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UT4 - Técnicas de PCR - 2ª Parte - Contenido educativo

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Subido el 1 de diciembre de 2023 por Pedro M.

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Vamos a corregir el ejercicio que os comentaba en la primera parte del tema. 00:00:00
Ya sabemos que en vivo necesitamos helicasas. 00:00:08
Si os acordáis, las helicasas son las que van abriendo y van rompiendo los puentes de hidrógeno 00:00:12
entre las dos heblas de la doble hélice, 00:00:17
de tal manera que tienen que entrar enseguida las proteínas SSBP, 00:00:20
acordaos, son las proteínas de unión a cadena sencilla, 00:00:26
para que no vuelvan a formar los puentes de hidrógeno, que ocurre de forma espontánea. 00:00:29
Al mismo tiempo tenemos girasas e topoisomerasas, 00:00:35
que si os acordáis, dan una vuelta al DNA, cortan y vuelven a empalmar, 00:00:40
de tal manera que este complejo de helicasas, proteínas SSBP, girasas topoisomerasas, 00:00:47
son las que nos permiten la desnaturalización del DNA, 00:00:54
que las dos hebras se puedan separar, que no hayan superestructuras superenrolladas, 00:00:58
por tanto que la estructura del DNA esté relajada y no vuelvan a formarse los puentes de hidrógeno. 00:01:05
Además tenemos la primasa, que si os acordáis, 00:01:14
es el enzima encargado de sintetizar el primer, un primer de RNA, 00:01:19
que se va a unir a la cadena molde y a partir de ese primer de RNA, 00:01:25
la DNA polimerasa va a sintetizar, va a replicar la nueva cadena, 00:01:30
la cadena de nueva síntesis del DNA. 00:01:36
Una vez se ha producido esa síntesis por la DNA polimerasa, 00:01:39
acordaos que la DNA polimerasa es capaz de destruir, romper los primers 00:01:44
y volver a sintetizar una hebra nueva, pero de DNA complementaria al DNA molde. 00:01:50
Y por último tenemos también la ligasa, que va uniendo un fragmento de Okazaki 00:01:57
con otro fragmento de Okazaki, para que sea una secuencia continua. 00:02:02
Todos estos son los enzimas que la célula tiene, 00:02:07
la maquinaria celular encargada de la replicación del DNA. 00:02:11
¿De acuerdo? 00:02:17
Entonces, in vitro, Karim Iulis se dio cuenta que, claro, 00:02:18
el complejo helicasa, proteínas SSBP, girasas y topoisomerasas 00:02:26
lo podía sustituir fácilmente jugando con la temperatura, 00:02:31
ya que nosotros sabemos que, al aumentar la temperatura, 00:02:37
normalmente a temperaturas en el DNA de un cromosoma eucariota, 00:02:40
al elevar la temperatura a 94 o 95 grados, 00:02:47
el DNA desnaturaliza de forma espontánea, se rompen los puentes de hidrógeno. 00:02:51
Esto ya lo sabemos del tema 2 y lo repasamos en el tema 4 de hibridación. 00:02:56
¿De acuerdo? 00:03:02
Por lo tanto, se dio cuenta que, jugando con la temperatura, 00:03:03
no era necesario poner en el tubo de ensayo helicasas, proteínas SSBP, 00:03:06
girasas y topoisomerasas, sino que, jugando con la temperatura, 00:03:12
subiendo la temperatura y bajándola, podía hacer que el DNA 00:03:16
desnaturalizase y renaturalizase. 00:03:20
¿Qué más? 00:03:27
En lugar de primers, es decir, en lugar de poner primasa 00:03:28
para que sintetice los primers, los cebadores, se le ocurrió una idea. 00:03:33
La idea fue sintetizar de forma artificial en el laboratorio los cebadores 00:03:38
