Saltar navegación

UT4 - Técnicas de PCR - 3ª Parte - Contenido educativo

Ajuste de pantalla

El ajuste de pantalla se aprecia al ver el vídeo en pantalla completa. Elige la presentación que más te guste:

Subido el 1 de diciembre de 2023 por Pedro M.

37 visualizaciones

Más información Transcripción

Descargar la transcripción

Bien, vamos a continuar con el tema 6. 00:00:00
Hoy vamos a ver lo que llamamos la PCR estándar o convencional, 00:00:03
también se le llama PCR básica. 00:00:07
Es el modelo de PCR diseñado por Mewlis en 1983 00:00:10
y se le llama PCR estándar porque es la forma más sencilla, 00:00:16
más simple de PCR. 00:00:20
A partir de ella vamos a ver después una serie de modalidades 00:00:23
que se han ido desarrollando pero teniendo siempre como base 00:00:26
esta PCR estándar o convencional, como también se le suele llamar. 00:00:31
Esta PCR convencional es la que se utiliza de forma rutinaria 00:00:35
cuando queremos hacer un análisis, un primer análisis por PCR. 00:00:39
Ya veréis que es la más sencilla y no permite la cuantificación 00:00:43
sino sencillamente la amplificación de un fragmento de DNA 00:00:48
y su detección en un DNA molde. 00:00:52
¿De acuerdo? 00:00:55
Entonces, en esta PCR estándar o convencional 00:00:56
vamos a amplificar un solo fragmento de DNA, 00:01:00
por tanto vamos a necesitar una pareja de primers nada más, 00:01:03
un único par de cebadores o de primers 00:01:08
y vamos a hacer un único proceso de amplificación a tiempo final. 00:01:11
Es decir, que vamos a analizar los resultados 00:01:16
una vez hayan acabado todos los ciclos de la PCR. 00:01:20
Veremos más adelante que la PCR a tiempo real 00:01:24
en la cual vamos a ir analizando cómo se amplifican los fragmentos, 00:01:28
cómo van apareciendo en la reacción a tiempo real, ciclo a ciclo. 00:01:33
Después de cada ciclo vamos a ir viendo 00:01:39
cómo se van amplificando los fragmentos, 00:01:41
pero esto lo veremos más adelante. 00:01:44
Para entender bien el funcionamiento de la PCR convencional 00:01:47
vamos a profundizar como cuatro apartados fundamentales. 00:01:50
Primero, lo primero que vamos a ver es la mezcla de reacción, 00:01:55
es decir, yo quiero hacer una PCR, 00:01:59
sabemos que necesitamos una serie de componentes 00:02:01
que ya vimos algunos en la explicación del otro día, 00:02:04
faltan muchos más componentes 00:02:09
porque necesitamos una mezcla de reacción 00:02:11
para que en el tubo de PCR se pueda llevar a cabo 00:02:13
la reacción en cadena, en cadena de la polimerasa. 00:02:16
¿De acuerdo? 00:02:20
En segundo lugar, vamos a ver cómo se prepara esa mezcla de reacción. 00:02:21
Es tremendamente importante preparar bien la mezcla 00:02:25
para que nuestros resultados sean fiables 00:02:29
y luego sean reproducibles, 00:02:32
es decir, que la PCR que hago con la muestra de un paciente hoy 00:02:34
me sirva y sea extrapolable 00:02:39
y la pueda comparar con las PCR que hago con las muestras de otros pacientes 00:02:43
mañana, pasado, la semana que viene 00:02:48
o que puedan hacer en otro laboratorio. 00:02:50
Por tanto, la mezcla de reacción que está bien hecha 00:02:52
hace que la PCR sea fiable y sea reproducible. 00:02:56
Luego veremos cómo programamos el termociclador, 00:03:01
cómo es el programa de una PCR convencional, 00:03:04
qué fases tiene, qué etapas tiene 00:03:07
y por último veremos un pequeño apartado de análisis 00:03:09
cómo analizamos el resultado una vez ya ha finalizado la PCR. 00:03:12
¿De acuerdo? 00:03:19
Vamos a entrar a ver la composición de la mezcla de reacción. 00:03:20
La mezcla de reacción no es ni más ni menos que una mezcla de reactivos. 00:03:25
Va a contener todos los reactivos necesarios 00:03:31
para que pueda llevarse a cabo in vitro una reacción de PCR 00:03:35
o una reacción in vitro de replicación del DNA, 00:03:40
de amplificación del DNA. 00:03:43
Es decir, en la mezcla de reacción tengo que tener todos los componentes 00:03:45
para que la DNA polimerasa pueda leer el DNA a molde 00:03:49
y realizar las copias de amplificación. 00:03:54
Esta mezcla de reacción no es ni más ni menos que un tampón. 00:03:58
¿De acuerdo? 00:04:03
Un tampón adecuado. 00:04:04
En este tampón van a ir disueltos todos los reactivos 00:04:05
que vamos a ir viendo ahora después. 00:04:09
Y este tampón lo que aporta es un pH idóneo 00:04:11
y una concentración salina idónea 00:04:14
para que la DNA polimerasa actúe con un máximo de fidelidad. 00:04:17
¿Qué es esto de la fidelidad? 00:04:24
La fidelidad, el máximo de fidelidad, 00:04:26
se entiende como que la PCR, 00:04:29
decimos que la PCR tiene una alta fidelidad 00:04:34
y la DNA polimerasa ha hecho una reacción de alta fidelidad 00:04:37
cuando no se ha equivocado al introducir un nucleótido. 00:04:40
¿De acuerdo? 00:04:46
Por tanto, el tampón de la mezcla de reacción 00:04:47
nos aporta un pH y una concentración de sales 00:04:51
que permiten que la DNA polimerasa realice una reacción de PCR 00:04:55
con el máximo de fidelidad. 00:05:00
Un ejemplo. 00:05:03
Normalmente estos tampones suelen ser una mezcla de una base, 00:05:04
que es tris, 00:05:10
o sea, una sustancia básica con cloro de potasio. 00:05:11
Tris, cloro de potasio. 00:05:15
Y el pH suele ser alto, entre 8 y 3, 9, 00:05:17
que es el pH idóneo para que la DNA polimerasa 00:05:21
pueda funcionar de forma óptima. 00:05:24
¿De acuerdo? 00:05:27
Comercialmente, estos tampones para la mezcla de PCR 00:05:29
no los hacemos en el laboratorio. 00:05:33
Podríamos hacerlo comprando tris, 00:05:37
comprando cloro de potasio 00:05:39
y ajustando el pH a 8, 3, 9, 00:05:41
a este rango de pH, 00:05:44
pero lo normal es comprarlo comercialmente 00:05:46
y normalmente vienen concentrados. 00:05:49
Dos veces concentrado, dos por, 00:05:52
cinco veces concentrado, cinco por 00:05:54
o diez veces concentrado. 00:05:56
Eso significa, esto significa que 00:05:58
si yo utilizo un tampón de PCR cinco por, 00:06:01
cinco por, por tanto cinco veces concentrado, 00:06:06
al tubo de reacción tendré que poner 00:06:09
un volumen cinco veces diluido. 00:06:12
¿De acuerdo? 00:06:16
Todo esto lo vamos a ver, 00:06:17
haremos ejercicios, haremos cálculos y problemas. 00:06:18
¿De acuerdo? 00:06:23
Esto se entenderá mucho mejor con los problemas. 00:06:24
Pero vamos, fundamentalmente, 00:06:27
la mezcla de reacción tiene un componente fundamental 00:06:29
que es el tampón, aporta el pH y las sales 00:06:32
para que el ADN a polimerasa actúe de forma fiel. 00:06:35
Suelen ser tampones de tris y cloro de potasio 00:06:39
y vienen concentrados. 00:06:43
¿De acuerdo? 00:06:45
En este tampón es donde yo voy a disolver, 00:06:46
voy a ir añadiendo el resto de componentes 00:06:48
que vamos a ver ahora. 00:06:50
El cloruro de magnesio, los DNTPs, 00:06:52
es decir, los nucleótidos de oxinucleótidos, 00:06:55
pero en este caso son trifosfato, 00:06:58
son nucleótidos que no llevan un fosfato, 00:07:01
sino que llevan tres, 00:07:03
los primers, por supuesto, 00:07:05
la polimerasa, que se suele utilizar 00:07:07
para la PCR convencional, 00:07:10
la tac-polimerasa y el DNA molde. 00:07:11
¿De acuerdo? 00:07:15
Vale, pues vamos a ir viendo ahora 00:07:17
en esta mezcla de reacción 00:07:19
cada uno de estos componentes. 00:07:20
El primero de ellos es el cloruro de magnesio. 00:07:26
El cloruro de magnesio es muy importante, 00:07:29
no tanto por el cloruro, 00:07:32
ya sabéis que es una sal, 00:07:34
el cloruro de magnesio es una sal binaria, 00:07:35
no tanto por el cloruro, sino por el magnesio, 00:07:38
porque es importante añadir magnesio, 00:07:40
porque la DNA polimerasa 00:07:42
utiliza el magnesio como cofactor. 00:07:43
Si no hay magnesio, 00:07:46
la DNA polimerasa no puede actuar 00:07:47
y por tanto podremos poner kilos y kilos 00:07:49
de DNA polimerasa que estará inactiva. 00:07:52
¿De acuerdo? 00:07:56
Por tanto, la ausencia de cloruro de magnesio 00:07:58
y también el exceso 00:08:00
inactivan la DNA polimerasa. 00:08:05
Esto es muy importante. 00:08:08
Es decir, la ausencia, 00:08:10
una concentración muy baja, 00:08:11
es como si no hubiera puesto, 00:08:13
si la concentración es muy baja, 00:08:14
si no tiene una cantidad de magnesio mínima, 00:08:15
la DNA polimerasa no va a actuar. 00:08:19
Pero si pongo en exceso, 00:08:21
también se va a inhibir la reacción de PCR 00:08:23
y sobre todo va a disminuir la fidelidad. 00:08:26
Por tanto, es muy importante el cloruro de magnesio. 00:08:30
Podemos jugar con su concentración. 00:08:33
Normalmente, a nivel comercial, 00:08:35
la concentración inicial, 00:08:39
que es lo que va a ir apareciendo aquí, 00:08:41
es la concentración del tubito 00:08:43
que yo compro en la casa comercial. 00:08:46
El cloruro de magnesio viene siempre a 25 milimolar. 00:08:48
Y la concentración final se refiere a la concentración 00:08:52
que tiene que haber en el tubo de PCR 00:08:55
antes de que empiece la reacción. 00:08:58
Entonces, la concentración final 00:09:00
