las interacciones hidrofóbicas, pues esas 00:08:18
interacciones que había se han roto y entonces nos queda la cadena de forma lineal. 00:08:26
Pues son en estas condiciones, en condiciones desnaturalizantes, es como se suele trabajar 00:08:32
con gels de poliacrilamida. 00:08:37
Y para desnaturalizar la poliacrilamida, perdón, la proteína, se utiliza este compuesto que 00:08:40
es el SDS, es el dodecyl sulfonato de sodio, que es esta molécula de aquí que tenéis, 00:08:49
o sea, son 12 carbonos y al final un azufre aquí unido a dos oxígenos y otros y el sodio. 00:08:57
Vale, pues entonces, eso, el SDS rompe estos enlaces que tenemos aquí, estos enlaces, 00:09:07
y se queda la cadena tal cual. 00:09:16
Pero una cosa importante también que hace el SDS es que carga con carga negativa, veis 00:09:19
aquí todas las cargas negativas, a la proteína, carga con carga negativa a la proteína. 00:09:26
Por lo tanto, todas las proteínas de nuestra muestra van a tener carga negativa y, por 00:09:34
lo tanto, cuando apliquemos un campo eléctrico, las proteínas, que como tienen todas carga 00:09:41
negativa, se van a dirigir hacia el cátodo, o sea, hacia abajo, se van a ir dirigiendo 00:09:49
hacia el cátodo, que estará aquí el cátodo. 00:09:55
Y las proteínas, entonces, se van a separar solo por su masa molecular, esto es importante, 00:09:59
¿vale? 00:10:06
Proteínas se separan por su masa molecular, las de mayor tamaño quedan aquí arriba, 00:10:07
después estas en color verde que son de menor tamaño y después estas que son más pequeñas. 00:10:12
Bueno, pues ya sabemos cómo preparamos el gel, cómo se introduce la muestra, bueno, 00:10:16
la muestra se introduce con unas, con pipetas, se introduce en estos pocillos de aquí, ¿vale? 00:10:27
Ahora vamos a ver un vídeo que yo creo que lo vais a entender mejor, vale, bien, pues 00:10:36
esto ya es lo que os he explicado, por aquí se introduce la muestra y las proteínas con 00:10:44
carga negativa se dirigen hacia el cátodo. 00:10:48
Bueno, pues una vez que ya, bueno, a partir de que introducimos las muestras, se aplica 00:10:52
el campo eléctrico, las proteínas se dirigen al cátodo y cuando termina la electroforesis 00:11:00
tenemos que analizar ese gel que nos ha quedado. 00:11:05
Pues para analizar ese gel lo que vamos a hacer es, lo que tenemos que hacer es teñir 00:11:12
el gel para poder ver esas rayitas que veíamos antes, para poder ver nuestras proteínas 00:11:18
y ese gel lo vamos a teñir con este producto que es el azul de coma, así, ¿vale? 00:11:24
Y se nos va a quedar una cosa así, el gel y todo con rayitas azules, ¿vale? 00:11:30
Entonces, lo que tenemos que hacer es, aparte de introducir nuestras muestras en los pocillos, 00:11:38
en uno de los pocillos tenemos que introducir una muestra que se llama muestra de referencia 00:11:47
y esa muestra de referencia nosotros conocemos, de esa muestra de referencia conocemos las 00:11:54
proteínas que tiene y conocemos sus masas moleculares y entonces, esta por ejemplo aquí 00:12:01
sería la muestra de referencia, nos salen todas estas líneas, lo que vamos a hacer 00:12:08
es medir qué distancia ha recorrido cada una de nuestras proteínas, de las de referencia, 00:12:14
medimos la distancia y la vamos a dividir entre la distancia que recorre el disolvente, 00:12:22
que el disolvente será el que aparece el último aquí, la última línea, entonces 00:12:29
medimos la distancia desde el gel separador, desde el principio del gel separador hasta 00:12:36
