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UT5 - Clonación Molecular - 1ª Parte - Contenido educativo

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Subido el 2 de febrero de 2024 por Pedro M.

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Bien, vamos a empezar la unidad de trabajo 8 sobre clonación de ácidos nucleicos. 00:00:00
En realidad es la unidad de trabajo 7 del libro, pero como nosotros hemos visto primero la unidad de trabajo 7 00:00:05
como el tema de bioinformática, este tema de clonación de ácidos nucleicos es la número 8. 00:00:12
Este tema es importante y también es relativamente complicado. 00:00:21
De hecho, junto con el tema 6 y el tema 9 son quizá los temas más complejos de las técnicas de biología molecular que vamos a ver. 00:00:25
Primero vamos a ver, en la clase de hoy vamos a ver los métodos de clonación molecular, 00:00:38
algunas generalidades, que es esto de la clonación molecular y los componentes de la clonación molecular. 00:00:44
Es decir, qué elementos necesitamos para poder llevar a cabo una clonación. 00:00:50
La clonación molecular o para clonar un gen. 00:00:55
Dejaremos para las siguientes clases las fases de este proceso de clonación, 00:00:59
cómo construir bibliotecas de DNA y un último apartado donde vamos a hablar de las aplicaciones de la clonación molecular en la actualidad, 00:01:04
sobre todo en laboratorios de investigación biomédica. 00:01:13
¿Qué es esto de la clonación molecular? 00:01:19
Pues la clonación molecular no es ni más ni menos que un proceso de amplificación. 00:01:21
De una secuencia. 00:01:25
Ya conocemos las técnicas de PCR que son técnicas de amplificación de una secuencia. 00:01:27
Para las técnicas de PCR necesitamos primers, necesitamos TAC polimerasa, necesitamos DNTPs, necesitamos cloruro de magnesio, buffer, etc. 00:01:34
La PCR es un proceso de amplificación in vitro. 00:01:47
En este caso la clonación. 00:01:53
La clonación molecular es un proceso de amplificación in vivo. 00:01:55
Lo vamos a llevar a cabo no en un tubo de ensayo y en un termociclador, sino que lo vamos a llevar a cabo en células. 00:01:59
De tal manera que el fragmento, la secuencia, que puede ser de cDNA, o sea, DNA complementario, o puede ser de un DNA genómico, 00:02:08
esa secuencia de interés que queremos amplificar, la vamos a introducir en un ser vivo, en una célula, 00:02:17
vamos a permitir que la célula se expanda, se divida y a partir de una célula obtengamos millones y millones y millones de células 00:02:25
y de ellas cada célula llevará una copia de esa secuencia, de las cuales después de cultivarlas in vitro podremos aislar la secuencia de interés de todas esas células. 00:02:35
Es por ello que este proceso se le llama clonación. 00:02:52
Clonación molecular, porque vamos a utilizar clones de células que van a amplificar in vivo un fragmento de cDNA, de DNA genómico, 00:02:55
basado en lo que llamamos la tecnología del DNA recombinante. 00:03:06
¿De acuerdo? 00:03:12
Esta tecnología del DNA recombinante es muy importante. 00:03:13
Tuvo su boom a nivel científico, sobre todo durante los años 70, 00:03:16
pero son técnicas que se utilizan mucho en los laboratorios de investigación, 00:03:22
sobre todo cuando queremos estudiar genes que no conocemos y los estamos estudiando por primera vez. 00:03:29
Os recuerdo que el cDNA es el DNA copia, no existe como tal en la naturaleza, 00:03:37
acordaos que se le llama DNA copia o DNA complementario porque es la copia 00:03:44
obtenida a partir de un DNA genómico. 00:03:49
Y es un DNA que se utiliza mucho en los laboratorios de investigación, sobre todo cuando queremos estudiar genes que no conocemos y los estamos estudiando por primera vez. 00:03:52
A partir de un RNA de una célula, ¿de acuerdo? 00:03:52
El enzima que lleva a cabo esta reacción de transcripción inversa, 00:03:55
acordaos que es la transcriptasa inversa o retrotranscriptasa, 00:04:02
que utiliza un RNA como molde para sintetizar un DNA copia. 00:04:07
¿Qué es el DNA copia? 00:04:19
A grandes rasgos de forma general, 00:04:20
genérica, el proceso de clonación molecular, ya veis que hablamos de clonación molecular, clonación porque utilizamos clones de células y vamos a obtener copias exactas y por eso de ahí viene el nombre de clon y es molecular porque lo que vamos a clonar no son las células, sino que vamos a clonar y vamos a amplificar DNA, pues es una clonación molecular. 00:04:22
Es muy diferente al concepto de clonación de seres vivos, de animales por ejemplo, no tiene nada que ver. 00:04:48
El proceso de clonación tiene cuatro pasos fundamentales y los tenemos que conocer. El primer paso es la inserción, vamos a insertar un fragmento de DNA, el que queremos amplificar, 00:05:00
nuestro fragmento. 00:05:16
El fragmento de DNA de interés en una molécula que nos va a servir, va a ser una molécula portadora, va a transportar ese fragmento dentro de las células que veremos ahora, ¿de acuerdo? 00:05:18