suele estar en torno a 1,5 milimolar. 00:09:02
¿De acuerdo? 00:09:05
Esto es una concentración media 00:09:06
y con el cloruro de magnesio podemos jugar. 00:09:09
¿De acuerdo? 00:09:12
Podemos jugar, 00:09:13
podemos subir hasta 2 milimolar, 00:09:14
2,25, incluso 2,5 milimolar, 00:09:17
no mucho más, 00:09:20
y podemos disminuir a 1 o incluso 0,75 milimolar. 00:09:21
¿De acuerdo? 00:09:25
Por tanto, 00:09:26
el primer componente que voy a poner en el tampón, 00:09:27
en la mezcla de reacción, 00:09:30
es el cloruro de magnesio. 00:09:31
Muy importante porque el magnesio es cofactor 00:09:33
de la DNA polimerasa. 00:09:36
Si no hay suficiente magnesio ahí en exceso, 00:09:37
la DNA polimerasa no funciona bien 00:09:41
y, por tanto, 00:09:44
la eficiencia de la reacción es bajita. 00:09:45
El segundo componente son los DNTPs. 00:09:48
Los DNTPs son los deoxinucleótidos trifosfato. 00:09:51
Ya hemos dicho antes 00:09:55
que son los nucleótidos normales. 00:09:56
Los 4 deoxinucleótidos 00:09:58
es una mezcla de los 4 deoxinucleótidos, 00:10:01
esto es importante, 00:10:04
adenina, timina, guanina y ciptosina, 00:10:05
los 4, 00:10:09
su concentración inicial es 10 milimolar. 00:10:10
Muy importante, 00:10:14
los 4 deoxinucleótidos, 00:10:16
los 4 DNTPs, 00:10:18
yo los compro comerciales, 00:10:20
ya mezclados. 00:10:22
También podría hacer yo la mezcla 00:10:24
y comprar los 4 DNTPs por separado, 00:10:26
pero muy importante, 00:10:29
la concentración final de esa mezcla 00:10:31
es 10 milimolar 00:10:34
y la concentración de cada uno de los DNTPs 00:10:36
tiene que ser idéntica. 00:10:39
Por tanto, 00:10:41
adenina, timina, guanina y ciptosina 00:10:42
deben estar a una concentración 00:10:45
de 2,5 milimolar. 00:10:47
Me imagino que se entiende, ¿de acuerdo? 00:10:50
2,5 milimolar por 4 nucleótidos 00:10:53
me da una concentración de 10 milimolar. 00:10:56
Y yo en el tubo, 00:11:00
normalmente se suele utilizar en el tubo de PCR, 00:11:01
una concentración final de DNTPs 00:11:04
de 200 micromolar aproximadamente. 00:11:07
¿De acuerdo? 00:11:11
Es una burrada. 00:11:12
¿Vale? 00:11:15
Pongo DNTPs en exceso. 00:11:16
Poner muchísimos DNTPs 00:11:18
no inhibe la reacción. 00:11:21
Lo que hace es que la reacción sea más cara 00:11:23
porque los DNTPs no son baratos. 00:11:26
De todas maneras, 00:11:28
el componente más caro de aquí, 00:11:29
como veremos ahora, 00:11:30
es la DNA polimerasa, 00:11:31
la TAC polimerasa. 00:11:32
¿De acuerdo? 00:11:34
Por tanto, muy importante. 00:11:35
Suele venir comercialmente ya la mezcla 00:11:37
de los 4 DNTPs a 10 milimolar. 00:11:39
La concentración de cada uno de ellos 00:11:42
debe ser idéntica. 00:11:44
Por tanto, 2,5 milimolar. 00:11:46
Y la concentración final en el tubo de reacción 00:11:48
suele estar en torno a 200 micromolar. 00:11:52
Los cebadores. 00:11:57
El forward y el reverse. 00:11:58
¿De acuerdo? 00:12:00
Los cebadores. 00:12:01
Normalmente, los cebadores los diseñamos 00:12:02
en el ejercicio que habéis hecho 00:12:06
con el gen de GPX. 00:12:08
Habéis diseñado unos cebadores específicos, 00:12:14
un forward, un reverse. 00:12:16
¿De acuerdo? 00:12:18
Cada uno de ellos tiene que estar 00:12:19
a la misma concentración, 00:12:23
a 10 micromolar, 00:12:24
que suele venir a esta concentración inicial 00:12:26
en el tubo comercial. 00:12:30
Normalmente, el tubo comercial 00:12:32
viene mucho más concentrado 00:12:34
y nosotros hacemos alícuotas. 00:12:36
Es decir, lo diluimos en tubitos 00:12:38
que los llamamos alícuotas. 00:12:40
Terminología nueva 00:12:42
que creo que hasta ahora no la hemos utilizado. 00:12:44
Por tanto, del tubo comercial que me llega 00:12:46
yo hago diluciones que son alícuotas 00:12:49
que las voy a dejar a 10 micromolar. 00:12:52
¿De acuerdo? 00:12:54
Por tanto, mi concentración inicial 00:12:55
de cebadores, 00:12:57
tanto del forward como del reverse, 00:12:58
de los dos, cada uno de ellos, 00:13:00
tiene que estar a 10 micromolar. 00:13:02
Y la concentración final 00:13:04
suele estar en torno a 200-400 nanomolar. 00:13:06
Fijaos que vamos bajando de escala. 00:13:11
Milimolar, micromolar, mil veces menos, 00:13:13
nanomolar, mil veces menos. 00:13:16
¿De acuerdo? 00:13:18
Si pongo un exceso de cebadores, 00:13:19
si no se inhibe la reacción, 00:13:22
lo único que puede pasar 00:13:25
es que haya tantos cebadores 00:13:26
que se empiecen a pegar 00:13:28
por cualquier sitio del DNA molde 00:13:29
y amplifique la polimerasa, 00:13:32
fragmentos, de forma inespecífica. 00:13:34
Entonces, la concentración de los cebadores 00:13:37
sí es crítica en la mezcla de reacción. 00:13:40
¿De acuerdo? 00:13:43
Va. 00:13:45
La DNA polimerasa. 00:13:46
Para la PCR convencional 00:13:48
ya hemos dicho que normalmente 00:13:49
se suele utilizar la TAC polimerasa. 00:13:50
Ya la conocemos. 00:13:52
La TAC polimerasa, igual que todos los enzimas, 00:13:54
no viene expresada en unidades de concentración, 00:14:01
sino en lo que llamamos unidades internacionales. 00:14:04
Esta es una unidad de actividad enzimática. 00:14:08
Es decir, lo que viene a decir esto 00:14:12
es que cuando me llega el tubito 00:14:15
que acabo de comprar con la TAC polimerasa 00:14:17
y me pone 2,5 unidades por microlitro, 00:14:20
significa que si yo cojo un microlitro 00:14:24
de ese tubo comercial, 00:14:27
en ese tubo hay 2,5 unidades 00:14:30
de actividad enzimática. 00:14:34
¿De acuerdo? 00:14:36
Bueno, el uso de unidades internacionales 00:14:38
para los enzimas se utiliza muchísimo. 00:14:41
Entonces, normalmente la DNA polimerasa 00:14:45
suele estar en torno a 2,5 a 5 unidades por microlitro 00:14:47
y dependiendo del tipo de DNA polimerasa que tenga, 00:14:51
suele variar en el tubo de reacción. 00:14:56
Se suele poner de 1 a 2,5 unidades de actividad. 00:15:00
Por tanto, si voy a poner 2,5 unidades de actividad 00:15:05
en mi tubo, tendría que pipetear un microlitro 00:15:10
si está a 2,5 unidades microlitro, 00:15:14
pero si el tubo me ha llegado a 5 unidades microlitro, 00:15:18
para tener en mi tubo 2,5 unidades, 00:15:22
tendría que añadir 0,5 microlitros. 00:15:25
Bueno, esto quizás es un poquito lioso, 00:15:28
pero no tiene ninguna complicación. 00:15:31
Haremos problemas, haremos problemas 00:15:35
y veréis que no es nada difícil. 00:15:37
¿Qué polimerasa utilizo para mi PCR convencional? 00:15:41
¿Cuál elijo? ¿La tag polimerasa? 00:15:45
¿La tag polimerasa gold, que es de máxima fidelidad? 00:15:47
Pues depende de tres parámetros 00:15:50
y esto es muy importante y lo tenéis en el libro. 00:15:52
El primer parámetro depende de la fidelidad. 00:15:54
Es decir, si yo, imaginaos que la PCR que quiero hacer 00:15:58
es solamente detectar, por ejemplo, la PCR de la COVID, 00:16:03
es sencillamente quiero detectar 00:16:08
si el paciente tiene o no tiene RNA del virus. 00:16:10
Por tanto, lo único que me interesa, 00:16:14
como vamos a ver más adelante, 00:16:16
es si es positivo o es negativo. 00:16:18
Que la DNA polimerasa haya cometido más o menos errores, 00:16:21
me da igual. 00:16:24
Por tanto, puedo utilizar una tag polimerasa baratita, 00:16:26
porque lo único que quiero es que amplifique. 00:16:29
Si amplifica, significa que el paciente es positivo. 00:16:32
Si no amplifica, significa que el paciente es negativo. 00:16:34
Pero si yo lo que quiero es amplificar un gen 00:16:37
para luego clonarlo en un vector 00:16:41
y hacer estudios funcionales en células, 00:16:43
es decir, si yo ese gen que he amplificado 00:16:46
luego lo voy a usar para otros experimentos, 00:16:48
necesito que lo haya copiado bien 00:16:51
y que la tag polimerasa no haya cometido errores. 00:16:53
Por eso necesito lo que llamamos 00:16:56
las DNA polimerasas de alta fidelidad. 00:16:58
Por tanto, primer parámetro 00:17:01
que miro para elegir la polimerasa, la fidelidad. 00:17:04
El segundo, la longitud del fragmento. 00:17:08
Es decir, no es lo mismo amplificar 200 pares de bases, 00:17:11
500 pares de bases, 00:17:14
que tener que amplificar 3,5 kilobases, 00:17:16
es decir, 3500 pares de bases. 00:17:19
Hay polimerasas que funcionan mucho mejor 00:17:22
cuando lo que queremos es amplificar fragmentos grandes. 00:17:25
Segundo parámetro, longitud del amplicón. 00:17:29
Y tercer parámetro, la secuencia que tenemos que amplificar. 00:17:33
No es lo mismo una secuencia muy rica en adeninas y timinas 00:17:37
que una secuencia muy rica en citosinas y guaninas. 00:17:41
¿De acuerdo? 00:17:44
Por tanto, tres parámetros para poder elegir la polimerasa. 00:17:45
La fidelidad, la longitud del amplicón 00:17:49
y la secuencia concreta. 00:17:52
¿De acuerdo? 00:17:55
Muy bien, pues ya hemos visto cuatro componentes 00:17:56
que vamos a ir poniendo en la mezcla de reacción 00:17:59
en cada tubo a estas concentraciones. 00:18:02
El magnesio, que es el cofactor, 00:18:05
los DNTPs, los elevadores forward y reverse. 00:18:07
Por tanto, pondré 200 o 400 nanomolar del forward 00:18:12
y 200-400 nanomolar del reverse 00:18:17
