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UT7 - Fundamentos de Hibridación Molecular - 2ª Parte - Contenido educativo

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Subido el 18 de marzo de 2024 por Pedro M.

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En este vídeo vamos a ver la última parte del tema 4 00:00:00
y nos vamos a centrar fundamentalmente en el estudio de las sondas. 00:00:04
Qué tipos de sondas se suelen utilizar, características de las sondas, 00:00:09
luego veremos los tipos de marcaje y las bases de las técnicas de hibridación. 00:00:13
En cuanto a las sondas, todas las sondas deben tener dos características fundamentales. 00:00:18
Para que podamos utilizarla en las técnicas de hibridación, 00:00:24
por un lado deben ser muy específicas y por otro lado muy sensibles. 00:00:27
Especificidad. La especificidad se refiere a la capacidad que va a tener la sonda 00:00:33
de discriminar la secuencia diana entre montones de secuencias 00:00:37
que vamos a tener, por ejemplo, en un genoma completo de una célula eucariota. 00:00:43
Es decir, vamos a decir que la sonda es muy específica 00:00:49
siempre y cuando sea capaz de reconocer su secuencia diana de forma exclusiva. 00:00:52
Para que una sonda tenga una elevada especificidad, cuanto mayor sea, cuanta mayor longitud tenga la sonda, más específica suele ser. 00:00:59
Un tamaño mínimo de 16 bases son las sondas menos específicas, es decir, todas las sondas deben tener un tamaño mínimo de 16 bases. 00:01:10
A partir de aquí, todas las bases suelen tener 20, 24, pueden tener incluso hasta centenares de bases, como vamos a ver ahora. 00:01:23
Cuanta mayor longitud de la sonda, mayor especificidad. 00:01:32
En segundo lugar, las ondas deben ser muy sensibles 00:01:36
La sensibilidad hace referencia a la capacidad que tenemos de detectarla 00:01:41
Es decir, es la probabilidad de detectar cantidades mínimas sonda diana 00:01:46
Imaginaos que en la muestra del paciente tengo muy poquita secuencia diana 00:01:51
O he podido purificar muy poco DNA del paciente para hacer la técnica de hibridación 00:01:57
diremos que la sonda es muy sensible si aunque tenga poco material de partida 00:02:03
cantidades mínimas voy a ser capaz, soy capaz de detectarla 00:02:09
entonces la sensibilidad no depende del tamaño de la sonda 00:02:14
sino que depende del número de moléculas marcadoras que puedo poner por cada sonda 00:02:19
para poder detectar la sonda vamos a ver ahora después 00:02:25
que tengo que ponerle un marcador que me permita visualizar dónde está la sonda. 00:02:29
Entonces, hay sondas que admiten un solo marcador. 00:02:35
Si admiten un solo marcador, me va a ser complicado detectarlas. 00:02:38
Y hay sondas que admiten decenas de marcadores. 00:02:41
Esas sondas son mucho más sensibles. ¿Por qué? 00:02:46
Porque las voy a detectar con muchísima más facilidad. 00:02:49
¿Qué tipos de sondas tenemos? 00:02:55
Pues tenemos sondas de DNA, sondas de RNA y sondas de síntesis artificial, síntesis química. 00:02:57
Las sondas de DNA van a ser moléculas de DNA y las puedo obtener de tres maneras diferentes. 00:03:03
Por síntesis química en el laboratorio, por síntesis artificial, por DNA recombinante, es decir, voy a utilizar bacterias, 00:03:10
voy a meter el gen de la sonda dentro del genoma de las bacterias y voy a utilizar las bacterias como biofactorías. 00:03:18
factorías. Las bacterias van a producir la sonda y yo luego lisaré las bacterias y purificaré la 00:03:25
sonda. Y también las podemos obtener por PCR, que es el método que más se utiliza actualmente. Es 00:03:31
muy sencillo, se diseñan unos primers, todo esto lo veremos en el tema 6, y diseño la sonda de 00:03:38
forma muy rápida y puedo tener la sonda en 3-4 horas. Las ondas de DNA de síntesis química tienen 00:03:44
