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Videoconferencia 5 diciembre - Contenido educativo - Contenido educativo

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Subido el 7 de diciembre de 2023 por Susana A.

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Vale, pues, hoy vamos a ver la siguiente técnica que es la electroforesis. 00:00:00
Vale, pues, esta técnica es un poco más compleja que la cromatografía que hemos visto, 00:00:23
¿vale? 00:00:43
Si os acordáis habíamos visto, bueno, que primero teníamos que extraer las proteínas 00:00:44
de nuestras células y las tres formas que teníamos de extraer las proteínas y una 00:00:50
vez extraídas las proteínas, pues, lo que hacíamos era, podíamos cuantificar el total 00:00:56
de esas proteínas que teníamos tres métodos, teníamos el método de Lowry, el método 00:01:01
de Bradford, estos dos métodos eran haciendo reaccionar las proteínas con otras sustancias 00:01:08
y se formaba una sustancia coloreada que luego medíamos en el espectrofotómetro ultravioleta 00:01:13
visible y si no también podíamos cuantificar las proteínas aprovechando que las proteínas 00:01:20
absorben a una longitud de onda de 280 nanómetros y luego lo medíamos en el espectrofotómetro 00:01:27
ultravioleta. 00:01:34
Esta sería la cuantificación, cómo cuantificamos esa cantidad que tenemos de proteínas en 00:01:35
la célula y una vez hecha la cuantificación podemos hacer una separación de las proteínas, 00:01:42
un fraccionamiento y esa separación se puede hacer por tres métodos, por diálisis, por 00:01:48
cromatografía y esta última técnica que vamos a ver es la electroforesis. 00:01:55
Bueno, el otro día, ahora me estoy acordando que el otro día no vimos del todo la cromatografía 00:02:00
en capa fina, que esta cromatografía no está en los apuntes pero bueno, yo creo que 00:02:06
es importante. 00:02:12
Entonces, el otro día vimos que teníamos tres tipos, no, cuatro tipos de cromatografía, 00:02:13
una cromatografía, un segundo que voy a ponerla a estas, ¿os acordáis que en cromatografía 00:02:21
teníamos una fase estacionaria que es todo esto de aquí en gris y teníamos una fase 00:02:30
móvil, que la fase móvil era la que va a arrastrar a nuestra muestra, que es esto de 00:02:36
aquí en negro en este caso, va a arrastrar a la muestra por toda la fase estacionaria. 00:02:42
Entonces, dependiendo de las interacciones entre los componentes de nuestra muestra y 00:02:49
la fase estacionaria, los componentes de nuestra muestra se van a quedar más o menos retenidos 00:02:54
y van a salir antes o después, o más tarde. 00:03:02
Si os acordáis, esta sería nuestra muestra en negro, pues aquí los componentes se van 00:03:06
separando, separando, primero sale el componente de color rojo, después este gris y después 00:03:12
este verde. 00:03:18
Entonces, esto es una forma de separar los componentes de una muestra. 00:03:19
Entonces, vimos que, bueno, acordaros de los nombres, fase estacionaria y fase móvil. 00:03:24
Bueno, vimos que había cuatro tipos de cromatografía, que podía ser filtración en gel, intercambio 00:03:31
iónico, afinidad y cromatografía en capa fina. 00:03:42
Los tres primeros de aquí se hacen en columna y teníamos la cromatografía de filtración 00:03:47
en gel. 00:03:56
Si os acordáis, era esta en la que teníamos como fase estacionaria, que eran estas unas 00:03:57
bolas de polímero que tienen unas oquedades, unos huecos, unos orificios. 00:04:04
Entonces, nuestra muestra, dependiendo de su masa molecular, pues si son moléculas 00:04:09
pequeñas se van a quedar retenidas aquí en nuestros huecos y las moléculas más grandes 00:04:16
van a salir primero. 00:04:21
Esta rojo, en rojo salen primeros, el huyen primero y las otras se van quedando ahí retenidas 00:04:22
y al final acaban saliendo, pero salen más tarde. 00:04:28
Esta es la cromatografía de filtración en gel, que nos sirve pues para eso, para separar 00:04:31
moléculas de diferente masa molecular. 00:04:37
Nos sirve también pues, por ejemplo, para purificar una proteína. 00:04:40
Si tenemos una proteína en la que se nos ha quedado ahí algún reactivo, como esos 00:04:44
reactivos tendrán menor masa molecular, pues se quedarán retenidos y saldrán más tarde. 00:04:48
Esta es la de filtración en gel. 00:04:54
Luego teníamos la cromatografía de intercambio iónico. 00:04:58
Acordaros que en esta cromatografía lo que se separan a las proteínas por su carga. 00:05:02
Entonces podemos tener la fase estacionaria, en este caso tiene carga positiva, esta es 00:05:10
la fase estacionaria, las bolas estas en gris, podría ser positiva o puede ser también 00:05:16
negativa, puede ser de los dos tipos. 00:05:23
Una sería intercambio aniónico y en el otro caso sería intercambio cationico. 00:05:25
Y esto de aquí, las bolas rojas y grises serían nuestra mezcla de proteínas. 00:05:30
Las que tengan carga negativa, estas rojas, se van a quedar interaccionando con la fase 00:05:38
estacionaria y las negras, que tienen carga positiva, van a eluir primero. 00:05:42
Pues esta es otra forma de separar nuestras proteínas y acordaros que también nos basábamos 00:05:49
en que dependiendo del punto isoléctrico de las proteínas, si estamos por debajo del 00:05:57
punto isoléctrico, la carga de las proteínas va a ser positiva, por debajo del punto isoléctrico 00:06:06
y si el pH está por encima del punto isoléctrico, la proteína tendrá carga negativa. 00:06:14
Entonces tenemos filtración en gel, que es la separación por masa molecular, cromatografía 00:06:22
de intercambio iónico, en la que se separan según su carga y por último teníamos la 00:06:31
cromatografía de afinidad, que aquí esta cromatografía es muy específica y se utilizan 00:06:37
