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Videoconferencia martes 12 de marzo - Contenido educativo

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Subido el 20 de marzo de 2024 por Susana A.

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Vale, pues hoy vamos a empezar el siguiente tema. No sé si tenéis alguna duda del tema 00:00:06
3, del tema anterior, de los ejercicios o alguna duda de la teoría. Vale, pues no hay 00:00:38
dudas. Bueno, pues entonces vamos a empezar el tema este, el 4, del tema 3. Bueno, el 00:00:52
otro día os expliqué la práctica que teníais que hacer en casa, ¿vale? O sea, quedaría 00:01:09
eso y ya estaría. Bueno, pues el tema 4 es la clonación de ácidos nucleicos. Vamos 00:01:17
a ver qué es esto de la clonación. Bueno, pues mirad, hasta 1970, claro, la molécula 00:01:31
de ADN ya vimos que es una macromolécula 00:01:53
que está formada por millones de bases nitrogenadas 00:01:57
entonces con su gran longitud y además 00:02:01
es un poco monótona porque es 00:02:04
adenina, timina, timina, adenina, guanina, citosina 00:02:08
entonces era una molécula que era difícil de 00:02:12
analizar hasta 1970. Sin embargo 00:02:17
Luego a partir de 1970 se descubren las enzimas de restricción, son unas enzimas que van a servir para cortar el ADN y a partir de ese momento pues el ADN se puede estudiar y es una molécula fácil para estudiar. 00:02:21
Con el, actualmente podemos pues separar, cortar regiones de ADN, podemos obtener un fragmento de ADN que hayamos cortado pues obtenerlo en grandes cantidades, podemos saber que nucleótidos, que secuencia de nucleótidos tiene ese ADN o también se puede incluso intercalar, 00:02:41
Nosotros cortamos un fragmento de ADN y podemos ahí intercalar un fragmento de ADN de otro organismo. 00:03:06
A todo este conjunto de técnicas que se pueden utilizar para analizar el ADN se conoce como ingeniería genética. 00:03:16
La ingeniería genética es la tecnología de la manipulación genética de organismos con un propósito determinado. 00:03:29
Bueno, pues aquí tenéis el mapa conceptual. Estos mapas conceptuales ya os digo que están muy bien. 00:03:38
Y esto es lo que vamos a estudiar en este tema. 00:03:51
Vamos a analizar los ácidos nucleicos, vamos a analizar el ADN y el ARN. 00:03:57
Entonces, el ADN vamos a utilizar técnicas de corte, corte del ADN. 00:04:04
Luego lo vamos a poder unir, vamos a poder secuenciar por el método de Sanger o por métodos automáticos. 00:04:12
Secuenciar significa saber el orden de las bases nitrogenadas. 00:04:21
Vamos a ver otra técnica que es la clonación, clonación que es la técnica del ADN recombinante. 00:04:26
Y lo que vamos a hacer aquí va a ser copiar un fragmento de ADN y copiarlo millones de veces. 00:04:32
Y ese fragmento de ADN se copia mediante la introducción en una bacteria y además luego vamos a obtener grandes cantidades de proteínas. 00:04:44
Bueno, esto ya lo veremos. 00:04:58
Podemos también identificar microorganismos, luego veremos la técnica de la PCR, de la reacción en cadena de la polimerasa, que seguro que esta os suena, la PCR, de la PCR, bueno, pues que hay varios tipos, la PCR consiste en aumentar, amplificar un fragmento de ADN y copiarlo millones de veces y todo esto a partir de una mínima cantidad de muestra. 00:05:02
También vamos a ver la hibridación, que hay varios tipos, Nordens, Southern y la técnica in situ, esto también lo vamos a ver. 00:05:30
Y todas estas que están con una sombra de color fucsia rusa, pues estas son aplicables a ARN. 00:05:43
Bueno, pues hoy vamos a ver lo que es el corte de ADN, cómo se corta el ADN y cómo se une este ADN. 00:05:52
Vale, pues ya vimos, bueno, este es el mismo mapa, pero más resumido. 00:06:07
Y bueno, este es otro mapa conceptual, pero bueno, he puesto de otra forma, pero es lo mismo, corte, unión, secuenciación, hibridación, PCR, clonación, lo único que aquí he añadido otra técnica que se llama la técnica CRISPR, que no sé si os suena a la que últimamente se ha hablado, de la técnica CRISPR. 00:06:17
Que está, aunque solamente la mencionan un poquito en los apuntes, pero también vamos a hablar sobre la técnica CRISPR, que está muy de actualidad. 00:06:41
Bueno, pues como os decía antes, hasta los años 70 no se podía prácticamente analizar el ADN porque, claro, por lo que hemos dicho, es una molécula tan grande que era imposible estudiarla. 00:06:54
Y ya con el descubrimiento de las enzimas de restricción que descubrió este científico Paul Berg y a partir de ese momento empieza el análisis del ADN. 00:07:10
Posteriormente estos científicos Cohen, Chan y Boyer crearon un plásmido a partir de secciones de ADN viral y bacteriano que tenía resistencia a antibióticos y lo insertaron en una bacteria. 00:07:28