y la DNA polimerasa. 00:18:19
¿Qué más necesito añadir? 00:18:21
El DNA molde, por supuesto. 00:18:24
Si no pongo DNA molde, la polimerasa... 00:18:26
Los elevadores no pueden hibridar con nada 00:18:29
y la polimerasa no tiene nada que copiar 00:18:32
porque no tiene nada que leer. 00:18:34
Por tanto, el DNA molde es tremendamente importante. 00:18:36
¿De acuerdo? 00:18:40
Entonces, ¿cuál es la concentración inicial? 00:18:41
Pues no la sé. 00:18:45
A priori, no la conozco. 00:18:46
Estas sí que las conozco porque son las comerciales. 00:18:48
Pero si yo es un DNA que he extraído de un paciente, 00:18:52
de unas células que me han llegado de un paciente, por ejemplo, 00:18:56
o un DNA que hemos extraído como el que purificasteis, 00:19:00
hicimos en la práctica, 00:19:04
es decir, la extracción y purificación que hicisteis en la práctica, 00:19:06
midiendo la absorbancia 260, 00:19:09
yo calcularía, como hicisteis en la práctica, 00:19:11
la concentración inicial de mi DNA molde. 00:19:14
Por tanto, a priori, no sé cuál es la concentración. 00:19:17
Lo que sí sé es el rango de concentraciones que se necesitan 00:19:21
en el tubo de PCR, 00:19:26
la concentración final que deben tener, 00:19:28
dependiendo de qué tipo de DNA es. 00:19:31
Si es un DNA plasmídico, un plásmido bacteriano, 00:19:34
está con poquita cantidad suficiente. 00:19:38
0,1 a un nanogramos. 00:19:41
Esto sería 1 por 10 elevado a la menos 9. 00:19:44
O sea, prácticamente nada. 00:19:48
Con muy poquito que ponga. 00:19:50
Si es un DNA plasmídico, es suficiente para que amplifique bien. 00:19:53
De 1 a 10 nanogramos si es el DNA cromosómico bacteriano. 00:19:57
¿Vale? El DNA... 00:20:02
Pero si es un DNA eucariota, por ejemplo, de levaduras, 00:20:04
o DNA nuclear, nuclear de células humanas, por ejemplo, 00:20:07
necesito mucha mayor cantidad. 00:20:13
¿Por qué? Porque hay tanta cantidad de DNA. 00:20:15
Imaginaos que es el DNA genómico de una célula eucariota humana. 00:20:19
46 cromosomas gigantescos. 00:20:24
Muy largos, muy grandes, muy complejos, con histonas. 00:20:27
¿Se entiende? 00:20:31
Para que los cebadores, para que los primers, 00:20:32
encuentren la secuencia diana, 00:20:35
necesito poner mucha mayor cantidad de DNA. 00:20:38
¿Ya os dais cuenta? 00:20:42
Que es prácticamente un orden de magnitud. 00:20:44
10 veces más, 100 veces más. 00:20:47
¿De acuerdo? 00:20:50
A grandes rasgos, como regla general, 00:20:52
se suelen poner, si no tenemos mucha idea, 00:20:55
se suelen poner 10 nanogramos de DNA 00:20:59
por cada microlitro de mezcla de reacción. 00:21:02
Es decir, yo he puesto aquí de 100 a 500 ya, 00:21:06
pero de 100 a 500 están 200, 250, 300, 429, 00:21:10
¿se entiende? 00:21:16
¿Qué cantidad pongo? 00:21:18
Pues esta regla de oro es muy importante. 00:21:20
Se estima unos 10 nanogramos de DNA 00:21:23
por cada microlitro de la mezcla de reacción. 00:21:26
Imaginaos que la PCR la voy a hacer en 50 microlitros. 00:21:30
La reaction mix son 50 microlitros por 10. 00:21:35
En ese tubo tendría que añadir 500 nanogramos. 00:21:42
¿Se entiende? 00:21:45
Espero que sí. 00:21:47
Del DNA molde, el libro nos recuerda, 00:21:50
yo no voy a entrar porque ya lo hemos dado, 00:21:54
lo hemos estudiado y lo hemos examinado, 00:21:56
nos recuerda que el DNA tiene que tener suficiente calidad 00:21:59
y debe haber suficiente cantidad. 00:22:03
En cuanto a la cantidad, lo acabamos de ver. 00:22:06
En cuanto a la calidad, 00:22:08
pues ya sabemos qué significa calidad. 00:22:11
Primer parámetro de calidad de un DNA molde, la integridad. 00:22:14
¿Cómo vemos la integridad? 00:22:17
Si os acordáis, corriendo el DNA en un gel de agarosa. 00:22:19
Si es un plásmido, un cromosoma bacteriano 00:22:22
o es DNA eucariota, ya sabemos, DNA genómico, 00:22:26
ya sabemos que en el gel de agarosa se ve diferente. 00:22:29
Primer parámetro, integridad. 00:22:32
Segundo parámetro, los contaminantes, la pureza. 00:22:34
Y esto acordaos que ya lo hemos medido 00:22:39
con las absorbancias 260, 230 y 280, 00:22:42
haciendo los cocientes, ¿os acordáis? 00:22:46
No voy a entrar en detalle porque ya lo sabemos. 00:22:48
Lo nuevo es esto que hemos visto, 00:22:52
de qué cantidad tengo que poner el DNA molde. 00:22:54
Muy importante, muy importante, 00:22:56
y el libro no hace mención, 00:22:58
hay que ceñirse a estas cantidades. 00:23:02
Uno puede decir, bueno, pues, 00:23:04
para asegurarme de que va a amplificar la polimerasa, 00:23:07
en lugar de 500, pues voy a poner 800 nanogramos. 00:23:10
Vale. 00:23:15
Una cantidad excesiva de DNA inhibe la reacción de PCR. 00:23:17
Para que nos aclaremos y nos entendamos, 00:23:22
la DNA polimerasa se aturulla, ¿de acuerdo? 00:23:24
No me pongáis esto en el examen, 00:23:28
pero es para que nos entendamos. 00:23:31
Hay tal cantidad, tal maraña de fibras de DNA 00:23:33
en el tubo de PCR que la DNA polimerasa 00:23:37
es incapaz de encontrar los sitios de hibridación 00:23:40
donde están los primers, ¿de acuerdo? 00:23:43
Y, por tanto, se inhibe la eficiencia 00:23:45
de la reacción de PCR. 00:23:49
Por tanto, no por poner mucho DNA es mejor. 00:23:51
Hay que poner el DNA justo, ¿vale? 00:23:55
Siguiendo esta regla, ¿de acuerdo? 00:23:58
Es lo mismo que la polimerasa, no lo he comentado antes, 00:24:00
pero uno puede decir, bueno, pues, 00:24:03
para que me funcione muy bien, 00:24:04
en lugar de 2,5, pues, yo le voy a poner 5 unidades, ¿vale? 00:24:06
Para poner más polimerasa de la que tocaría, 00:24:12
no inhibe la reacción. 00:24:16
Lo que ocurre es que si en lugar de poner 2,5 pongo 5, 00:24:19
ese tubito de reacción me va a costar el doble de caro. 00:24:23
Y la DNA polimerasa es muy cara, muy cara. 00:24:27
Un tubito de DNA polimerasa con el buffer, 00:24:31
con el buffer de reacción, reaction buffer, 00:24:36
concentrado con 100 microlitros aproximadamente, 00:24:39
o sea que tendríamos, 00:24:43
si tuviésemos que poner un microlitro de la polimerasa, 00:24:44
tendríamos para 100 reacciones. 00:24:47
Daos cuenta que en el termobloque, 00:24:49
o sea, sí, el bloque térmico de los termocicladores, 00:24:53
los termocicladores están programados para 96 muestras. 00:24:59
O sea que con un tubo de 100 microlitros, 00:25:04
si tengo que poner un microlitro, 00:25:06
básicamente el tubo me lo fundo 00:25:08
poniendo todos los tubos del termociclador. 00:25:10
Vale. 00:25:13
A lo que voy, que me estoy enrollando. 00:25:14
La DNA polimerasa, un tubito de 100 microlitros con su buffer, 00:25:17
que te suelen venir dos tubitos de buffer, 00:25:21
te puede costar en torno a 200 euros. 00:25:25
Entonces, si en lugar de poner 2,5 pongo el doble, 00:25:28
pues me va a salir el doble de caro. 00:25:33
Esto es importante. 00:25:36
Por tanto, cuidaremos la calidad y la cantidad del DNA molde. 00:25:39
Y por último, hay determinadas ocasiones, 00:25:44
imaginaos que yo he diseñado unos primers de nuevo, 00:25:49
no son primers que los conozco porque los acabo de diseñar, 00:25:52
como habéis hecho vosotros. 00:25:55
He puesto cloro de magnésio 1,5, 200 micromolar de DNTP, 00:25:56
he puesto estas cantidades de DNA eucariota. 00:26:01
Es la primera vez que hago esa PCR con esos primers 00:26:04
y no me funciona. 00:26:07
¿Qué hago? 00:26:09
¿Dónde ha estado el fallo? 00:26:11
¿Los cebadores están mal diseñados? 00:26:13
¿Los puedo coger y tirarlos? 00:26:15
¿Hay algún componente, algún reactivo que no funciona? 00:26:17
Pues lo normal es, 00:26:20
hay una serie de aditivos y potenciadores 00:26:22
que puedo utilizar, 00:26:25
que me ayudan a que la PCR funcione mejor 00:26:27
y la DNA polimerasa actúe de forma más óptima. 00:26:31
No vamos a entrar en detalle, los tenéis en el libro, 00:26:35
pero utilizar estos aditivos, 00:26:38
normalmente cuando tenga bajo rendimiento, 00:26:40
esto es muy importante, 00:26:43
¿de acuerdo? 00:26:45
No me ha funcionado la PCR, 00:26:46
no ha amplificado casi nada, 00:26:47
por tanto he tenido un bajo rendimiento 00:26:48
o en segundo lugar, 00:26:50
cuando me habían salido un montón de bandas 00:26:52
y por tanto ha amplificado muchos fragmentos, 00:26:55
los cebadores se han pegado por ahí, 00:26:58
en el DNA molde, 00:27:00
no solamente a su sitio específico, 00:27:01
sino también a otros. 00:27:03
¿Qué aditivos se suelen utilizar? 00:27:04
Tenéis una tablita en el libro, 00:27:06
se suele utilizar DMSO, 00:27:08
lo vamos a ver ahora después, 00:27:09
y la formamida. 00:27:10
La formamida la conocemos, 00:27:12
si os acordáis del tema 4 de hibridación. 00:27:13
La formamida, 00:27:16
los dos, tanto el DMSO como la formamida, 00:27:17
lo que me ayudan es a la desnaturalización, 00:27:21
a que el DNA molde se abra mejor 00:27:24
y por tanto se desnaturalice mejor 00:27:26
y la polimerasa pueda entrar mejor. 00:27:29
¿De acuerdo? 00:27:32
Muy bien. 00:27:34
Falta un componente que no está en el libro, 00:27:37
lo voy a decir después. 00:27:40
Bueno, lo iba a decir después, 00:27:42
lo voy a decir ahora. 00:27:43
Por tanto, en la mezcla de reacción, 00:27:44