y añadir al tubo de ensayo ya directamente los cebadores, los primers, 00:03:45
sin necesidad de que la primasa tuviese que realizar su actividad enzimática. 00:03:52
La polimerasa, la DNA polimerasa, tuvo que elegir una DNA polimerasa 00:03:59
que fuese termoestable, puesto que uno de los problemas es que, 00:04:05
si tenemos que desnaturalizar a 95 grados, la DNA polimerasa 00:04:10
y cualquier enzima que es una proteína también desnaturaliza. 00:04:16
De tal manera que si pongo el DNA a 95 grados y tengo la DNA polimerasa, 00:04:21
la DNA polimerasa me la cargo, desnaturaliza, se desnaturaliza y se inactiva. 00:04:26
De tal manera que tuvo que buscar unas DNA polimerasas que fuesen termoestables 00:04:33
y pudiesen aguantar temperaturas elevadas. 00:04:38
Y en cuanto a la ligasa, en este caso no tenemos que ligar nada, 00:04:41
no tenemos fragmentos de Okazaki y por tanto no es necesario poner ligasa. 00:04:46
De tal manera que de todos estos enzimas, si os dais cuenta, 00:04:51
jugando con la temperatura y añadiendo directamente los cebadores, los primers específicos, 00:04:55
solamente se dio cuenta que solamente era necesario poner una enzima, 00:05:01
que era la DNA polimerasa termoestable. 00:05:06
Por tanto, y en resumen, la PCR diseñada por Mulis en el año 83 tiene un punto clave. 00:05:09
Su punto clave es que es un diseño repetitivo. 00:05:19
Es decir, se trata de repetir secuencialmente ciclos de replicación del DNA. 00:05:23
¿Cuáles son los grandes problemas con los que se encontró Mulis? 00:05:30
El primero es la especificidad de copia. 00:05:35
Es decir, de esa cadena gigantesca, imaginaos que es un cromosoma eucariota, 00:05:37
el cromosoma 5, que es enorme, que tiene miles y miles de pares de bases. 00:05:44
¿Cómo selecciono yo específicamente? 00:05:50
¿Cómo aseguro yo que se amplifica un fragmento concreto de forma específica? 00:05:55
Solamente ese y ningún otro fragmento de toda la longitud del cromosoma. 00:06:02
Y el segundo problema es el que ya os comentaba antes de la termoresistencia de la polimerasa. 00:06:08
Es decir, si yo voy a utilizar la temperatura para desnaturalizar el DNA 00:06:14
y tengo la DNA polimerasa, la DNA polimerasa también se va a desnaturalizar, 00:06:20
se va a inactivar a cada ciclo. 00:06:27
¿Cómo lo solucionó? 00:06:31
Pues la solución para el primer problema de la especificidad de copia 00:06:33
fue diseñar cebadores primers específicos. 00:06:39
Los primers, que los vamos a ver ahora más adelante, 00:06:43
estos cebadores específicos son los que le dicen a la polimerasa el comienzo y el final, 00:06:46
los límites del fragmento concreto que queremos amplificar. 00:06:51
¿De acuerdo? 00:06:57
Por tanto, diseñando unos cebadores específicos, 00:06:58
me aseguro que de toda la longitud de ese cromosoma 00:07:02
solamente se va a amplificar específicamente un fragmento concreto. 00:07:06
Y en cuanto a la termoresistencia, 00:07:12
lo que hizo Mulis fue buscar animales que viviesen en ambientes que llamamos extremófilos 00:07:15
y encontró una serie de bacterias, 00:07:23
que son arqueobacterias muy antiguas, muy primitivas, 00:07:26
que son extremófilas y hay de muchos tipos. 00:07:29
Pues unas viven en ambientes ácidos, otras en ambientes alcalinos, 00:07:32