Y bueno, esta es la tecnología del ADN recombinante. Ahora no os preocupéis si no entendéis esto porque luego lo veremos en los próximos días lo que es la técnica esta del ADN recombinante. 00:07:40
Vale, pues entonces vamos a ver el corte y unión de moléculas de ADN. 00:07:53
Sabemos que los ácidos nucleicos, ya dijimos, están formados por nucleótidos y esos nucleótidos a su vez están formados por un grupo fosfato, 00:08:02
el azúcar, que es la pentosa, y una base nitrogenada. Y que estos nucleótidos están unidos unos a otros mediante enlaces fosfodiéster. Esto es un enlace fosfodiéster, esto es un enlace fosfodiéster. 00:08:13
y por otra parte sabíamos también que la estructura del ADN, la estructura secundaria 00:08:32
era una estructura de doble hélice, una doble hélice, esta sería una cadena, una de las cadenas de ADN 00:08:40
y esta sería la otra cadena de ADN y que en el centro están las bases nitrogenadas 00:08:50
que están formando, están unidas por puentes de hidrógeno. 00:08:57
Si os acordáis, teníamos como bases nitrogenadas adenina, timina, citosina y guanina. 00:09:03
La guanina y la citosina están unidas por tres puentes de hidrógeno 00:09:10
y la adenina y la timina están unidas por dos puentes de hidrógeno. 00:09:15
Entonces, esto que hay aquí en colores son las bases nitrogenadas. 00:09:22
que están en el centro de la doble hélice y están unidas por puentes de hidrógeno. 00:09:27
Bueno, pues si recordáis, para desnaturalizar el ADN, lo que hacíamos era romper estos puentes de hidrógeno. 00:09:35
Pero ahora lo que queremos es fragmentar el ADN, o sea, fragmentar esas cadenas. 00:09:45
Por lo tanto, para fragmentar las cadenas de ADN, lo que tenemos que hacer es romper estos enlaces fosfodiéster, que estos enlaces fosfodiéster ya son enlaces covalentes y van a necesitar más energía para romper estos enlaces de aquí, fosfodiéster. 00:09:52
Vale, pues, bueno, pues esto es lo que os comentaba, este es el enlace fósforo y éster, o sea, tenemos el fósforo y luego tenemos dos grupos éster, el oxígeno unido a dos átomos y aquí tenemos la pentosa y por aquí las bases nitrogenadas. 00:10:14
Acordaros que en el ARN tenemos uracilo en vez de timina 00:10:39
Bueno, pues, ¿cómo hacemos para romper el ADN? 00:10:45
Claro, el ADN son cadenas de nucleótidos 00:10:56
Pero ¿cómo hacemos para que se nos rompa por aquí? 00:11:02
O que se nos rompa por aquí el ADN y también por aquí 00:11:06
y que no se nos rompa por otra parte, por otra zona de la cadena. 00:11:10
La cadena es tan larga y los enlaces son iguales, son enlaces fosfodiéster 00:11:15
y las bases nitrogenadas también son las mismas. 00:11:21
Entonces, ¿cómo hacemos para que el enlace se nos rompa donde nosotros queremos? 00:11:26
Pues al fragmento de ADN que a nosotros nos interesa se le llama Diana. 00:11:33
Y para hacer un corte en una zona específica, en un fragmento específico, lo que necesitamos son unas enzimas que se llaman endonucleasas de restricción o enzimas de restricción, que se conocen también como tijeras moleculares. 00:11:42
Bueno, pues ¿cómo se supo que estas endonucleasas son las que cortan el ADN? 00:12:04
Bueno, antes de eso, estas enzimas que cortan los enlaces fosfodiéster en secuencias específicas y a estas secuencias específicas se les llama sitios de restricción. 00:12:12
Tenemos endonucleasas de restricción o enzimas de restricción y al sitio donde corta se le denomina sitio de restricción. 00:12:29
Bueno, aquí os he puesto un ejemplo, este sería una doble hélice de ADN, aquí tenemos las bases nitrogenadas, tenemos guanina, adenina, adenina, timina, timina, citosina y esto de aquí, ¿veis? 00:12:40
marrón clarito, sería la enzima. Pues esta enzima va a cortar el ADN, va a cortar por aquí una cadena 00:13:05
y la otra cadena y va a romper un enlace fosfodiéster. Bueno, pues ¿cómo se descubrió que existían 00:13:14
estas enzimas de restricción y que eran las que cortaban el ADN? Pues esto se descubrió a partir 00:13:30
de cepas de bacterias que se vio que algunas fijaros que eran 1950 se vio que algunas bacterias 00:13:36
eran inmunes a virus no se infectaban por virus pues se investigó acerca de esto y se observó 00:13:47
Fijaros, que pasaron 20 años para entender el mecanismo de cómo estas bacterias se defendían de los virus. 00:13:59
Y se le recibieron el premio Nobel, estos tres científicos, Arber, Smith y Nathans, recibieron el premio Nobel en 1978. 00:14:10
Bueno, pues el caso es que hay algunas bacterias que cuando les infecta un virus, los virus tienen también ADN o ARN, pues hay algunas bacterias que cuando les infecta un virus lo que hacen es, con una enzima que tienen, lo que hacen es cortar ese ADN que les está infectando, el ADN que aquí llamamos intruso. 00:14:19