si os dais cuenta, 00:27:46
tenemos, 00:27:47
tiro para atrás, 00:27:48
el buffer, 00:27:50
que suele venir concentrado, 00:27:52
tenemos cloro de magnesio, 00:27:54
DNTPs, 00:27:56
tenemos los primers, 00:27:57
tenemos la polimerasa, 00:27:59
el DNA molde, 00:28:00
si se requiere algún aditivo 00:28:01
y agua. 00:28:03
¿De acuerdo? 00:28:05
Agua. 00:28:06
Lo veremos ahora después. 00:28:07
Hay que añadir agua 00:28:09
y no es agua cualquiera, 00:28:10
no es agua del grifo, 00:28:11
sino que es agua miliQ, 00:28:12
agua bi-destilada, 00:28:14
estéril, 00:28:16
por tanto autoclavada 00:28:18
y preparada para técnicas de biología molecular. 00:28:19
No vale cualquier tipo de agua. 00:28:22
¿Vale? 00:28:24
Muy bien. 00:28:25
En cuanto a la preparación de las muestras, 00:28:26
cuando yo voy a preparar la mezcla de reacción, 00:28:31
tengo que calcular qué volumen 00:28:34
al tampón de reacción, 00:28:36
le tengo que poner qué volumen, 00:28:39
tengo que poner de magnesio, 00:28:41
de DNTPs, 00:28:42
todo esto lo voy a ir calculando, 00:28:43
lo voy calculando, 00:28:45
lo vais a calcular, 00:28:46
voy a hacer infinidad de ejercicios 00:28:47
porque es muy importante 00:28:49
y un problema de estos saldrá en el examen, 00:28:50
sí o sí, seguro. 00:28:53
Y dependiendo del volumen final, 00:28:56
el volumen final, 00:29:01
normalmente la especie reconvencional 00:29:02
se suele hacer o en 25 o en 50, 00:29:04
pues imaginaos que yo he ido calculando 00:29:08
y tengo que poner 1,5 microlitros de esto, 00:29:11
0,5 microlitros de esto de los cebadores, 00:29:14
1 microlitro de cada uno de la polimerasa, 00:29:17
pues 0,5 microlitros del DNA molde, 00:29:20
voy a poner, no lo sé, 20 microlitros. 00:29:24
¿De acuerdo? 00:29:29
Voy sumando, voy sumando cada uno de estos volúmenes 00:29:30
y tengo que llegar a un volumen final de reacción. 00:29:35
Hemos dicho que el volumen final 00:29:39
de la reacción de PCR 00:29:40
normalmente suele ser o 25 microlitros 00:29:41
o 50 microlitros. 00:29:44
Entonces, hasta el volumen final de 25 o de 50, 00:29:46
lo que voy a añadir, 00:29:51
voy a ajustar al volumen final 00:29:53
y voy a añadirlo de agua preparada, 00:29:56
agua estéril, 00:29:59
se le llama agua estéril de grado PCR 00:30:01
o para técnicas de biología molecular. 00:30:04
¿De acuerdo? 00:30:07
También se puede comprar comercial 00:30:08
o se coge agua biodestilada, 00:30:09
la autoclavas y la esterilizas. 00:30:11
O sea que es mucho más barato. 00:30:13
¿De acuerdo? 00:30:15
Por tanto, el componente que nos faltaba 00:30:16
lo vamos a utilizar al final 00:30:18
para ajustar al volumen de reacción. 00:30:20
¿De acuerdo? 00:30:23
Normalmente, el agua es lo primero que se pone en el tubo. 00:30:25
Esto ya lo veremos y lo haremos en prácticas. 00:30:29
¿De acuerdo? 00:30:31
En segundo lugar, 00:30:33
en cuanto a la preparación de las muestras, 00:30:35
es que no vamos a preparar, 00:30:38
y esto es muy importante, 00:30:40
una mezcla de reacción, 00:30:42
una mezcla con todos los componentes, 00:30:44
por cada uno de los tubos que tenga que analizar. 00:30:47
Es decir, imaginaos, 00:30:50
imaginaos que me ha llegado al laboratorio 00:30:53
y tengo que analizar 10 muestras de pacientes, 00:30:55
10 muestras de pacientes. 00:30:58
Por tanto, necesito 10 tubos de PCR. 00:31:00
La pregunta es, 00:31:03
¿hago 10 tubos, 10 mezclas de reacción? 00:31:05
¿O no? 00:31:11
La respuesta es no. 00:31:13
Nunca se hacen 10 mezclas de reacción diferentes, 00:31:16
sino que hacemos una supermezcla 00:31:19
con todos los componentes, 00:31:22
tampón, clodo de magnesio, 00:31:24
DNTPs, cebadores, polimerasa, agua, 00:31:26
la ponemos, menos el DNA molde. 00:31:29
¿De acuerdo? Esto es lo que llamamos 00:31:33
la mezcla máster. 00:31:36
Nadie habla de la mezcla máster, 00:31:39
por favor no me pongáis esto en el examen, 00:31:41
que yo solo de verlo aquí me duele el estómago. 00:31:43
¿De acuerdo? Todo el mundo habla de la máster mix, 00:31:46
MM, máster mix. 00:31:48
¿De acuerdo? ¿Qué es una máster mix? 00:31:50
Es una mega mezcla de reacción 00:31:52
que va a contener el volumen 00:31:56
de mezcla de reacción 00:31:59
para los 10 tubos de los pacientes. 00:32:01
¿De acuerdo? 00:32:04
Por ejemplo, 00:32:10
suponiendo que el volumen final 00:32:12
de cada tubo de PCR son 50 microlitros, 00:32:15
ya hemos dicho que vamos a ajustar 00:32:18
el volumen al volumen de reacción, 00:32:20
pues el volumen de reacción 00:32:22
son 50 microlitros. 00:32:24
Me han pedido que haga esta PCR, 00:32:26
el procedimiento del laboratorio 00:32:28
es hacerlo en un volumen 00:32:31
de 50 microlitros. 00:32:33
También me han dicho que la cantidad 00:32:35
de DNA molde que tengo que poner en el tubo 00:32:37
es de un microlitro. 00:32:39
Yo me imagino que ellos, 00:32:41
sabiendo la concentración inicial 00:32:43
y sabiendo la cantidad 00:32:45
final que tienen que poner, 00:32:47
ellos han calculado 00:32:49
que tendrían que poner de DNA molde 00:32:51
un microlitro. 00:32:53
Pues supongamos que 00:32:55
el volumen final del tubo son 50. 00:32:57
La cantidad de DNA 00:32:59
que tengo que añadir 00:33:01
es un microlitro. 00:33:03
¿De acuerdo? 00:33:05
Y me han llegado al laboratorio 00:33:07
para analizar 8 muestras de pacientes. 00:33:09
¿De acuerdo? 00:33:11
Por tanto, voy a hacer 00:33:13
una master mix, 00:33:15
la master mix que tengo que hacer. 00:33:17
Como son 8 muestras de pacientes, 00:33:19
voy a preparar 00:33:21
la master mix para 11 tubos de PCR. 00:33:23
¿De dónde vienen estos 11 tubos de PCR? 00:33:27
Y esto es muy importante. 00:33:29
Pues 8 tubitos de PCR 00:33:31
van a ser para las 00:33:33
8 muestras de los 00:33:35
8 DNAs de los pacientes 00:33:37
más 00:33:39
2 tubos de PCR 00:33:41
para el control positivo y negativo. 00:33:43
Ahora hablamos de ellos. 00:33:45
No puede haber 00:33:47
una reacción de PCR que no tenga 00:33:49
controles positivo y negativo. 00:33:51
Por tanto, 00:33:53
ya serían 10 00:33:55
y siempre añado un tubo más. 00:33:57
¿De acuerdo? Siempre añado un tubo más. 00:33:59
Este tubo más no va a ir 00:34:01
al termociclador. 00:34:03
¿De acuerdo? 00:34:05
Sino que es un tubo 00:34:07
que yo añado para asegurarme 00:34:09
que en estos 10 00:34:11
tubos de aquí voy a poner 00:34:13
el volumen de 00:34:15
master mix correspondiente. 00:34:17
Es decir, 00:34:19
a ver si nos aclaramos. 00:34:21
Tiro un poquito para atrás. 00:34:23
Si yo tuviese que preparar 00:34:25
solamente un tubo 00:34:27
de PCR, pues lo haría 00:34:29
así. Hago los cálculos para 00:34:31
ese tubo, cuánto de cloruro de magnesio 00:34:33
tengo que añadir, de NTP, 00:34:35
de todos los componentes 00:34:37
y voy añadiendo 00:34:39
cada componente. ¿Qué es lo 00:34:41
que ocurre? Que como estáis viendo 00:34:43
ya veis las cantidades 00:34:45
estamos hablando, estamos en torno a nanos 00:34:47
y micros, 00:34:49
gramos, nanomolar, 00:34:51
micromolar. 00:34:53
Normalmente los volúmenes que tenemos que 00:34:55
pipetear de magnesio, de NTP, 00:34:57
de cebadores, son tremendamente pequeños. 00:34:59
Estamos hablando de 2 microlitros. 00:35:01
Del buffer, 00:35:03
del buffer, 00:35:05
el buffer a lo mejor 00:35:07
es de lo que más solemos 00:35:09
pipetear y a lo mejor son 00:35:11
5 microlitros, pero es que 00:35:13
de la polimerasa se suelen pipetear 00:35:15
0,2 microlitros, 00:35:17
0,5 microlitros. 00:35:19
En resumidas cuentas, 00:35:21
los volúmenes que tengo que pipetear 00:35:23
tubo a tubo, para cada tubo, 00:35:25
son volúmenes muy pequeños. 00:35:27
¿Qué inconveniente tiene? 00:35:29
El inconveniente fundamental es que 00:35:31
puedo cometer 00:35:33
muchos errores de pipeteo 00:35:35
y estamos hablando de cantidades 00:35:37
muy pequeñas, volúmenes muy pequeños. 00:35:39
Si yo, en una reacción 00:35:41
de 50 microlitros, 00:35:43
donde tengo que añadir un microlitro, 00:35:45
imaginemos, de la DNA polimerasa 00:35:47
o tengo que añadir 00:35:49
0,5 microlitros de la DNA polimerasa, 00:35:51
por error de pipeteo 00:35:53
pongo 0,4 00:35:55
o 0,3, porque 00:35:57
he pipeteado mal, eso puede 00:35:59
hacer que la PCR no funcione 00:36:01
y no sea eficiente. 00:36:03
O si en lugar de los cebadores, si tengo que 00:36:05
poner 3 microlitros, pongo 00:36:07
2,4 00:36:09
por error de pipeteo, 00:36:11
eso va a hacer que la PCR 00:36:13
no funcione bien, ¿de acuerdo? 00:36:15
De tal manera que, 00:36:17
¿por qué tenemos que hacer una 00:36:19
Master Mix? 00:36:21
¿Por qué hago una Master Mix 00:36:23
para todos los tubos de los pacientes? 00:36:25
Para todas las muestras 00:36:27
y no hago 00:36:29
8 tubos diferentes, pipeteados 00:36:31
uno a uno todos los componentes? 00:36:33
Uno, porque es tremendamente 00:36:35
lento y un rollo. 00:36:37
Y esto es así. Y en segundo 00:36:39
lugar, ¿por qué? Si yo hago 00:36:41
una mezcla Master, 00:36:43
una Master Mix para 10, 00:36:45
12, 11 tubos, a veces 00:36:47
se hacen Master Mix para 50 tubos, 00:36:49