otras viven en ambientes alófitos, 00:07:37
es decir, con concentraciones de sales tremendamente elevadas 00:07:39
y hay otras que son termófilas, 00:07:43
es decir, viven en ecosistemas de temperatura muy elevada. 00:07:46
Por ejemplo, son bacterias que viven en los reefs, 00:07:53
o sea, en las dorsales oceánicas, ¿de acuerdo?, 00:07:57
donde está continuamente fluyendo magma 00:08:00
y donde las temperaturas rondan una media de 80 grados centígrados. 00:08:04
¿De acuerdo? 00:08:10
De tal manera que él se dio cuenta que si esos animales 00:08:11
eran capaces de vivir a esas temperaturas, 00:08:13
debían tener unas DNA polimerasas que fuesen termoestables 00:08:16
y no desnaturalizasen a esas temperaturas. 00:08:20
Y efectivamente, la DNA polimerasa que más se utiliza 00:08:23
es la TAC polimerasa, ¿de acuerdo?, 00:08:28
que es la primera polimerasa que se utiliza en las PCRs, 00:08:32
que procede de una arqueobacteria termófila 00:08:37
que se llama Termus aquaticus, de ahí su nombre, 00:08:41
TAC polimerasa, 00:08:44
y es la que más se utiliza y se utiliza de forma rutinaria. 00:08:46
¿De acuerdo? 00:08:50
Muy bien. 00:08:53
El primer elemento, 00:08:54
vamos a ir viendo ahora los elementos que se necesitan. 00:08:55
Hemos dicho que son los primers, 00:08:58
luego veremos las características de las DNA polimerasas, 00:09:00
sobre todo la TAC polimerasa termoestable. 00:09:05
Los cebadores, los primers que se utilizan en la PCR, 00:09:08
a diferencia de los primers de la replicación, 00:09:11
que son sintetizados por la primasa, 00:09:15
no son primers de RNA, sino que son primers de DNA. 00:09:22
Son oligonucleótidos, 00:09:28
es decir, cadenas cortas de nucleótidos monocatenarios de DNA. 00:09:30
¿De acuerdo? 00:09:36
De tal manera que para cada PCR, 00:09:37
para cada reacción de PCR, 00:09:39
necesitamos dos cebadores, 00:09:41
una pareja de cebadores, 00:09:43
un cebador que lo llamamos forward, 00:09:45
que es el que va a ir delante, 00:09:47
y el otro cebador que lo llamamos reverse. 00:09:49
Imaginaos que este es el DNA molde, 00:09:52
imaginaos que este es el cromosoma 2 esquematizado, 00:09:55
la hebra 5'3', 00:10:00
la 3'5', 00:10:02
y este es el fragmento en esta zona sombreada, 00:10:05
el fragmento que yo quiero amplificar. 00:10:08
El gen que yo quiero amplificar 00:10:10
puede tener una longitud de 500 pares de bases, 00:10:12
1.000, las que sean. 00:10:15
200, 300 pares de bases. 00:10:17
Los cebadores, el forward y el reverse, 00:10:20
deben diseñarse de forma específica, 00:10:24
de manera que vayan uno al principio del fragmento 00:10:27
y otro al final del fragmento. 00:10:31
Daos cuenta, y esto es muy importante, 00:10:35
que la tag polimerasa, 00:10:38
las DNA polimerasas que utilizamos en la PCR, 00:10:40
como son polimerasas, 00:10:43
acordaos que solamente saben leer 00:10:45
en dirección 3', 5', 00:10:48
y por tanto la cadena que sintetizan es 5', 3'. 00:10:51
De tal manera que los dos cebadores 00:10:56
se van a unir en el extremo 3' del fragmento. 00:10:59
El forward se unirá a la cadena molde 3', 5', 00:11:06
en el extremo 3' del fragmento, 00:11:11
si os dais cuenta. 00:11:14
¿De acuerdo? 00:11:17
Y el reverse se va a unir en el extremo 3', 00:11:18
pero en este caso de la cadena que es 5', 3'. 00:11:21