Entonces el virus intenta introducir su ADN en la bacteria, pero la bacteria tiene unas enzimas que lo que hacen es cortar ese ADN que está metiendo el virus. 00:14:43
Ahora que, claro, el ADN que tiene el virus y el ADN de la bacteria es igual 00:15:00
Está formado por enlaces fornucleótidos, enlaces fosfodiéster, las bases nitrogenadas 00:15:07
¿Cómo sabe la bacteria que tiene que cortar el ADN del virus? 00:15:13
¿Pero cómo hace para que esa enzima no corte su propio ADN? 00:15:19
Por lo que hacen esas bacterias es metilar los nucleótidos de adenina, metilar significa que ponen un grupo CH3, se une un grupo CH3 al nucleótido de adenina 00:15:25
Y así de esta forma la enzima de restricción no va a poder cortar este enlace fosfodiéster en la que está la adenina metilada y en cambio sí que va a poder cortar estos enlaces fosfodiéster, estos de aquí. 00:15:43
Bueno, entonces, las bacterias tienen un mecanismo de defensa que hacen que las endonucleasas degraden el material genético extraño que entra en la célula. 00:16:00
Las bacterias tienen la capacidad de metilar su ADN, lo cual sirve para distinguir entre el ADN extraño y el ADN propio. 00:16:19
Las enzimas de restricción no pueden cortar el ADN metilado y de este modo solo afectan al ADN extraño y no al ADN de la bacteria. Esto se llama la metilación. Un grupo metilo es un CH3. 00:16:27
Bueno, pues dentro de estas enzimas de restricción tenemos dos tipos, bueno tres mejor dicho. 00:16:48
Tenemos tipo 1, tipo 2 y tipo 3. 00:16:58
Las enzimas de restricción tipo 1 y tipo 3 lo que pueden hacer es, o sea son enzimas de restricción porque cortan, pueden cortar el ADN 00:17:01
Y además son enzimas también de modificación porque metilan el ADN. Metilar es poner un CH3. Ahora, la diferencia entre las de tipo 1 y las de tipo 3 es la siguiente. 00:17:13
Las de tipo 1 van a cortar el ADN, pero lo cortan al azar. Lo cortan a mil pares de bases o más de la secuencia de reconocimiento. Mil pares de bases. PB es pares de bases. Un par de bases sería adenina timina, citosina guanina. 00:17:32
Esos son pares de bases. Pues fijaros, estas cortan pero a 1.000 pares de bases. Y las de tipo 3 cortan a entre 5 y 8 pares de bases antes o después de la secuencia que reconocen. 00:17:55
y estas, las dos, las de tipo 1 y las de tipo 3, necesitan energía para moverse a través de la molécula hasta llegar al sitio donde tienen que cortar. 00:18:12
Entonces estas serían tipo 1 y tipo 3. 00:18:31
Y por otro lado tenemos las de tipo 2. 00:18:35
Estas de tipo 2 son las que realmente se utilizan en ingeniería genética. 00:18:38
Estas son más sencillas y solamente tienen actividad de restricción, es decir, que solamente cortan el ADN y además cortan justo en la secuencia que reconocen. 00:18:43
Entonces, estas cortan en la zona, en el sitio de restricción que nos interesa y en cambio fijaros estas que la tipo 1 corta a mil pares de bases y está entre 5 y 8 pares de bases más lejos de la secuencia de reconocimiento. 00:18:58
Y ahora, estas no requieren energía, estas de aquí sí que necesitan energía, la 1 y la 3, pero las de tipo 2 no necesitan energía para cortar y lo que sí que necesitan es cationes magnesio. 00:19:15
Estos cationes magnesio se utilizan como cofactores. 00:19:33
Si os acordáis cuando vimos las enzimas, os acordáis que las enzimas son proteínas y había algunas enzimas que necesitan de ayuda para poder reaccionar. 00:19:37
Pues estas de tipo 2 necesitan cationes magnesio para que puedan actuar frente al sustrato. 00:19:52
Y a esto se les llama el cofactor, necesitan de un cofactor. 00:20:02
Y estos cationes magnesio se suelen obtener de cloruro de magnesio. 00:20:07
Bueno, pues estas son las de tipo 2. 00:20:15
Ahora, estas endonucleasas de restricción se conocen más de mil, o sea, más de un millar. 00:20:20
Y algunas de ellas reconocen la misma secuencia, la misma secuencia diana. 00:20:30
Pero bueno, hay más de un millar. 00:20:36
Son estructuras sencillas y por lo tanto se pueden aislar fácilmente y se pueden conservar y manejar fácilmente. 00:20:40
Y estas enzimas se aíslan de bacterias, de organismos prokaryotas, generalmente son bacterias. 00:20:49
Ahora, ¿cómo trabajan estas enzimas de restricción? 00:21:04
Bueno, pues estas endonucleasas de restricción pueden reconocer hasta más de 100 secuencias de ADN y las secuencias de ADN que distinguen son secuencias palindrómicas, secuencias palindrómicas que se leen igual de izquierda a derecha en una cadena como de derecha a izquierda en la otra cadena. 00:21:12
Aquí tenemos, por ejemplo, la cadena, la cinco prima, tres prima, que tiene adenina, timina, citosina, citosina, timina, adenina, guanina, guanina, adenina, timina. 00:21:44
Pues se lee igual, fijaros, aquí hay adenina, pues aquí también tenemos adenina, timina, timina, citosina, citosina, citosina, citosina, 00:21:57