lo que ha recorrido la primera proteína y ese valor lo dividimos entre el valor que 00:12:42
ha recorrido el disolvente, ¿vale? 00:12:47
Pues ahora lo que hacemos es representar, representamos el RF, o sea, lo que ha recorrido 00:12:51
cada una de nuestras proteínas frente al logaritmo de la masa molecular que nosotros 00:13:01
conocemos de nuestra muestra de referencia, como conocemos la masa molecular, medimos 00:13:07
en nuestro gel que hemos analizado, medimos en nuestro gel los RF y hacemos una representación, 00:13:14
representamos esos puntos, ajustamos a mínimos cuadrados y vamos a obtener una recta, esa 00:13:23
recta como veis tiene la pendiente negativa, ¿vale? 00:13:31
Y bueno, esta sería la ordenada en el origen. 00:13:36
Y ahora a partir de esta recta, de estos valores, lo que hacemos es en nuestra muestra medimos 00:13:40
el RF de nuestras proteínas, medimos el RF, o sea, la distancia que recorre nuestra proteína 00:13:49
dividido entre la distancia que recorre el disolvente, medimos ese RF que sería esto 00:13:57
aquí en rojo, ¿vale? 00:14:04
La sustancia, la muestra desconocida y lo que hacemos es interpolar en la recta, ¿vale? 00:14:06
Metemos ese dato, el dato del RF lo metemos aquí en la ecuación de la recta, en la X 00:14:14
y de ahí deduciremos la masa molecular de nuestra proteína, de nuestra proteína desconocida. 00:14:22
¿Vale? 00:14:30
Pues entonces, importante eso, en electroforesis se aplica un campo eléctrico a la muestra. 00:14:31
En electroforesis en gel de agarosa las proteínas que estamos analizando tienen carga negativa 00:14:39
porque le hemos añadido el SDS, el dodecyl sulfato de sodio, las hemos aplicado carga 00:14:47
negativa y las hemos desnaturalizado, por lo tanto nuestras proteínas se van a desplazar 00:14:53
hacia el cátodo y el desplazamiento, el mayor o menor desplazamiento va a ser en función 00:14:58
de la masa molecular y por lo tanto vamos a poder determinar la masa molecular de una 00:15:04
muestra de una proteína desconocida. 00:15:11
Vale, pues vamos a ver un vídeo, bueno aquí os he puesto varios vídeos que están bien 00:15:14
de la Universidad de Sevilla de Valencia y también uno del CSIC, los tres están bien, 00:15:25
vamos a ver este del CSIC y los otros si queréis también los podéis echar un vistazo en casa 00:15:33
y vamos a ver cómo se trabaja en el laboratorio para que os hagáis una idea de lo que es 00:15:38
la práctica de electroforesis. 00:15:44
Vale, como no lo soléis escuchar, pues yo os lo voy contando. 00:15:59
Esto sería electroforesis en gel de poliacrilamida, entonces lo primero que hay que hacer es, 00:16:04
ahora un momento que quito los subtítulos, lo primero que tenemos que hacer es preparar 00:16:19
el gel y para preparar el gel tenemos este dispositivo de aquí, aquí podríamos preparar 00:16:28
dos geles, aquí uno y aquí otro y para ello necesitamos dos cristales, estos dos cristales 00:16:35
uno es más grande que el otro, entonces se pone uno encima del otro y el grande tiene 00:16:43
aquí en los dos laterales tiene como un reborde para que cuando introduzcamos la disolución 00:16:49
se entre los dos cristales pues pueda entrar, entonces, veis, ponemos un cristal sobre el 00:16:55
otro y lo colocamos en el dispositivo, cerramos el dispositivo para que se queden bien fijos 00:17:10
los cristales y lo ponemos en este otro dispositivo, vale y ahora ya lo que vamos a hacer es, vamos 00:17:18
a ir preparando la disolución para que se forme el gel de poliacrilamida, entonces para 00:17:28