por ejemplo enzimas para separar sustratos. 00:06:45
Si como vimos ya que la reacción enzima-sustrato es una reacción muy específica, pues dependiendo 00:06:52
del sustrato que tengamos se van a separar unas enzimas u otras. 00:07:00
Por último vimos la cromatografía en capa fina, esta yo creo que ya la vimos un poco 00:07:08
así al final y bueno vamos a repasarla también ahora un poquito más. 00:07:14
Esta es la que es un poco diferente, esta cromatografía en capa fina se llama también 00:07:26
TLC, por las siglas en inglés Thin Layer Chromatography, TLC, y entonces aquí también 00:07:31
tenemos una fase estacionaria, aquí la fase estacionaria es una placa de gel de sílice 00:07:39
y es un sólido que es polar, tiene grupos funcionales polares y esta sería la fase 00:07:48
estacionaria y la fase móvil es una mezcla de disolventes. 00:07:58
Lo que vamos a hacer es que esta fase móvil va a ascender, asciende por capilaridad a 00:08:04
través de la fase estacionaria, va a arrastrar nuestra muestra y entonces la muestra dependiendo 00:08:10
de si sus componentes son polares o apolares se van a quedar más o menos retenidos en 00:08:18
la fase estacionaria. 00:08:24
Entonces lo que hacemos es pinchar, se dice así pinchar, es decir, ponemos aquí una 00:08:28
gota de nuestra muestra y introducimos, ponemos la gota en la placa de gel de sílice y introducimos 00:08:34
esta placa en la cubeta que es esta de aquí, en esta cubeta. 00:08:45
La fase móvil, el hluyente, va ascendiendo por capilaridad, asciende, asciende, no hay 00:08:52
que dejarlo que suba hasta el final del todo, cuando llega hasta más o menos un centímetro 00:08:57
se saca la placa de la cubeta y entonces lo que ocurre es que los componentes de nuestra 00:09:03
muestra se han ido separando según su polaridad, los componentes más polares se van a quedar 00:09:12
más retenidos en la placa, porque como la placa es polar pues se van a quedar más retenidos 00:09:21
y los componentes no polares van a ascender y van a quedar más arriba de la placa. 00:09:28
Entonces lo que se hace es medir el RF se llama, que se llama la relación de frentes 00:09:36
y lo que se mide es la distancia que ha recorrido el analito, el componente de nuestra muestra 00:09:46
pues por ejemplo sería de aquí, en este sería de aquí a aquí, este sería el A, 00:09:53
esto es la distancia que ha recorrido este componente y lo dividiríamos entre la distancia 00:10:00
que ha recorrido el disolvente que sería hasta aquí, entre esta distancia, entre D 00:10:05
y eso nos va a dar la relación de frentes, es la distancia recorrida por el analito A 00:10:12
por ejemplo partido de la distancia recorrida por la fase móvil, entonces este parámetro 00:10:20
va a tomar valores entre 0 y 1, cuanto más cerca sea de 0 significa que el analito tiene 00:10:27
más afinidad por la fase estacionaria, queda muy retenido y sin embargo cuanto más cercano 00:10:34
a 1 sea el valor este de RF, el analito tiene más afinidad por la fase móvil y entonces 00:10:40
queda poco retenido por la fase estacionaria, cuanto más cerca será el RF más próximo 00:10:47
a 0 y cuanto más arriba quede RF más próximo a 1, vale y entonces se puede hacer dos tipos 00:10:56
de medidas, una sería utilizar patrones, entonces por ejemplo se puede utilizar, imaginaros 00:11:16
que queremos saber los aminoácidos que tiene la caseína, la caseína es una proteína que 00:11:26
tiene varios aminoácidos, pues entonces lo que hacemos es pinchar la caseína, preparamos 00:11:32
una disolución de caseína y la pinchamos y pinchamos por ejemplo aquí un aminoácido, 00:11:39
pues no sé, por ejemplo la leucina y entonces hacemos la cromatografía, dejamos que pase 00:11:45
la fase estacionaria, digo perdón, la fase móvil que ascienda por capilaridad, sacamos la placa, 00:11:51
bueno luego habría que revelarla, se utiliza una disolución que se llama anidrina para ver los 00:11:58
colores y lo que podríamos hacer es comparar, pues aquí como nosotros hemos puesto leucina y esta es 00:12:05
nuestra muestra de caseína, pues podemos decir que la caseína contiene un aminoácido que es la 00:12:13
leucina, entonces esto sería mediante comparación, una muestra que tiene varios aminoácidos y 00:12:22
pinchamos pues uno de esos aminoácidos que creemos que está en nuestra muestra, comparamos y en este 00:12:31
caso pues tendría leucina y otra forma de hacer las medidas es mediante el valor de RF, lo que os 00:12:39
decía antes, pues medir por ejemplo aquí esta mancha pues sería, medimos esta distancia, la B y 00:12:47
la dividimos entre la distancia que ha recorrido el disolvente que sería de aquí hasta aquí, hasta 00:12:54
cuando hemos sacado la placa de nuestra cubeta, dividiríamos un valor que en este caso pues es por 00:13:00
ejemplo 2,1 es este valor entre el valor de lo que ha recorrido el disolvente que es 2,8 y nos da 0,75 00:13:07
entonces este valor de RF lo podemos comparar, pues si tenemos datos de este tipo de muestras se 00:13:17
puede comparar y ver si nuestra muestra pues tiene este compuesto, entonces estas son dos formas de 00:13:24
identificar. 00:13:32
Bueno aquí simplemente os había puesto todas las aplicaciones que tiene la cromatografía 00:13:36
capa fina, es una técnica muy sencilla pero que se utiliza mucho sobre todo en análisis presuntivos 00:13:42
es decir simplemente para saber si una muestra tiene un compuesto o no, luego ya se hace en 00:13:50
otra serie de análisis pero nos sirve para ir seleccionando y entonces pues se utiliza en 00:13:59
control de la industria farmacéutica, control de calidad, controles de identidad y 00:14:06
pureza, en medioambiente para análisis de aguas, de suelos, de residuos, en análisis de alimentos, 00:14:13