T, T, A, A, G, G, y aquí también una G, una A, una A, y una T, y una T. 00:22:08
Se leen igual en una de las cadenas de 5' a 3' y en el otro sentido, la otra cadena, se lee también igual en la otra dirección. 00:22:17
Bueno, pues estas son secuencias palindrómicas. 00:22:36
Por ejemplo, aquí os he puesto esta enzima que se llama ECO R1. 00:22:41
Reconoce esta secuencia, la GAATTC. 00:22:46
¿Veis? Y aquí en la otra cadena tenemos G, A, A, T, T, C. Pues esta enzima reconoce esta secuencia, va pasando a través del ADN hasta que ve esta secuencia que es palindrómica y cuando llega a esta secuencia, esta endonucleasa rompe las dos cadenas, rompe los enlaces fósforo y éste. 00:22:50
Bueno, aquí os he puesto este dibujo que viene ahí en el documento. Esta sería la enzima, esto de aquí morado. Lo que está en rojo es el ADN. La enzima se une débilmente al ADN, se desplaza hasta que encuentra la secuencia afín. 00:23:13
Ahora el ADN se pliega y ya la enzima actúa y el ADN se extiende, se rompe. 00:23:38
Y ya la enzima se despega y puede actuar frente a otra cadena de ADN. 00:23:48
Si os acordáis de las enzimas, esto era una característica importante de las enzimas, 00:23:55
que actúan frente a un sustrato y luego quedan libres para actuar frente al siguiente sustrato. 00:24:03
Bueno, aquí os he puesto algunas enzimas. Esta sería la de Escherichia coli, que es 00:24:17
la que hemos visto, la ECO-R1, y que corta por aquí entre la guanina y la adenina, en 00:24:23
una de las cadenas y en la otra igual, entre adenina y guanina. Esta de aquí, Bacillus 00:24:29
amilolifuefaciens, que es la BAMH1, pues esta corta aquí entre las dos guaninas y aquí 00:24:37
lo mismo, entre las dos guaninas. Y si os fijáis, esta también es una secuencia palindrómica 00:24:47
G, G, A, T, C, C, G, G, A, T, C, C. Esta otra, Aemophilus influenzae, que es la GINDE3, 00:24:53
pues lo mismo, corta en esta secuencia, que es la A, A, G, C, T, T, y corta entre las 00:25:07
dos adeninas por aquí y corta por aquí. Y a esto se le denomina sitio de reconocimiento, 00:25:16
es el sitio donde va la enzima a cortar. Bueno, aquí os he puesto esto, esta tabla, pero 00:25:23
no es parecida a la anterior, pero era para que vierais también alguna otra. Entonces, 00:25:34
bueno, pues aquí son estas enzimas, si veis son todas de origen bacteriano, pues esta 00:25:40
la que hemos visto ya, la Ascherichia coli, esta, por ejemplo, la TAC-1, la Cermus aquaticus. 00:25:48
¿Veis? Cortaría, por ejemplo, esta secuencia TCGA, que como es palindrómica, aquí sería 00:25:56
TCGA. Entonces, eso, cada enzima corta una secuencia determinada. Por ejemplo, esta de 00:26:04
aquí, pues corta esta secuencia GGCC, GGCC. Ahora, cuando la enzima corta, claro, corta 00:26:15
dos enlaces fosfodiéster, uno en cada cadena. Por lo tanto, nos van a quedar dos extremos 00:26:28
de ADN. Bueno, pues estas enzimas, al cortar el ADN, se van a poder producir dos tipos 00:26:35
de cortes. Tenemos cortes que se pueden obtener extremos romos y cortes que pueden dar lugar 00:26:43
a extremos cohesivos. ¿Qué diferencia hay entre una y otra? Pues mirad, los extremos 00:26:55
romos se producen cuando el corte es en vertical. Esta sería la región, el fragmento palindrómico 00:27:01
C, C, C, G, G, G, C, C, C, G, G, G y la enzima corta justo entre la citosina y la guanina 00:27:12
en una cadena, entre guanina y citosina, entre la otra cadena. Por lo tanto, el corte 00:27:21
es vertical y no nos van a quedar bases desapareadas. En cambio, cuando se obtienen extremos cohesivos 00:27:28
El corte no es vertical, aquí hay un corte y el otro corte está en este otro lado. 00:27:36
Aquí en este caso se corta entre la guanina y la adenina, entre guanina y adenina. 00:27:43
Y lo que ocurre aquí es que van a quedar bases desapareadas. 00:27:51
Vamos a ver qué significa esto de bases desapareadas. 00:27:56
Mira, yo creo que aquí se ve mejor. 00:28:00
Aquí, por ejemplo, tendríamos la enzima que es la ALU1 y esta enzima corta por aquí, entre la guanina y la citosina. 00:28:02
Entonces se nos van a quedar las bases, o sea, no van a quedar bases desapareadas porque la guanina sigue estando apareada, la citosina y la adenina latimina, la citosina, la guanina, latimina con la adenina. 00:28:11
Y estos extremos se llaman extremos romos. 00:28:27
Ahora, cuando la enzima no corta en vertical, pues nos van a quedar extremos que se llaman extremos cohesivos o también se llaman extremos pegajosos. 00:28:33
En este caso ha cortado por aquí una cadena y por aquí la otra cadena. 00:28:48
Entonces nos han quedado la adenina, adenina, timina, timina, estas cuatro bases nos quedan desapareadas, desapareadas porque no tienen aquí ninguna base a la que puedan unirse mediante puentes de hidrógeno y en la otra cadena nos quedan la timina, timina, adenina, adenina. 00:28:53