os podéis imaginar que los volúmenes 00:36:51
serán 50 veces 00:36:53
mayores. Es decir, 00:36:55
ya no tendré que pipetear 00:36:57
0,5 microlitros de 00:36:59
DNA polimerasa, 00:37:01
con lo que conlleva el error que cometo, 00:37:03
sino que tendría que multiplicar 00:37:05
0,5 microlitros 00:37:07
por 50, 00:37:09
si son 50 tubos. 00:37:11
¿De acuerdo? Y por tanto, 00:37:13
tendría que poner 25 microlitros. 00:37:15
Pipetear 25 microlitros, 00:37:17
el error que 00:37:19
puedo cometer es asumible, 00:37:21
porque de 25 microlitros, 00:37:23
si yo pipeteo 24,5 00:37:25
microlitros, la diferencia 00:37:27
es mínima. ¿De acuerdo? 00:37:29
Por tanto, en este 00:37:31
ejemplo, si yo tuviese 00:37:33
que hacer las PCRs en 00:37:35
50 microlitros y un microlitro 00:37:37
es el DNA molde, 00:37:39
¿sí? 00:37:41
Tengo que 00:37:43
calcular, hacer los cálculos 00:37:45
para 49 microlitros 00:37:47
de MasterMix que tendré que poner 00:37:49
en cada tubo. 00:37:51
Entonces, en cada tubo de PCR 00:37:53
de los DNA de los pacientes van a ir 00:37:55
49 microlitros de MasterMix 00:37:57
y luego, al final, 00:37:59
añadiré un microlitro del DNA. 00:38:01
¿De acuerdo? Del DNA del paciente 00:38:03
1 en el tubo 1. 00:38:05
DNA del paciente 2 en el tubo 2 00:38:07
y así sucesivamente. 00:38:09
Entonces, acordaos, 00:38:11
en este caso, 00:38:13
8 tubos tengo que preparar 00:38:15
para la muestra de los pacientes, 00:38:17
2 para control positivo y negativo 00:38:19
y siempre añado 1 00:38:21
por si acaso me equivoco. 00:38:23
Si no pipeteo bien, 00:38:25
si hay errores de pipeteo, 00:38:27
lo que a veces ocurre es que si yo hago 00:38:29
una MasterMix justita 00:38:31
para los 10 tubos 00:38:33
que necesito, 00:38:35
pues pongo luego 49 microlitros 00:38:37
en el primer tubo, 00:38:39
49 en el segundo, en el tercero 00:38:41
y cuando llego al último, a veces, 00:38:43
por errores de pipeteo, 00:38:45
no tengo 49 microlitros sino que tengo 00:38:47
44. 00:38:49
Me faltan 5 microlitros. 00:38:51
Ese tubo, la PCR de ese tubo, 00:38:53
ya es diferente, 00:38:55
porque la cantidad de MasterMix es diferente 00:38:57
y estoy introduciendo un error. 00:38:59
Para evitar esto, 00:39:01
ya está la regla de que más vale que sobre 00:39:03
que no que falte. 00:39:05
Entonces, una vez calculados 00:39:07
cuántos tubos tengo de PCR, 00:39:09
cuántos tubos que son, 00:39:11
nuevamente, el número de DNAs 00:39:13
que tienes que analizar más 00:39:15
control positivo y negativo, 00:39:17
se le suele añadir un tubo más. 00:39:19
¿De acuerdo? Para que sobre más 00:39:21
MasterMix y no que nos falte. 00:39:23
Este ejemplo 00:39:25
con 11 tubos lo tenéis en el libro. 00:39:27
Está aquí. 00:39:29
Se ha puesto la tablita del tubo 00:39:31
en el cual ellos han calculado 00:39:33
para este ejemplo 00:39:35
han calculado 00:39:37
para 11 tubos. 00:39:39
¿De acuerdo? Son 8 pacientes, 00:39:41
control positivo y negativo y el tubo de más. 00:39:43
Y han ido calculando 00:39:45
qué volumen tendrían que poner por cada tubo. 00:39:47
Pues del tampón, 00:39:49
como el volumen es 00:39:51
50 microlitros 00:39:53
y está 10 veces concentrado, 00:39:55
el volumen final, 00:39:57
para saber cuánto hay que poner 00:39:59
del tampón, el volumen final, 00:40:01
hay que dividirlo entre 00:40:03
la concentración, que son 10, 00:40:05
10 veces concentrado, por tanto, 00:40:07
serían 5 microlitros. 00:40:09
50 entre 10, 5 microlitros. 00:40:11
Esto sería el volumen 00:40:13
para un tubo, pero como tengo que hacer 00:40:15
100, multiplico. 00:40:17
Y en mi MasterMix pondré 55 microlitros. 00:40:19
¿Cuál es la concentración final? 00:40:21
Estaba 10 por, 00:40:23
y ahora ya no está concentrado. 00:40:25
1 por es, que ya no está concentrado. 00:40:27
Está a la concentración 00:40:29
idónea. 00:40:31
¿Cloro de magnesio? Vaya, pues aquí el cloro de magnesio 00:40:33
me dicen que está a 50 milimolar. 00:40:35
Suavecenamente. 00:40:37
Entonces, ellos han calculado, para este volumen 00:40:39
final, todos estos ejercicios de MasterMix 00:40:41
los vamos a hacer, ¿de acuerdo? 00:40:43
De tal manera que el volumen de cada 00:40:45
reactivo que me sale, 00:40:47
¿de acuerdo? Yo lo tengo que multiplicar 00:40:49
por el número de tubos. 00:40:51
Y ese es el volumen que yo pondré en mi MasterMix. 00:40:53
Por tanto, 00:40:55
de cebador forward en la MasterMix 00:40:57
tendré que poner 11 microlitros 00:40:59
y no un microlitro. 00:41:01
¿Me entiende? 00:41:03
Por tanto, ¿cuáles son los componentes 00:41:05
de la MasterMix? 00:41:07
Todos los componentes de la PCR, 00:41:09
todos los reactivos, menos 00:41:11
el DNA. 00:41:13
Entonces, yo voy a hacer mi 00:41:15
MasterMix con el tampón, también con el 00:41:17
agua. Ya os he dicho, 00:41:19
y lo veremos en prácticas, que el agua, 00:41:21
aunque lo calculamos al final, 00:41:23
es el primer reactivo que ponemos 00:41:25
porque es el que tiene mayor volumen. 00:41:27
Es el que ponemos siempre en mayor volumen. 00:41:29
Pondría el agua, luego ponemos 00:41:31
el tampón, luego se suelen poner 00:41:33
en orden el magnesio, 00:41:35
los DNTPs, los cebadores 00:41:37
y lo último ponemos la TAC 00:41:39
polimeras. Una vez ya tengo 00:41:41
la MasterMix, lo mezclo muy bien 00:41:43
y lo que hago es, fijaos que 00:41:45
el volumen final son 539 00:41:47
microlitros, preparo mis 00:41:49
10 tubos 00:41:51
y los rotulo. Tubo 1, 00:41:53
paciente 1, paciente 2, paciente 3, 00:41:55
control positivo, control negativo 00:41:57
y a cada uno de los tubos, 00:41:59
de los 10 tubos, voy a 00:42:01
añadir ¿qué volumen? 00:42:03
49 microlitros. 00:42:05
¿De acuerdo? 00:42:07
De tal manera que si os dais cuenta, 00:42:11
en todos los 00:42:13
tubos voy a tener la misma 00:42:15
mezcla de reacción y 00:42:17
por tanto, me puedo fiar 00:42:19
mucho de los resultados, porque los 00:42:21
reactivos que estoy utilizando para la 00:42:23
reacción son idénticos. 00:42:25
Están mezclados a la vez 00:42:27
y proceden del mismo tubo. 00:42:29
Por tanto, en todas las 00:42:31
PCRs, en todos los tubos de PCRs 00:42:33
tengo la misma MasterMix. 00:42:35
La misma mezcla de reacción. 00:42:37
Idéntica. Una vez 00:42:39
ya he dispensado 49 microlitros 00:42:41
en cada uno de los tubos, 00:42:43
solo faltaría añadir 00:42:45
un microlitro del DNA correspondiente 00:42:47
a cada tubo. Mezclo bien 00:42:49
lo pongo en el termociclador. 00:42:53
¿De acuerdo? 00:42:55
¿Qué es esto 00:42:57
de los controles positivos y negativos? 00:42:59
Tremendamente importante. 00:43:01
Yo al final, cuando veamos 00:43:03
cómo analizamos los resultados, 00:43:05
lo hacemos en geldagarosa y vemos 00:43:07
si ha amplificado o no ha amplificado 00:43:09
con una banda. Yo veo una banda. 00:43:11
Ah, pero ¿cómo me fío yo? 00:43:13
¿Cómo sé yo que esa banda 00:43:15
amplificada corresponde al fragmento 00:43:17
al fragmento 00:43:19
que quiero amplificar 00:43:21
y no es una banda 00:43:23
inespecífica por ahí? 00:43:25
¿De acuerdo? Porque voy a usar 00:43:27
controles positivos y controles negativos. 00:43:29
¿De acuerdo? 00:43:31
Entonces, muy importante. Primero, 00:43:33
siempre tiene que haber un control positivo 00:43:35
y un control negativo. Ahora veremos 00:43:37
en qué consisten. 00:43:39
Segundo, importante. 00:43:41
El control positivo y el control negativo 00:43:43
deben llevar la misma Master Mix. 00:43:45
Por eso lo añado aquí. 00:43:47
Si os dais cuenta, 00:43:49
8 pacientes, 2 tubos más. 00:43:51
Si fueran 29 pacientes, 00:43:53
pues pondría 29 pacientes más 00:43:55
2 más 1. 00:43:57
¿De acuerdo? 00:43:59
Más el tubo para el error 00:44:01
de pipeteo. 00:44:03
¿De acuerdo? Entonces haría el cálculo. 00:44:05
Siempre los tengo que añadir. 00:44:07
Y esto es muy importante. 00:44:09
Deben llevar la misma Master Mix 00:44:11
y lo debo de poner a la vez 00:44:13
en el termociclador con el mismo programa. 00:44:15
De tal manera que es 00:44:17
como si fueran 2 pacientes más. 00:44:19
¿Vale? Como si en lugar 00:44:21
de 8 pacientes tuviera 10 pacientes. 00:44:23
¿En qué consiste el control positivo? 00:44:25
El control positivo es 00:44:27
la mezcla de reacción y un microlitro 00:44:29
de DNA de un DNA 00:44:31
que yo sé que es positivo. 00:44:33
Donde tengo que 00:44:35
observar sí o sí la banda 00:44:37
de amplificación. 00:44:39
¿De acuerdo? 00:44:41
Esto ahora cuando veamos el análisis de los resultados 00:44:43
lo entenderemos mejor. 00:44:45
Pero entonces es un DNA que yo ya lo he testado. 00:44:47
Yo ya lo he probado. 00:44:49
Y yo ya sé que ahí tiene que amplificar 00:44:51
la polimerasa y por tanto la reacción 00:44:53
tiene que ser positiva y tengo que observar 00:44:55
¿Qué es el control negativo? 00:44:57
El control negativo lleva de todo 00:44:59
todo igual, todo igual, todo igual 00:45:01
la misma Master Mix. 00:45:03
Acordaos que eso es muy importante. 00:45:05
Es una Master Mix pero en lugar de llevar 00:45:07
DNA, en lugar de poner un microlitro 00:45:09
de DNA, pongo un microlitro 00:45:11
de agua. 00:45:13
