UT01 Videoconferencia 17-11-25 - Contenido educativo
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Pero antes de comenzar con los contenidos donde nos habíamos quedado, quería comentaros que para la semana que viene hay planteadas unas sesiones de prácticas que son de iniciación.
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Yo sé que en este módulo optativo que se ha planteado nuevo este año hay muchos alumnos matriculados ya de otros años que tienen el módulo de análisis químico, lo tienen aprobado.
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Entonces quería comentaros que estas sesiones de prácticas están pensadas sobre todo para aquellos alumnos que no han entrado nunca a un laboratorio, por eso se llaman sesiones de iniciación, tanto de análisis químico como de microbiología para que os vayáis familiarizando con el entorno de trabajo del laboratorio,
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con el laboratorio en sí y con el distinto material que vais a utilizar tanto en microbiología como en análisis químico a lo largo de todo el curso.
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Esto significa que aquellas personas que ya tengan soltura o manejo en un laboratorio o que tengan el módulo de análisis químico aprobado,
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realmente estas sesiones de prácticas no os van a aportar mucho.
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Las que se planteen ya para enero o febrero, que estamos barajando las fechas, esas sí porque ya están relacionadas con los contenidos del módulo.
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Entonces, para que no haya confusiones, que sé que algunos de vosotros me estáis escribiendo, pues que sepáis que son de iniciación y están pensadas para las personas que no han tenido nunca un contacto con un laboratorio.
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Por eso se han planteado para análisis químico y para introducción al análisis químico, ¿vale? Entonces, eso lo primero.
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Y lo segundo, pues quería comentaros también, pues que ya prácticamente estáis todos matriculados en el aula virtual y, bueno, lanzaros un poco la propuesta de a ver si queréis,
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Dentro de este módulo, los alumnos que estáis matriculados, elegir como a una persona que sea como portavoz del grupo. No es que haga funciones como de delegado en presencial, en la enseñanza presencial, porque los delegados asisten a reuniones de delegados y tal.
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No funciona igual en distancia, pero sí, si queréis, el grupo tiene algún tipo de duda, de inquietud, a lo mejor una videoconferencia no se ha subido bien o hay cualquier tipo de error, pues bueno, en lugar también de que empecéis a mandar correo o que las comunicaciones se diluyan, si hay un portavoz de la clase que sea un poco el enlace de unión conmigo, pues creo que es más fácil.
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En fin, es totalmente voluntario y es aconsejable también, ¿vale? Entonces, bueno, ahí os lo dejo, lo maduráis entre vosotros, sé que tenéis un grupo de WhatsApp, entonces pues ya lo vais decidiendo, ¿de acuerdo?
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Y ya, pues si hay alguna persona que sí quiere ofrecer voluntaria y el resto del grupo está de acuerdo, pues con que me envíéis un correo, pues yo tomo nota.
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Bueno, pues entonces, dicho esto, vamos a seguir con nuestra unidad de trabajo.
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Creo que nos quedamos en los límites de detección y de cuantificación de los métodos analíticos.
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Estábamos definiendo los parámetros de validación de un método, los parámetros cuantitativos, ¿vale?
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y los límites de detección y de cuantificación son parámetros que están muy relacionados con la sensibilidad del método
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y su cálculo o su determinación se extrae de la recta de calibración del método o también denominada recta de regresión.
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Los límites de detección y de cuantificación tenéis que tener una cosa en cuenta, que definen la cantidad de analito.
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Es decir, es una concentración. Cuando yo hablo de límite de detección y de límite de cuantificación estoy hablando de concentraciones. Son concentraciones mínimas. ¿Cuál es la diferencia entre una y otra?
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Pues el límite de detección, lo tenéis aquí hecho en la pantalla un poquito más grande, como su nombre indica, es la mínima concentración de analito que se puede detectar.
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Detectar. La palabra es detectar, no es cuantificar. Se puede detectar con un nivel aceptable de confianza. El límite de detección es muy necesario en aquellas medidas que son de carácter cualitativo.
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El límite de cuantificación, lógicamente, siguiendo la misma línea de razonamiento, me va a dar la mínima concentración de analito en una muestra, pero ésta se puede cuantificar ya con un nivel aceptable de exactitud y de precisión.
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Entonces, esa es la principal diferencia entre el límite de detección de carácter cualitativo y el de cuantificación de carácter cuantitativo. Pero ambos son concentraciones. Tener cuidado con eso, que suele ofrecer error cuando se habla de calcular el límite de detección o el límite de cuantificación.
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Se está pidiendo las concentraciones mínimas de analito en un caso y en el otro.
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Ahora vamos a ver cómo se calcula.
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Bien, entonces tenemos que el límite de detección, según la UPAC, establece el siguiente convenio.
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Aquí tenéis una fórmula en la cual se establece que la señal, que es lo que se identifica con la letra I,
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Y la señal que a mí me da el aparato en instrumento, recordad que estamos dentro de la validación de métodos instrumentales de análisis.
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Entonces, esta señal, que es la señal que corresponde al límite de detección, es decir, la señal que corresponde a esa concentración mínima, va a ser igual a la señal que me va a dar mi blanco
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más tres veces la desviación estándar del blanco.
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Lógicamente, si aquí en esta fórmula estamos introduciendo la desviación estándar del blanco
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es porque vamos a realizar una medición del blanco un determinado número de veces.
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De ahí que podamos calcular su desviación estándar.
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Esta fórmula, lógicamente, no me da una concentración porque yo estoy hablando de señales.