Lo mismo, aquí están desapareadas porque no tienen aquí otra base nitrogenada con la que formar puentes de hidrógeno. Pues a esto se le llaman extremos cohesivos. Extremos romos y extremos cohesivos. 00:29:13
Aquí he puesto otro ejemplo, bueno, que es parecido, aquí también es la ALU1, pues eso que corta dando lugar a extremos romos, no quedan bases desapareadas. 00:29:29
La NLA3, pues esta corta entre la guanina y la timina y entre la citosina y la guanina por aquí. 00:29:44
O sea que nos van a quedar extremos cohesivos, nos van a quedar estas cuatro bases desapareadas y aquí estas cuatro bases nos quedan también desapareadas. 00:30:01
Y esta de aquí, la AU3A1, pues también nos da extremos cohesivos 00:30:16
Porque corta por aquí entre la citosina y la guanina 00:30:24
Y por aquí corta entre la adenina y la guanina 00:30:28
Pues nos van a quedar estas bases, la citosina, la timina, la adenina, la guanina 00:30:32
Nos quedan desapareadas 00:30:36
Y en la otra cadena, la guanina, la adenina, la timina y la citosina 00:30:38
Nos quedan también desapareadas 00:30:43
Bueno, aquí en el documento tenéis esta evaluación, pero bueno, yo creo que es fácil. 00:30:45
Aquí lo único que nos dicen es que tenemos que relacionar las enzimas con el sitio de corte. 00:31:03
Entonces, bueno, esto es fácil, ya cuando os veáis la teoría lo hacéis. Aquí lo que tenemos es, pues, si cortan a una distancia de mil pares de bases, a una distancia de ocho o diez pares de bases o dentro de la secuencia de reconocimiento. 00:31:11
Vale, pues ya hemos visto que estas enzimas, estas endonucleasas de restricción se aíslan de bacterias, de organismos prokaryotas, por lo que para su nomenclatura se nombran a partir de las bacterias de las que son extraídas. 00:31:31
Ya hemos visto un poco los nombres. Entonces, para el nombre, pues la primera letra se corresponde con el género de la bacteria. Por ejemplo, la Eco R1 sería de la Escherichia, esa sería la E. 00:32:01
Las dos siguientes letras, la C y la O, pues van a provenir de la especie de la bacteria 00:32:19
Aquí sería coli, entonces es E, C, O 00:32:26
Y luego la siguiente letra proviene de la cepa de la bacteria 00:32:30
Que en este caso es la RY13 00:32:36
Y la última letra, bueno, sería más bien número 00:32:40
sería el orden de identificación de la enzima en la bacteria. 00:32:45
O sea, esta es la quinta endonucleasa que se ha aislado de esta especie de la Escherichia coli. 00:32:53
Entonces, la E, género de la bacteria, especie de la bacteria, cepa y orden de identificación. 00:33:00
Bueno, pues para trabajar con enzimas de restricción hay una serie de factores que son importantes que pueden afectar a la actividad de la enzima. 00:33:08
Bueno, pues estos factores son, por un lado es importante la pureza del ADN, que estemos trabajando con un ADN puro, para eso pues tiene que ser un ADN que no tenga contaminantes, que no tenga por ejemplo proteínas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS, que no tenga sales, porque todos estos contaminantes van a inhibir a la endonucleasa. 00:33:29
Por otro lado, importante también, temperatura y pH. ¿Por qué? Porque la temperatura y el pH, hemos visto, las enzimas son proteínas. 00:34:00
Por lo tanto, si aumentamos mucho o disminuimos mucho la temperatura o se cambia el pH, pues eso va a afectar a la estabilidad de las enzimas y a su actividad, 00:34:17
Porque se pueden desnaturalizar. Acordaros de la desnaturalización de las proteínas. Por otro lado, también, si tenemos adenasas, estas enzimas degradan el ADN. Y si además tenemos, sobre todo en presencia de cationes de magnesio, ¿qué más factores pueden afectar a estas enzimas? 00:34:29
al mecanismo, a la actividad de las enzimas, pues también puede afectar los grados de 00:34:59
metilación, que algunas enzimas son inhibidas por metilación. Por otra parte, también 00:35:08
puede ser el tipo de molécula de ADN. Si, por ejemplo, el ADN no tiene la secuencia 00:35:16
que es reconocida por la enzima y esta secuencia que no sea accesible, si el ADN está muy 00:35:23
enrollado, pues la enzima no puede acceder al sitio de restricción, no va a poder actuar. 00:35:32
Y también vamos a necesitar un buffer, trabajar con una disolución tampón adecuada, porque 00:35:41
que esto es lo que va a proveer el ambiente para que la enzima trabaje en condiciones óptimas. 00:35:49
Bueno, pues estos serían los factores importantes que pueden afectar a la actividad, 00:35:56
que son la pureza, temperatura y pH, las adenasas, los grados de metilación, 00:36:04
el tipo de molécula de ADN y necesitamos también de un buffer, 00:36:11
una disolución tampón adecuada para que el ph no varía demasiado vale bueno pues hemos cortado los 00:36:17