De tal manera que cuando una vez tengamos unidos 00:11:25
los cebadores a las dos cadenas molde 00:11:29
y se una la DNA polimerasa, 00:11:34
va a sintetizar siempre en dirección 5', 3'. 00:11:37
Es decir, que en cada una de las hebras del DNA molde 00:11:44
la DNA polimerasa avanza en sentido opuesto. 00:11:49
Una iría hacia la derecha y la otra hacia la izquierda. 00:11:52
¿De acuerdo? 00:11:57
Muy bien. 00:12:00
Esto es muy importante. 00:12:01
¿De acuerdo? 00:12:03
Por tanto, los cebadores, si os acordáis, 00:12:04
son los que marcan la especificidad de la reacción de PCR. 00:12:08
Es decir, si en el examen os pregunto 00:12:13
qué elemento de la PCR es el que determina 00:12:15
la especificidad de la reacción? 00:12:19
Los primers. 00:12:23
¿Por qué? 00:12:24
Porque son los que van a delimitar 00:12:25
qué fragmento se tiene que amplificar. 00:12:28
Por tanto, de esto que acabo de decir, 00:12:32
se deduce que los primers, una vez diseñe los primers, 00:12:35
deben ser secuencias que sean únicas en toda la longitud. 00:12:41
De tal manera que este cebador se una única y exclusivamente aquí 00:12:47
y no se pegue de forma inespecífica a lo largo de la cadena. 00:12:52
Y este cebador, el reverse, se una específicamente aquí 00:12:55
y no se une inespecíficamente a lo largo de la secuencia. 00:13:00
Donde se una un cebador, se pegará la polimerasa y amplificará. 00:13:03
Por tanto, los cebadores, los primers, 00:13:08
tienen que ser tremendamente específicos 00:13:11
y unirse solamente en estas secuencias diana. 00:13:14
Porque si no, la DNA polimerasa puede amplificar de forma inespecífica 00:13:18
fragmentos que no son el fragmento que queremos amplificar. 00:13:23
¿De acuerdo? 00:13:28
¿Qué características a grandes rasgos tienen estos cebadores, los primers? 00:13:29
La primera característica es la longitud. 00:13:35
No puedo hacer un cebador muy pequeño 00:13:38
porque si el cebador es muy pequeño, 00:13:40
es decir, muy cortito, 00:13:43
la probabilidad de que se pegue en sitios de forma inespecífica es muy grande. 00:13:45
Por tanto, se estima que la longitud 00:13:50
debe ir siempre entre 18 y 30 pares de bases. 00:13:53
Nunca más de 30 pares de bases 00:13:57
porque entonces es muy difícil que hibride, 00:13:59
que se una el DNA molde. 00:14:02
Y nunca menos de 18, 00:14:04
a ver, la longitud mínima son 16, 00:14:06
menos de 16, 18, 00:14:09
y eso nunca porque es muy fácil entonces 00:14:12
que se ponga, se pegue de forma inespecífica 00:14:14
en otras zonas, en otras secuencias del DNA molde. 00:14:17
Segunda característica, la composición de bases. 00:14:22
Es muy importante. 00:14:25
Para que la unión del primer, 00:14:26
para que la unión del primer a la secuencia diana, 00:14:29
de cada uno de los primers a su secuencia diana, 00:14:34
para que esa unión sea fuerte, 00:14:38
la composición de guaninas y citosinas 00:14:40
debe estar en torno al 60%, 00:14:43
del 40 al 60%, 00:14:46
para que la unión sea fuerte. 00:14:48
Si tengo muchas adeninas y timinas, 00:14:50
si las adeninas y timinas superan el 60%, 00:14:52
la unión va a ser débil 00:14:55
y es muy fácil que se desenganchen. 00:14:57
¿De acuerdo? 00:15:00
Por tanto, la composición en la secuencia de los primers, 00:15:01
la composición de guaninas y citosinas 00:15:05
debe estar en torno al 50%, 00:15:09