Por tanto, en este tubo 00:45:15
lleva todos los reactivos para 00:45:17
hacer la PCR pero no tiene DNA 00:45:19
molde. Si no tiene DNA molde 00:45:21
¿Puede amplificar 00:45:23
algo? No. 00:45:25
No puede amplificar nada porque la 00:45:27
polimerasa no puede leer porque no hay DNA 00:45:29
molde. 00:45:31
La pregunta ahora es ¿qué es lo que ocurre 00:45:33
si yo en el control negativo 00:45:35
que no tendría que ver una banda 00:45:37
no tendría que amplificar 00:45:39
observo una banda? 00:45:41
Si yo observo una banda en el control negativo 00:45:43
significa que ha habido 00:45:45
contaminación de un DNA 00:45:47
extraño, exógeno 00:45:49
un DNA contaminante 00:45:51
y esto es 00:45:53
esto es 00:45:55
desgraciadamente es frecuente 00:45:57
¿Vale? Que se nos contamine. ¿Y qué se ha contaminado? 00:45:59
Pues a lo mejor alguno de los reactivos 00:46:01
desde el agua a los cebadores 00:46:03
a los DNTPs 00:46:05
por tanto sin el control 00:46:07
negativo observo una banda 00:46:09
significa que 00:46:11
ha habido contaminación 00:46:13
¿De acuerdo? De un DNA extraño 00:46:15
algún reactivo está contaminado y por 00:46:17
tanto los resultados 00:46:19
de esa PCR de esos 00:46:21
ocho pacientes no me los puedo creer 00:46:23
tengo que repetirlo 00:46:25
todo y normalmente hay que repetirlo 00:46:27
con reactivos nuevos 00:46:29
ojo 00:46:31
a las contaminaciones 00:46:33
ojo a los controles negativos 00:46:35
fijaos es importante 00:46:37
si yo no pongo el control negativo y hay algún 00:46:39
alguna contaminación en alguno de los reactivos 00:46:43
si yo no pongo el control 00:46:45
negativo no sé si 00:46:47
esa banda que amplifica 00:46:49
en las muestras de los pacientes 00:46:51
corresponde al DNA del paciente 00:46:53
y por tanto el paciente es positivo o 00:46:55
que ha habido una contaminación 00:46:57
por tanto el control positivo 00:46:59
es muy importante 00:47:01
el control negativo también es muy importante 00:47:03
si el control negativo observo banda 00:47:05
no me lo puedo creer, tengo que repetirlo 00:47:07
y lo tengo que repetir con reactivos 00:47:09
nuevos 00:47:11
¿De acuerdo? Esto es muy importante 00:47:13
¿De acuerdo? 00:47:15
Muy bien 00:47:17
ya tengo preparada la MasterMix 00:47:19
he preparado mi MasterMix 00:47:21
para mis 10 reacciones de PCR 00:47:23
para 11 tubos 00:47:25
he dispensado 00:47:27
la MasterMix 49 microlitros 00:47:29
en cada uno de los tubos y le he añadido 00:47:31
un microlitro de DNA molde 00:47:33
perfecto, tapo los tubitos 00:47:35
les pongo las tapas 00:47:37
y me voy al termociclador 00:47:39
muy bien 00:47:41
el termociclador hay que programarlo 00:47:45
¿Qué es el termociclador? 00:47:47
pues no ni más ni menos que un aparato 00:47:49
que tiene un termobloque 00:47:51
que es capaz 00:47:53
de cambiar de temperaturas 00:47:55
de forma rapidísima 00:47:57
de tal manera que pasa 00:47:59
de 95 a 57 grados 00:48:01
en cuestión de 3 segundos 00:48:03
nada 00:48:05
y a 72 grados lo mismo 00:48:07
y yo lo voy a programar 00:48:09
de tal manera que 00:48:11
la programación del termociclador 00:48:13
todas las PCRs convencionales 00:48:15
tienen estas 4 fases 00:48:17
la primera fase 00:48:19
es una fase de desnaturalización inicial 00:48:21
la desnaturalización 00:48:23
a 94, normalmente a 95 grados 00:48:25
al principio de todo 00:48:29
hago un ciclo 00:48:31
un ciclo significa que lo voy a hacer solamente una vez 00:48:33
de tal manera que 00:48:35
esta desnaturalización inicial 00:48:37
de partida 00:48:39
cojo la mezcla de reacción con el DNA molde 00:48:41
y la voy a poner a 95 grados 00:48:43
aquí en el esquema 00:48:45
han puesto 3 minutos 00:48:49
y suelen poner 5 minutos 00:48:51
mínimo 5 minutos de desnaturalización 00:48:53
que es una burrada 00:48:55
es mucho tiempo 00:48:57
¿por qué tanto tiempo? 00:49:03
¿cuál es el objetivo? 00:49:05
el objetivo de esta fase de desnaturalización inicial 00:49:07
es que todo el DNA molde 00:49:09
sí o sí desnaturalice 00:49:11
se encuentre ya desnaturalizado 00:49:15
cuando vayan a empezar los ciclos 00:49:17
de replicación 00:49:19
que son los ciclos de replicación 00:49:21
todo el DNA ya esté desnaturalizado 00:49:23
y si se han formado dimeros de primers 00:49:25
también desnaturalizan 00:49:27
y estén todos los primers 00:49:29
en forma monocatenaria 00:49:31
por tanto al final de esta primera fase 00:49:33
si yo tuviese un microscopio y pudiese mirar 00:49:35
dentro del tubo 00:49:37
lo que vería serían hebras monocatenarias 00:49:39
¿de acuerdo? 00:49:41
la segunda fase son los ciclos de replicación 00:49:43
los ciclos de replicación 00:49:45
ya sabemos que estos ciclos de replicación 00:49:47
es una repetición 00:49:49
cíclica de 3 temperaturas 00:49:51
95ºC 00:49:53
temperatura de anilin 00:49:55
baja la temperatura de anilin 00:49:57
que sabemos que está en torno a 00:49:59
60ºC 00:50:01
55ºC 00:50:03
60ºC y temperatura de extensión 00:50:05
72ºC 00:50:07
anilin 00:50:09
extensión 00:50:11
¿se os acordáis? 00:50:13
¿cuánto tiempo le ponemos? 00:50:15
ya daos cuenta que en el termociclador 00:50:17
en el termociclador 00:50:19
podemos programar 3 parámetros 00:50:21
temperatura 00:50:23
tiempo y ciclos 00:50:25
en la primera fase 00:50:27
temperatura 95ºC 00:50:29
tiempo 95ºC 00:50:31
ciclos, un solo ciclo 00:50:33
y aquí lo mismo, temperatura 00:50:35
tiempo 00:50:37
y número de ciclos 00:50:39
son los 3 parámetros 00:50:41
que se pueden 00:50:43
que podemos programar 00:50:45
¿de acuerdo? 00:50:47
¿qué tiempo le ponemos? 00:50:49
normalmente suelen ser 30, 30 00:50:51
¿de acuerdo? 30 segundos 00:50:53
30 segundos y acordaos que 00:50:55
el tiempo de extensión 00:50:57
ya os dije que son 00:50:59
10 segundos 00:51:01
10 segundos de amplificación de extensión 00:51:03
por cada 100 pares de bases 00:51:05
que queremos amplificar 00:51:07
esto en la PCR convencional 00:51:09
¿y cuántos ciclos ponemos? 00:51:11
¿cuántas veces lo va a repetir? 00:51:13
pues suele ser entre 25 y 35 ciclos 00:51:15
y esto ya 00:51:17
hay que verlo de forma experimental 00:51:19
menos de 25 ciclos 00:51:21
no es suficiente 00:51:23
no da tiempo para que lo podamos ver bien 00:51:25
en un gel de agarosa 00:51:27
y más de 35 ciclos 00:51:29
ya no es fiable 00:51:31
porque si ponemos muchos, muchos ciclos 00:51:33
hay un problema, el primer problema es que 00:51:35
acordaos que la DNA polimerasa se va a inactivar 00:51:37
¿vale? porque tiene que pasar muchas veces 00:51:39
por 95 grados 00:51:41
entonces si ponemos muchos ciclos 00:51:43
es más probable que se inactive y empiece a funcionar mal 00:51:45
y en segundo lugar 00:51:47
pueden empezar a amplificar 00:51:49
pueden empezar a amplificarse 00:51:51
fragmentos 00:51:53
inespecíficos y eso es muy habitual 00:51:55
por tanto hay que jugar 00:51:57
con el número de ciclos 00:51:59
30 ciclos está muy bien 00:52:01
normalmente cuando es una PCR que no hemos 00:52:03
hecho nunca se empieza por 00:52:05
35 ciclos 00:52:07
le damos caña 00:52:09
le das caña a la PCR 00:52:11
pero con 35 ciclos si los cebadores funcionan 00:52:13
y la polimerasa también, tienes que amplificar 00:52:15
sí o sí 00:52:17
si en la primera PCR pongo 25 y no 00:52:19
observo amplificación, pues la tengo 00:52:21
que repetir, pero si a 35 ciclos 00:52:23
observo PCR, entonces luego 00:52:25
ya voy disminuyendo, 32 ciclos 00:52:27
30, 28 00:52:29
y ya me quedaría con el número 00:52:31
de ciclos suficiente para poderlo ver 00:52:33
para que amplifique bien 00:52:35
y verlo en un gel lagroso 00:52:37
por tanto, primera fase 00:52:39
desnaturalización inicial, segunda fase 00:52:41
los ciclos de amplificación 00:52:43
esta es la fase 00:52:45
más importante 00:52:47
una tercera fase 00:52:49
que también es un solo ciclo 00:52:51
de extensión final 00:52:53
¿qué es esto de la extensión final? 00:52:55
vamos a poner la mezcla 00:52:57
de reacción, una vez ya han acabado 00:52:59
los ciclos de replicación a 72 grados 00:53:01
un tiempo que va entre 00:53:03
5 y 10 minutos 00:53:05
se suelen poner 10 minutos 00:53:07
¿por qué? 00:53:09
esto se hace para hacer 00:53:11
una extensión final 00:53:13
es decir, imaginaos que a lo largo 00:53:15
de todos estos ciclos 00:53:17
llegan 40 segundos 00:53:19
de extensión 00:53:21
42, 45 00:53:23
y a algunas polimerasas no les ha dado tiempo 00:53:25
a acabar de amplificar 00:53:27
los fragmentos que tenían que amplificar 00:53:29
¿de acuerdo? imaginaos 00:53:31
y se han quedado a medias 00:53:33
pues le damos un tiempo 00:53:35
5-10 minutos a 72 grados 00:53:37
para que las polimerasas 00:53:39
que no han acabado, les dé tiempo 00:53:41
más que de sobra para acabar 00:53:43
de sintetizar y amplificar los fragmentos 00:53:45
que se hayan podido quedar medias 00:53:47
¿de acuerdo? 00:53:49
y el último paso es a 4 grados 00:53:51
¿vale? es el de mantenimiento 00:53:53
es decir, le vamos a decir al termociclador 00:53:55
ojo, cuando acabe 00:53:57
la extensión final, pones el termobloque 00:53:59
a 4 grados, es decir, como si estuviera 00:54:01