Por tanto, el primer paso es, voy a coger de todo el DNA de la célula, imaginaos que yo quiero amplificar solamente un gen, un único gen, de todo el DNA genómico de esta célula eucariota, 00:05:34
que está dentro del núcleo, lo primero que hago es lizar esta célula, obtener, extraer y purificar su DNA y de aquí voy a aislar el fragmento, ojo, si recordáis, yo en las técnicas de PCR, a partir de este DNA genómico, con dos primers, un forward y un reverse, lo amplifico in vitro, aquí no, aquí voy a coger todo el DNA genómico, 00:05:48
de mis células y voy a cortar con unos enzimas de restricción el fragmento que me interesa, con dos enzimas de restricción o un único enzima de restricción, en la parte de delante, cinco prima y la parte de atrás, tres prima, del fragmento que me interesa y lo voy a purificar, de tal manera que a partir del DNA genómico, yo no amplifico nada, no estoy amplificando, sino que estoy aislando y purificando, 00:06:18
mi fragmento, ¿cómo lo hago?, cortándolo directamente de la molécula de DNA genómico, una vez ya tengo aislado y purificado este fragmento, lo que voy a hacer va a ser insertarlo, ¿en qué lo voy a insertar?, lo inserto en un vector, aquí nos han puesto el ejemplo de un fragmento de DNA genómico eucariota, que lo voy a insertar en un vector bacteriano, 00:06:48
¿veis que esto es una bacteria? 00:07:16
o representa una bacteria, donde tiene su DNA cromosómico, que sabemos que es circular y muy grande y también contiene moléculas circulares bicatenarias más pequeñas, que son los plásmidos, yo a partir de este plásmido lo puedo linearizar, es decir, también lo puedo cortar y en lugar de este fragmento propio del plásmido, lo voy a sustituir por mi fragmento de intestino, 00:07:18
de tal manera que voy a obtener una molécula híbrida, híbrida en el sentido de que tiene una parte plasmídica bacteriana y una parte eucariota, en este caso, que lleva el inserto, ¿de acuerdo?, a este fragmento de interés, y ya vamos entrando en terminología de clonación molecular, a este fragmento de interés lo llamamos inserto, ¿de acuerdo?, 00:07:48
pues cuando hablemos del inserto queremos referirnos a este fragmento de DNA, ¿por qué lo llamamos inserto?, porque lo vamos a insertar, ¿dónde lo vamos a insertar?, en un vector, este plásmido es el vector, ya veremos que hay muchos tipos de vectores, en este caso, este plásmido bacteriano es nuestro vector, en este vector voy a introducir el inserto, 00:08:18
¿de acuerdo?, y voy a obtener lo que llamamos un vector recto. 00:08:43
El vector recto es el vector recombinante, por tanto, tenemos el inserto, tenemos el vector y tenemos el vector recombinante, que es aquel vector que ha introducido, que tiene en su secuencia insertada el fragmento, insertado el fragmento de interés, el inserto, ¿de acuerdo?, vale. 00:08:48
El segundo paso, una vez ya he obtenido mi vector recombinante, es introducirlo. 00:09:11
De nuevo, en células que llamamos hospedadoras, células vivas hospedadoras, como este es un plásmido bacteriano, lo normal es este plásmido meterlo en células de origen bacteriano, bacterias, no son bacterias cualquiera, son bacterias que están tratadas y se le llaman bacterias competentes, todo esto lo veremos más adelante en el tema. 00:09:18
El segundo paso es la introducción del vector recombinante en la célula hospedadora. 00:09:48
El tercer paso es la selección y multiplicación, es decir, ahora esta bacteria que ha introducido y tiene dentro el vector recombinante lo llamamos clon recombinante. 00:09:56
Ahora ya es un clon recombinante que lo voy a poner en cultivo para que se pueda dividir y obtener millones. 00:10:11
Millones y millones y millones de copias, ¿vale?, de clones exactamente idénticos a esta célula recombinante, a este clon recombinante, ¿de acuerdo? 00:10:18
Claro, uno puede decir, sí, perfecto, pero ¿cómo diferencio yo aquellas bacterias que son recombinantes y tienen el vector recombinante de aquellas bacterias que no lo han introducido? 00:10:30
Por eso, vamos a verlo ahora más adelante. 00:10:45
Más adelante necesitamos un proceso de selección. 00:10:48
Hay que seleccionar de todas las bacterias que tenga al final, voy a seleccionar las que tengan el clon recombinante y las otras las voy a, bueno, me las voy a cargar, ¿de acuerdo? 00:10:51
Las voy a alisar. 00:11:04
Ya veremos qué métodos de selección tenemos. 00:11:06
Por tanto, primer paso, hemos obtenido el vector recombinante. 00:11:09
En el segundo obtenemos el clon recombinante. 00:11:15
El tercer paso es la multiplicación, división celular y la selección. 00:11:18
Y por último, una vez ya tengo todas mis células seleccionadas de tal manera que yo sé que todas las células son recombinantes, ahora las puedo a todas alisar y purificar de ahí el vector recombinante, volver a cortarlo, 00:11:25
y ya obtendría... 00:11:44
El fragmento, recupero el inserto, el fragmento amplificado. 00:11:48
Si recordáis, partía de un clon que tiene un único fragmento, un único inserto con un plásmido. 00:11:53