tirando al 60%. 00:15:11
¿De acuerdo? 00:15:13
Una vez ya tenemos diseñado el primer, 00:15:14
el forward y el reverse, 00:15:17
¿de acuerdo? 00:15:19
El forward y el reverse, 00:15:20
o el 5' y 3' también se les llaman, 00:15:22
hemos de estudiar la secuencia. 00:15:25
De tal manera que en la secuencia de los primers 00:15:28
no tengamos secuencias complementarias 00:15:31
intramoleculares o intermoleculares. 00:15:34
Es decir, 00:15:37
las secuencias complementarias intramoleculares 00:15:38
lo que provocan es que el propio cebador 00:15:42
forme una horquilla 00:15:47
y tenga secuencias complementarias, 00:15:49
forme una horquilla, 00:15:52
de tal manera que este primer que forma una horquilla 00:15:54
no está disponible para poder unirse a su secuencia diana. 00:15:58
Y por tanto, pierdo primers. 00:16:01
O que este primer con otro primer forward 00:16:04
tengan secuencias complementarias. 00:16:09
¿De acuerdo? 00:16:12
Esto sería una horquilla 00:16:13
que sería una secuencia complementaria intramolecular 00:16:17
dentro de la misma molécula 00:16:20
y estas de aquí son lo que llamamos los dímeros, 00:16:22
dímeros de primers 00:16:25
que pueden ser dímeros de un cebador consigo mismo 00:16:27
o con el otro cebador. 00:16:31
¿De acuerdo? 00:16:33
Forward y reverse 00:16:34
o forward y forward 00:16:36
o reverse y reverse. 00:16:37
En todas ellas, 00:16:39
si tengo secuencias complementarias intramoleculares 00:16:41
todo esto va a hacer que la PCR sea menos eficiente. 00:16:44
¿De acuerdo? 00:16:48
Y la última característica de los cebadores 00:16:50
es su temperatura de fusión. 00:16:53
Acordaos que ya vimos en el tema 4 00:16:54
que la temperatura de melting 00:16:57
o la temperatura de fusión 00:16:59
es específica, única, 00:17:00
muy específica, única 00:17:04
para cada híbrido que se forma. 00:17:06
Aquí se tiene que formar un híbrido, 00:17:08
un híbrido entre DNA molde y primer 00:17:10
de tal manera que 00:17:14
este híbrido y este otro híbrido, 00:17:16
cada uno de ellos 00:17:19
tiene una temperatura de melting diferente. 00:17:20
¿De acuerdo? 00:17:23
Ya veremos cómo se calcula la temperatura de melting 00:17:24
pero esa temperatura de melting 00:17:27
para que la reacción vaya bien 00:17:29
tiene que estar en torno a 52-65ºC 00:17:31
nunca por debajo de 50ºC 00:17:34
nunca por encima de 65ºC 00:17:36
¿De acuerdo? 00:17:38
Estando ahí en torno a 55-60ºC 00:17:39
más o menos la temperatura de melting 00:17:42
la reacción va a funcionar muy bien 00:17:44
y los dímeros, o sea los híbridos 00:17:46
primer, ADN, molde 00:17:49
se van a formar muy bien. 00:17:51
¿De acuerdo? 00:17:53
De esto de los diseños de cebadores 00:17:54
vamos a hacer una actividad 00:17:56
que os la subiré también a la plataforma 00:17:58
para que podáis hacerla durante estos días 00:18:00
que no tendremos clase presencial. 00:18:03
¿De acuerdo? 00:18:05
Muy bien. 00:18:07
En cuanto a las DNA polimerasas termoestables 00:18:09
ya hemos dicho que proceden todas ellas 00:18:12
de organismos que son extremófilos 00:18:15
viven en ambientes extremos 00:18:20
y en concreto las DNA polimerasas termoestables 00:18:23
proceden de arqueobacterias termófilas 00:18:26
es decir, que viven a temperaturas 00:18:31
que pueden rondar de los 50ºC a los 80ºC 00:18:33
¿De acuerdo? 00:18:37