análisis de aditivos, de pesticidas, en medicina forense, en aplicaciones clínicas por ejemplo en 00:14:19
el control de dopaje, entonces es una técnica pues eso que es una técnica muy sencilla, rápida y 00:14:27
en el que nos sirve es como un análisis presuntivo, a partir de estos datos ya se hacen otra serie de 00:14:33
medidas, no podemos confirmar nada con esta técnica pero sí que podemos ir, nos ayuda a 00:14:39
después qué técnica tenemos que elegir, cómo tenemos que seguir nuestro análisis, entonces bueno 00:14:45
aquí hay un vídeo del CSIC también, que creo que este nos lo puse el otro día, que es la 00:14:53
cromatografía de en capa fina, a ver si quiero, bueno lo pongo desde aquí 00:15:01
esta sería la mezcla, nuestra muestra, tenemos una mezcla de productos 00:15:23
y ahora vamos a pinchar, esta sería la placa de gel de sílice y pinchamos, ponemos ahí una gota, habría que 00:15:40
secar con el secador y se coloca en la fase móvil, que es una mezcla de disolventes y 00:15:48
ahora va a ascender por capilaridad, la fase móvil y va a arrastrar a nuestra muestra 00:15:56
y se van separando los componentes de nuestra muestra 00:16:02
vale pues ahora ya se sacaría la placa, antes de que llegue al final se saca la placa y se miden 00:16:20
los RF, aquí tendríamos pues estos en amarillo, bueno pues hasta aquí 00:16:36
bien pues esto es de cromatografía, aquí os he puesto algún otro vídeo que también son interesantes 00:16:50
para que veáis, en este explican un poco más en detalle en el laboratorio cómo se realiza la 00:16:59
cromatografía en capa fina, esto cuando tengáis tiempo pues le echéis un vistacillo y luego en 00:17:06
la página de biomodel de la que os he hablado alguna vez, vale bueno igual entramos y os explico 00:17:14
un poco porque hay un laboratorio virtual en el que se puede hacer una cromatografía en capa fina 00:17:24
a ver si voy a entrar 00:17:31
entonces veis la pantalla verdad 00:17:51
pues mirad aquí en esta página de biomodel hay este laboratorio y entonces tenéis aquí 00:17:54
el 1 y el 2 es una muestra en la que tenéis que saber qué aminoácidos tiene y entonces aquí 00:18:10
tenemos pues tenemos leucina, valina, glicina, arginina y triptófano entonces vamos pinchando 00:18:18
con la pipeta, vamos cogiendo una cantidad de muestra y pinchamos aquí, bueno hay veces que 00:18:25
esto cuesta un poco hacerlo, a ver hay que cogerle el truquillo 00:18:35
ahí veis ponemos una gota y ahora esta pipeta la tiramos, nos aparece otra, bueno esto sería 00:18:46
un capilar en realidad, ahora cogemos de la muestra 2 y pinchamos 00:18:54
bueno otra vez 00:19:01
no sé aquí es que hay que cogerle el truquillo 00:19:12
vaya pues ahora no quiere salir 00:19:21
bueno sería eso, ir pinchando 00:19:32
ahora esta la tiramos a la basura y cogemos por ejemplo la leucina, cogemos leucina y pinchamos 00:19:37
vale tiramos, bueno vamos a hacer solamente estas, estas serían las dos muestras y leucina 00:19:50
pero vosotros lo podéis hacer con las otras también, le hacemos la cromatografía sería 00:20:02
meter la placa y empieza a ascender la fase móvil, bueno aquí va muy rápido en la realidad 00:20:08
no va tan rápido y entonces ahora tenemos que visualizar las manchas, se añade esta 00:20:15
disolución que es en inibrina, creo que hay que ponerlo ahí, vale veis y entonces aquí 00:20:24
tendríamos la muestra A que tiene estos aminoácidos y la muestra B pues estos otros y nosotros 00:20:33
en la C hemos puesto leucina pues podemos confirmar que las muestras, tanto la muestra A como la muestra B 00:20:41
tienen leucina porque han aparecido a la misma altura, el RF será igual, luego pues compararíamos 00:20:48
si hubiéramos puesto valina, glicina, genina, triptófano pues compararíamos también si 00:20:56
nos aparecen y entonces podemos decir pues la muestra A tiene leucina, valina, genina 00:21:01
depende de las manchas que nos salgan aquí, entonces cuanto más polar sea nuestra muestra, nuestro aminoácido 00:21:08
se va a quedar más cerca, se va a quedar más abajo porque como es polar pues va a reaccionar con la fase estacionaria 00:21:19
que es polar también y cuanto menos polar va a quedar más arriba, veis por eso la leucina 00:21:28
es un aminoácido que no es polar y por eso queda más arriba en la placa de cromatografía. 00:21:37
En el caso de cromatografía en capa fina las separaciones por polaridad, vale acordaros que 00:21:45
teníamos las otras tres tipos de cromatografía que eran cromatografía por filtración de gel 00:21:52
que se separan las moléculas por masa molecular, cromatografía de intercambio iónico que se separan por su carga 00:21:58
y cromatografía de afinidad, bueno pues aquí tenéis este laboratorio por si os apetece hacer algún día. 00:22:05
Y ahora entonces nos vamos a meter ya con la electroforesis que es otra técnica de separación de proteínas 00:22:15
Además de separar las proteínas se utiliza también para identificar. 00:22:26
Aunque se trata de una técnica de separación no se utiliza solo para obtener una proteína pura 00:22:36
sino para identificar las diferentes proteínas presentes en una muestra. 00:22:41
Esta técnica es un poco más complicada parece a mí, pero bueno la intentaremos ver entre hoy y el próximo día 00:22:46
a ver si logramos terminarlo. 00:22:57
Entonces, ¿en qué consiste la electroforesis? Pues aquí tenéis esta frase, esta es la base de la electroforesis 00:23:01
Entonces, como las biomoléculas tienen carga eléctrica, al someterlas a estas biomoléculas a un campo eléctrico 00:23:10
pues podemos separarlas en función de la carga eléctrica que tengan vamos a separar estas biomoléculas. 00:23:20
Entonces, la mayoría de las biomoléculas poseen una carga eléctrica 00:23:28