Después de dejarlas en cultivo in vitro, ¿de acuerdo? 00:12:02
De cultivo in vitro, voy a tener millones y millones de bacterias y por tanto millones y millones y millones de copias de este fragmento. 00:12:06
Que yo ahora puedo alisar estas células y obtener de nuevo este fragmento. 00:12:18
Por tanto, como veis, la clonación molecular es una técnica de amplificación in vivo de un fragmento determinado de cDNA o DNA genómico, que me interesa. 00:12:23
¿De acuerdo? 00:12:38
¿Qué ventajas tiene la clonación molecular? 00:12:42
Porque claro, uno puede decir, pero si tengo que purificar y aislar el fragmento, luego debo introducirlo en un plásmido. 00:12:48
Este plásmido lo tengo que introducir en estas células. 00:12:58
Debo dejar que se multipliquen. 00:13:03
Luego tengo que seleccionar estas células y más adelante, recuperar el fragmento amplificado, 00:13:06
pues seguramente puedo estar fácilmente una semana en la clonación molecular. 00:13:14
Para hacer lo mismo que una PCR podría hacer en dos o tres horitas de trabajo. 00:13:18
¿De acuerdo? 00:13:26
Sí, eso es cierto. 00:13:28
Es un proceso mucho más largo, pero conlleva unas ventajas y unas diferencias que veremos ahora después con respecto a las técnicas de PCR. 00:13:30
La primera es que, la primera ventaja es que podemos obtener cantidades ilimitadas de la secuencia de interés. 00:13:41
Es decir, yo estas células, esta célula la puedo cultivar en un matraz aforado, que son bacterias, de 250 mililitros. 00:13:48
O en un matraz aforado de 500 mililitros. 00:13:59
O en un matraz aforado de 1000 mililitros, por tanto de un litro. 00:14:02
O en un matraz aforado de 2 litros, que no sé si existen. 00:14:06
O en un tanque industrial de 600 litros. 00:14:10
Lo que quiero decir es que, 00:14:14
dependiendo del volumen de medio de cultivo en el cual tengo estas células, 00:14:16
puedo obtener trillones y trillones y trillones de células y por tanto de copias amplificadas. 00:14:22
Esta cantidad ilimitada de amplificación, esta amplificación ilimitada de una secuencia de interés, no puedo realizarlo con la PCR. 00:14:30
La clonación me permite también, 00:14:41
me permite también la clonación de secuencias de DNA de gran tamaño. 00:14:45
Por PCR puedo amplificar un tamaño máximo de 35 kilobases. 00:14:49
¿De acuerdo? 35 mil letras. 00:14:54
Aquí puedo, ya lo veremos, puedo incluso tener insertos, insertos de un millón de pares de bases, una megabase. 00:14:56
¿De acuerdo? 00:15:05
Y que son, ya lo veremos ahora, porque los puedo introducir en vectores muy grandes que los llamamos cromosomas. 00:15:06
¿De acuerdo? Unos cromosomas artificiales. 00:15:15
Ojo, que lo veremos ahora después. 00:15:17
Tercera ventaja. 00:15:19
Puedo crear librerías genómicas y librerías de DNA complementario, de cDNA. 00:15:20
Esto lo veremos en un apartado exclusivo para las librerías o bibliotecas de DNA. 00:15:27
Y por último puedo producir proteínas, hormonas y obtener organismos transgénicos, terapia génica, etcétera, etcétera. 00:15:35
Es decir, las aplicaciones. 00:15:43
Las aplicaciones que tiene la clonación molecular son, bueno, tiene una serie de aplicaciones que son imposibles de conseguir con las técnicas de PCR. 00:15:45
Todo esto ya lo veremos. 00:15:56
Es decir, mirad, ¿cómo que puedo producir proteínas? 00:15:58
Pues mirad, sabéis que hay una enfermedad que se llama la diabetes, que la sufren muchas personas en nuestra población, que lo que ocurre es que les falta el gen de la insulina, 00:16:02
tienen mutaciones o tienen una producción baja de insulina y tienen que administrarse insulina varias veces al día o últimamente los tratamientos actuales es una vez al día. 00:16:13
¿De dónde viene esa insulina? 00:16:24
Esa insulina es una proteína. 00:16:26
La insulina es una proteína, es una hormona proteica, muy pequeñita, tiene nueve aminoácidos. 00:16:28
Esa insulina, ¿cómo se ha conseguido? 00:16:34
Pues es una insulina recombinante. 00:16:36
Es decir, es una insulina que hemos aislado su gen. 00:16:38
Lo hemos clonado en un plásmido, lo hemos metido en bacterias. 00:16:42
Ojo, esta bacteria en su interior ahora tiene un gen eucariota humano, que es el gen de la insulina. 00:16:47
Y por las características del plásmido voy a multiplicar estas células y voy a hacer que la maquinaria de la célula sea capaz de leer y transcribir este gen. 00:16:55
Por tanto... 00:17:11
Las baterías las voy a utilizar como biofactorías. 00:17:14
De tal manera que una vez haya introducido el gen de la insulina voy a obligar a todas estas bacterias 00:17:18
a que lean, transcriban el gen y 00:17:24
produzcan la proteína con sus ribosomas. 00:17:29
De tal manera que voy a tener a 300 ayudantes, 300 soldaditos, 00:17:33
como trillones de biofactorías que van a producir insulina 00:17:39
y la van a secretar al medio de cultivo. 00:17:44
De tal manera que yo ahora puedo recoger el medio de cultivo, 00:17:46
aislar y purificar la insulina y prepararla en plumas o en bolígrafos 00:17:49