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Acordaros, la recta de calibrado siempre de un método me va a relacionar la señal de un aparato, que es la Y, con la concentración de mi muestra, que es la X.
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Y esa relación es la ecuación de una recta. Pues cuando yo hablo de Y en validación de métodos, estoy siempre hablando de la señal del instrumento.
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Tener eso siempre en cuenta.
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La IUPAC establece esta relación.
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Vosotros os preguntaréis si esto es una señal, ¿cómo calculo yo el límite de detección que es una concentración?
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Para ello, lo que se hace es referir estas señales, transformarlas, utilizando la recta de calibrado, al límite de detección que lo tenéis aquí abajo.
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Es decir, este límite de detección ya es una concentración y este límite de detección es igual a tres veces la desviación estándar del blanco partido por la pendiente de la recta de calibrado.
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En los problemas, cuando empecemos a relacionar estos conceptos en los problemas, veréis que vamos a jugar con estas dos fórmulas, con la señal y con la concentración, en función de los datos que a mí me dé el problema.
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Pero lo que es importante aquí es que sepamos interpretar la fórmula, es decir, que sepamos leer esta fórmula que os estoy señalando, cuando se habla de límite de detección es una concentración, y aquí esta otra fórmula me relaciona la señal del límite de detección con la señal del blanco y con la desviación estándar del blanco.
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¿De acuerdo? Así que no nos liemos y tengamos esto claro. Entonces, aquí estamos introduciendo el concepto de blanco. ¿El blanco qué es? Pues el blanco básicamente es todo lo que yo tengo en mi muestra menos el analito.
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Es decir, en términos más formales, un blanco es un medio químico idéntico al de mis soluciones patrón que yo he utilizado para construir mi recta de calibrado, pero sin el analito.
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Es decir, la concentración de analito es cero.
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Entonces vosotros os preguntaréis, bueno, si la concentración de analito es cero, el aparato no la puede detectar.
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luego si no la puede detectar, la señal del blanco debe ser cero. Esa es la teoría, la señal del blanco debería de ser cero, pero siempre todos los instrumentos tienen una respuesta a un blanco, dan una mínima señal.
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No es 0,000. La respuesta a un blanco en instrumentación analítica se denomina ruido de fondo. Esa mínima señal que me da el blanco, que en mucha bibliografía veréis como noise en inglés, se debe muchas veces a errores o factores que están vinculados al aparato, suciedad del aparato o si yo he cometido algún tipo de error a la hora de preparar la disolución patrón, etc.
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Entonces, no penséis que la señal del blanco de un instrumento es cero, sino que va a tener una mínima señal. Luego lo que se puede hacer es corregir esa señal del blanco. Corregirla no es nada más y nada menos que restarle esa mínima señal que me ha dado el blanco al resto de los patrones.
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Eso es corregirlo para dejar el blanco a cero. Eso se haría de forma analítica y en el laboratorio hay muchísimos instrumentos que tienen ya un botón que te permite corregir o adaptar, o sea, corregir el blanco a cero.
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Disculpadme. Esto es el cálculo referente al límite de detección. El límite de cuantificación prácticamente sigue el mismo razonamiento, lo único es que nos cambia la fórmula.
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Veis que la señal que me da el aparato para la concentración correspondiente al límite de cuantificación vuelve a ser la señal del blanco más 10 veces la desviación estándar del blanco.
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Por tanto, el límite de cuantificación, esa concentración mínima que es cuantificable con un nivel aceptable de exactitud y de precisión, es igual a 10 veces la desviación estándar de mi blanco partido por la pendiente de la recta de calibrado.
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¿Veis? Que son muy similares las fórmulas que nos permiten calcular el límite de detección y de cuantificación.
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Cuando nosotros, por ejemplo, tenemos una predicción de, esto es un error, se refiere a la predicción de la concentración de mi muestra y nos da un valor inferior al límite de cuantificación, lo que se debe de incluir en el análisis es inferior al límite de cuantificación.
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No es correcto decir que el límite de cuantificación no se puede cuantificar si nos decimos que es inferior al límite e indicamos ese valor.
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¿Qué es lo que nos permiten los límites de detección y de cuantificación?
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Pues nos permiten determinar en nuestro método analítico unas regiones en las que la identificación y la cuantificación son aceptables.
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Es decir, yo tengo aquí mi límite de detección, esta concentración mínima me da una señal.
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Esta señal, ¿cuál es? La señal del límite de detección, la tenéis aquí. La señal del blanco más tres veces la desviación estándar del blanco, su señal y el límite de detección.
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Por debajo del límite de detección, la identificación de mi analito se considera dudosa. Luego nosotros vamos a tener una identificación aceptable siempre en aquellos rangos que son superiores a ese límite mínimo de identificación.
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¿Y cuál es ese límite mínimo? Pues el límite de detección. El límite de cuantificación, la cuantificación se considera aceptable siempre en valores superiores al límite de cuantificación, ¿de acuerdo?
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No sé si lo entendéis, si no luego al final comentamos las dudas, pero aquí tenéis las regiones donde se considera aceptable la identificación y la cuantificación marcadas por estos límites.
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Y el resumen de su cálculo, la concentración de ambos y las señales que nos darían ambos en el aparato referenciadas al blanco y a la desviación estándar del blanco.
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¿Qué ocurre si a la hora de calcular el límite de detección y el límite de cuantificación no me dan o no tengo un valor del blanco?
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En este caso, los límites de detección y de cuantificación se calcularían utilizando lo que se denomina la desviación estándar del residuo.