como consecuencia se desplazan cuando se ven sometidas a un campo eléctrico 00:23:33
por lo tanto vamos a someter a nuestras muestras a un campo eléctrico 00:23:39
y estas muestras dependiendo de su carga se van a desplazar 00:23:44
si tienen carga positiva pues se van a dirigir hacia el ánodo 00:23:48
si tienen carga negativa se van a desplazar hacia el cátodo 00:23:54
este sería el campo eléctrico, en el campo eléctrico tenemos un ánodo y un cátodo 00:24:00
pues dependiendo de la carga de nuestras moléculas se van a desplazar hacia un lado o hacia el otro 00:24:06
esto no lo tenéis en los apuntes, pero bueno, esto os lo explico porque yo creo que puede ayudaros 00:24:13
Entonces, se van a desplazar por un lado eso, por la carga 00:24:18
y por otro lado, por ejemplo en este caso, pues a mayor carga se van a quedar más retenidos 00:24:23
Entonces, esto sería si las partículas, unas tienen carga positiva y otras tienen carga negativa 00:24:34
Entonces, aquí os he puesto este dibujo porque esta sería la base de la electroforesis 00:24:47
sería aplicar un campo eléctrico, es decir una carga negativa y una carga positiva 00:24:54
nuestras muestras están en una disolución tampón, en unas cubetas 00:25:00
y las muestras se tienen que aplicar en un soporte 00:25:07
este sería el soporte, un sólido, que ahora veremos cómo es este soporte 00:25:13
y aquí aplicaríamos nuestra muestra 00:25:19
Entonces, acordaros de eso, es aplicar un campo eléctrico y separar las muestras según su carga 00:25:21
Entonces, hay varios tipos de electroforesis 00:25:31
esto tampoco lo tenéis, pero bueno, esto simplemente porque lo sepáis 00:25:35
Tenemos medios de baja, depende de cómo sea el soporte donde coloquemos la muestra 00:25:39
tenemos medios de baja fricción y medios de elevada fricción 00:25:45
En los medios de baja fricción, pues la muestra se aplica aquí en el medio 00:25:51
el soporte que tenemos es papel o acetato de celulosa 00:25:58
Estas serían dos cubetas en las que tenemos dos disoluciones tampón 00:26:05
y aplicaríamos el campo eléctrico 00:26:10
Por lo tanto, en este caso la separación simplemente es por carga 00:26:14
Las cargas negativas se van a dirigir hacia el polo positivo 00:26:18
Las cargas positivas se van a dirigir hacia el polo negativo 00:26:22
Estos son medios de baja fricción, en papel o en acetato de celulosa 00:26:27
Y luego tenemos medios de elevada fricción, que estos son los que vamos a estudiar más 00:26:33
Medios de elevada fricción, ¿en qué consisten? 00:26:40
Pues que el soporte, que aquí teníamos o papel o acetato de celulosa 00:26:42
pues en este caso lo que vamos a tener es un polímero 00:26:47
un polímero que va a formar una red tridimensional 00:26:51
Vamos a aplicar nuestra muestra por aquí por arriba, esta sería nuestra muestra 00:26:56
y entonces la muestra se va a ir separando según su tamaño 00:27:02
porque como aquí en este polímero vamos a tener huecos, vamos a tener orificios 00:27:08
y entonces las moléculas de menor peso molecular van a pasar, van a salir antes 00:27:13
y las de mayor peso molecular se van a quedar ahí retenidas 00:27:20
Las tasas amarillas, que son mayores, se quedan retenidas arriba 00:27:24
Entonces, tenemos dos tipos en estos medios de elevada fricción 00:27:30
Tenemos gel de agarosa y gel de poliacrilamida 00:27:38
Este es el que vamos a estudiar para proteínas, con el que se trabaja sobre todo para proteínas 00:27:42
El gel de poliacrilamida 00:27:49
Ahora no os preocupéis si no entendéis bien esto porque luego al final lo vais a entender 00:27:52
Entonces, el soporte donde se coloca nuestra muestra es un gel 00:27:59
Es el gel de poliacrilamida, en el que vamos a separar proteínas 00:28:05
Bueno, aquí os he puesto que también hay modos de soporte que pueden ser en horizontal o en vertical 00:28:12
En nuestro caso, con el gel de poliacrilamida sería este, en vertical 00:28:20
Entonces, vamos a estudiar ya la electroforesis en gel de poliacrilamida 00:28:26
Que también se llama SIPAGE, por las siglas en inglés 00:28:35
Poliacrilamide Gel Electroforesis 00:28:39
Bueno, como se dice en inglés 00:28:43
Entonces, lo que vamos a hacer es separar las proteínas según su masa molecular 00:28:45
Esto es importante, lo que os he dicho ya 00:28:54
Vamos a hacer pasar a nuestras proteínas, que van a entrar aquí 00:28:57
Por aquí entran nuestras proteínas 00:29:01
Esto de aquí va a ser el gel 00:29:03
Y nuestras proteínas entran por aquí 00:29:07
Aplicamos una carga y se van a ir separando las proteínas según su masa molecular 00:29:09
Las de mayor masa molecular van a quedar más arriba 00:29:15
Y las de menor masa molecular más abajo 00:29:19
Entonces, ¿cómo preparamos estos gels de poliacrilamida? 00:29:25
Estos gels son unos gels porosos, o sea, tienen poros, tienen huecos 00:29:31
Y esa porosidad de esos poros se puede regular 00:29:37
Es el tamaño de poros y la cantidad 00:29:42
Y ese gel lo vamos a preparar a partir de acrilamida 00:29:46
Para la práctica de electroforesis en gel de poliacrilamida vamos a necesitar eso 00:30:08
El soporte, que es el gel de poliacrilamida, por donde van a pasar nuestras muestras 00:30:13
Vamos a necesitar una disolución tampón 00:30:19
La disolución tampón es la que permite la conducción eléctrica 00:30:22
Porque ya hemos dicho que vamos a aplicar un campo eléctrico 00:30:26
Necesitamos nuestra muestra, que va a ser una mezcla de proteínas 00:30:30
Y el campo eléctrico 00:30:34
Entonces, vamos a ver las etapas para realizar esta electroforesis 00:30:38
Entonces, las etapas para realizar esta electroforesis serían 00:30:49
Primero, tenemos que preparar el soporte, que es el gel de poliacrilamida 00:30:53