preparar esta disolución necesitamos una disolución de acrilamida y bisacrilamida, 00:17:35
se necesita agua, se necesita SDS y luego se va a necesitar también el persulfato, 00:17:42
acordaros, el persulfato es el iniciador y se va a necesitar también el TEMED que 00:17:51
es el catalizador, entonces ahora va a ir mezclando todos los componentes de la disolución 00:17:57
vale, el agua 00:18:13
a la disolución tampón también se necesita una disolución tampón que es un tampón de tris y 00:18:26
clorhídrico, ahora la disolución de acrilamida y bisacrilamida y el SDS 00:18:33
vale, ahora se añade el persulfato de amonio que es el iniciador de la reacción 00:18:42
y ahora se añade el TEMED que es el catalizador, una vez que se añada el TEMED enseguida ya hay 00:18:53
que introducir la disolución entre los dos cristales que tenemos aquí porque el TEMED 00:19:01
lo que hace es catalizar la reacción, entonces si no lo introducimos rápido 00:19:08
pues se nos va a polimerizar aquí en el vasito 00:19:12
vale, lo mezcla un poco y ya con una pipeta PASTER 00:19:23
lo mezcla un poco con la pipeta y ya va a ir introduciendo entre los dos cristales, 00:19:29
veis que se va llenando, se va llenando los dos cristales, este sería el gel separador 00:19:35
donde se van a separar las proteínas, ahora tenemos que añadir por arriba, vamos a añadir 00:19:44
una capa de agua y esta capa de agua lo que hace es aislar a la poliacrilamida porque es que, 00:19:53
porque si no con el oxígeno del aire no gelifica, no polimeriza, por lo tanto añadimos una capa 00:20:03
de agua en el borde superior para que polimerice, veis si os fijáis aquí el vial ya en el vial ya 00:20:09
había empezado a polimerizar por eso hay que hacerlo un poco rápido, bien pues ya aquí habría 00:20:16
que esperar 45 minutos a que gelifique y el siguiente paso sería quitar el agua que hemos 00:20:23
puesto aquí arriba, vale ya quitamos el agua, tendríamos ya ahí el gel separador y ahora va 00:20:30
a preparar el gel concentrador que es el gel, la parte de arriba del gel, se mezclan los mismos 00:20:49
reactivos lo que pasa que en concentraciones diferentes y a un pH diferente, ese sería, 00:20:56
aquí ya tendríamos el témed, se mezcla y ya se introduce con la pipeta entre los cristales, 00:21:04
ahora se introduce el peine, esto de aquí es el peine y esto lo que va a hacer va a 00:21:15
generar pocillos, va a generar unos huecos cuando gelifique el gel se van a generar unos huecos aquí 00:21:21
y por aquí en estos huecos pues va a ser donde introduzcamos después nuestras muestras, ahora 00:21:32
ya lo está introduciendo en la cubeta de electroforesis, ya aquí ya una vez introducido 00:21:41
en la cubeta ya va a aplicar el campo eléctrico, aquí ya vamos a empezar ya la electroforesis como 00:21:50
tal, entonces aquí tendría, esta cubeta tiene dos electrodos, hay que colocar el negro, hay que 00:21:55
enchufarlo al negro y el rojo al rojo, esta es la cubeta de electroforesis 00:22:03
y ahora lo que se hace es añadir aquí a esta cubeta una disolución tampón, 00:22:20
se añade una disolución tampón, 00:22:51
se añade por dentro y luego se va a añadir también por fuera 00:22:58
y se quita el peine, ya nos habrán quedado ahí los pocillos, ahora tenemos este sistema 00:23:05
en amarillo que nos va a ayudar a introducir las muestras porque si no es difícil ver los 00:23:15
pocillos, entonces se pone este sistema y así es más fácil introducir las muestras. 00:23:22