dos características fundamentales. Son sondas monocatenarias y, por tanto, si son sondas ya 00:03:54
monocatenarias, la ventaja que tienen es que no requieren un paso previo de desnaturalización. 00:04:00
Y, por otro lado, y esta es una desventaja, son sondas de tamaño reducido. Es decir, en el 00:04:09
laboratorio por síntesis química no puedo sintetizar sondas de DNA muy largas. Esto, la 00:04:15
ventaja que tiene es que penetran mucho mejor en los tejidos entonces las de síntesis química se 00:04:22
suelen utilizar en hibridación in situ cuando la sonda tiene que entrar dentro de las células al 00:04:27
ser de tamaño reducido penetran mucho mejor dentro de las células hasta llegar al núcleo sin embargo 00:04:33
al ser de tamaño reducido tienen menor sensibilidad porque le puedo colgar menos marcadores y menor 00:04:40
especificidad por su tamaño reducido. Es decir, como son tan pequeñitas, se van a unir a su 00:04:49
secuencia diana, pero tienen mayor probabilidad de unirse de forma inespecífica en otros sitios 00:04:56
del genoma. Las ondas que sintetizamos por DNA recombinante, ya hemos dicho que vamos a meterlas 00:05:02
en el genoma de una bacteria. Todo esto, cómo se producen estas ondas, lo entenderemos mejor 00:05:12
cuando veamos el tema 7 con la clonación de genes, vamos a clonar el gen de esa sonda dentro de un plásmido, 00:05:17
el plásmido lo vamos a transformar y lo vamos a meter dentro de bacterias y utilizaremos las bacterias como biofactorías 00:05:27
de las cuales purificaremos la sonda. 00:05:35
Las características de estas sondas es que son bicatenarias porque están producidas por bacterias 00:05:38
y por tanto requieren un paso previo de desnaturalización antes de realizar la hibridación. 00:05:44
Al ser producidas por bacterias puedo sintetizar, las bacterias pueden sintetizar sondas de gran tamaño, 00:05:52
y hablamos de centenares de bases, ¿de acuerdo? 00:06:00
En este sentido suelen ser sondas muy específicas, por tanto las sondas de DNA recombinante son muy sensibles 00:06:03
porque les voy a poder colgar a cada sonda muchos marcadores 00:06:11
porque son muy largas y al ser muy largas son muy específicas 00:06:15
porque va a ser muy difícil que estas sondas se unan de forma inespecífica 00:06:19
y se peguen por ahí por el genoma. 00:06:24
De tal manera que reconocerán su secuencia diana con mucha facilidad. 00:06:27
Y las sondas de PCR también van a ser bicatenarias, 00:06:31
por tanto requieren un paso previo a la hibridación, 00:06:34
un paso de desnaturalización, tendré que poner toda la muestra y las ondas a 95 grados 00:06:38
y en este caso las ondas de PCR suelen ser de tamaño intermedio, 00:06:44
desde una veintena, treintena de pares de bases, aquí sí que hablamos de pares de bases 00:06:50
porque son bicatenarias, a unos 100-150 pares de bases, como mucho, ¿de acuerdo? 00:06:55
Por tanto, la sensibilidad y la especificidad de las ondas de PCR están intermedias, ¿vale? 00:07:02
Son más sensibles que las de síntesis química y más específicas, pero son menos sensibles y menos específicas que las de ADN recombinante. 00:07:08
Además de las ondas de ADN tenemos ondas de RNA. Como son ondas de RNA, ya sabemos que una característica fundamental es que siempre van a ser monocatenarias. 00:07:17
Por tanto, aquí nunca tendremos, cuando utilicemos una sonda de RNA, un paso de desnaturalización. 00:07:27
De nuevo, estas ondas de RNA las puedo sintetizar en el laboratorio por síntesis química 00:07:34
Es decir, por un proceso químico puedo ir haciendo que un nucleótido se enganche a otro 00:07:42
Y obtener la sonda en el laboratorio de forma artificial 00:07:47
O nuevamente puedo meterla en un plasmido y meterla en bacterias 00:07:50
Y hacer que la bacteria del gen de DNA transcriba el mensajero de ese DNA, de ese gen 00:07:55
y ese mensajero va a ser mi sonda de RNA que luego purifico. 00:08:02