En segundo lugar, tenemos que preparar nuestra muestra de proteínas 00:30:58
En tercer lugar, vamos a introducir esta muestra de proteínas en el gel de poliacrilamida 00:31:04
En cuarto lugar, le aplicamos el campo eléctrico 00:31:11
Y en quinto lugar, vamos a tener que teñir ese gel para ver cómo han corrido nuestras proteínas 00:31:15
Cuáles han salido antes y cuáles después 00:31:24
Bueno, pues vamos a ver todos estos pasos 00:31:27
El primero sería la preparación del gel de poliacrilamida 00:31:30
Vamos a ver cómo preparamos este gel de poliacrilamida 00:31:35
Hemos dicho que los gels de poliacrilamida actúan como tamices moleculares 00:31:39
Lo que van a hacer es retardar el movimiento de las moléculas más grandes 00:31:46
Como van a tener ahí unos poros, pues a las moléculas más grandes les va a costar más pasar 00:31:50
Y en cambio, las más pequeñas van a pasar a través del gel con más facilidad 00:31:56
Entonces, para preparar estos gels de poliacrilamida, si os fijáis 00:32:05
Es una poli, o sea, muchas, muchas acrilamidas 00:32:10
Entonces, lo que necesitamos es 00:32:16
Para preparar este soporte necesitamos 00:32:18
El monómero, que va a ser la acrilamida, que es este compuesto de aquí 00:32:22
Esto se llama monómero, que es la acrilamida 00:32:26
Pues lo que necesitamos es preparar la poli, o sea, muchas acrilamidas 00:32:30
Lo que vamos a hacer es unir muchos monómeros, muchas acrilamidas 00:32:35
Una con otra, una con otra 00:32:40
Y al final se nos van a formar cadenas 00:32:42
Esto en azul sería una cadena de poliacrilamida 00:32:45
Esto de aquí en azul también sería otra cadena de poliacrilamida 00:32:49
Formamos un polímero 00:32:54
Vamos a unir muchos monómeros de estos 00:32:56
Y se nos van a formar cadenas, o sea, uniones de acrilamidas 00:32:59
Una con otra, una con otra, y se nos forma una cadena, otra cadena 00:33:05
Y así se nos van a formar muchas cadenas de acrilamida 00:33:09
¿Y cómo formamos esta poliacrilamida? 00:33:13
Pues lo que vamos a hacer es añadir un compuesto que es el persulfato amónico 00:33:17
Que va a ser el que inicie esta reacción de polimerización 00:33:24
¿Y cómo va a iniciar el persulfato esta reacción? 00:33:30
Pues lo que va a hacer va a ser romper este doble enlace 00:33:34
Rompe este doble enlace, se nos generan aquí dos radicales 00:33:38
Y así se van a poder unir una acrilamida con otra 00:33:43
Aquí tendremos otra acrilamida que se habrá también generado radicales en su doble enlace 00:33:48
Y se van uniendo unas con otras, unas con otras, unas con otras 00:33:53
Hasta que se nos genera este polímero muchas acrilamidas 00:33:57
Pero para que se dé en buenas condiciones esta reacción 00:34:02
Necesitamos otro compuesto que es el TEMED 00:34:09
Que este compuesto es el catalizador 00:34:13
El catalizador va a ser el que acelere esta reacción de polimerización 00:34:17
Porque si no es una reacción muy lenta 00:34:22
Pues tenemos que añadir, por un lado, persulfato amónico 00:34:24
Para que comience la reacción, para que este doble enlace se rompa 00:34:28
Y luego tenemos que añadir un catalizador que es el TEMED 00:34:32
Que lo que va a hacer va a ser acelerar la velocidad de polimerización 00:34:36
Que se unan más rápidamente estas acrilamidas para formar la poliacrilamida 00:34:40
Pero además necesitamos otro compuesto adicional 00:34:46
Y ese compuesto adicional es la bisacrilamida 00:34:51
¿Y qué va a hacer esta bisacrilamida? 00:34:55
Pues lo que va a hacer es, si os fijáis aquí que lo tenemos en rosa, la bisacrilamida 00:34:59
La bisacrilamida va a unir unas cadenas con otras 00:35:05
¿Veis? Aquí está uniendo esta cadena de aquí, azul, con esta otra cadena de aquí 00:35:09
Entonces va uniendo una cadena con otra 00:35:14
Y se va a formar una poliacrilamida que se llama entrecruzada 00:35:18
Es un polímero entrecruzado 00:35:23
Porque se van uniendo unas cadenas con otras 00:35:27
Y entonces lo que se nos van a generar van a ser poros, se nos van a generar huecos 00:35:31
Si os fijáis aquí, tenemos aquí una cadena de poliacrilamida 00:35:37
Aquí otra cadena de poliacrilamida y aquí otra cadena de poliacrilamida 00:35:43
En este caso la bisacrilamida está aquí en color azul 00:35:48
Pues la bisacrilamida une esta cadena con esta otra 00:35:52
Y une esta cadena con esta otra 00:35:56
Y acaba formando, acaba generando aquí un poro 00:36:00
Entonces el gel al final va a tener poros, va a tener huecos 00:36:05
Que dependiendo del tamaño del hueco van a pasar unas moléculas más grandes o menos 00:36:10
Vale, entonces bueno 00:36:18
Como resumen 00:36:22
Bueno, como resumen no, aquí lo que tenemos que tener en cuenta 00:36:26
Es que la acrilamida es un compuesto que es cancerígeno 00:36:31
Vale, entonces si se trabaja un día con la acrilamida 00:36:37
Pues bueno, no pasa nada por trabajar un día en el laboratorio 00:36:43
Pero cuando ya la exposición es continua 00:36:46
Pues el compuesto es cancerígeno 00:36:49
Puede producir cáncer de piel, es teratógeno y es neurotóxico 00:36:53
Por lo tanto siempre hay que manejarlo con guantes, en campana, con mascarilla si se puede 00:36:58
Y lo único que sí que cuando ya se polimeriza 00:37:07
Ya es inocua, la poliacrilamida ya es inocua 00:37:12
Lo único que puede que igual quede alguna acrilamida por ahí que no se haya polimerizado 00:37:16
Y entonces bueno, pues hay que tener, hay que seguir teniendo alguna precaución 00:37:21
No tantas, pero sí que hay que tener alguna precaución 00:37:26
Pero en principio la poliacrilamida es inocua 00:37:29
El gel ya no es tóxico, no es cancerígeno 00:37:33
Vale, entonces aquí lo único que he supuesto es que en algunos cosméticos 00:37:38
Como geles fijadores de pelo pues llevan acrílicos de este tipo 00:37:43