¿Qué características tienen 00:18:39
estas polimerasas termoestables 00:18:41
respecto a las DNA polimerasas 00:18:43
por ejemplo de nuestras células eucariotas? 00:18:45
Pues la primera de ellas es que 00:18:48
realizan su actividad polimerasa 00:18:50
a una temperatura óptima 00:18:52
y la temperatura óptima 00:18:54
aproximadamente ronda los 70ºC 00:18:56
¿De acuerdo? 00:19:01
Es decir, para que esta DNA polimerasa termoestable 00:19:02
pueda amplificar un fragmento de DNA 00:19:06
y sintetizar una cadena de DNA 00:19:10
debe encontrarse a temperaturas 00:19:12
en torno a 70-75ºC 00:19:14
Normalmente suelen ser en una temperatura de 72ºC 00:19:18
Ya os podéis grabar esta temperatura 00:19:21
72ºC 00:19:24
Y en segundo lugar, la segunda diferencia 00:19:26
es que pueden mantener su actividad polimerasa 00:19:28
tras tiempos prolongados de incubación 00:19:31
a altas temperaturas 00:19:35
Es decir, mantienen su actividad polimerasa 00:19:37
hasta 40-45 minutos seguidos a 95ºC 00:19:41
Que es una burrada 00:19:47
95ºC 00:19:49
Daos cuenta que estamos rozando 00:19:50
la temperatura de ebullición del agua 00:19:52
Metemos un dedo y sacamos el hueso 00:19:54
¿Vale? Para que os hagáis una idea 00:19:56
Pues esta, cogemos una DNA polimerasa termoestable 00:19:58
la metemos a 95ºC 00:20:01
y aguanta sin desnaturalizarse 00:20:03
tres cuartos de hora 00:20:05
En torno a 40-45 minutos 00:20:07
¿De acuerdo? 00:20:09
Esto es muy importante 00:20:11
porque ninguna otra DNA polimerasa 00:20:12
de células eucariotas por ejemplo 00:20:14
tiene ninguna de estas dos características 00:20:16
ni su temperatura óptima 72ºC 00:20:18
ni aguanta temperaturas de 95ºC 00:20:21
sin desnaturalizarse 00:20:24
¿De acuerdo? 00:20:26
Tenemos muchos tipos de DNA polimerasas termoestables 00:20:27
muchas 00:20:30
La clásica es la TAC polimerasa 00:20:31
que es la primera 00:20:33
¿De acuerdo? 00:20:34
Tiene actividad polimerasa, por supuesto 00:20:35
pero además tiene actividad exonucleasa 00:20:37
5'-3' 00:20:40
pero no tiene actividad correctora 00:20:42
¿Os acordáis de la actividad correctora? 00:20:44
Era la actividad exonucleasa 3'-5' 00:20:46
Sin embargo 00:20:49
después de descubrirse 00:20:50
y utilizarse la TAC polimerasa 00:20:53
se han ido descubriendo otras polimerasas 00:20:56
que además de la actividad polimerasa 00:20:58
y 5'-3' exonucleasa 00:21:00
tienen también actividad correctora 00:21:03
actividad exonucleasa 3'-5' 00:21:05
A estas muchas de las empresas 00:21:08
que comercializan estas polimerasas 00:21:11
las llaman gold 00:21:13
doradas 00:21:15
¿De acuerdo? 00:21:16
TAC polimerasa dorada 00:21:17
la TAC gold 00:21:19
¿De acuerdo? 00:21:20
¿Por qué? 00:21:21
Porque hacen que 00:21:22
no se cometan tantos errores 00:21:23
Es decir, acordaos que la polimerasa 00:21:25
puede equivocarse 00:21:27
y meter un nucleótido incorrecto 00:21:28
Si tiene esta actividad exonucleasa 00:21:31
ella misma es capaz de corregirla 00:21:33
¿De acuerdo? 00:21:35
Saca ese nucleótido erróneo 00:21:36
y mete el correcto 00:21:37
Y luego tenemos otras polimerasas 00:21:39
que son las que llamamos 00:21:41
transcriptasas inversas 00:21:42
Es decir, esas transcriptasas inversas 00:21:44
son DNA polimerasas 00:21:46
que tienen una característica 00:21:48
y es que no utilizan DNA molde 00:21:50