Vale, veis que tenemos varios pocillos, 8, entonces en uno de ellos ya está introduciendo 00:23:33
una muestra, esta pues podría ser la de referencia, veis se van llenando los pocillos 00:23:41
y entonces aquí vamos a ir poniendo distintas muestras, pueden ser por ejemplo muestras de 00:23:53
distintos pescados, pues de atún, de lubina, de salmón y luego vamos a poder ver qué proteínas 00:23:59
tienen esos pescados, nos van a salir aquí diferentes proteínas y vamos a poder comparar 00:24:06
pues si igual hay dos pescados que son parecidos y nos aparecen proteínas también parecidas. 00:24:11
Y ya la última. 00:24:26
Y ahora ya, bueno esta sería ya la última y ya conectaríamos la cubeta al campo, o sea 00:24:27
aplicaríamos ya el campo eléctrico. 00:24:53
Cerramos la cubeta, el cable negro con el cable negro y el rojo con el rojo, le vamos 00:25:00
a aplicar aquí un voltaje y ahí hay que esperar a que las proteínas se vayan desplazando 00:25:05
a través del gel separador. 00:25:13
Vale, veis, ahora las proteínas se van a dirigir hacia el cátodo y se van a ir empezando 00:25:23
a separar. 00:25:36
Ahora ya termina la electroforesis y ya vamos a obtener nuestro gel, lo que pasa es que 00:25:44
el gel, lo que os comentaba antes, ahora mismo no se van a ver bien, no se van a ver 00:25:51
las proteínas y lo tenemos que teñir y se teñe con una disolución de azul de como así. 00:25:56
Vale, ahí tendríamos los dos cristales que los tenemos que separar. 00:26:15
Bueno, primero se le añade agua para limpiar de la disolución tampón y ahora vamos a 00:26:20
separar los dos cristales. 00:26:26
Separamos los dos cristales con esta cuña verde y en uno de los dos cristales se nos 00:26:29
quedará el gel. 00:26:34
Veis, ahí tenemos el gel, este sería el gel y ahora tenemos que teñirlo. 00:26:38
Lo se lava primero con agua. 00:26:46
¿Veis cómo es el gel? 00:26:53
Vale, y entonces ahora lo ponemos en una disolución de azul de coma así. 00:26:59
Y se deja ahí un tiempo agitando. 00:27:05
Se pone en un balancín en este aparato y ahí se deja agitando. 00:27:10
Y lo siguiente que tendremos que hacer es desteñir el gel para que solamente veamos 00:27:20
las proteínas porque si no ahora no veríamos nada. 00:27:25
Guardamos la disolución de tinción. 00:27:29
¿Veis? Ahora se nos ha quedado todo el gel azul y ahora tenemos que lavarlo. 00:27:34
Y ya nos aparecerán las bandas de las proteínas. 00:27:41
Dejamos hologramalando. 00:27:45
Están quizás aquí un poco más blanquitas, pero claro, muchas veces hay que guardarlas 00:27:51
las vamos a solvir y luego nos las voy a meter automaticamente. 00:27:59
Permiso puna. 00:28:04
Y con el tipes de vitex, es que me estoy siendo 조금 seguido. 00:28:06
Tendríamos que quitar la parte del gel concentrador para contar a partir del gel separador. 00:28:11
Ahora está añadiendo la disolución que va a desteñir. 00:28:27
Lo vuelvo a poner ahí en el balencín. 00:28:32
¿Veis? Ya empiezan a aparecer las bandas de proteínas. 00:28:42
Hay que sacar el gel con cuidado que no se rompa. 00:29:01
Y ahí ya tendríamos las bandas. 00:29:09
Y entonces ahí ya mediríamos los RFs. 00:29:12
Compararíamos con nuestra muestra de referencia y mediríamos los RFs de nuestras muestras. 00:29:15
Vale, pues este es el vídeo. 00:29:23
Ya os digo que hay otros dos vídeos de la Universidad de Valencia y de Sevilla que también están muy bien. 00:29:26
Y ahora vamos a ver de la página de Biomodel una simulación de electroforesis. 00:29:31
Entonces en esta página entráis en Biomodel, en la página de la Universidad de Alcalá de Henares. 00:29:43