fragmentos de adn pero quizá que querramos también unir esos fragmentos hay veces que en alguna de 00:36:36
las técnicas lo que se hace es unir dos fragmentos de adn pero son fragmentos de adn que provienen 00:36:48
de organismos diferentes 00:36:55
claro, ahora hemos roto 00:36:57
para cortar el ADN hemos roto 00:37:00
enlaces fosfodiéster, pues ahora 00:37:03
para formar otra vez, para unir esos fragmentos 00:37:06
vamos a necesitar también que se formen 00:37:09
enlaces fosfodiéster 00:37:12
y por lo tanto para unir estos fragmentos 00:37:14
lo que vamos a necesitar son las otras 00:37:19
enzimas que se llaman ADN ligasas 00:37:23
Y para crear estos nuevos enlaces se va a necesitar energía o otro cofactor. 00:37:25
Bueno, pues claro, como hemos visto que teníamos dos tipos de extremos, los extremos romos y los extremos cohesivos, pues ahora la unión también va a ser diferente. 00:37:37
Si os acordáis, antes hemos dicho extremos cohesivos o pegajosos. Esto ya nos está indicando que va a ser fácil unir esos extremos. Y en cambio los extremos romos van a ser más difícil que se unan. 00:37:50
Bueno, pues por un lado, para unir los extremos cohesivos a partir de fragmentos distintos de ADN, importante, estos fragmentos de ADN tienen que haber sido cortados con la misma enzima de restricción, ¿vale? 00:38:07
Porque, claro, nosotros cortamos, por ejemplo, la de EcoR1, pues corta esta secuencia. 00:38:29
Por lo tanto, cortaríamos un ADN con esta enzima, la Escherichia coli, 00:38:47
Y el otro ADN de otro organismo diferente tendremos que cortarlo también con esta misma enzima para que luego nos queden los extremos que se puedan después unir fácilmente. 00:38:55
Porque si cortáramos un ADN con esta enzima nos quedarían bases desapareadas, pues adenina, AATT. Imaginaos que el otro ADN lo cortamos con esta enzima, pues nos van a quedar bases desapareadas, nos van a quedar GATCC y eso no va a ser posible que se unan. 00:39:08
Por lo tanto, si queremos unir dos tipos de ADN provenientes de organismos diferentes, vamos a necesitar que hayan sido cortados con la misma enzima de restricción. 00:39:32
Esto sería para los dos tipos de extremos, cohesivos y romos. 00:39:56
Ahora ya hemos dicho que estos van a ser colas que se llaman extremos pegajosos 00:40:03
Porque estos extremos se van a unir por, lo primero que van a hacer es unirse por puentes de hidrógeno 00:40:10
Y posteriormente una vez que tengamos las bases ya apareadas 00:40:19
Posteriormente lo que vamos a necesitar es que se unan estos fragmentos mediante la formación de un enlace fosfodiéster 00:40:25
que lo va a formar la ADN ligasa. 00:40:33
Aquí en este dibujo se ve mejor, mirad. 00:40:37
Aquí tenemos un ADN y otro ADN cortados con la enzima ECO-R1. 00:40:40
Nos han quedado aquí bases desapareadas, timina-timina, adenina-banina. 00:40:47
Y en este otro ADN nos han quedado también las mismas, timina-timina, adenina-adenina. 00:40:52
Por lo tanto, se nos van a formar puentes de hidrógeno entre esta timina y esta adenina. 00:40:58
Timina, adenina, adenina, timina, adenina, timina. 00:41:06
Se nos van a formar entre cada una de ellas dos puentes de hidrógeno. 00:41:10
Ahora ya tenemos las bases apareadas, pero ahora necesitamos unir estos nucleótidos. 00:41:16
La guanina con la adenina y aquí la adenina con la guanina. 00:41:22
Pues para unir estos nucleótidos lo que utilizamos es una ADN ligasa. 00:41:25
¿Veis que aquí ya están unidas la guanina con la adenina y la adenina con la guanina? 00:41:33
Entonces estos extremos son los extremos cohesivos, estos son cohesivos o pegajosos, estos son los que es fácil unirlos. 00:41:39
Y ahora, para los extremos romos, pues ya es más complicado 00:41:47
Porque para los extremos romos, claro, no tenemos aquí bases desapareadas 00:41:52
No hay ninguna base desapareada 00:41:57
Entonces, para los extremos romos, lo primero que tenemos que hacer es modificarlos 00:41:59
Y esto se hace con una enzima, que es la enzima DTT 00:42:05
Es la enzima de soxinucleotidil transferasa terminal 00:42:10
Bueno, pues con esta enzima lo que va a hacer va a ser 00:42:16
En una de las cadenas de ADN 00:42:21
Pues va a añadir una cola de poli de A 00:42:24
O sea, una cola de nucleótidos de soxiadenilato 00:42:28
Va a añadir adeninas, bases nitrogenadas que van a tener adenina 00:42:32
Y en la otra cadena va a añadir una cola de poli de T 00:42:37
O sea, una cola de desoxitimidato 00:42:41
Va a añadir timinas, nucleótidos que van a contener timina y en la otra nucleótidos que tienen adenina 00:42:45
Por lo tanto se van a formar dos colas que sí que ahora van a ser complementarias 00:42:53
Y se van a unir estas colas por puentes de hidrógeno 00:42:57