Y por último tenemos sondas químicas, pero sintéticas, ¿vale? 00:08:12
De tal manera que en el laboratorio yo voy a crear una estructura sintética química 00:08:19
diferente a los ácidos nucleicos, pero parecida. 00:08:25
Es decir, este es un ejemplo, tenemos dos tipos, peptídicos y lo que son los ácidos nucleicos bloqueados. 00:08:28
Aquí tenemos el ejemplo, tenemos nuestro DNA con su esqueleto azúcar fosfato y lo que hacemos por síntesis química es sustituir el esqueleto azúcar fosfato por un esqueleto artificial. 00:08:35
En este caso, en los PNA, son los ácidos nucleicos peptídicos, vamos a sustituir el azúcar fosfato, el esqueleto azúcar fosfato, por un esqueleto peptídico formado por unidades de aminoetilglicina. 00:08:49
¿Qué característica tiene este compuesto aminoetilglicina? Cuando uno, un aminoetilglicina con el siguiente, la distancia que queda entre este grupo acetilo y el siguiente es idéntica a la distancia que queda entre las dos pentosas. 00:09:06
De tal manera que lo puedo utilizar como un esqueleto sintético al cual en el grupo acetilo le voy a enganchar las bases nitrogenadas y de una manera muy sencilla por síntesis química puedo obtener ácidos nucleicos sintéticos, ¿de acuerdo? Sondas sintéticas que pueden ser peptídicas o bloqueadas. 00:09:24
¿De acuerdo? 00:09:47
Los peptídicos, ¿qué ventaja tienen? 00:09:49
Son sondas no cargadas, son sondas neutras. 00:09:51
Recordamos las sondas de DNA y del RNA, 00:09:55
por la estructura de polifosfato, del esqueleto polifosfato, 00:09:57
tiene siempre una carga negativa. 00:10:02
En algunos casos, para algunas técnicas, la carga negativa me viene mal. 00:10:04
Entonces puedo sustituirla por una sonda que no tenga carga eléctrica, 00:10:08
de síntesis química. 00:10:12
Y por otro lado, una ventaja, una segunda ventaja es que no se degradan por nucleasas, ya que las nucleasas no rompen los enlaces peptídicos, ¿de acuerdo? Los bloqueados, la de síntesis química, ácidos nucleicos bloqueados, os lo podéis mirar en el libro, no se utilizan tanto, ¿de acuerdo? 00:10:13
Una vez yo ya he obtenido mi sonda, debo marcar la sonda. ¿Qué es el marcaje? Es el procedimiento por el cual le voy a enganchar a la sonda algo, un compuesto químico, que me va a permitir visualizar si se ha formado o no se ha formado el híbrido. 00:10:34
Tenemos dos tipos de marcadores. Unos marcadores que me permiten detectar directamente el híbrido, es decir, hago la hibridación y después revelo. 00:10:53
Y ya directamente veo la sonda, gracias a estos marcadores. Y marcadores indirectos, en los cuales son marcadores que no los puedo detectar directamente y por tanto necesito un proceso de revelado un poquito más laborioso y más largo. 00:11:04
Los marcadores directos de detección directa más utilizados son los isótopos radioactivos clásicos aunque están en desuso y se están intentando retirar por el hecho de que son, utiliza isótopos radioactivos y su peligrosidad. 00:11:24
Los que más se utilizan son marcadores con fósforo 32 y con tritio, que es un isótopo del hidrógeno. 00:11:39
Y estas ondas marcadas con isótopos radioactivos se utilizan mucho en las técnicas de Southern Blot y Northern Blot, 00:11:47
que nos las explicaréis en el tema 5. 00:11:54
Actualmente la tendencia es sustituir los isótopos radioactivos por fluorocromos. 00:11:57
Los fluorocromos son compuestos químicos que cuando yo hago incidir sobre ellos una luz ultravioleta emiten luz en el rango del visible, luz azul, luz verde, roja, de tal manera que una vez ha formado el híbrido cojo la muestra, la irradio con luz ultravioleta y puedo detectar la fluorescencia gracias a la presencia de los fluorocromos. 00:12:04
Por otro lado, los marcadores indirectos normalmente se utilizan lo que llamamos aptenos. ¿Qué son los aptenos? Van a ser moléculas pequeñas, de pequeño tamaño, que las vamos a acoplar a la sonda y que no alteran su unión, la unión de la sonda a la secuencia diana. 00:12:32