para los pacientes de diabetes. 00:17:56
Esta aplicación es, por supuesto, impensable en técnicas de PCR 00:17:59
porque son técnicas únicamente de amplificación. 00:18:06
Aquí, además de amplificar ese fragmento, puedo hacer que las bacterias hagan más cosas. 00:18:09
Por tanto, la clonación molecular tiene una serie de aplicaciones 00:18:14
mucho más amplias y de mayor aplicación clínica, por ejemplo, que las técnicas de PCR. 00:18:19
Aquí el libro os pone esta tabla. Está muy bien, una tabla comparativa. 00:18:29
Si no la hubiera puesto el libro, os... 00:18:34
os hubiera pedido que la hicierais vosotros. 00:18:36
Sabemos que es clonación molecular. 00:18:39
La primera diferencia es que esta es in vivo y esta es in vitro, por supuesto. 00:18:41
Aquí el fragmento en clonación molecular, el fragmento de interés, 00:18:45
lo introducimos en una célula viva y vamos a aprovechar su maquinaria replicativa 00:18:49
para amplificarlo. 00:18:54
Y aquí, sin embargo, el DNA lo vamos a amplificar in vitro, en un tubo de ensayo, 00:18:56
en condiciones artificiales que las vamos a generar en nuestro tubo de PCR. 00:19:01
¿De acuerdo? 00:19:06
Por tanto, un contexto in vivo, un contexto in vitro. 00:19:07
La clonación molecular es una técnica manual y dura varios días, ya hemos dicho, 00:19:11
fácilmente una semana. 00:19:17
Mientras que la PCR es automatizada, puede ser automatizada, de hecho, 00:19:19
existen robots que realizan las PCRs introduciendo los reactivos, 00:19:24
hacen la PCR, corren el gel de agarosa y nos dan el resultado. 00:19:30
Y eso en una... 00:19:34
en unas horitas. 00:19:36
¿De acuerdo? 00:19:37
En clonación molecular, esta técnica nos permite obtener prácticamente cualquier cantidad de DNA, 00:19:37
cantidades ingentes de DNA. 00:19:45
Mientras que aquí, la cantidad que obtenemos de amplicones, 00:19:47
de amplicones, varía dependiendo del número de ciclos, 00:19:52
pero hay un número de ciclos máximo, que son 40, acordaos. 00:19:56
¿De acuerdo? 00:20:00
A partir de 40 ciclos, la TAC polimerasa se empieza ya a deteriorar 00:20:00
y ya no se... 00:20:05
no se especifica. 00:20:06
¿De acuerdo? 00:20:07
Y por último, la clonación molecular nos permite amplificar secuencias de DNA 00:20:09
larguísimas, incluso millones de pares de bases, 00:20:13
mientras que aquí, el amplicón máximo, las PCRs de cadena larga, ¿de acuerdo? 00:20:17
Pues el tamaño máximo es de unas 35 kilobases, 35.000 pares de bases. 00:20:25
¿De acuerdo? 00:20:32
Frente a los millones de pares de bases que se pueden obtener, 00:20:33
es importante conocer las similitudes entre ambas técnicas 00:20:36
y las diferencias para saber cuándo puedo utilizar una, 00:20:46
cuándo debo utilizar la otra. 00:20:50
¿De acuerdo? 00:20:52
No sería raro que preguntara algunas cosas relacionadas con esto. 00:20:53
Vamos a ver ahora los componentes de la clonación, 00:20:58
es decir, qué elementos, qué componentes necesitamos 00:21:02
para realizar una clonación. 00:21:05
Lo primero, ya hemos ido hablando de algunos de ellos, 00:21:06
lo primero que necesitamos son vectores de clonación. 00:21:10
¿Qué es un vector de clonación? 00:21:13
De forma genérica, nosotros, y tiro para atrás, 00:21:15
aquí hemos hablado de un caso particular, un ejemplo particular, 00:21:18
en el que hemos utilizado un vector bacteriano, que es un plásmido, 00:21:23
y como células hospedadoras, bacterias. 00:21:28
Pero podemos utilizar otro tipo de vectores, que los veremos ahora, 00:21:31
y también podemos, 00:21:34
y también podemos introducirlos en otro tipo de células. 00:21:36
Pues un vector de clonación, de forma genérica, son moléculas de DNA 00:21:39
que pueden replicarse autónomamente en una célula huésped. 00:21:43
Por tanto, una célula huésped, yo puedo introducir un plásmido o un vector, 00:21:49
así vamos a hablar de forma genérica, un vector, 00:21:55
lo introduzco en esa célula y él por sí solo se puede replicar dentro de la célula, 00:21:58
de tal manera que de una copia de ese vector pueda tener más. 00:22:03
Primera característica, por tanto, de los vectores deben ser autorreplicativos. 00:22:06
Y segunda característica, que permitan que yo le pueda insertar un DNA extraño 00:22:12
sin que pierdan esa capacidad de replicación autónoma. 00:22:19
Son las dos características que le voy a pedir a cualquier molécula 00:22:25
para que pueda servirme de vector de clonación. 00:22:28
Ya sabéis que este DNA, 00:22:32
que no es propio, sino que es extraño para el vector, 00:22:36
porque no es suyo, no es de su secuencia, 00:22:40
lo llamamos inserto. 00:22:43
Inserto es el fragmento de DNA que voy a clonar en el vector. 00:22:44
¿De acuerdo? 00:22:50
¿Qué características deben tener los vectores de clonación? 00:22:52
Esta parte es muy importante. 00:22:56
¿De acuerdo? 00:22:58
Cuatro características fundamentales. 00:23:01
Todos los vectores de clonación, todos, sin excepción, 00:23:02
ninguna, deben contener estas cuatro características, 00:23:06