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La desviación estándar del blanco puede ser sustituida por la desviación estándar del residuo, que aquí tenéis la fórmula estadística por la cual se calcula, donde tenemos que saber identificar qué significa el valor del residuo y el valor del blanco.
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Cuando nosotros hablamos del residuo lo estamos referenciando a los valores predictivos, es decir, a los valores que yo obtengo de mi recta de calibrado.
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Si nosotros miramos esta fórmula vemos que estamos comparando la señal analítica que se obtiene con unos patrones y luego la señal analítica, veis que tiene aquí este angulito encima, que es la señal de predicción.
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La concentración es el valor del instrumento y el valor de predicción es, para una concentración, el valor que yo obtengo de la recta de calibrado.
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Entonces, de ahí, restando el valor que me da el instrumento menos el que yo obtengo de la recta de calibrado para cada concentración de patrón,
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elevándolo al cuadrado, realizando su sumatorio, se obtiene la desviación estándar del residuo.
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Esto, lógicamente, se calcula con la hoja Excel o se calcula con la calculadora científica.
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Entonces, hay una cosa que tenemos que tener en cuenta cuando estamos calculando los límites de detección y de cuantificación
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y es un punto en el que normalmente se suelen cometer errores a la hora de realizar los cálculos.
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Es decir, si nosotros estamos en el laboratorio y estamos realizando un procedimiento de validación y tenemos que calcular estos límites, puede ser muy normal que nuestra muestra tengamos que diluirla o concentrarla, es decir, disminuir su concentración o aumentar su concentración antes de realizar la recta de calibrado
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para poder obtener unos límites de detección y de cuantificación que me dé el aparato que sean detectables.
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Entonces, si yo hago esas diluciones o esas concentraciones, cuando yo vaya a calcular los límites de detección y de cuantificación,
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tengo que deshacer o esa dilución o esa concentración.
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Entonces, tenemos que tener cuidado con eso, que muchas veces suelen ser puntos en los que solemos fallar. Nosotros realizamos la dilución, calculamos la recta de calibrado, aplicamos la fórmula y pensamos que el límite de detección y de cuantificación es ese, pero mi muestra ha sido diluida o concentrada, así que, por favor, no perdamos nunca el hilo de lo que hemos ido haciendo a lo largo de nuestro proceso de validación del método.
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Entonces, los valores de concentración de los patrones se van a establecer teniendo en cuenta los límites de detección, de cuantificación de nuestro instrumento y del intervalo de linealidad, que es lo que vamos a ver ahora.
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Quizá esta parte sea un poquito más difícil de entender. Lo más normal es que se trabaje con la desviación estándar del blanco, pero que sepáis que hay casos en los que no vamos a disponer de esa desviación estándar y entonces tenemos que recurrir a los valores de mi instrumento y a los valores que yo obtendría con la recta de calibrado para cada patrón.
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Y tendría que aplicar entonces esta fórmula. Bien, entonces una vez que ya tenemos claro cuáles son los límites de detección y de cuantificación, el siguiente parámetro que está relacionado con ellos es el intervalo de linealidad.
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El intervalo de linealidad es un rango, es decir, tiene un límite inferior y un límite superior en el que la señal analítica, la señal del instrumento y la concentración del analito es una línea recta, es decir, son proporcionales.
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En este intervalo de linealidad la sensibilidad se mantiene constante. Veremos ahora a continuación que la sensibilidad de un método es un parámetro que viene determinado por la pendiente de la recta de calibrado.
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Bien, entonces, el intervalo de linealidad, que también podéis verlo como intervalo útil de concentración, tiene como límite inferior el límite de cuantificación y como límite superior el límite superior de respuesta lineal o el límite de linealidad o límite superior.
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La verdad es que podéis encontrarlo en la bibliografía científica de las tres formas.
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Entonces, ¿cuál es el límite superior? El límite superior es el valor de concentración a partir del cual ya se pierde esa linealidad.
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Es decir, ya mi método no responde a una ecuación de la recta cuando yo lo represento gráficamente.
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Ese es el intervalo de linealidad. ¿Cómo se calcula?
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Para calcularlo de forma analítica se suele seguir un método iterativo que se llama y en ese método iterativo se va a verificar que se cumple la expresión que os estoy señalando en la pantalla.
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¿Esto qué quiere decir? Que la señal experimental o la señal que me va a dar mi aparato menos la señal de predicción, es decir, la señal que yo obtendría sustituyendo en la ecuación de la recta de calibrado el valor de la concentración patrón en valor absoluto,
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es decir, siempre en positivo, referenciada a la señal de predicción, tiene que ser menor o igual
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de 0,03. Esto quiere decir que el límite superior nos va a proporcionar una señal que no se aparta
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de la linealidad en más de un 3%. Si nos fijamos en esta fórmula y recordamos la fórmula
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de lo que era un error relativo, aquí lo que estamos comparando es la señal experimental
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con la señal de predicción y ese error relativo debe de ser inferior al 3%. Esta es básicamente
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la interpretación de esta fórmula. Entonces, esto se calcularía siempre aplicando de forma
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práctica en distintos intervalos dentro de la recta de calibrado. Veremos un ejemplo
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cuando lleguemos a los problemas aplicando esta ecuación y ver que se cumple esta proporción.
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En el momento que nuestra proporción supere el 3%, ya se puede admitir que la concentración utilizada para verificar esta ecuación no forma parte del intervalo de linealidad.