¿cuál es la diferencia entre los anteriores marcadores y estos? 00:12:53
por ejemplo la digoxigenina y la biotina 00:12:58
que hay que conocer los nombres 00:13:00
la digoxigenina y la biotina no son fluorescentes 00:13:02
no son radioactivos 00:13:05
y por tanto no los puedo detectar directamente 00:13:07
he de utilizar en este caso 00:13:10
un procedimiento inmunohistoquímico 00:13:13
es decir, aquí en este ejemplo que os pongo 00:13:17
han sintetizado una sonda 00:13:20
y cuando han sintetizado, esta sonda es de RNA porque queremos detectar un RNA mensajero, 00:13:22
cuando han sintetizado la sonda han incluido un nucleótido, en este caso el uracilo, 00:13:28
que lo han marcado con digoxigenina. Es un nucleótido modificado que lleva colgando una pequeña bolita 00:13:32
que es la digoxigenina, de tal manera que cuando se produzca la transcripción donde haya un uracilo 00:13:41
voy a tener una digoxigenina. Esta digoxigenina después del proceso de hibridación se formarán 00:13:48
los híbridos. Yo no la puedo detectar porque no emite color, no emite fluorescencia, no emite 00:13:55
radioactividad, no emite nada. Entonces para poder detectarla necesito un segundo componente y se 00:13:59
suele utilizar mucho anticuerpos. Anticuerpos específicos contra la digoxigenina. ¿Qué 00:14:07
¿Qué característica tienen estos anticuerpos? Que a estos anticuerpos les he acoplado un segundo 00:14:14
marcador, que no es la digoxigenina porque no es un apteno. Este marcador es un enzima, 00:14:18
un enzima que es la fosfatasa alcalina. De tal manera que después de la hibridación incubo con 00:14:25
el anticuerpo marcado. ¿Dónde haga ya? Digoxigenina se unirá específicamente y quedará anclado el 00:14:31
anticuerpo y por tanto quedará anclado el enzima. ¿Qué gracia tiene este enzima? La fosfatasa 00:14:37
alcalina que después yo lo incubo con unos reactivos que son compuestos que llamamos 00:14:43
cromógenos. Estos sustratos cromogénicos o cromógenos son compuestos químicos que no tienen 00:14:49
ni color ni emiten fluorescencia pero si son metabolizados por una reacción enzimática por 00:14:57
la fosfata salcalina se convierten en compuestos de color azul y producen donde esté la sonda 00:15:07
precipita el nbtbcip que es este compuesto precipita sobre la sonda formando un precipitado de color 00:15:15
azul que sí que lo puedo observar al microscopio. Se entiende por tanto los marcadores que requieren 00:15:24
métodos indirectos son digo oxigenina y biotina no emiten luz no emiten radioactividad no emiten 00:15:33
fluorescencia y necesito un segundo proceso para poder detectarlos en este caso se utilizan 00:15:40
anticuerpos acoplados a una enzima que cuando le pongo su sustrato me va a producir un precipitado 00:15:47
donde esté el híbrido un precipitado de color azul que al microscopio óptico lo puedo observar 00:15:53
Para detectar los isotopos radioactivos utilizaré autoradiografías y para detectar los híbridos que están marcados con fluorocromos utilizaré un microscopio de fluorescencia. 00:16:00
¿Cuándo utilizo isotopos radioactivos? 00:16:14
Ya lo hemos dicho, las técnicas de Southern Blot y Northern Blot 00:16:17
Utilizo fluorocromos en la técnica del FISH 00:16:20
Es decir, hibridación in situ fluorescente 00:16:23
Y los aptenos se utilizan en todo tipo de técnicas de hibridación 00:16:27
Se utilizan muchísimo 00:16:31
¿Cómo marco las ondas? 00:16:33
Los métodos de marcaje 00:16:38
Este apartado no es importante 00:16:39
O lo podéis mirar, ¿de acuerdo? Pero no es el más importante 00:16:41
No vamos a ver los métodos de marcaje, son complejos y no tiene sentido que los veamos 00:16:47
Porque normalmente las sondas no las sintetizo en el laboratorio 00:16:53
Sino que las compro ya sintetizadas y comerciales o las encargo a un laboratorio para que me las produzca 00:16:56