en la nevera 00:54:03
es lo mismo que si yo llego, abro el termociclador 00:54:05
cojo las reacciones 00:54:07
y las meto en la nevera 00:54:09
pues tú vas a poner el termobloque a 4 grados 00:54:11
un tiempo infinito 00:54:13
es decir, hasta que yo llegue 00:54:15
y lo quite 00:54:17
esta fase es muy importante 00:54:19
¿por qué? porque esto nos permite 00:54:21
por ejemplo, poner una PCR 00:54:23
a las 5 de la tarde, cuando ya nos vamos a ir 00:54:25
la dejamos puesta 00:54:27
el termociclador 00:54:29
hace toda la PCR, que puede durar 00:54:31
dos horitas y media, y cuando acaba 00:54:33
se queda toda la noche a 4 grados 00:54:35
llego a la mañana siguiente 00:54:37
y ya la tengo preparada, ¿se entiende? 00:54:39
entonces, esta fase de mantenimiento 00:54:41
es muy importante, porque si 00:54:43
la mantenemos a temperatura ambiente 00:54:45
y no se mantiene como si estuviera en la nevera 00:54:47
pueden haber amplificaciones 00:54:49
podrían haber 00:54:51
amplificaciones inespecíficas 00:54:53
¿de acuerdo? 00:54:55
por tanto, sería raro 00:54:57
esto es muy importante, la programación del termociclador 00:54:59
y las fases 00:55:01
del termociclador, sería raro 00:55:03
que no se lo preguntase en el examen 00:55:05
hay que saber interpretar 00:55:07
una gráfica de este estilo y saberla 00:55:09
explicar, ¿de acuerdo? cada una de las fases 00:55:11
en este cuadro 00:55:13
que viene en el libro 00:55:15
se recoge el protocolo 00:55:17
¿de acuerdo? como lo han programado 00:55:19
para un fragmento 00:55:21
que quieren amplificar 00:55:23
un amplicón de 500 pares de bases 00:55:25
¿de acuerdo? 00:55:27
de naturalización inicial, 3 minutos 00:55:29
30 segundos, 30 segundos es suficiente 00:55:31
para que haga la anilin 00:55:33
¿de acuerdo? 00:55:35
extensión, 45 segundos 00:55:37
daos cuenta, 500 pares de bases 00:55:39
cada 100 pares de bases, 10 segundos 00:55:41
50 pares de bases serían 00:55:43
50 segundos, estamos ahí 00:55:45
en torno a eso 00:55:47
una extensión final, cercana a los 10 minutos 00:55:49
y luego el mantenimiento 00:55:51
¿de acuerdo? 00:55:53
¿como analizamos 00:55:55
los productos amplificados? 00:55:57
esto también es muy importante, es decir, como sé 00:55:59
si la PCR me ha salido bien o no me ha salido 00:56:01
bien, pues lo hacemos mediante 00:56:03
un gel de agarosa 00:56:05
una electroforesis en gel de agarosa 00:56:07
es un gel de agarosa 00:56:09
que el porcentaje 00:56:11
de agarosa es muy importante 00:56:13
y suele ir de 0,5 a 2% 00:56:15
incluso un poquito más 00:56:17
¿de acuerdo? 00:56:19
el porcentaje puede ser hasta 2,5% 00:56:21
¿de acuerdo? 00:56:23
cuanto mayor porcentaje 00:56:25
y esto quiero que lo apuntéis 00:56:27
que no lo pone el libro 00:56:29
cuanto mayor porcentaje de agarosa 00:56:31
mejor 00:56:33
se van a ver los amplicones 00:56:35
pequeñitos 00:56:37
¿de acuerdo? amplicones de 100 pares de bases 00:56:39
200, 50, 300 00:56:41
hasta 500 pares de bases 00:56:43
tengo que poner un porcentaje 00:56:45
de agarosa elevado 00:56:47
si el porcentaje de agarosa es bajito 00:56:49
uno, por ejemplo, 0,81 00:56:51
1,2% 00:56:53
esos geles los hago cuando 00:56:55
los amplicones son muy grandes 00:56:57
una kilobase, dos kilobases 00:56:59
3,5 kilobases 00:57:01
¿de acuerdo? entonces se ven muchísimo 00:57:03
mejor cuando el porcentaje del gel 00:57:05
es bajito 00:57:07
¿de acuerdo? ¿cómo veréis si el paciente 00:57:09
es positivo o es negativo? 00:57:11
una vez hecha la electroforesis lo veré 00:57:13
una banda específica 00:57:15
lo vamos a ver ahora 00:57:17
y después, para decir que el resultado 00:57:19
ha sido positivo, acordaos que 00:57:21
el control negativo no tiene que haber 00:57:23
amplificado y no tiene que haber banda 00:57:25
¿cuándo diré que el paciente es negativo? 00:57:27
cuando en el carril 00:57:29
de ese paciente no haya una banda 00:57:31
¿de acuerdo? 00:57:33
y en el control positivo 00:57:35
si haya banda, esto es muy importante 00:57:37
vamos a ver un ejemplo 00:57:39
vale, este es un ejemplo, un análisis que hicieron 00:57:41
¿de acuerdo? esto es un análisis 00:57:43
real, es un gel de agarosa 00:57:45
que lo han corrido y lo hemos 00:57:47
visto en un documentador de gels 00:57:49
¿de acuerdo? son 00:57:51
6 carriles, los lanes 00:57:53
6 carriles, el primero lo han dejado vacío 00:57:55
como veis aquí, el pocillo 00:57:57
empty well, el pocillo 00:57:59
vacío, en el segundo 00:58:01
está el marcador 00:58:03
de pesos moleculares 00:58:05
¿de acuerdo? nos están diciendo que es un marcador 00:58:07
de pesos moleculares de 50 00:58:09
pares de bases, eso significa que 00:58:11
cada banda son 50 pares 00:58:13
de bases, o sea, esta banda tiene 00:58:15
un tamaño de 50 pares de bases 00:58:17
bien, 150 00:58:19
200 y así sucesivamente 00:58:21
¿de acuerdo? 00:58:23
en el carril 3 00:58:25
tenemos el control negativo 00:58:27
por tanto no observo banda 00:58:29
en el carril 4 tengo el control 00:58:31
positivo, aquí siempre 00:58:33
tengo que observar banda 00:58:35
y en los pacientes, que son dos pacientes 00:58:37
muestra 1, muestra 2, sample 1 00:58:39
sample 2, ¿vale? 00:58:41
muestra 1 y muestra 2, tengo dos pacientes 00:58:43
pues resulta que los dos son positivos 00:58:45
¿y cómo sé que esta 00:58:47
banda corresponde al fragmento 00:58:49
que tenía yo que amplificar? 00:58:51
porque tiene el mismo tamaño que 00:58:53
tiene el control positivo, y es aproximadamente 00:58:55
un poquito más 00:58:57
de 150 pares de bases, en 00:58:59
concreto 166 00:59:01
pares de bases, por tanto 00:59:03
esta PCR, control negativo 00:59:05
ha salido negativo, control positivo 00:59:07
ha salido positivo, el resultado 00:59:09
de estos pacientes me lo puedo 00:59:11
creer, ¿de acuerdo? 00:59:13
por tanto diría que el resultado 00:59:17
es correcto 00:59:19
no es raro 00:59:23
el ejemplo que os ponen en el libro 00:59:25
que yo observe esta banda aquí abajo 00:59:27
esta es una bandita 00:59:29
de un tamaño muy pequeño, acordaos que esta tenía 00:59:33
150 pares de bases 00:59:35
por tanto esto tiene 00:59:37
20, 40 pares de bases 00:59:39
aproximadamente, esto es lo que llamamos los 00:59:41
primer dimers 00:59:43
los dimers de primers, a veces los primers 00:59:45
queramos o no queramos, los hayamos 00:59:47
diseñado bien o no tan bien 00:59:49
da igual si están perfectamente diseñados 00:59:51
es muy fácil que entre ellos 00:59:53
formen dimers 00:59:55
¿vale? que son 00:59:57
híbridos bicatenarios 00:59:59
¿vale? porque son híbridos 01:00:01
de un primer con otro primer 01:00:03
los dos primers hacen un burluño 01:00:05
aunque tengan una pequeña 01:00:07
porción complementaria 01:00:09
y forman dimers, y los vemos aquí 01:00:11
abajo, esto es muy normal observarlo 01:00:13
pero ¿por qué no 01:00:15
aceptamos esta PCR? 01:00:17
porque si os dais cuenta 01:00:19
hay varias bandas 01:00:21
quizá esta que es la mayoritaria y la que se ve mejor 01:00:23
es la que yo quiero amplificar, pero si os dais cuenta 01:00:25
hay muestras 01:00:27
donde hay una banda 01:00:29
encima, por tanto tengo bandas 01:00:31
inespecíficas, un poquito más 01:00:33
exagerado es lo que vemos aquí 01:00:35
si solamente en 01:00:37
cada PCR estándar amplifico 01:00:39
un solo fragmento, fijaos aquí 01:00:41
la cantidad de bandas inespecíficas 01:00:43
que tenemos, por tanto 01:00:45
este resultado 01:00:47
sería rechazado 01:00:49
¿de acuerdo? 01:00:51
rechazado 01:00:53
podríamos pensar que es lo que podemos 01:00:55
hacer para quitar toda esta 01:00:57
inespecificidad, pero bueno 01:00:59
no es tema de 01:01:01
para esta clase, sino que ya lo veremos 01:01:03
y ya os lo contaré en clase 01:01:05
o en prácticas 01:01:07
¿de acuerdo? 01:01:09
muy bien 01:01:11
muy bien 01:01:13
de esta PCR estándar se han 01:01:15
desarrollado otro tipo de 01:01:19
modalidades, que es lo que llamamos la 01:01:21
PCR con inicio en caliente 01:01:23
PCR para fragmentos grandes 01:01:25
y PCR de alta fidelidad 01:01:27
cada una de ellas con un objetivo 01:01:29
diferente ¿de acuerdo? 01:01:31
la PCR con inicio en caliente 01:01:33
es una PCR que se diseñó 01:01:37
porque se observaba 01:01:41
que algunas de estas bandas que vemos aquí 01:01:43
inespecíficas, no se producían 01:01:45
durante la reacción 01:01:49
de PCR en sí misma 01:01:51
dentro del termociclador 01:01:53
sino que se producían 01:01:55
a temperatura ambiente 01:01:59
o sea que había polimerasas 01:02:01
que eran capaces de amplificar de forma 01:02:03
inespecífica, hay algunas polimerasas 01:02:05
cuando están a temperatura ambiente 01:02:07
antes, una vez hemos puesto 01:02:09
la MasterMix en el tubo 01:02:11
hemos añadido el DNA 01:02:13
hasta que lo metemos 01:02:15
en el termociclador, que pasan unos minutos 01:02:17
porque no somos flash 01:02:19
¿de acuerdo? no somos rayos 01:02:21
y lo que observan los investigadores 01:02:23
era que se amplificaban 01:02:25
a temperatura ambiente 01:02:27
bandas inespecíficas 01:02:29
¿qué es lo que se suele hacer? 01:02:31