sino que utilizan RNA molde 00:21:53
Leen RNA y sintetizan DNA 00:21:56
¿De acuerdo? 00:21:59
Ya veremos para qué las utilizamos 00:22:00
Pero también se utilizan muchísimo 00:22:02
¿De acuerdo? 00:22:05
¿Cuál es el ciclo básico de una PCR? 00:22:08
Hemos dicho que la reacción de PCR 00:22:11
son una repetición secuencial 00:22:14
de ciclos de PCR 00:22:17
Se pueden hacer 25, 30, 35 00:22:19
e incluso 40 ciclos de PCR 00:22:22
¿De acuerdo? 00:22:25
En una reacción de PCR 00:22:26
¿En qué consiste uno de esos ciclos? 00:22:28
Uno de esos ciclos tiene tres fases 00:22:31
y esto es muy importante 00:22:33
Esto os lo voy a preguntar sí o sí 00:22:35
¿De acuerdo? 00:22:37
Así que apuntadlo 00:22:38
Un ciclo básico de la PCR 00:22:42
tiene tres fases 00:22:44
Partimos de un DNA molde 00:22:45
¿Os acordáis? 00:22:47
Además del DNA molde 00:22:48
ya veremos que tenemos que poner los primers 00:22:49
y además de los primers 00:22:52
tenemos que poner la DNA polimerasa 00:22:53
Cuando va a comenzar la PCR 00:22:56
la reacción de PCR 00:22:59
y va a empezar el primer ciclo 00:23:01
Este ciclo 00:23:03
igual que todos los ciclos sucesivos 00:23:04
pasa por tres fases 00:23:06
La primera fase es una fase de desnaturalización 00:23:07
Esta fase de desnaturalización 00:23:10
el único objetivo que tiene 00:23:12
es que del DNA molde 00:23:14
que es bicatenario 00:23:16
se rompan todos los puentes de hidrógeno 00:23:18
y obtener dos hebras monocatenarias 00:23:20
desnaturalización 00:23:23
Esta fase de desnaturalización 00:23:24
es siempre a la misma temperatura 00:23:27
que es a 95º 00:23:29
94º o 95ºC 00:23:30
Siempre 00:23:33
¿Cuánto tiempo la ponemos a 95º? 00:23:34
Depende 00:23:38
Depende 00:23:40
Si el DNA molde 00:23:41
es un DNA mitocondrial 00:23:43
que es circular y es pequeñito 00:23:45
tiene pocas pares de bases 00:23:47
la desnaturalización puede ser rápida 00:23:49
en unos cuantos segundos 00:23:51
Pero si estamos hablando 00:23:53
que el DNA molde 00:23:54
es un cromosoma entero 00:23:55
eucariota 00:23:57
que tiene miles y miles de pares de bases 00:23:58
el tiempo de desnaturalización 00:24:01
tiene que ser mayor 00:24:02
y puede llegar incluso a un minuto 00:24:03
Acordaos 00:24:06
Acordaos 00:24:08
que si utilizo 00:24:09
de tiempo de desnaturalización 00:24:10
un minuto 00:24:12
y hago 40 ciclos 00:24:13
la tag polimerasa 00:24:16
va a estar 40 minutos 00:24:18
a 95º 00:24:20
Acordaos que esto es muy importante 00:24:22
porque 00:24:24
40 o 45 minutos 00:24:26
es el máximo que aguanta a 95º 00:24:28
la tag polimerasa 00:24:31
la polimerasa termoestable 00:24:32
¿De acuerdo? 00:24:35
Por tanto, primera fase 00:24:36
fase de desnaturalización 00:24:37
a 95º 00:24:39
¿Cuánto tiempo? 00:24:41
Depende de la longitud 00:24:42
del DNA molde 00:24:44
A mayor longitud 00:24:46
mayor tiempo de desnaturalización 00:24:47
como es lógico 00:24:49
Segunda frase 00:24:51
La segunda fase 00:24:52
es la fase de hibridación de los cebadores 00:24:53
¿Hibridación de los cebadores? 00:24:56
Cada uno de los cebadores 00:24:58
hemos dicho que tiene 00:25:00
una temperatura de melting 00:25:01
el forward tiene una temperatura 00:25:03
de melting propia 00:25:05
el reverse tiene una temperatura 00:25:06
de melting propia 00:25:07
La temperatura de hibridación 00:25:09