Tenemos varios métodos de marcaje, es decir, el marcaje es la unión del marcador a la sonda 00:17:03
que no los vamos a ver, los tenéis aquí, los tenéis en el libro por si queréis echarles un vistazo 00:17:10
lo que sí es importante es este apartado 00:17:16
y esto le voy a preguntar seguro 00:17:19
las fases de la hibridación, es decir, cualquier técnica de hibridación 00:17:22
de las que nos vais a explicar en el tema 5 00:17:26
se compone de cuatro fases fundamentales 00:17:29
dependiendo de la técnica se añaden más fases 00:17:33
o hay diferentes procesos dentro de cada fase, pero todas las técnicas de hibridación poseen estas cuatro fases. 00:17:37
La primera fase es una fase de pre-hibridación. No vamos a producir el híbrido aquí. 00:17:45
Aquí lo que vamos a hacer va a ser preparar. ¿Qué preparamos? 00:17:50
Preparamos la muestra, preparamos el soporte, preparamos la sonda. 00:17:54
Si tuviésemos que marcarla nosotros y sintetizarla. 00:18:00
Por ejemplo, imaginaos que queremos hacer una técnica de hibridación in situ 00:18:03
Sobre un corte histológico de, por ejemplo, una biopsia de un paciente 00:18:09
Tenemos que preparar la muestra sobre el portaobjetos 00:18:16
El soporte va a ser el portaobjetos 00:18:21
La muestra es el corte del paciente 00:18:23
Pero la muestra la tenemos que permeabilizar 00:18:25
Es decir, a las células del tejido tenemos que hacerle agujeros 00:18:28
Para que pueda entrar la sonda 00:18:31
Todo este proceso es la fase de pre-hibridación 00:18:33
Dependiendo de la técnica de hibridación que vayamos a hacer 00:18:38
Y del tipo de muestra 00:18:41
La preparación y la pre-hibridación es muy diferente 00:18:42
Ya en el tema 5 nos lo iréis contando 00:18:47
La segunda fase es la fase de hibridación 00:18:50
Es decir, aquí voy a poner en contacto la sonda 00:18:53
Para que encuentre su secuencia diana 00:18:56
En el tejido, en las células, en un DNA 00:18:58
que acabo de purificar. En la hibridación, y esto es muy importante, tengo que tener en cuenta dos 00:19:02
parámetros fundamentales. El primero es la temperatura de melting del híbrido. Acordaos 00:19:08
que ya dijimos que cada híbrido, cada híbrido va a tener una temperatura de melting única y 00:19:14
exclusiva, característica. Entonces, ¿cuál es la temperatura óptima para llevar a cabo la 00:19:21
hibridación es la temperatura de melting del híbrido menos 25 grados centígrados. De tal 00:19:29
manera que si esta es la temperatura de melting del híbrido que quiero formar, sonda secuencia 00:19:36
diana, la temperatura óptima para que se lleve a cabo la hibridación estaría aquí, la temperatura 00:19:42
de melting menos 25 grados. Pero tenemos una horquilla, un rango de temperaturas que va desde 00:19:49
de la temperatura de melting menos 32 grados a temperatura de melting menos 16 grados, 00:19:58
en las que dentro de esta temperatura la hibridación es máxima. 00:20:03
Si veis aquí, la eficiencia de hibridación es máxima en esta horquilla. 00:20:08
Es muy importante, por tanto, llevar a cabo la hibridación en este rango de temperaturas. 00:20:12
Y el segundo parámetro que tenemos que controlar en la hibridación 00:20:19
es que se lleve a cabo en condiciones de rigurosidad relajadas. 00:20:24
Es decir, voy a permitir que la sonda se forme el híbrido y se estabilice el híbrido. 00:20:30
Si os acordáis, voy a aumentar, aumentando la fuerza iónica, 00:20:39
es decir, la concentración de cationes, hago que el híbrido sea más estable. 00:20:46
Si os acordáis. 00:20:52
Y si disminuyo la presencia de formamida, que es un agente desnaturalizante, si os acordáis, también hago que el híbrido sea más estable. 00:20:52
De tal manera que en esta fase de hibridación me conviene tener condiciones relajadas para que toda mi sonda encuentre y se una a su secuencia diana. 00:21:03