Y aquí tendríamos esto en gris. Sería el gel. 00:29:51
Lo que pasa es que aquí solamente tenemos dos pocillos. 00:29:55
Y lo que tenemos que hacer es... 00:29:58
Bueno, aquí hay unos ejercicios. Vamos a entrar aquí. 00:30:01
Entonces aquí lo que nos pregunta es la influencia de la diferencia de potencial aplicada. 00:30:06
O sea, si ponemos más voltaje o menos, ¿qué es lo que ocurre? 00:30:12
¿Se separan más los patrones o se separan menos? ¿Avanzan más rápido o avanzan más lento? 00:30:18
Pues entonces lo vamos a comprobar. 00:30:23
Esto de aquí serían los patrones de nuestra muestra de referencia. 00:30:25
Entonces son distintas proteínas que conocemos su masa molecular. 00:30:31
Las marcamos y las introducimos en el pocillo, en el primer pocillo. 00:30:39
Vale. 00:30:47
Aquí. 00:30:52
Ah, añadir patrón, que no lo veía. 00:30:58
Vale, pues añadimos el patrón. 00:31:01
Esta sería nuestra muestra de referencia. 00:31:04
Y ahora vamos a añadir nuestra muestra. 00:31:07
Y de las muestras tenemos 10 problemas. 00:31:10
Pues vamos a hacer el 2, por ejemplo. 00:31:14
Vale, pues le damos a añadir muestra. 00:31:19
Y aquí se nos añade nuestra muestra. 00:31:22
Vamos a ponerle, por ejemplo, un voltaje muy bajo, del 50. 00:31:25
Y le damos a comenzar. 00:31:30
Lo demás lo dejamos igual, la velocidad y el tanto por ciento de acrilamida lo dejamos igual. 00:31:32
Y ahora le vamos a dar a comenzar. 00:31:37
¿Veis? Esta sería nuestra muestra de referencia, cómo se van separando las proteínas. 00:31:41
Lo que hay que hacer es parar cuando justo esté llegando casi al final. 00:31:48
Lo paramos. 00:31:55
Y esto de aquí, la banda esta aquí morada, es el disolvente, que es el bromofenol. 00:31:57
Y este es el que nos va a servir para calcular el RF. 00:32:05
Pues entonces, en este caso, hemos aplicado un voltaje de 50. 00:32:11
Y ahora vamos a aplicar un voltaje de 200. 00:32:15
Y vamos a ver si va más... 00:32:19
Ah, bueno, tendríamos que volver a introducir nuestras muestras. 00:32:21
Añadimos el patrón. 00:32:26
Añadimos la muestra a muestra, que era la muestra 2. 00:32:29
Y le damos a comenzar y vamos a ver qué diferencia hay. 00:32:36
Vale, pues si os fijáis, estaba bastante más rápido que la anterior. 00:32:43
Vamos a ver otra vez la de 50. 00:32:49
Añadimos patrón. 00:32:53
Añadimos muestra. 00:33:00
Y le damos. 00:33:03
Estaba bastante más lenta que a 200. 00:33:07
Entonces, el voltaje influye en la rapidez de separación. 00:33:10
Y después tendríamos la influencia de la concentración de acrilamida. 00:33:16
Entonces, dependiendo de la concentración, puede ser que los patrones se separan más, se separan menos, 00:33:21
tienen mayor movilidad o tienen menor movilidad. 00:33:28
Bueno, pues vamos a verlo. 00:33:32
Tenemos aquí concentraciones de acrilamida que van del 7,5 al 15%. 00:33:34
Pues vamos a empezar por la de 7,5. 00:33:40
Vamos a hacerlo, por ejemplo, con otra muestra. 00:33:44
Vamos a hacerlo con la muestra 4, por ejemplo. 00:33:47
Vale, los patrones los ponemos igual. 00:33:52
El voltaje vamos a ponerlo a 150. 00:33:55
Y le vamos a añadir el patrón. 00:33:59
Añadimos patrón. 00:34:01
Y añadimos muestra. 00:34:05
Y le damos a comenzar. 00:34:13
Vale, pues fijaros, quedaros con esta imagen. 00:34:16
Fijaros, la azul, la amarilla, la banda azul está bastante separada de la amarilla. 00:34:20
Esta es un poquito más juntas y esta es un poquito más separadas. 00:34:26
Pues vamos a quedarnos con esta imagen. 00:34:30