Bien, pues una cosa importante es que 00:37:50
En función de la cantidad de acrilamida que pongamos 00:37:55
Y de la cantidad de bisacrilamida que pongamos 00:37:58
Se van a quedar las cadenas más o menos entrecruzadas 00:38:02
Vale, entonces en función de la concentración de acrilamida se obtienen entramados más o menos densos 00:38:08
Mientras que la cantidad de bisacrilamida condiciona el grado de entrecruzamiento de las cadenas 00:38:15
Ambos componentes determinan las características del gel, es decir, su resistencia mecánica 00:38:22
Su fragilidad, su elasticidad, el grado de reticulación, el tamaño de poro 00:38:28
Entonces, el tamaño de poro viene determinado por la concentración total de monómeros 00:38:35
Entonces, el gel se define por, el reticulado es el tanto por ciento, T se llama 00:38:43
Que es la concentración total de monómeros de acrilamida y bisacrilamida en relación peso-volumen 00:38:50
Y la dureza, que viene dada por la relación de la cantidad de bisacrilamida al total de monómeros 00:38:56
Vale, entonces dependiendo de eso, de las cantidades de acrilamida y bisacrilamida 00:39:03
Pues vamos a poder obtener un buen resultado o no 00:39:08
En este caso fijaros que tenemos un 3% de acrilamida 00:39:14
Pues fijaros, bueno, así van a aparecer los resultados, van a aparecernos así como rayas 00:39:19
Vale, entonces, en el caso del 3% de acrilamida, pues aquí no se ha separado 00:39:27
Nuestra muestra se ha separado un poco, pero aquí no vamos a poder ver nada 00:39:32
Si ponemos un 6% de acrilamida, pues ya empieza a separarse un poquito más 00:39:36
Pero estas muestras de aquí no se han separado bien 00:39:41
Aquí en el 9% pues ya se ha separado mejor y en el 12% pues también se va 00:39:44
Ya se ve que las proteínas se han separado, ya podemos ver todas las proteínas separadas 00:39:50
En este caso no vemos nada y en este caso se nos quedan ahí algunas proteínas que no se han separado 00:39:58
Por eso es importante elegir la proporción de acrilamida y de bisacrilamida en el gel 00:40:04
Vale, bueno, pues aquí os he puesto lo que es el TEMED y el Persulfato 00:40:15
Generan los radicales para iniciar la sesión que prosigue en cadena hasta formar el hidrogel 00:40:19
El Persulfato actúa como iniciador, esto ya es lo que os he dicho antes 00:40:27
Y el TEMED actúa como catalizador y lo único que tiene que estar a pH básico 00:40:31
Y dependiendo también de la concentración de ambos, así será la velocidad de polimerización 00:40:39
Como el TEMED es el catalizador, dependiendo de la concentración, así será la velocidad de polimerización 00:40:47
Bien, pues seguimos con el gel de poliacrilamida 00:41:01
Todavía no nos hemos metido con la muestra, todavía seguimos con el gel 00:41:05
Entonces, hay dos tipos de gels con los que se puede trabajar 00:41:09
Se puede trabajar un gel que sea sencillo, que sea un gel único 00:41:17
O en el caso de la electroforesis, el gel de poliacrilamida, se suele trabajar con gels que tienen dos partes 00:41:35
Estos gels están divididos, por un lado, en un gel que se llama o gel de carga o gel concentrador o acumulador o de compactación 00:41:45
Yo lo he visto de todas estas formas 00:41:59
Y un gel de resolución o lo he visto también como separador 00:42:02
En el caso del documento que tenéis en el aula virtual, lo llaman gel de carga y gel de resolución 00:42:08
Pero lo podéis ver así también, o separador, o en este caso concentrador o acumulador o de compactación 00:42:17
Entonces, imaginaros eso, que el gel lo vamos a dividir en dos 00:42:26
El gel concentrador, mirad aquí lo tenéis, veis aquí lo tenéis como gel acumulador 00:42:32
Que sería este de aquí en beige clarito o en amarillo 00:42:38
El gel este, el gel de carga o gel concentrador 00:42:41
Pues lo que va a hacer es que todas nuestras proteínas, nosotros vamos a meter las proteínas por aquí, por unos pocillos que vamos a hacer 00:42:48
Entonces lo que va a hacer el gel concentrador es que todas las proteínas empiecen a separarse a la misma vez 00:42:57
Entonces las proteínas, nosotros vamos a introducir por aquí nuestras proteínas 00:43:06
Y el gel concentrador lo que va a hacer es que todas las proteínas comiencen aquí a separarse 00:43:10
Y las proteínas van a pasar, atraviesan el gel concentrador 00:43:17
Y a partir de aquí ya empiezan a separarse las proteínas según su masa molecular 00:43:21
Se van a separar en el gel separador 00:43:27
Entonces, para preparar estos dos geles lo que hacemos es poner diferentes cantidades de acrilamida y de bisacrilamida 00:43:32
Por ejemplo, el gel separador va a tener mayor cantidad de acrilamida, va a tener mayor BH y el tamaño de poro es menor 00:43:40
Entonces nosotros vamos a introducir por aquí nuestras proteínas en esto que se llama unos pocillos 00:43:50
Vamos a introducir nuestras proteínas, vamos a aplicar el campo eléctrico 00:43:57
Y esas proteínas se van a ir separando según su masa molecular 00:44:03
Yo sé que esto es un poquito complicado de entender, pero yo creo que poco a poco lo vais a ir viendo 00:44:11
Entonces aquí tendríamos la muestra y aquí es cuando empiezan a separarse 00:44:20
Empieza a separarse nuestra muestra en el gel de resolución o concentrador 00:44:27
Entonces tenemos el gel de carga, evita que las proteínas se dispersen en el gel 00:44:32
Y provoca que todas las proteínas de la muestra se alineen en una fina banda que entra al mismo tiempo y a la misma velocidad en el gel separador 00:44:37
Y se encuentra a BH 6,8 00:44:50
Esto es para que todas comiencen a separarse a la vez 00:44:53
Y luego el gel de resolución, aquí es donde tiene lugar la separación de las proteínas 00:45:01