estos cuatro componentes en su secuencia. 00:23:10
¿De acuerdo? 00:23:13
Por tanto, 00:23:14
estas características son aspectos que debo tener en cuenta 00:23:15
para que una molécula de DNA la pueda utilizar como vector. 00:23:20
Es decir, ¿cómo elijo el vector? 00:23:24
Pues primero, para que sea un vector, debe cumplir estas cuatro condiciones. 00:23:27
Si no cumple alguna de ellas, no es vector. 00:23:31
Y no lo voy a utilizar para clonación molécula. 00:23:35
Primero, debe contener un origen de replicación. 00:23:38
Si os acordáis, para que un fragmento de DNA se pueda replicar, 00:23:42
tanto si es bacteriano como eucariota, 00:23:48
requiere de un origen de replicación. 00:23:51
Si os acordáis del tema 2, ya vimos esto, 00:23:53
y en bacterias lo llamábamos el oricé, 00:23:57
es una secuencia donde se va a anclar la maquinaria de replicación, 00:24:00
y se va a anclar la maquinaria de replicación, 00:24:04
de tal manera que a partir del origen de replicación 00:24:05
se va a replicar toda la molécula. 00:24:09
Por tanto, si yo quiero que el vector sea autorreplicativo, 00:24:12
debe contener un origen de replicación. 00:24:16
El origen de replicación, ya veremos, puede ser bacteriano, 00:24:18
puede ser eucariota, dependiendo de la célula donde yo lo vaya a meter, 00:24:21
pondré uno o pondré otro. 00:24:27
Segunda característica, debe contener un sitio de inserción múltiple. 00:24:29
Es lo que llamamos un polilínquer, ¿de acuerdo? 00:24:34
Entonces, en la secuencia del vector va a haber una región, 00:24:39
lo vamos a ver ahora, 00:24:43
una región que va a ser la región donde se va a insertar el DNA 00:24:45
que queremos amplificar, ¿de acuerdo? 00:24:51
Es lo que llamamos el polilínquer. 00:24:53
Y este polilínquer está formado, 00:24:55
tiene un poquito hacia adelante, por aquí se ve muy bien, 00:24:59
aquí tenemos un plásmido, 00:25:02
vamos a volver a repasar ahora después, 00:25:04
donde tenemos el origen de replicación 00:25:07
y tenemos un polilínquer, aquí lo tenemos, 00:25:10
que es una región en la cual encontramos la secuencia, 00:25:14
su secuencia, la secuencia de esta región, 00:25:22
no es ni más ni menos que la secuencia de restricción 00:25:26
de un montón de enzimas de restricción una detrás de la otra. 00:25:29
¿Os acordáis? 00:25:34
Los enzimas de restricción eran aquellos enzimas que se unían al DNA 00:25:34
y eran capaces de reconocer una secuencia diana 00:25:42
o secuencia de restricción y cortar el DNA. 00:25:46
De tal manera que en este polilínquer, 00:25:51
este polilínquer en concreto, 00:25:54
puede ser reconocido por todos estos enzimas de restricción. 00:25:56
¿Por qué? 00:26:00
Porque aquí una detrás de otra 00:26:01
están todos los polilínquers, 00:26:03
todas las secuencias específicas 00:26:04
que reconocen todos estos enzimas de restricción. 00:26:07
Por tanto, para cortar este vector, 00:26:10
como si fuera con unas tijeras, 00:26:13
yo puedo utilizar cualquiera de estos enzimas de restricción. 00:26:15
Cualquiera de ellos van a ir chequeando por aquí 00:26:19
dónde está su secuencia diana 00:26:22
y ahí lo van a cortar. 00:26:23
De tal manera que una vez yo lo haya cortado, 00:26:26
aquí en este punto de corte, 00:26:28
una vez este plásmido ya lo he linearizado, 00:26:31
ya no es circular, lo he linearizado, 00:26:34
aquí es donde se va a insertar 00:26:36
el fragmento que quiero amplificar. 00:26:38
¿De acuerdo? 00:26:42
Por tanto, un origen de replicación, 00:26:43
el polilínquer, 00:26:46
un marcador de selección 00:26:49
y un marcador de identificación. 00:26:51
Ya hemos dicho, 00:26:53
y tiro otra vez para atrás, 00:26:55
que una vez que ya he introducido el vector 00:26:57
en la célula hospedadora 00:27:01
y se ha amplificado, 00:27:03
debo de llevar a cabo un proceso de selección. 00:27:04
Este proceso de selección 00:27:06
lo puedo llevar a cabo gracias 00:27:08
a que en el vector tengo 00:27:10
un marcador de selección 00:27:12
y un marcador de identificación. 00:27:14
¿Qué es el marcador de selección 00:27:16
y el marcador de identificación? 00:27:18
Son dos genes. 00:27:20
Dos genes que yo he introducido en el vector. 00:27:22
El marcador de selección 00:27:24
me va a permitir determinar 00:27:26
cuál de esas células, 00:27:28
quién lleva el vector. 00:27:30
¿Vale? 00:27:32
Por tanto, 00:27:34
de todas las bacterias, 00:27:36
¿cuáles han introducido el vector? 00:27:38
Tienen el vector. 00:27:40
Pero, ¡ojo! 00:27:42
Ese vector puede ser vector normal, 00:27:44
vacío, 00:27:46
o puede ser vector recombinante. 00:27:48
Por tanto, 00:27:50
y esto no lo he explicado antes, 00:27:52
lo explico ahora. 00:27:54
Algunas de estas células, 00:27:56
cuando yo hago este proceso 00:27:58
de insertar el fragmento 00:28:00
en el plásmido, 00:28:02
algunos de estos plásmidos 00:28:04
no lo introducen 00:28:06
y lo único que hacen es 00:28:08
se vuelven a unir. 00:28:10
De tal manera que tendré plásmidos vacíos 00:28:12
y plásmidos recombinantes. 00:28:14