Y le vamos a añadir el patrón. 00:34:34
Y le vamos a añadir el patrón. 00:34:36
Y le vamos a añadir el patrón. 00:34:38
Y le vamos a añadir el patrón. 00:34:40
Vale, pues aquí se pueden ver las dos imágenes más separadas. 00:34:44
Pues vamos a quedarnos con esta imagen. 00:34:48
Y ahora vamos a cambiar la concentración de acrilamida. 00:34:52
Y vamos a poner el máximo, vamos a poner 15. 00:34:56
Vale, volvemos a introducir el patrón. 00:35:02
Y le damos a comenzar. 00:35:06
Vale, pues entonces, como hemos puesto mucha acrilamida, 00:35:14
aquí estas bandas, si os fijáis, están más pegadas. 00:35:18
Las bandas de mayor masa molecular están aquí más pegadas. 00:35:22
Antes nos salían más separadas. 00:35:27
Pues dependiendo de qué zona queramos ver, 00:35:29
pues vamos a elegir un tanto por ciento de acrilamida mayor o menor. 00:35:33
Y ahora vamos a ver la... 00:35:39
Vamos a dar un poquito... 00:35:42
Vale, y ahora vamos a ver la gráfica, cómo se analiza la gráfica. 00:35:47
Pues en este caso... 00:35:53
Bueno, vamos a volver a hacer la anterior. 00:35:55
A ver... 00:35:59
Sí, vamos a volver a hacer la... 00:36:01
Vamos a volver a hacer a 10, por ejemplo. 00:36:05
Añadimos patrón. 00:36:09
Añadimos muestra. 00:36:16
Le damos a comenzar. 00:36:21
No se separa éste. 00:36:29
Vamos a coger otra, porque aquí no sé por qué no se separa éste. 00:36:32
Se necesitará... 00:36:37
A ver, vamos a hacer la 1. 00:36:39
La 1. 00:36:42
Y vamos a hacer al 12%. Añadimos patrón. 00:36:46
Añadimos muestra. 00:36:54
Y le damos a comenzar. 00:36:59
Vale. 00:37:12
Bien, pues le damos a detener. 00:37:15
Y ahora vamos a ver la gráfica. 00:37:18
Esta sería la gráfica, esta sería la representación de estas bandas, de estas proteínas que tenemos en la muestra de referencia. 00:37:21
La movilidad relativa es el RF que yo os comentaba antes, que es la distancia desde aquí hasta la primera banda, 00:37:30
dividida entre la distancia desde aquí hasta lo que recorre el disolvente. 00:37:40
Y se va representando frente al logaritmo de la masa molecular. 00:37:45
En este caso nos sale una recta cuya pendiente es menos 0,94 y la ordenada en el origen es 4,81. 00:37:49
Pues entonces tendríamos que medir esta distancia de aquí, la distancia de nuestra muestra, que si pinchamos aquí la tenemos, 00:37:58
tenemos aquí la movilidad relativa que es, o sea, éste sería el avance en milímetros, son 3,08, 00:38:07
dividido entre lo que ha recorrido el disolvente, nos va a dar la movilidad relativa, que son 0,05. 00:38:14
Pues este valor de movilidad relativa lo metemos en la recta y de ahí vamos a sacar la masa molecular. 00:38:20
Vale, entonces si pinchamos aquí... 00:38:32
Vale, pues eso ya habría que calcularlo. 00:38:36
Bueno, pues esta es una simulación de la electroforesis, de cómo se lleva a cabo una electroforesis en gel de poliacrilamida. 00:38:41
Si queréis, vosotros en casa podéis también practicar. 00:38:57
Y bueno, en principio terminaríamos hoy esta parte de electroforesis. 00:39:04
No sé si tenéis alguna duda de la electroforesis o de la cromatografía o de alguna de las técnicas que hemos visto. 00:39:19
Muchas gracias. 00:39:33
Autor/es:
S.A.
Subido por:
Susana A.
Licencia:
Todos los derechos reservados
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Fecha:
7 de enero de 2024 - 17:33
Visibilidad:
Clave
Centro:
IES LOPE DE VEGA
Duración:
39′ 45″
Relación de aspecto:
1.78:1
Resolución:
1280x720 píxeles
Tamaño:
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