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No es el límite superior. El límite superior o el intervalo de linealidad que es el que tenéis aquí, veis que aquí tenemos una línea recta, este intervalo de linealidad a mí me permite determinar mi zona de trabajo.
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Es la zona en la que tenemos una relación proporcional entre la concentración o la masa de nuestro analito y la respuesta que me da el instrumento.
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El límite inferior viene dado por el límite de cuantificación y el límite superior es aquel a partir del cual ya se pierde la linealidad.
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Veis que aquí ya mi método no responde a una recta. Si yo prolongo la recta por aquí, ya estoy viendo que toda esta parte no sigue una proporción directa o linealidad.
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Tiene otro tipo de relación, la que sea, pero ya no es lineal. Entonces, por encima del límite superior tendremos lo que se denomina zona de saturación y por debajo del intervalo de trabajo tenemos lo que se denomina zona muerta,
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que corresponde a concentraciones muy bajas en las cuales la respuesta no es lineal.
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Nosotros siempre debemos de movernos en nuestro intervalo de linealidad o zona de trabajo.
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Ahora sí, vamos al siguiente parámetro de validación de métodos,
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parámetro cuantitativo que está relacionado con los límites de detección y de cuantificación que
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es la sensibilidad. La sensibilidad de forma analítica, tenéis aquí la fórmula, es la
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relación que existe entre la variación de la señal analítica, este triangulito en matemáticas
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significa variación, es decir, cuánto me varía a mí en el eje Y la señal cuando yo la concentración en el eje X la varío.
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Por tanto, a nivel, digamos, cuantitativo, la sensibilidad se va a expresar como la pendiente de la recta de calibrado.
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Este, digamos, la letra B, el factor B, es lo que se denomina sensibilidad, que corresponde a la pendiente de la recta.
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La pendiente también, creo que lo comentamos en la sesión anterior, se define como el ángulo que forma cada recta con el eje X.
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Lógicamente, cuando este ángulo es mayor, por ejemplo, mirad la recta de color azul,
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Si este ángulo es mayor, variaciones pequeñitas de concentración me dan respuestas de señal grandes. Entonces, ahí estoy teniendo un método que es muy sensible.
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¿Por qué es muy sensible? Porque yo al variar la concentración unas pocas unidades, el aparato me da una respuesta de señal, una variación en la respuesta de señal grande.
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Si variaciones pequeñitas de concentración me dan variaciones de respuesta pequeñas, fijaros la recta en verde, ese método es poco sensible.
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Luego, por tanto, a mayor sensibilidad tendremos mayor pendiente en nuestra recta de calibración.
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Los últimos parámetros que vamos a ver correspondientes a los parámetros cuantitativos de validación de métodos es la selectividad y la robustez.
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No confundir selectividad con sensibilidad. La selectividad es la capacidad que tiene un método analítico para poder determinar esa sustancia de interés o analito de una manera específica en presencia de otros componentes que forman parte de la matriz.
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Es un parámetro que se debe tener en cuenta cuando se determinan analitos en muestras complejas, sobre todo cuando la matriz puede tener otros compuestos que puedan ser interferentes o que sean similares al analito.
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Es en este caso cuando la selectividad cobra importancia a la hora de determinarla en el proceso de validación.
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Y, por último, tenemos la robustez. ¿Cómo de robusto es un método analítico? ¿Qué nos sugiere la palabra robustez? Pues nos está indicando la resistencia que tiene el método analítico al cambio cuando se van a variar algunas condiciones experimentales en las que ese método se desarrolla.
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Es decir, la robustez es el grado de reproducibilidad de un método analítico que se va deliberadamente a someter a variaciones operacionales y medioambientales.
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¿Para qué? Para conocer su estabilidad. Ese es el concepto de robustez y cómo influye esa variabilidad sobre los resultados, o sea, qué nivel de dispersión me van a producir en los resultados.
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Bien, pues entonces, llegados hasta aquí y haciendo una recapitulación, lo que hemos visto en la primera sesión de videoconferencias y en esta hemos visto es la definición y cómo se calculan con los distintos parámetros estadísticos los, digamos, bueno, herramientas estadísticas, perdonadme,
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los principales parámetros de cuantificación en la validación de un método analítico.
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La exactitud, la precisión, el límite de detección, el límite de cuantificación, el intervalo de respuesta lineal.
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Acordaros que teníamos unos parámetros que eran cualitativos y unos parámetros de carácter cuantitativo.
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Una vez que nosotros ya hemos visto cómo se calculan y se definen estos parámetros, ¿en qué consiste el diseño experimental de una validación?
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Mirad, en la práctica, llevar a cabo una validación consiste en conocer cuáles son las prestaciones que ofrece este método.
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Es decir, hay que evaluar los parámetros de calidad del método, hay que determinar estos parámetros que hemos comentado hasta ahora.
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Y para ello podemos llevar a cabo la aplicación repetida de ese método a materiales de referencia.
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Podemos realizar la comparación de los resultados obtenidos del método que se está validando con los resultados que se obtienen por otros métodos.
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Se puede realizar una evaluación sistemática de aquellos factores que influyen en el resultado, se puede realizar una evaluación de la incertidumbre de los resultados, estudios de reproducibilidad entre varios laboratorios, que es lo que se denomina interlaboratorio o de validación externa,
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que se utilizan muchísimo cuando se van a validar métodos de referencia o métodos oficiales que se llevan a cabo por laboratorio de reconocido prestigio.