Vectores vacíos, 00:28:16
vectores recombinantes. 00:28:18
Cuando yo coja esta mezcla 00:28:20
y la introduzca dentro de las células, 00:28:22
habrá células que introducirán 00:28:24
el vector recombinante 00:28:26
y células que introducirán vector vacío. 00:28:28
¿De acuerdo? 00:28:30
El marcador de selección 00:28:32
me permite discriminar 00:28:34
las células vacías 00:28:36
que no tienen vector 00:28:38
de las células que llevan vector. 00:28:40
Y el marcador de identificación 00:28:42
me permite determinar 00:28:44
dentro de las que llevan vector 00:28:46
las que llevan vector vacío 00:28:48
de las que llevan vector recombinante. 00:28:50
¿De acuerdo? 00:28:52
Todo esto lo vamos a ver 00:28:54
ahora más adelante. 00:28:56
¿Qué tipos de vectores tenemos? 00:29:02
El más utilizado, 00:29:04
los más utilizados son los plásmidos 00:29:06
que ya sabemos que son moléculas 00:29:08
de DNA circular, 00:29:10
bicatenario, 00:29:12
que poseen un origen de replicación 00:29:14
¿De acuerdo? 00:29:16
Y que sabemos 00:29:18
que tienen capacidad 00:29:20
de autorreplicación, 00:29:22
replicación autónoma. 00:29:24
Normalmente todos estos plásmidos 00:29:26
son de origen bacteriano, 00:29:28
contienen un origen de replicación bacteriano, 00:29:30
es un oricén, 00:29:32
y suelen llevar 00:29:34
incorporado, porque nosotros 00:29:36
le solemos incorporar, 00:29:38
un gen de resistencia a un antibiótico. 00:29:40
¿De acuerdo? 00:29:42
Un gen de resistencia a un antibiótico. 00:29:44
En este caso es un gen de resistencia 00:29:48
a ampicilina. 00:29:50
De tal manera que 00:29:52
este va a ser mi marcador de selección. 00:29:54
¿Por qué es el marcador de selección? 00:29:58
¿Por qué es el marcador de selección? 00:30:00
Bueno, 00:30:02
esto lo voy a explicar un poquito más adelante. 00:30:04
¿De acuerdo? 00:30:06
Pero este sería mi marcador de selección. 00:30:08
De tal manera que aquí tengo el plásmido 00:30:10
que va a ser mi vector. 00:30:12
Los plásmidos se utilizan muchísimo como vectores. 00:30:14
Ya lo he dicho. 00:30:16
¿Cómo seleccionamos cuál es el plásmido adecuado? 00:30:18
Pues nos vamos a fijar en dos parámetros importantes. 00:30:20
El primero, el tamaño del inserto. 00:30:22
Hay plásmidos que admiten 00:30:24
insertos 00:30:26
grandes. 00:30:28
Un inserto muy grande, 00:30:30
de kilobases. 00:30:32
Hay otros plásmidos 00:30:34
que soportan 00:30:36
y pueden transportar 00:30:38
insertos más pequeños. 00:30:40
Dependiendo del tamaño del inserto, 00:30:42
elijo un plásmido u otro. 00:30:44
Y en segundo lugar, el número de copias 00:30:46
del plásmido por célula. 00:30:48
En este ejemplo, este plásmido 00:30:50
su número de copias es 3. 00:30:52
Cada célula puede soportar 00:30:54
3 copias 00:30:56
como máximo. 00:30:58
El número de copias es mucho mayor. 00:31:00
Se pueden auto-replicar 00:31:02
hasta 50 veces. 00:31:04
Con una sola bacteria 00:31:06
tendría 50 copias 00:31:08
del inserto. 00:31:10
De mi fragmento de interés. 00:31:12
Dependiendo del tamaño del inserto 00:31:14
y del número de copias del plásmido, 00:31:16
voy a elegir un vector u otro. 00:31:18
Aquí, por ejemplo, 00:31:20
el libro nos pone estos dos ejemplos. 00:31:22
Hay cientos y cientos 00:31:24
de vectores plasmídicos 00:31:26
disponibles. 00:31:28
Para los laboratorios de 00:31:30
biología molecular. 00:31:32
Este de aquí, ya veis por ejemplo 00:31:34
que tiene el oricé 00:31:36
y tiene dos genes de resistencia. 00:31:38
Un gen de resistencia 00:31:40
a ampicilina y un gen de resistencia 00:31:42
a tetraciclina. Ya hemos dicho antes 00:31:44
que los marcadores de selección 00:31:46
y los marcadores de identificación 00:31:48
suelen ser genes. Genes de resistencia 00:31:50
a antibióticos. 00:31:52
En este caso, también lleva el gen 00:31:54
de resistencia a ampicilina 00:31:56
¿De acuerdo? 00:31:58
Como marcador de selección. 00:32:00
Lleva su oricé y aquí 00:32:02
nos han puesto un gen LAGZ 00:32:04
que ya veremos para qué se utiliza 00:32:06
y su polilínquer. En este caso, 00:32:08
este vector no tiene 00:32:10
un polilínquer delimitado 00:32:12
en una región muy específica y pequeñita 00:32:14
sino que el polilínquer está 00:32:16
a lo largo de 00:32:18
toda la secuencia 00:32:20
del plásmido. 00:32:22
Hay diferentes tipos de plásmidos 00:32:24
con diferentes características. 00:32:26
Este, por ejemplo, admite 00:32:28
genes pequeños 00:32:30
y tiene un número de copia de 20. 00:32:32
Este, en cambio, admite 00:32:34
hasta 10 kilobases, 10.000 00:32:36
pares de bases, que son insectos grandes 00:32:38
y tiene una alta tasa 00:32:40
de replicación, 500 copias por célula. 00:32:42
De tal manera que si yo tengo 00:32:44
500 células, pues entonces 00:32:46
tendré 500 por 500 00:32:48
25.000 00:32:50
o 250.000, si no me equivoco 00:32:52
250.000 copias 00:32:54
del insecto. 00:32:56
¿De acuerdo? Hemos dicho 00:32:58
que los marcadores de selección 00:33:00
e identificación son genes de resistencia 00:33:02
ampicilina. 00:33:04