El porcentaje de acrilamida aquí es mayor, por tanto el tamaño de poro es menor 00:45:06
Haciendo que las proteínas de mayor masa molecular se muevan más lentamente 00:45:11
Este gel realiza la separación a un pH de 8,8 00:45:16
Entonces, importante para cuando se trabaja en el laboratorio 00:45:20
Cuando se preparan estos gels, lo que se hace es 00:45:30
Se disuelve la acrilamida con la bisacrilamida 00:45:34
Y seguidamente se añade el témet y el persulfato 00:45:38
Una vez que añadimos el témet y el persulfato ya tenemos que preparar el gel 00:45:43
Porque ya va a empezar a polimerizar la poliacrilamida 00:45:50
Por una parte hay que tener en cuenta que hay que evitar la presencia de oxígeno 00:45:55
Porque el oxígeno inhibe la polimerización 00:46:01
Inhibe que se forme la poliacrilamida 00:46:06
Por lo tanto la mezcla de polimerización debe desgasificarse a vacío 00:46:11
Que además esto impide la formación de burbujas 00:46:15
Que estas burbujas alteran el campo eléctrico 00:46:19
Y por otro lado en el laboratorio también necesitamos una temperatura óptima de polimerización 00:46:22
Que es de 25 a 30 grados 00:46:27
Y a esta temperatura el proceso ocurre en pocos minutos 00:46:29
Aunque conviene dejarlo transcurrir más tiempo 00:46:33
Por otro lado en el laboratorio, esto ya lo hemos comentado antes 00:46:40
Los monómeros son neurotóxicos 00:46:44
Por lo que deben manejarse en campana extractora, con guantes y mascarillas 00:46:46
Bien, esto está repetido, no me había dado cuenta 00:46:51
Dice aquí luego la toxicidad se reduce al mínimo una vez que ya sea polimerizado 00:46:55
Pero bueno, es mejor continuar trabajando con guantes 00:47:01
Mirad, aquí podéis ver 00:47:06
Bueno, no sé si se ve bien, luego lo enseño mejor 00:47:08
Bien, pues entonces esto sería lo que es la preparación del gel 00:47:12
Es decir, necesitamos acrilamida 00:47:17
Vamos a polimerizar esta acrilamida 00:47:21
Para polimerizar esta poliacrilamida lo que necesitamos es el persulfato 00:47:25
El persulfato que es el iniciador y el TEMED que es el catalizador 00:47:33
Vamos a generar una poliacrilamida, es decir, muchas cadenas de acrilamida 00:47:38
Y estas cadenas de poliacrilamida las tenemos que unir unas a otras 00:47:44
¿Cómo las unimos? Pues con bisacrilamida 00:47:50
Se nos van a generar unos huecos, unos poros 00:47:53
Por los que luego van a pasar nuestras moléculas 00:47:57
Entonces, vamos a preparar un gel en dos partes 00:48:02
Un gel, la parte de arriba va a ser el gel concentrador 00:48:07
Que nos sirve para que todas las proteínas comiencen a separarse a la vez, al mismo tiempo 00:48:12
Y el gel separador, que aquí es donde se separan nuestras proteínas en función de su masa molecular 00:48:18
Bien, pues ahora vamos a ver, ya tenemos el gel hecho 00:48:29
Vamos a ver cómo preparamos nuestra muestra 00:48:32
Nuestra muestra que la vamos a adicionar por aquí en estos huecos que se llaman pocillos 00:48:35
Bueno, pues nuestra muestra, hay dos formas de hacer el análisis 00:48:45
La muestra se puede introducir en condiciones nativas 00:48:51
Esto es en inglés 00:48:57
O sea, sin desnaturalizar, en condiciones nativas 00:48:59
O sea, las proteínas mantienen su estructura tridimensional 00:49:04
Y lo que se suele hacer en la electroforesis de gel de poliacrilamida 00:49:09
Se suele trabajar en condiciones desnaturalizantes 00:49:17
¿Cómo hacemos que nuestra proteína se desnaturalice? 00:49:22
¿Os acordáis que desnaturalizar era que se rompían los enlaces? 00:49:27
Pues los puentes de hidrógeno, los enlaces por fuerzas electrostáticas 00:49:33
Los enlaces de isufuro, esos enlaces se rompían 00:49:40
Y entonces la proteína pierde sus estructuras, su estructura terciaria, su estructura secundaria 00:49:44
La proteína se queda con solo su estructura primaria, es decir, la unión de aminoácidos 00:49:50
¿Cómo hacemos que desnaturalice esta proteína? 00:49:55
Lo que hacemos es añadir un compuesto que se llama SDS, que es el dodefil sulfonato de sodio 00:49:59
Este compuesto es un detergente y lo que va a hacer es eso, es desnaturalizar nuestra proteína 00:50:08
Es decir, va a romper estos enlaces que mantenían la estructura terciaria 00:50:16
Rompe estos enlaces y nuestra proteína se nos queda con solo la estructura primaria 00:50:21
Pero además de eso, ¿qué hace el SDS? 00:50:28
El dodefil sulfonato de sodio 00:50:32
Pues lo que va a hacer va a ser aportar carga negativa a toda la cadena de proteínas 00:50:35
Entonces, la proteína tenga la carga que tenga, si añadimos el SDS se va a quedar cargada negativamente 00:50:44
Todas las cadenas de proteínas negativamente 00:50:54
¿Y qué es lo que vamos a conseguir con esto? 00:50:58
Pues lo que vamos a conseguir es que cuando pongamos a nuestras proteínas en el campo eléctrico 00:51:02
Cuando apliquemos el campo eléctrico, como todas las proteínas van a tener carga negativa 00:51:10
Pues todas las proteínas se van a dirigir hacia el polo positivo 00:51:16
Todas se van a mover hacia el polo positivo, pero se van a separar solamente según su masa molecular 00:51:21
Porque todas tienen la misma carga, todas tienen carga negativa 00:51:31
Pero se van a separar según su masa molecular 00:51:35
Bueno, aquí está puesto lo mismo 00:51:40
Como resultado la proteína adquiere una carga global negativa y directamente proporcional a su tamaño 00:51:42
De modo que la cantidad de SDS que interacciona con la proteína es constante 00:51:49
Esto nos garantiza una separación proporcional a la masa molecular de la proteína 00:51:54
Como esta se encuentra desnaturalizada, la interacción con el polímero de acrilamida será mayor cuanto mayor sea la masa molecular 00:52:02