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Entonces, como veis, el diseño experimental de una validación es un proceso complejo, es un proceso largo y es un proceso que lleva una inversión de tiempo
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y una inversión de material muy alta. Estos parámetros de calidad deben de ser validados
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cuando se va a determinar la validación del método, pero van a depender de las características
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del método en sí. Es decir, si nosotros vamos a validar un método cualitativo, puede
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ser suficiente determinar el límite de detección y la selectividad. Tiene sentido porque el método
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es cualitativo, no vamos a cuantificar nuestro analito, vamos a detectar su presencia o ausencia,
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por ejemplo. ¿Qué ocurre con los métodos cuantitativos? Pues en este caso, como mínimo,
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fijaros que os remarco la palabra mínimo porque a partir de exactitud, precisión e intervalo de
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linealidad, el resto de parámetros cuantitativos que hemos visto es el laboratorio el que va a
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determinar en su procedimiento de validación si se van a determinar o no. Pero como mínimo la
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exactitud, la precisión y el intervalo de linealidad son los parámetros cuantitativos que se deben
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determinar. Fijaros que en el intervalo de linealidad ya tenemos implícito el cálculo del
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límite de cuantificación y del límite superior que acabamos de explicar. Entonces, tener en cuenta
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que siempre a la hora de validar un método se determinará por el propio laboratorio cuáles son
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los parámetros que se deben de determinar. Aquí tenéis, en un caso u otro, los parámetros mínimos.
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La validación, el procedimiento en sí, como os he comentado anteriormente, es un procedimiento bastante largo,
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debe de estar documentado, porque así lo exige la norma de competencia técnica, y se lleva a cabo en varias etapas.
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La primera etapa, lo que hacemos en esta etapa es establecer un plan de validación y este plan de validación debe de contener un alcance, es decir, el método de ensayo que se va a utilizar, se va a definir también qué analito y la matriz o matrices para las que se valida.
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Y luego el diseño experimental de esa validación. Análisis de blancos, que es un método que veremos a continuación que se utiliza como control de calidad interno, si vamos a utilizar materiales de referencia, número de repeticiones que se van a realizar, cuáles van a ser las condiciones de trabajo, etc.
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Y por último, se tiene que especificar los materiales y el instrumental necesario para llevar a cabo esa validación. Una vez que se ha establecido el plan de validación, se desarrollan las actividades de validación de acuerdo a este plan que se ha establecido.
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Una vez que ya se han determinado esas actividades y se han obtenido estos parámetros de validación, ¿qué se realiza? La evaluación de los resultados. ¿Cómo? Pues actualmente se llevan a cabo mediante el uso de herramientas estadísticas e informáticas.
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Es verdad que muchos laboratorios, sobre todo los laboratorios de industria farmacéutica, ya están muy automatizados y tienen ellos implementados el software LIMS, pero otros laboratorios están en proceso de digitalización y muchos de ellos se utilizan como herramientas informáticas hojas Excel.
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Por eso es importante que nos vayamos familiarizando y soltando en el manejo de las hojas de cálculo.
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Una vez que ya se han evaluado los resultados, lo que hay que realizar es el informe de validación. El informe de validación va a plasmar los resultados que se han obtenido en ese proceso de validación y se va a realizar una declaración de aplicabilidad del método.
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Esto está relacionado con la definición que vimos de validación al principio de la unidad de trabajo.
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Vuelvo para atrás, he salido de pantalla completa, a lo mejor se os ve ahora un poquito más pequeñito, pero para recordaros la definición de validación que la teníamos al principio de la unidad,
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Pues vemos que validar consiste en demostrar con pruebas documentales que el método analítico cumple los requisitos para una aplicación específica concreta.
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A esto es a lo que nos referimos cuando en el informe de validación se debe hacer una declaración de la aplicabilidad del método, es decir, si ese método cumple esos requisitos para ese caso o esa aplicación concreta.
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El informe de validación debe de ser realizado por la persona responsable de ese estudio de validación del método.
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Hasta aquí hemos visto la primera parte de nuestra unidad de trabajo, que estaba basada en la definición de validación y cuáles eran los principales criterios de validación.
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que vimos que eran los criterios cuantitativos, supremos y básicos, y luego los criterios de carácter cualitativo o los criterios de practicabilidad.
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Una vez que ya hemos visto la primera parte, nuestra segunda parte está encaminada al control de calidad interno y externo en los laboratorios.
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Y aquí, en esta segunda parte, vamos a abordar, aparte de lo que implica y qué actividades se llevan a cabo en el control de calidad interno y externo, la parte de los gráficos de control.
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Bien, pues aquí tenéis otra vez el extracto normativo de la norma de competencia técnica 17.025 en la cual se establece el procedimiento de control de calidad en los laboratorios.
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Veis que esa obligatoriedad viene establecida en el punto 5.9.1, donde el laboratorio debe de establecer sus procedimientos de control de calidad para llevar a cabo un seguimiento de la validez de sus ensayos.
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Los resultados obtenidos deben de registrarse de forma que puedan detectarse tendencias y, cuando sea posible, aplicar técnicas estadísticas para la revisión de los resultados.
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¿De acuerdo? Entonces, la norma 17.025 nos establece, lógicamente, que los datos de control de calidad deben de ser analizados y si no satisfacen los criterios establecidos,
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se deben de tomar aquellas acciones correctoras para corregir el problema y evitar consignar o registrar resultados que sean incorrectos.
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Ese seguimiento, que debe de ser planificado y revisado, se puede llevar a cabo mediante el uso de materiales de referencia certificados
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certificados o con un control de calidad interno utilizando materiales de referencia secundarios.