Por lo que al final, con la ADN ligasa, estas bases se van a unir, se van a formar enlaces fosfodiéster. 00:43:02
Bueno, aquí lo tenemos. 00:43:17
Este sería un corte que se ha hecho con esta enzima, con la SMA1. 00:43:19
Y este es el corte en vertical que hemos dicho antes. 00:43:26
por lo tanto no nos quedan bases desapareadas 00:43:30
y lo que tenemos que hacer es añadir la enzima, la DTT 00:43:33
y esa enzima DTT va a añadir timinas, o sea nucleótidos que tienen timina 00:43:37
en una de las cadenas y en la otra de las cadenas añade nucleótidos que tienen adenina. 00:43:45
Avenina, avenina, avenina. El siguiente paso, claro, estas dos bases nitrogenadas son complementarias, por lo tanto se van a unir, se van a formar puentes de hidrógeno y lo último que tiene que pasar es que va a actuar la ADN ligasa. 00:43:51
Y la ADN ligasa lo que va a hacer va a ser unir estos enlaces formando aquí enlaces fosfodiéster. Va a unir estas dos bases nitrogenadas y va a formar enlaces fosfodiéster. Va a unir la citosina y la timina y en el otro lado la citosina y la adenina. 00:44:14
Bueno, aquí teníais una autoevaluación. Aquí dice, completa el siguiente párrafo. 00:44:34
Las enzimas que catalizan la reacción de unión de dos fragmentos de ADN se denominan, son las responsables de formar nuevos enlaces en una reacción que utiliza u otro cofactor similar. 00:44:47
La unión de extremos requiere una modificación inicial del sitio de unión. 00:45:03
La enzima DTT puede emplearse para ello ya que facilita la creación de nucleótidos. 00:45:10
Bueno, pues os dejo un minutillo para pensar esto y ahora lo corregimos. 00:45:17
Vale, pues vamos a corregirlo. 00:46:05
Las enzimas que catalizan la reacción de unión de dos fragmentos de ADN se denominan ADN ligasas. 00:46:09
Este nombre es fácil, ligasas de unión. 00:46:18
Son las responsables de formar nuevos enlaces fosfodiéster. 00:46:23
Acordaros, los enlaces fosfodiéster están uniendo los nucleótidos. 00:46:27
en una reacción que utiliza ATP, bueno, que utiliza, podemos decir, energía u otro factor similar. 00:46:32
La unión de extremos romos requiere una modificación inicial del sitio de unión. 00:46:42
La enzima DTT puede emplearse para ello ya que facilita la creación de colas de nucleótidos, 00:46:51
que puede ser una cola, como hemos visto, de timina. 00:46:59
Y la otra de adeninas, nucleótidos con adeninas. Y así se van a formar enlaces por puentes de hidrógeno. 00:47:02
Y luego teníamos por aquí otra auto-evaluación. A ver, esto, bueno, reflexiona. 00:47:14
Que busca en internet con bibliografía de qué especie bacteriana se ha aislado la enzima de restricción SMA1. 00:47:21
vale, bueno, pues esta ya 00:47:29
está aquí 00:47:32
la solución, esta es de la especie 00:47:34
bacteriana 00:47:36
esta es Serratia 00:47:38
Marcenscens 00:47:39
y luego nos dice, pues bueno 00:47:41
que buscad otra como la AE3 00:47:45
estas 00:47:48
y bueno, estas 00:47:49
estas yo creo que estaban aquí 00:47:52
aquí 00:47:56
Aquí está la BAMH1, proviene de esta bacteria, de la Bacillus amylolycoefaciens, y esta proviene de la Haemophilus influenzae. 00:48:03
Y bueno, nos faltarían dos, que serían aquí, esta la PV2, que a lo mejor vamos a ver si la tenemos en esta tabla, 00:48:18
PV aquí, aquí no sé 00:48:40
si es uno o dos 00:48:45
no lo veo bien 00:48:46
pero bueno, esta sería de aquí 00:48:48
aquí tenéis algunas 00:48:50
hemos visto que hay 00:48:53
más de mil tipos 00:48:54
enzimas 00:48:58
de restricción que se obtienen 00:48:59
de bacterias 00:49:02
diferentes 00:49:04
aquí tenéis alguna de las bacterias 00:49:06
de las que se pueden obtener 00:49:09
Y el sitio de reconocimiento. Vale, pues esta sería la primera parte de este tema, del tema 4. El próximo día veremos la hibridación y la secuenciación. Eso sería antes de Semana Santa. 00:49:10
y después de Semana Santa yo creo que ya veremos la PCR y la técnica del ADN recombinante, que esas son un poquito más largas. 00:49:35
En este tema también nos hablan un poco aquí de la tecnología CRISPR, aquí donde pone para saber más, aquí nos hablan un poco de la tecnología CRISPR. 00:49:49
Os voy a contar un poco de la tecnología CRISPR que está como muy de actualidad. Bueno, de esto no sé si tenéis alguna duda. Vale, pues mirad la técnica o la tecnología CRISPR. 00:50:02
Entonces, es una técnica en la que podemos editar, podemos cortar un gen, podemos mutar un gen. Es una técnica que, fijaros, que hasta el año 2012 modificar un gen, pues como dice aquí, era una obra de ingeniería y podía costar hasta unos 5.000 euros y solamente se podía para unas pocas regiones. 00:50:27
En cambio aquí con la tecnología CRISPR se puede editar o corregir el genoma de cualquier célula. 00:50:57
Y esto de CRISPR viene de las siglas en inglés, de estas siglas, 00:51:07
Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, 00:51:13