El resultado global es que la velocidad de desplazamiento de la proteína en el campo eléctrico es inversamente proporcional a la masa molecular 00:52:12
Entonces tenemos aquí nuestra mezcla de proteínas 00:52:22
Y esto serían las cadenas de polímero que está entrecruzado y que tiene poros, que tiene huecos 00:52:27
Si aplicamos el campo eléctrico, pues todas las proteínas se van a dirigir hacia el polo positivo 00:52:33
Que estará el polo positivo aquí abajo 00:52:39
Y se van a separar según su masa molecular 00:52:42
Estas amarillas que son más grandes se quedan retenidas 00:52:45
Y estas lilas moradas, pues como son más pequeñas, van a ir atravesando los poros 00:52:49
Van atravesando los poros hasta que, hasta el final, van a aparecer al final, abajo, más abajo 00:52:54
Bueno, pues como resumen, la SDS-PAGE, la estroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, donde se dice sulfonato de sodio 00:53:04
Es muy utilizada porque la gran mayoría de las proteínas son solubles en el SDS 00:53:15
Porque todos los complejos SDS-proteína tienen carga negativa y migran, por tanto, en el mismo sentido 00:53:22
Porque su densidad de carga es muy elevada, por lo que su velocidad de migración también lo es 00:53:29
Y las estroforesis son muy rápidas 00:53:36
Porque la separación depende sólo de un parámetro físico-químico como es sólo la masa molecular 00:53:38
Y esto se puede calcular 00:53:44
Y porque los complejos SDS-proteína se tiñen fácilmente 00:53:46
Vamos a ver luego qué es esto de tiñir 00:53:51
Bueno, aquí os he puesto un poco cómo se colocan las... 00:53:57
El gel se coloca entre dos placas de vidrio 00:54:03
Y una vez que tenemos el gel entre esas dos placas de vidrio 00:54:08
Lo que se hace es generar aquí arriba unos huecos, unos pocillos 00:54:13
Con un aparato que se llama un peine 00:54:18
Antes de que polimerice por completo, se hacen aquí como unos agujerillos, unos pocillos 00:54:23
Y por estos pocillos es por donde vamos a introducir nuestra muestra 00:54:30
Vale, esto yo creo que lo mejor será ver un vídeo 00:54:37
Que yo creo que ya lo... Bueno, ahora os digo cuál es el vídeo por si queréis verlo en casa 00:54:42
Pero si no, el próximo día lo vemos 00:54:47
Para que veáis un poco cómo es la práctica 00:54:49
Para que os hagáis una idea cómo es el gel 00:54:51
Cómo se introducen las muestras 00:54:53
Porque si no así, en teoría, es un poco complicado que lo entendáis 00:54:56
Bueno, aquí estaría la explicación de cuando aplicamos el campo eléctrico 00:55:02
Cómo las proteínas, como tienen carga negativa, se van a dirigir al cátodo 00:55:08
Y cómo se van separando aquí las proteínas 00:55:13
Las proteínas se van añadiendo aquí en esta serie de pocillos 00:55:17
Y una vez que hemos aplicado el campo eléctrico 00:55:21
Lo tenemos ahí durante... Pues depende del tipo que sea 00:55:26
Pero media hora, una hora 00:55:30
Se separan los dos cristales en los que tenemos el gel 00:55:32
Y ese gel lo tenemos que teñir 00:55:35
Porque no vamos a ver nada 00:55:37
No vamos a ver nuestras proteínas 00:55:40
Las tenemos que teñir 00:55:43
Y se utiliza este compuesto, el azul de comasi 00:55:45
Que tiñe el gel 00:55:48
Tiñe todo el gel, tiñe a nuestras proteínas 00:55:50
Bien, pues este sería el... 00:55:54
Cómo nos quedaría el gel 00:55:58
Veis que nos aparecen así estas rayitas 00:56:00
En color azul 00:56:03
Y lo que tenemos que, en uno de estos pocillos de los que os he hablado antes 00:56:05
Además de en cada uno poner nuestras proteínas 00:56:10
Las que queremos determinar 00:56:14
En uno de ellos vamos a poner una mezcla de proteínas 00:56:16
Que nos va a servir de referencia 00:56:22
De esta mezcla de proteínas ya sabemos 00:56:25
Que RF tenemos 00:56:28
Que distancia recorren cada una de nuestras proteínas de esta mezcla 00:56:30
Y entonces lo que vamos a hacer va a ser 00:56:35
Representar 00:56:37
Vamos a representar 00:56:41
Estos serían los puntos azules 00:56:44
Serían nuestras proteínas, patrón 00:56:46
Las que conocemos 00:56:48
Su masa molecular 00:56:50
Y conocemos la distancia que recorren 00:56:52
Conocemos su RF 00:56:54
Pues representamos todas esas proteínas que conocemos 00:56:56
De nuestra muestra de referencia 00:57:01
Hacemos la representación 00:57:03
Bueno, se representa el logaritmo de la masa molecular 00:57:05
Frente al RF 00:57:07
Y a partir de la ecuación de la recta 00:57:10
Lo que vamos a poder determinar es 00:57:13
Nuestra muestra desconocida 00:57:15
Nuestra muestra desconocida 00:57:18
Hacemos la electroforesis 00:57:20
Medimos el RF 00:57:22
El RF es la distancia que recorre nuestra muestra 00:57:24
A partir de la distancia que recorre el disolvente 00:57:28
Pues vamos a medir el RF de nuestra muestra desconocida 00:57:31
Lo metemos en la ecuación de la recta 00:57:34
Y podemos sacar la masa molecular de nuestra muestra 00:57:37
Vale, pues entonces, como son ya las 7 menos 25 00:57:42
Yo creo que el próximo día os voy a poner el vídeo 00:57:46
Para que veáis un poco como se trabaja en el laboratorio 00:57:51
Y luego ya os vuelvo a repetir un resumen de esta presentación 00:57:54
Porque lo que os digo, yo creo que así es un poco complicado 00:57:59
Ver la teoría 00:58:03
Y yo creo que os va a ser más útil ver el vídeo 00:58:05
Vale, pues voy a parar la grabación 00:58:10
Autor/es:
Susana
Subido por:
Susana A.
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Todos los derechos reservados
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34
Fecha:
7 de diciembre de 2023 - 17:38
Visibilidad:
Clave
Centro:
IES VIRGEN DE LA PALOMA
Duración:
58′ 13″
Relación de aspecto:
1.78:1
Resolución:
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Tamaño:
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