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Una vez que ya tenemos claro que el control de calidad interno en los laboratorios viene
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exigido por norma, vamos a ver cómo se lleva a cabo. Entonces, los resultados de este control
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de calidad interno, como os he dicho antes, ¿para qué se utilizan? Pues para determinar que nuestro
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método de ensayo funciona correctamente y se puede proceder a aplicarlo en nuestras técnicas
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de rutina, es decir, lo puedo aplicar a analizar mis muestras y los resultados se pueden enviar
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al cliente, si no, no tiene ningún sentido. ¿De acuerdo? Entonces, en el control de calidad interno,
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¿qué operaciones vamos a llevar a cabo? Vamos a llevar a cabo un análisis de blancos, análisis
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de muestras ciegas y análisis de muestras de control. Este análisis de muestra de control
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se plasma en los gráficos de control. Un análisis de blancos. Vemos que aquí tenéis
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marcado en rojo el blanco, el instrumento me va a dar una señal analítica no atribuida
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al analito y puede interferir en su determinación. Entonces, nosotros podemos encontrarnos blanco
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de patrones, blanco de proceso y blanco de matriz. Estos son los tres tipos de blancos
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que un laboratorio puede utilizar cuando lleva a cabo un control de calidad interno utilizando
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el análisis de blancos. El blanco de patrones, pues digamos esa solución blanco, ¿cómo se prepara? Pues se prepara teniendo únicamente en cuenta
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los reactivos introducidos en los patrones, nada más. Cuando yo además tengo en cuenta el sistema analítico, es decir, no solo los reactivos,
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sino los equipos, el proceso, el analista y el ambiente, mi blanco se denomina blanco de proceso y el blanco de matriz es ese blanco que resulta cuando se forma un complejo con el analito presente en la muestra,
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De forma que no pueda ser detectado. Aquí tenemos los tres tipos de blancos a utilizar. ¿Cuál es el siguiente que hemos visto? El análisis de muestras ciegas.
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Veis que como su nombre indica, muestras ciegas son muestras que tienen un contenido conocido de analito que se procesan de forma rutinaria por los analistas del laboratorio sin conocer que son muestras de control.
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Es decir, los analistas no conocen que lo que están procesando es una muestra de control, de ahí que se llame muestras ciegas. Y los análisis de muestras de control, que era el otro tipo de control de calidad, tienen como objetivo chequear o monitorizar el desempeño del método de ensayo.
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Es decir, digamos de alguna manera corroborar que el método funciona de manera continua.
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Las muestras de control se basan en analizar muestras que contienen el analito de interés en una concentración conocida en las series de análisis que el laboratorio realiza en una jornada determinada.
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Entonces, la diferencia entre análisis de muestras ciegas y muestras de control es que en el caso de muestras ciegas los analistas desconocen lo que están determinando en la muestra de control si saben que están tratando con muestras de control y que lo que van a verificar es el desempeño de ese método.
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Como materiales de control, el laboratorio suele utilizar materiales de referencia certificados y materiales de referencia internos y muestras adicionadas con patrones.
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Bien, entonces, los gráficos de control. Los gráficos de control lo que nos permiten es la representación de las concentraciones medidas a un material de referencia o a una muestra de control en distintas sesiones de trabajo.
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¿Veis? Aquí tenemos los puntos azules. Vemos que en las muestras de control la concentración está perfectamente definida. Existen dos tipos de gráficos de control, los gráficos Sheward y los gráficos de Kusum.
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Aquí tenemos un ejemplo del gráfico SIGWAR. Para realizar el gráfico SIGWAR se suelen determinar entre 20 o 30 réplicas o determinaciones de las muestras de control.
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Entonces vemos que aquí en el gráfico Sheward tenemos establecido una serie de líneas que se denominan líneas de control y líneas de aviso y un valor central que corresponde al valor medio obtenido de las réplicas que se han determinado.
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Entonces, si vosotros miráis lo que os estoy señalando aquí a la izquierda, vemos que en torno al valor medio se van a distribuir los distintos puntos entre los valores que corresponden a tres veces la desviación estándar y menos tres veces la desviación estándar, más dos veces y menos dos veces.
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Es decir, digamos que el gráfico Sheward se aplica porque nuestras determinaciones corresponden a una campana gaussiana, es decir, a una distribución normal.
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Y esto nos permite poderlos encuadrar entre los límites superiores o límites de control que están entre más menos, que lo tenéis aquí, tres veces la desviación estándar y la línea de aviso superior e inferior que está en los límites de más menos dos veces la desviación estándar.
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Siempre en torno a este valor medio.
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Por tanto, cuando nosotros vamos a determinar un gráfico Shigua, nosotros lo que tenemos es que calcular nuestro valor medio de nuestras determinaciones y los límites de control y de aviso.
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Los límites de aviso se calculan con esta fórmula, es decir, el valor medio más menos dos veces la desviación estándar partido por la raíz de n, que es n mi número de determinaciones, y los límites de control, el valor medio más menos tres veces la desviación estándar partido por la raíz de n.
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Y una vez que nosotros marcamos nuestras líneas, podemos observar cómo quedan nuestras determinaciones, los distintos puntos que vienen determinados aquí en la diapositiva de color azul.
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Veis que en este caso no existe ningún punto que se nos salga de la línea de control, ni por el nivel superior ni por el nivel inferior.