para evitar eso, se hace 01:02:33
una inicio en caliente 01:02:35
es decir 01:02:37
también se le llama Hot Start 01:02:39
¿de acuerdo? la PCR 01:02:41
Hot Start PCR 01:02:43
de inicio en caliente 01:02:45
¿de acuerdo? 01:02:47
se basa fundamentalmente 01:02:49
podemos intentar 01:02:51
evitar esto de tres maneras 01:02:53
la primera, que es muy engorrosa 01:02:55
es, hago la MasterMix 01:02:57
sin la DNA polimerasa 01:02:59
en los tubos, añado la MasterMix 01:03:01
acordaos, en esa MasterMix van a faltar 01:03:03
dos cosas, polimerasa 01:03:05
y DNA molde 01:03:07
cojo cada tubo 01:03:09
pongo la MasterMix, pongo el DNA molde 01:03:11
ojo, todavía no tiene DNA polimerasa 01:03:13
por tanto, no 01:03:15
puede amplificar nada 01:03:17
lo meto en el termociclador 01:03:19
¿de acuerdo? 01:03:21
hago que el termociclador 01:03:23
suba a 65 grados 01:03:25
aproximadamente 01:03:27
o sea, que ya se caliente 01:03:29
y lo que hago es, paro el termociclador 01:03:31
y con las muestras a 65 grados 01:03:33
abro el termociclador 01:03:35
quito las tapas 01:03:37
y añado la polimerasa ya 01:03:39
a esa temperatura 01:03:41
lo único que puede amplificar 01:03:43
ya es el fragmento 01:03:45
el fragmento específico 01:03:47
como veis, esta modalidad es muy engorrosa 01:03:49
es un rollo, es un petardo 01:03:51
claro, y las posibilidades 01:03:53
de contaminación 01:03:55
son muy grandes, ¿por qué? 01:03:57
porque tengo que manejar y abrir 01:03:59
y destapar los tubos muchas veces 01:04:01
la segunda estrategia 01:04:03
era aislando la DNA polimerasa 01:04:05
del resto de componentes, hacer una MasterMix 01:04:07
con una polimerasa 01:04:09
un poquito específica 01:04:11
un poco especial, de tal manera que 01:04:13
la venden comercial 01:04:15
y la polimerasa va dentro de unas 01:04:17
nanoesferas de cera 01:04:19
de tal manera que 01:04:21
a temperatura ambiente, la DNA polimerasa 01:04:23
está secuestrada 01:04:25
dentro de las esferas y no funciona 01:04:27
cuando la ponga en el termociclador 01:04:29
a medida que vaya aumentando 01:04:31
la temperatura, cuando llegue a alrededor 01:04:33
de unos 55 grados 01:04:35
la cera funde 01:04:37
se funde, la DNA polimerasa 01:04:39
se libera 01:04:41
y no puede actuar 01:04:43
y otra modalidad, otra estrategia 01:04:47
es suministrando 01:04:49
lo que llamamos las DNA polimerasas 01:04:51
inactivas, es decir 01:04:53
a temperatura ambiente son inactivas 01:04:55
y solamente se activan 01:04:57
cuando están ya 01:04:59
a temperatura elevada 01:05:01
dependiendo de la PCR 01:05:03
suelen llevar un bloqueante 01:05:07
un bloqueante termolábil 01:05:09
ya que cuando está por encima 01:05:11
de los 55 grados 01:05:13
se rompe el bloqueante 01:05:15
porque es termolábil 01:05:17
la unión y la DNA polimerasa 01:05:19
quedaría nuevamente libre 01:05:21
esto es lo que llamamos 01:05:23
la PCR 01:05:25
en inicio incaliente, ¿cuándo la utilizaremos? 01:05:27
ya os digo, cuando observemos 01:05:29
bandas 01:05:31
inespecíficas 01:05:33
segunda modalidad 01:05:35
o modificación de la PCR estándar 01:05:37
PCR para grandes fragmentos 01:05:39
imaginaos que no son 500 pares de bases 01:05:41
normalmente la PCR estándar 01:05:43
convencional está diseñada 01:05:45
para fragmentos como mucho 01:05:47
de 3 kilobases, 3,5 01:05:49
kilobases como mucho 01:05:51
si yo quiero amplificar fragmentos mayores 01:05:53
pues tengo que añadir 01:05:55
una serie de modificaciones 01:05:57
en la mezcla de reacción 01:05:59
voy a añadir 01:06:01
una mezcla de 01:06:03
polimerasas 01:06:05
una polimerasa 01:06:07
va a ser mayoritaria y otra 01:06:09
va a ser minoritaria 01:06:11
la mayoritaria va a ser una polimerasa 01:06:13
que solo es polimerasa 01:06:15
no tiene actividad correctora 01:06:17
y esa la pongo en cantidades ingentes 01:06:19
de tal manera que 01:06:21
esa polimerasa lo único que hace es 01:06:23
una vez encuentra un primer 01:06:25
amplifica, amplifica, amplifica 01:06:27
y por detrás 01:06:29
va una segunda polimerasa que la pongo 01:06:31
en cantidad minoritaria 01:06:33
mucho mejor, unas 10 veces menos 01:06:35
y esta lo único que va haciendo es 01:06:37
releer 01:06:39
lo que la otra ha sintetizado 01:06:41
y si detecta errores las corrige 01:06:43
porque tiene actividad exonucleasa 01:06:45
¿de acuerdo? 01:06:47
Primera modificación que se introduce 01:06:49
una mezcla de polimerasas 01:06:51
en segundo lugar hay que añadir 01:06:53
aditivos, aquí si son obligatorios 01:06:55
y puedo añadir el glicerol o el DMSO 01:06:57
el DMSO acordaos que es 01:06:59
el DMSO es dimetilsulfóxido 01:07:01
apuntadlo 01:07:03
no se si estará el nombre en el libro 01:07:05
no me acuerdo, dimetilsulfóxido 01:07:07
hay que conocer el nombre 01:07:09
el DMSO es como la forma amida 01:07:11
ayuda a desnaturalizar el DNA 01:07:13
claro cuando son fragmentos muy grandes 01:07:15
cuesta más desnaturalizarlos 01:07:17
porque son más largos, por tanto el DMSO 01:07:19
ayuda a la desnaturalización 01:07:21
y el glicerol ayuda 01:07:23
a estabilizar las DNA polimerasas 01:07:25
a que aguanten 01:07:27
mejor, ¿por qué? 01:07:29
porque como vamos a ver ahora 01:07:31
voy a cambiar 01:07:33
el programa de termociclador 01:07:35
y la fase de extensión de 72 grados 01:07:37
la tengo que alargar muchísimo 01:07:39
eso significa 01:07:41
que la polimerasa va a estar mucho más 01:07:43
tiempo a altas temperaturas 01:07:45
¿de acuerdo? por tanto 01:07:47
añado glicerol para proteger las polimerasas 01:07:49
y estabilizarlas, y por último 01:07:51
añado en la mezcla de reacción 01:07:53
concentraciones bajas de glucopotasio 01:07:55
¿de acuerdo? 01:07:57
en el tampón de reacción 01:07:59
no se sabe muy bien 01:08:01
por qué 01:08:03
las bajas 01:08:05
concentraciones de potasio favorecen 01:08:07
que se amplifiquen bien los fragmentos 01:08:09
grandes, pero experimentalmente 01:08:11
se ve que es así, ¿de acuerdo? 01:08:13
bajas concentraciones de potasio 01:08:15
se amplifican mejor los grandes fragmentos 01:08:17
y por último tenemos la que llamamos 01:08:19
PCR de alta fidelidad 01:08:21
¿cuándo haremos una PCR de alta fidelidad? 01:08:23
la PCR de alta fidelidad 01:08:25
la vamos a utilizar 01:08:27
cuando nos interese 01:08:29
reutilizar el amplicón 01:08:31
es decir, hago la PCR 01:08:33
y del gel de agarosa 01:08:35
de este gel de agarosa 01:08:37
yo puedo 01:08:39
aislar esta banda, la corto 01:08:41
con un bisturí 01:08:43
aíslo y purifico ese DNA 01:08:45
amplificado porque lo voy a utilizar 01:08:47
para más experimentos 01:08:49
en ese caso me interesa 01:08:51
que la secuencia 01:08:53
de todos los fragmentos amplificados 01:08:55
sea perfecta y la polimerasa 01:08:57
no cometa errores 01:08:59
eso es muy importante, ¿de acuerdo? 01:09:01
y entonces 01:09:03
¿qué variaciones 01:09:05
vamos a añadir 01:09:07
para hacer una PCR de alta fidelidad? 01:09:09
primero, vamos a 01:09:11
utilizar DNA polimerasas 01:09:13
con 01:09:15
actividad correctora, siempre 01:09:17
son las que llamamos, la primera que salió 01:09:19
fue la tag gold 01:09:21
la tag dorada 01:09:23
es decir, es una polimerasa que además de polimerasa 01:09:25
es, ella misma 01:09:27
puede ir corrigiendo actividad exonucleasa 01:09:29
¿de acuerdo? y en segundo lugar 01:09:33
favorecer las condiciones 01:09:35
de mayor fidelidad 01:09:37
¿de acuerdo? 01:09:39
enzimática, por tanto, vamos a intentar 01:09:41
poner las condiciones 01:09:43
para que la DNA polimerasa 01:09:45
no cometa errores, ¿cómo? 01:09:47
ajustando el pH, fundamentalmente 01:09:49
ajustando el pH, ¿de acuerdo? 01:09:51
algunas enzimas presentan 01:09:53
mayor fidelidad, hay que ver cuál es nuestra tag 01:09:55
polimerasa, si es la gold o cuál 01:09:57
porque hay muchísimas 01:09:59
y hay polimerasas que trabajan 01:10:01
mejor, de forma más fiel 01:10:03
a un pH bajo 01:10:05
más bajo de lo habitual, más bajo 01:10:07
de 8, y hay otras que tienen que ser al revés 01:10:09
un poquito más básico, un poquito 01:10:11
más elevado de 9, ¿de acuerdo? 01:10:13
entonces, dependiendo de la polimerasa que utilicemos 01:10:15
de alta fidelidad, pondremos un pH 01:10:17
u otro, y, en segundo lugar 01:10:19
el magnesio 01:10:21
hay que dar con la concentración 01:10:23
de magnesio, un exceso de magnesio 01:10:25
inhibe la 01:10:27
fidelidad, y por tanto hace que 01:10:29
la polimerasa cometa más errores 01:10:31
entonces, experimentalmente 01:10:33
habría que dar con el pH 01:10:35
adecuado y la concentración de magnesio 01:10:37
adecuada, ¿de acuerdo? 01:10:39
Idioma/s:
es
Autor/es:
Pedro Melgar-Rojas
Subido por:
Pedro M.
Licencia:
Reconocimiento - No comercial - Sin obra derivada
Visualizaciones:
37
Fecha:
1 de diciembre de 2023 - 10:16
Visibilidad:
Clave
Centro:
IES BENJAMIN RUA
Duración:
1h′ 10′ 42″
Relación de aspecto:
1.78:1
Resolución:
1280x720 píxeles
Tamaño:
93.04 MBytes

Del mismo autor…

Ver más del mismo autor

EducaMadrid, Plataforma Educativa de la Comunidad de Madrid

Plataforma Educativa EducaMadrid