y que en español son repeticiones palindrómicas cortas, agrupadas y regularmente interespaciadas. 00:51:17
Bueno, pues esta tecnología CRISPR, lo que es la base de la tecnología, la investigación básica, la hizo este científico, Francisco Mojica, 00:51:25
En 1993 comenzó a hacer su tesis doctoral y al empezar la tesis empezó a investigar por qué él vivía en Alicante 00:51:38
Entonces se puso a investigar por qué las arqueas que vivían en las salinas de Santa Pola 00:51:55
porque estas arqueas aguantaban condiciones extremas de temperatura y de salinidad. 00:52:03
Esto fue en el año 1993 y posteriormente pasaron 10 años hasta que descubre que estas arqueas 00:52:09
tenían una secuencia de ADN que era diferente y esta secuencia de ADN tenía repeticiones palindrómicas, 00:52:32
si os acordáis las repeticiones palindrómicas que se leen igual al derecho en una cadena como en la otra cadena en el otro sentido 00:52:45
y además tenían en su secuencia de ADN, esto sería el ADN, pues tenían un fragmento de ADN 00:52:53
y este fragmento de ADN que él llamó espaciador provenía de fragmentos de virus. 00:53:03
Y además tenían otra secuencia de ADN y esta secuencia de ADN codificaba a una proteína que la llamó proteína Cas9. 00:53:10
de sistema asociado a CRISPR 00:53:22
entonces él se puso a investigar sobre el ADN de estas arqueas 00:53:25
y en 2003 pasaron 10 años hasta que descubrió que estas arqueas 00:53:30
tenían esta secuencia, por lo que 00:53:34
bueno, aquí está representado lo mismo 00:53:40
aquí en rombo serían las secuencias palindrómicas 00:53:43
y aquí entre las secuencias palindrómicas 00:53:47
tenemos una secuencia que provienen de virus. Estos serían los virus y estas serían las secuencias 00:53:51
que provienen de los virus. Pues entonces él descubrió que había unas bacterias o las arqueas 00:53:57
que tenían un mecanismo de defensa frente a los virus y es decir que cuando el virus infectaba 00:54:12
infectaba a una bacteria, pues esta bacteria lo que hacía era copiar fragmentos de ese 00:54:20
ADN y los incorporaba en su genoma, en su ADN, esos eran los espaciadores. Y además 00:54:25
hacía copias de ARN, de ese fragmento del virus. Entonces, la próxima vez que ese virus 00:54:33
entre la bacteria, pues la bacteria ya tiene, a ese virus ya le reconoce porque tiene esa secuencia de virus en su ADN 00:54:48
y además como tiene unas secuencias de ARN que son del virus, pues ese virus ya lo identifica. 00:54:58
Por lo que la proteína Cas9 lo que va a hacer va a ser romper ese ADN, lo va a destruir. Esta proteína es una enzima, una endonucleasa que va a romper ese ADN. 00:55:08
Bueno, en 1993 fue cuando Mojica empezó a investigar, en 2003 ya descubrió ese mecanismo y posteriormente hubo todos estos investigadores que se pusieron a estudiar este mismo mecanismo de defensa de las bacterias frente a los virus. 00:55:27
Y en el 2013, estas dos investigadoras, Yeri Ferdouna y Emanuel Charpentier, descubrieron la aplicación de este mecanismo. 00:55:53
Ellas lo que descubrieron fue cómo aplicar lo que había descubierto ya Mojica, de cómo actuaban las enzimas, pues ellas descubrieron la aplicación. 00:56:07
Es decir, pues si nosotros queremos editar un gen, lo que podemos hacer es copiar ese gen, crear un ARN de ese fragmento de ADN que queremos modificar y con ese ARN y con la proteína Cas9, que actúan como tijeras moleculares, lo que podemos cortar es ese ADN que nosotros queremos identificar. 00:56:21
cortar. Bueno, pues esta es la tecnología CRISPR. Bueno, ahora quizá os suene un poco 00:56:51
complicado, pero ya volveremos a ello. Simplemente quería que supierais un poquito de qué 00:57:01
lleva esto de la CRISPR. Simplemente es eso. Para editar un gen, lo que podemos hacer es 00:57:09
saber mediante 00:57:18
un fragmento de ARN 00:57:20
saber dónde tenemos 00:57:23
que cortar y posteriormente 00:57:25
la proteína 00:57:27
la proteína, la Cas9 00:57:28
la nucleasa, va a 00:57:31
cortar ese fragmento de 00:57:33
ADN 00:57:35
pero bueno, ya os digo que de esto 00:57:36
volveremos porque 00:57:39
ahora yo creo que igual 00:57:41
os he podido liar un poco 00:57:44
pero ya volveremos a esto de la CRISPR 00:57:46
vale, pues entonces 00:57:50
no sé si tenéis alguna duda 00:57:53
de esto que hemos visto 00:57:58
o de las prácticas que 00:57:59
de la práctica de casa, de laboratorio 00:58:05
no sé si hay alguna duda 00:58:10
voy a cortar la grabación 00:58:11
Autor/es:
S.A.
Subido por:
Susana A.
Licencia:
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Fecha:
20 de marzo de 2024 - 15:54
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Clave
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IES LOPE DE VEGA
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