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Vemos que tenemos dos puntos que se nos salen del límite de aviso superior y un puntito que lo toca,
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pero del límite de aviso inferior no tenemos ninguno que se salga y el resto se encuentran contenidos en torno al valor medio entre los límites de aviso superior e inferior.
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Entonces, una vez que nosotros hemos representado gráficamente nuestros puntos y hemos calculado nuestros límites,
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vamos a ver cuáles son los principales criterios de determinación de si nuestro método está fuera de control o no.
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Aquí tenéis un ejemplo hecho con la hoja Excel, donde tenemos cada cuadrito azul, viene a representar los puntitos anteriormente,
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que os he dicho anteriormente, que son estos puntitos, y tenemos en rojo los límites superiores e inferiores de control y en verde el límite superior e inferior de aviso.
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Las fórmulas con las que lo hemos calculado y aquí tenéis el valor medio.
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Mirad, cuando vamos a representar o cuando tengáis que realizar un gráfico de control, tenéis que tener cuidado a la hora de escoger la escala.
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Este digamos que es el punto que más conflicto suele generar, porque el gráfico realmente cuando vosotros en la hoja Excel lo construís y hacéis las distintas columnas,
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ya os subiré un ejercicio resuelto para que veáis cómo se calcula con la hoja Excel,
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lógicamente lo que tenemos nosotros que determinar es cuál es esta escala del eje Y y del eje X.
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¿Para qué? Para que los puntos se vean con una determinada resolución. Ese es quizá el punto más conflictivo. Veis que aquí la escala va de 5 en 5, 5, 10, 15, 20. Si esta escala la hacemos muy grande o muy pequeña, pues la resolución del gráfico se puede ver mejor o peor.
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Ese es el único punto que tenemos que tener en cuenta. El resto es únicamente realizar los cálculos de los distintos límites y del valor medio conforme a las fórmulas que hemos comentado.
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Bien, entonces, vamos a la interpretación de los resultados.
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Mirad, aquí os he puesto los distintos casos, desde la A a la H, que pueden dar, digamos, indicios de que un método analítico está fuera de control.
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Pero los puntos que más, digamos, habituales o que con más frecuencia os vais a encontrar en el laboratorio son el caso A y el caso B.
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Es decir, un punto que lo tenemos fuera de los límites de control, se refiere a los límites superiores de control, o dos puntos consecutivos más allá de los límites de aviso.
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Por ejemplo, es el caso que teníamos aquí. Aquí tenemos estos dos puntos, están fuera del límite de aviso superior, luego en este caso tendríamos este método, por ejemplo, lo tendríamos fuera de control.
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Si tuviéramos algún punto fuera de los límites de control superior e inferior, también sería indicio de que el método analítico que estamos trabajando con él en el laboratorio también se encuentra fuera de control.
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Otros casos que os podéis encontrar menos frecuentes son los que os he listado aquí de los puntos C a H.
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Pero insisto que los que más os vais a encontrar o los más habituales son el que nos encontremos puntos fuera de los límites de control, superior e inferior, o dos puntos consecutivos más allá de los límites de aviso.
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El siguiente gráfico de control también se denomina gráfico CUSUM.
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Es un gráfico de sumas acumuladas, esto CUSUM es el acrónimo de sus siglas en inglés.
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Se trata de gráficos que son más sensibles que los gráficos SHIWAR a determinar situaciones de falta de control estadístico.
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En este tipo de gráficos lo que vamos a representar frente al tiempo es la suma de las sucesivas diferencias entre el resultado obtenido y el valor de referencia.
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Si lo comparamos con el gráfico Shigua, lo que nosotros hemos representado es el valor medio y luego cómo se distribuyen nuestras concentraciones.
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El gráfico Kusum va a trabajar con la representación de las sumas sucesivas diferenciadas.
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Consiste en aplicar esta fórmula.
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c sub n es el cusum, la suma acumulada que corresponde a la sesión enésima
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bien, x sub i son los valores individuales que se obtienen en las sucesivas sesiones de trabajo
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y x puede ser el valor de referencia o el valor medio
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bien, cuando nosotros estamos trabajando con un gráfico cusum
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Para interpretar los resultados, nosotros lo que vamos a realizar en este caso, en el gráfico CUSUM, se va a utilizar una plantilla que tiene forma de V y entre cuyos brazos es donde tienen que quedar incluidos todos los puntos de nuestro gráfico.
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Es decir, la representación es diferente a como lo hemos explicado en el gráfico SIGUAN. Aquí lo que tendríamos que construir en el laboratorio debe de disponer de esa plantilla V.
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Esta plantilla normalmente viene dibujada sobre un plástico transparente, ahora vamos a ver unos ejemplos, y la vamos a colocar sobre nuestro gráfico con la bisectriz.
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La bisectriz es la división que existe entre el ángulo que forman los dos segmentos de la V, la división de ese ángulo por la mitad, eso es la bisectriz.
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Se coloca paralela al eje de ordenadas y el vértice, lo que es el extremo, se va a colocar a una cierta distancia de la última observación del gráfico.
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Si alguna de, digamos, la línea CUSUM corta alguno de los brazos de la V, podremos decir que nuestro método está fuera de control.
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Normalmente, en los laboratorios se suelen utilizar como el valor de 30 grados para construir la V, el ángulo que forman los dos segmentos de la V, y el valor de 2 para la distancia al vértice.
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Mirad, aquí lo vamos a ver. Esta sería nuestra plantilla, ¿veis? La plantilla V, si nosotros la prolongamos, sería esta de aquí.
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Este ángulo que forma es 30 grados y esta distancia desde el vértice hasta este punto es lo que hemos dicho de 2.