¿Por qué se utilizan genes de resistencia 00:33:06
ampicilina, tetraciclina, cannamicina, 00:33:08
antibióticos? ¿Por qué? 00:33:10
Porque eso me va a permitir seleccionar 00:33:12
y tiro para atrás otra vez 00:33:14
qué células 00:33:16
tienen el vector. 00:33:18
De tal manera que yo 00:33:20
estas células, hemos dicho que una vez 00:33:22
que han introducido el vector 00:33:24
recombinante, estas células 00:33:26
las vamos a 00:33:28
poner en cultivo. 00:33:30
Pero las vamos a poner en cultivo 00:33:32
y en el medio de cultivo, además de todos 00:33:34
los nutrientes que necesitan las bacterias 00:33:36
voy a poner un antibiótico, que es 00:33:38
ampicilina. De tal manera que 00:33:40
sólo aquellas células que hayan 00:33:42
introducido y sean 00:33:44
células recombinantes, clones 00:33:46
recombinantes, van a poder 00:33:48
sobrevivir. ¿Por qué? 00:33:50
Porque habrán incorporado 00:33:52
el marcador de selección, que 00:33:54
no es ni más ni menos 00:33:56
que el gen de resistencia 00:33:58
a la ampicilina. Es un gen 00:34:00
que permite a la bacteria introducir 00:34:02
la ampicilina y romperla. 00:34:04
De tal manera que hace que esta bacteria 00:34:06
sea resistente a la ampicilina. 00:34:08
Por tanto, ¿qué bacterias 00:34:10
serán resistentes a la ampicilina? 00:34:12
Solamente 00:34:14
aquellas que contengan el 00:34:16
plásmido, el vector recombinante. 00:34:18
¿De acuerdo? 00:34:20
Además de plásmidos, que son los que más 00:34:24
se utilizan, luego tenemos bacteriófagos. 00:34:26
Es decir, virus, 00:34:28
los bacteriófagos o fagos en general 00:34:30
son los virus que infectan 00:34:32
bacterias. Entonces, de tal 00:34:34
manera que yo puedo coger un virus 00:34:36
dentro de su genoma, meterle el 00:34:38
fragmento de interés 00:34:40
y hacer que el virus propague 00:34:42
ese 00:34:44
fragmento infectando a las 00:34:46
bacterias. De tal manera que vaya 00:34:48
introduciendo, si recordáis, por 00:34:50
el ciclo lítico lisogénico 00:34:52
introduzca, llega 00:34:54
el virus, según 00:34:56
su ciclo, llega el virus y lo 00:34:58
normal es que introduzca todo 00:35:00
su genoma 00:35:02
y lo inserte, 00:35:04
si sigue el ciclo lisogénico, 00:35:06
que lo vamos a ver rápidamente, 00:35:08
inserte este fragmento suyo 00:35:10
de su genoma en el cromosoma 00:35:12
bacteriano. ¿De acuerdo? 00:35:14
De tal manera que la bacteria cuando se duplica 00:35:16
va duplicando 00:35:18
el genoma del 00:35:20
virus. Si yo dentro del 00:35:22
genoma del virus además 00:35:24
he añadido aquí dentro 00:35:26
mi fragmento de interés, 00:35:28
utilizo como vector el virus 00:35:30
y el virus va infectando bacterias, 00:35:32
va introduciendo en las bacterias 00:35:34
mi gen de interés 00:35:36
junto con su genoma 00:35:38
y a medida que se amplifican 00:35:40
las bacterias, pues se va 00:35:42
amplificando también el genoma del virus 00:35:44
y mi inserto. 00:35:46
¿De acuerdo? En determinadas 00:35:48
circunstancias de este ciclo lisogénico 00:35:50
un virus puede 00:35:52
hacer un ciclo lítico y por tanto 00:35:54
producir más viriones, 00:35:56
lisar la bacteria 00:35:58
y producir más virus que vayan a infectar 00:36:00
más bacterias. ¿De acuerdo? 00:36:02
Por tanto, puedo utilizar bacteriófagos, 00:36:04
virus, 00:36:06
como vectores para llevar 00:36:08
mi inserto de unas células 00:36:10
a otras por medio del 00:36:12
ciclo de infección 00:36:14
normal de los virus. 00:36:16
Estos de aquí, los virus 00:36:22
que siguen un ciclo lisogénico pueden 00:36:24
insertar temporalmente su material genético 00:36:26
como ya hemos dicho dentro del 00:36:28
genoma de las bacterias. 00:36:30
El que más se utiliza bacteriófago 00:36:32
como vector de clonación 00:36:34
es el fago lambda. 00:36:36
Tenemos aquí su estructura 00:36:38
¿De acuerdo? Con una región izquierda, 00:36:40
una central y una derecha 00:36:42
y aquí se utiliza mucho el fago lambda 00:36:44
para insertar en estas 00:36:46
zonas de CoR1 00:36:48
que es una enzima de restricción 00:36:50
para insertar los fragmentos de interés. 00:36:52
¿De acuerdo? 00:36:54
Muy bien. 00:36:56
Tenemos los cósmidos. Los cósmidos son 00:36:58
vectores híbridos que tienen 00:37:00
una parte del cromosoma del fago 00:37:02
y una parte del plásmido y permiten 00:37:04
insertos de hasta 50.000 00:37:06
pares de bases. 00:37:08
Los fagémidos que también son 00:37:10
vectores híbridos que están compuestos por 00:37:12
un plásmido ¿De acuerdo? 00:37:14
con su origen de replicación bacteriano 00:37:16
y le insertamos también un origen de replicación 00:37:18
del fago M13. 00:37:20
Se utiliza muy poco 00:37:22
los fagémidos y para 00:37:24
usos muy específicos. 00:37:26
Y después tenemos los cromosomas 00:37:28
artificiales. Los cromosomas artificiales 00:37:30
son vectores de clonación con gran 00:37:32
capacidad de tal manera 00:37:34
que podemos insertarles 00:37:36
fragmentos enormes, de gran tamaño. 00:37:38
Tenemos dos tipos diferentes. 00:37:40
Le llamamos cromosomas porque son 00:37:42