Como comprenderéis, en estas condiciones de rigurosidad relajadas, 00:21:14
la sonda, son condiciones en las que voy a permitir que la sonda también se una 00:21:20
inespecíficamente en otros puntos del genoma, ¿de acuerdo? 00:21:25
Y se van a producir uniones, en este caso, inespecíficas. 00:21:30
¿Qué es lo que hago? 00:21:35
Sabiendo que voy a permitir que se forman uniones inespecíficas, 00:21:38
hago una tercera fase que es importantísima que es la fase de lavado pos hibridación esta fase 00:21:42
de lavado es la más importante y la que determina la especificidad de la técnica es decir si yo 00:21:51
quiero que la técnica de hibridación sea muy específica y que la sonda solamente se una a 00:21:59
su secuencia diana he de controlar muy bien el lavado pos hibridación qué característica tiene 00:22:06
que tener el lavado pos hibridación voy a elevar la rigurosidad respecto a la fase de hibridación 00:22:13
si aquí he puesto condiciones relajadas aquí voy a poner condiciones de rigurosidad elevadas ¿cómo 00:22:22
lo hago? aumentando la fuerza iónica perdón disminuyendo la fuerza iónica disminuyendo los 00:22:29
cationes si os acordáis al disminuir los cationes se desestabilizan los híbridos y aumentando 00:22:36
la concentración de forma amida, que es un agente desnaturalizante y, por tanto, 00:22:43
tanto la fuerza iónica baja como la alta concentración de forma amida, 00:22:49
estas dos condiciones hacen que los híbridos sean menos estables. 00:22:55
Y puedo jugar también con la temperatura, de tal manera que voy a poner una temperatura mayor 00:23:04
que en el proceso de hibridación. 00:23:09
La temperatura suele estar en torno a 50-55 grados en la hibridación 00:23:12
y aquí nos vamos a 60-65 grados, ¿de acuerdo? 00:23:16
De tal manera que aumentando la temperatura, 00:23:19
disminuyendo la fuerza iónica y aumentando la concentración de forma mida, 00:23:23
voy a hacer que todas aquellas ondas que había permitido que se uniesen 00:23:27
de forma inespecífica en un montón de sitios del genoma, 00:23:32
que no son la secuencia diana 00:23:36
gracias a esta rigurosidad elevada 00:23:38
aquí se van a despegar porque estarán unidas de forma débil 00:23:42
y estas condiciones van a permitir 00:23:45
que solamente la sonda unida 00:23:49
de forma fuerte, es decir 00:23:51
unida formando todos los puentes de hidrógeno 00:23:54
con su secuencia diana 00:23:58
esos sean los híbridos, los únicos híbridos que permanezcan 00:23:59
después de la hibridación 00:24:04
y los lavados pos hibridación, que repito que es la fase más importante y de la que depende la 00:24:08
especificidad de la técnica, llevamos a cabo el revelado. Ahora tengo que detectar si ha habido 00:24:13
o no ha habido híbrido y dónde está el híbrido, por ejemplo en una hibridación in situ. El revelado, 00:24:19
la detección, ya depende del tipo de marcador. Si el marcaje es radioactivo, ya hemos dicho que 00:24:26
vamos a revelar con autoradiografía. Si he utilizado fluorocromos necesitaría un microscopio 00:24:32
de fluorescencia pero si he utilizado aptenos utilizaremos métodos inmunohistoquímicos es 00:24:38
decir necesito anticuerpos que reconozcan los aptenos y que vayan marcados con enzimas etcétera 00:24:44
etcétera que es lo que hemos explicado antes. Por tanto todas las técnicas de hibridación 00:24:50
El procedimiento tiene cuatro fases, una fase de prehibridación, una fase de hibridación, los lavados pos hibridación que son muy importantes y por último el revelado o la detección del híbrido. 00:24:56
Idioma/s:
es
Autor/es:
Pedro Melgar-Rojas
Subido por:
Pedro M.
Licencia:
Reconocimiento - No comercial - Sin obra derivada
Visualizaciones:
28
Fecha:
18 de marzo de 2024 - 9:12
Visibilidad:
Clave
Centro:
IES BENJAMIN RUA
Duración:
25′ 10″
Relación de aspecto:
1.78:1
Resolución:
1280x720 píxeles
Tamaño:
34.97 MBytes

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