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Entonces, nosotros cuando colocamos sobre nuestro gráfico de sumas acumuladas construido y colocamos nuestra plantilla, que la podéis ver así o la podéis ver en forma de V.
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En este caso, nosotros la hemos colocado aquí para determinar la situación de fuera de control de nuestro método y vemos que los valores que hay desde este punto hacia la izquierda no hay ningún valor que corte los brazos de nuestra plantilla.
00:54:47
Luego, en este caso, todos los valores están dentro de nuestra V, este método no se encuentra fuera de control. Estos son los dos tipos de gráficos que se suelen utilizar en el control de calidad interno de los laboratorios.
00:55:06
En industria farmacéutica se suele utilizar con bastante frecuencia el gráfico Sheward.
00:55:27
Hasta aquí ya hemos visto lo que es nuestro control de calidad interno y las conclusiones que hemos de extraer.
00:55:34
Pues tenemos básicamente que la adecuación de un método analítico a un problema determinado, para ver si ese método puede resolver ese problema o esa situación, se va a establecer como en función de los parámetros de calidad que ofrece ese método.
00:55:45
Entre esos parámetros tenemos parámetros de carácter cuantitativo que se calculan con herramientas estadísticas, son la exactitud, la precisión, la sensibilidad, límite de detección, límite de cuantificación, intervalo de trabajo lineal, selectividad y robustez.
00:56:09
La selección de un método analítico debe de tener en cuenta estos parámetros en función de los requisitos exigidos para el problema analítico que se pretende resolver o el analito que vamos a determinar.
00:56:33
En la validación de los métodos de ensayo, como en el análisis de los datos que provienen del control de calidad, ¿qué vamos a utilizar? Pues vamos a utilizar herramientas estadísticas y gráficos de control.
00:56:52
Y las buenas prácticas de laboratorio, que son también otro tipo de normativa de competencia técnica, que ya la estudiaréis en el módulo de calidad, proponen requisitos similares, pero la norma une en ISO 17025 son los que los presentan de forma más detallada.
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Y además esta norma es aplicable a los laboratorios de calibración y ensayo.
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Entonces, hasta aquí hemos abordado la unidad de trabajo número 1 que es referente a la validación de los métodos analíticos.
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Os recuerdo que tenéis los contenidos del tema en PDF aquí en el apartado de contenidos y os subiré una tarea y unos ejercicios de aplicación práctica de lo que acabamos de ver para nuestra siguiente sesión.
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Bueno, son las cinco menos cuarto y antes de cerrar la videoconferencia, quería preguntaros si tenéis algún tipo de duda. Voy a mirar el chat porque realmente no tenemos ningún mensaje.
00:58:19
Bueno, no sé si tenéis algún tipo de duda o no. Si queréis que pare la videoconferencia, vamos, la grabación la paro y si no, podemos resolver las dudas en conjunto.
00:58:33
Bueno, mirar, el problema que le ocurre a esta unidad de trabajo es que abordar el concepto de validación sin estar realizando una validación real en un laboratorio, pues lógicamente resulta un poco abstracto.
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Porque hemos visto una serie de parámetros estadísticos y una serie de conceptos que en algunos casos se van a determinar todos y en otros nos determinará el laboratorio cuáles son los parámetros que en ese caso hay que determinar.
00:58:59
Pero vosotros pensar nada más que con el propio concepto en sí que hemos visto, el proceso de validación es un proceso bastante largo y es un proceso muy complejo que tiene que ser planificado de una manera muy concisa antes de llevar a cabo una validación.
00:59:13
Aquí lo que tenéis que centraros mucho es, no solo en el concepto de validación, sino en qué casos se procede a validar un método y en cuáles no, y la diferencia entre validación y verificación.
00:59:29
Porque un método que es normalizado y un método que es aceptado y exigido por normativa no tiene sentido validarlo. En ese caso, la norma nos pide verificarlo, pero verificar implica también determinar el desempeño o qué laboratorio es capaz de desenvolverse con ese método.
00:59:45
Es decir, que de alguna manera hay que chequear también parámetros estadísticos. Entonces, centraros en eso y luego en qué significa cada parámetro estadístico.
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¿Qué significa la exactitud de un método? ¿Qué significa la precisión? Los límites de detección y de cuantificación, que son concentraciones, no nos confundamos con las señales que nos da el instrumento, cómo se relacionan entre sí y os habéis dado cuenta que todo pivota alrededor de la recta de calibrado.
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Así que, por favor, repasaros con vuestra calculadora científica cómo tenéis que manejaros con la parte de estadística, porque cada calculadora tiene una forma de trabajar diferente.
01:00:42
Vale, entonces buscaros las instrucciones si no las sabéis manejar y empezar a mirar cómo trabajáis con la calculadora científica.
01:00:58
Y ahora, para la siguiente videoconferencia, pues voy a subiros unos ejercicios que vamos a ir resolviendo y que están basados en estos parámetros de, digamos, de cuantificación de la validación de los métodos.
01:01:08
Bueno, yo por mi parte si no tenéis ningún tipo de duda más, pues dejamos la videoconferencia, nos vemos dentro de 15 días, así os doy tiempo para que lo vayáis repasando y os iré subiendo los ejercicios y un cuestionario también para que os ayude a repasar estos conceptos.
01:01:26
Bueno, pues entonces desearos buena semana.
01:01:49
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- 25 de noviembre de 2025 - 18:00
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- 1h′ 01′ 59″
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