muy grandes pero tiene una 00:37:44
estructura parecida a los cromosomas eucariotas 00:37:46
pero no son cromosomas 00:37:48
eucariotas. Son cromosomas 00:37:50
artificiales que pueden ser bacterianos 00:37:52
por tanto con toda la estructura 00:37:54
de un cromosoma bacteriano 00:37:56
que permiten insertos de hasta 00:37:58
300 kilobases 00:38:00
300.000 pares de bases 00:38:02
y los artificiales de 00:38:04
levaduras 00:38:06
los GIST Artificial Chromosomes 00:38:08
JAX en inglés 00:38:10
por las siglas en inglés 00:38:12
que alcanzan millones 00:38:14
de pares de bases. Más 00:38:16
de una megabase. 00:38:18
Los hay incluso de dos megabases. 00:38:20
Esto en cuanto 00:38:22
a los vectores. Ya hemos dicho 00:38:24
que además de los vectores y del inserto 00:38:26
necesitamos 00:38:28
también los vectores lanzadera. 00:38:30
Se utilizan muy poco y estos vectores lanzadera 00:38:32
los vamos a utilizar para meter 00:38:34
un gen y que nos sirva para 00:38:36
transportarlo entre dos 00:38:38
tipos de células. 00:38:40
Son también vectores híbridos 00:38:42
contienen orígenes de replicación 00:38:44
de dos hospedadores por ejemplo 00:38:46
de bacterias y de células eucariotas 00:38:48
o de bacterias y virus 00:38:50
y solamente se utilizan 00:38:52
como transbordadores. 00:38:54
Para transportar el fragmento 00:38:56
de un tipo de célula a otra 00:38:58
utilizamos los vectores 00:39:00
lanzaderas. 00:39:02
Además de los vectores 00:39:06
necesitamos células hospedadoras 00:39:08
por supuesto. 00:39:10
¿Cómo definimos las células hospedadoras? 00:39:12
Pues aquellas en las que vamos a poder 00:39:14
introducir el vector de clonación 00:39:16
para que se pueda amplificar 00:39:18
el inserto. 00:39:20
Por tanto deben ser células 00:39:22
que permitan 00:39:24
y que puedan albergar 00:39:26
vectores de clonación. 00:39:28
Las cultivamos en medio 00:39:30
de cultivos adecuados 00:39:32
en los que se van a multiplicar 00:39:34
¿De acuerdo? 00:39:36
En los que se van a seleccionar 00:39:38
y van a dar lugar a las células hijas. 00:39:40
Todas ellas 00:39:42
con la misma carga genética 00:39:44
incluido el vector. 00:39:46
Todas ellas van a contener el vector 00:39:48
por eso las llamamos clones. 00:39:50
Son clónicas a la primera célula. 00:39:52
¿De acuerdo? 00:39:54
Y por eso las llamamos a todas ellas 00:39:56
componentes. 00:39:58
Las células que más se utilizan 00:40:00
son las células bacterianas, son prokaryotas 00:40:02
son células 00:40:04
muy, muy utilizadas 00:40:06
y en ellas podemos clonar 00:40:08
por supuesto plásmidos, 00:40:10
fagos y cósmidos. 00:40:12
¿De acuerdo? 00:40:14
Son células muy fácilmente 00:40:16
se pueden transformar de forma 00:40:20
muy fácil 00:40:22
y que son células muy versátiles 00:40:24
de tal manera que además crecen 00:40:26
con mucha rapidez. 00:40:28
Todo esto son ventajas de las bacterias. 00:40:30
Las que más se utilizan son 00:40:32
Escherichia coli, hay que conocerla. 00:40:34
Escherichia coli es una bacteria 00:40:36
intestinal, la tenemos en el colon 00:40:38
todos los seres humanos 00:40:40
y la mayoría de los mamíferos 00:40:42
Escherichia coli, en concreto dos cepas 00:40:44
que es la cepa K12 00:40:46
y la cepa DH5 alfa. 00:40:48
Estas dos cepas 00:40:50
se utilizan muchísimo 00:40:52
y son cepas que llamamos bacterias 00:40:54
competentes. 00:40:56
Están tratadas 00:40:58
de tal manera que 00:41:00
permiten, están preparadas 00:41:02
para que puedan albergar 00:41:04
estos vectores de clonación. 00:41:06
Y luego tenemos 00:41:08
células hospedadoras eucariotas 00:41:10
que pueden ser 00:41:12
levaduras, células vegetales, animales 00:41:14
o de mamíferos. 00:41:16
¿De acuerdo? 00:41:18
Por ejemplo, de levaduras 00:41:20
la que más se utiliza son 00:41:22
como levaduras Saccharomyces cerevisiae 00:41:24
y Saccharomyces 00:41:26
cerevisiae 00:41:28
Hay que conocerlas. 00:41:30
Saccharomyces cerevisiae 00:41:32
es una levadura que se utiliza muchísimo 00:41:34
como célula hospedadora eucariota. 00:41:36
En células 00:41:38
vegetales y animales 00:41:40
las utilizamos para genes 00:41:42
para insertar genes 00:41:44
siempre y cuando queramos 00:41:46
obtener 00:41:48
plantas o animales transgénicos. 00:41:50
Por tanto, 00:41:52
de forma rutinaria 00:41:54
no se suelen utilizar células vegetales 00:41:56
solamente para amplificar 00:41:58
un fragmento de DNA. 00:42:00
Para amplificar un fragmento de DNA 00:42:02
y obtener muchas copias 00:42:04
utilizamos levaduras. 00:42:06
¿Cuándo utilizaremos células vegetales y animales? 00:42:08
Cuando queramos obtener plantas 00:42:10
y animales transgénicos. 00:42:12
Idioma/s:
es
Autor/es:
Pedro Melgar-Rojas
Subido por:
Pedro M.
Licencia:
Reconocimiento - No comercial - Sin obra derivada
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Fecha:
2 de febrero de 2024 - 19:16
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Clave
Centro:
IES BENJAMIN RUA
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