hago un inciso 00:25:11
nadie dice hibridación de cebadores 00:25:13
sino que todo el mundo habla de 00:25:15
anilin de los primers 00:25:17
anilin 00:25:19
tenéis en la página 00:25:20
no sé cuántos del libro 00:25:21
cómo se escribe lo de anilin 00:25:23
¿De acuerdo? 00:25:25
Sí, me parece que está en la página 139 00:25:27
que la tengo aquí delante 00:25:29
¿De acuerdo? 00:25:30
El anilin de los primers 00:25:31
¿De acuerdo? 00:25:33
La temperatura de anilin 00:25:34
de los primers 00:25:36
es exclusiva 00:25:37
única e irrepetible 00:25:39
para esa pareja de primers 00:25:41
¿De acuerdo? 00:25:43
Imaginaos 00:25:45
que yo quiero hacer 00:25:46
dos reacciones de PCR diferentes 00:25:48
en dos tubos diferentes 00:25:50
en el primer tubo 00:25:52
meto el forward 1 00:25:54
y el reverse 1 00:25:56
y en el segundo tubo 00:25:58
meto el forward 1 00:26:00
y un reverse 2 00:26:02
diferente 00:26:04
¿De acuerdo? 00:26:06
Son dos parejas diferentes 00:26:08
reverse 1 00:26:10
forward 1 00:26:12
reverse 2 00:26:13
forward 1 00:26:14
La temperatura de anilin 00:26:15
o temperatura de hibridación 00:26:17
en cada uno 00:26:19
de los tubos es diferente 00:26:21
¿De acuerdo? 00:26:23
Por tanto 00:26:25
la desnaturalización 00:26:27
a 95 grados 00:26:29
la hibridación 00:26:31
el anilin de los primers 00:26:33
depende de 00:26:35
cada pareja de primers 00:26:37
y de la temperatura de melting 00:26:38
suele estar 00:26:40
y esto sí que es importante 00:26:41
suele estar en torno a 00:26:43
50-65 grados 00:26:45
la temperatura de anilin 00:26:47
nunca a los 65 grados 00:26:49
porque sería 00:26:51
muy difícil que hiciese la hibridación 00:26:53
y tampoco por debajo de 00:26:55
50 grados 00:26:57
y esto es muy importante 00:26:59
cuanto mayor sea 00:27:01
la temperatura de anilin 00:27:03
es decir, cuanto más se aproxime 00:27:05
a 60-62-65 grados 00:27:07
hacemos que la reacción 00:27:11
de PCR sea más específica 00:27:13
cuanto menos sea 00:27:15
la temperatura de anilin 00:27:17
cuanto más se acerque 00:27:19
a 55 grados 00:27:21
52, 50 grados 00:27:23
permitimos 00:27:25
que la reacción sea menos específica 00:27:27
¿Por qué? 00:27:29
Porque permitimos que estos primers 00:27:31
se puedan pegar 00:27:33
a lo largo de todo el DNA molde 00:27:35
en sitios de forma inespecífica 00:27:37
por tanto 00:27:39
la temperatura de anilin 00:27:41
la temperatura de anilin 00:27:43
es muy importante 00:27:45
y cuanto más cercana 00:27:47
cuanto más alta sea 00:27:49
mejor, cuanto más cercana 00:27:51
a 60-62-65 grados 00:27:53
mejor 00:27:55
porque hacemos que la reacción 00:27:57
sea más específica 00:27:59
y hacemos que a estos primers 00:28:01
les sea muy difícil 00:28:03
unirse a sitios de forma inespecífica 00:28:05
y solamente se unirán 00:28:07
donde se puedan unir de forma 00:28:09
fuerte 00:28:11
Muy bien, primer paso 00:28:13
de naturalización, segundo paso 00:28:15
el anilin, tercer paso 00:28:17
es lo que llamamos la fase de extensión 00:28:19
es decir 00:28:21
en esta fase de extensión vamos a 00:28:23
poner el tubo a la temperatura 00:28:25
óptima 00:28:27
de la DNA polimerasa 00:28:29
para que polimerice, si os acordáis 00:28:31
a 72 grados, entre 70 y 75 00:28:33
suele ser 72 grados 00:28:35
a esta temperatura 00:28:37
de 72 grados 00:28:39
la DNA polimerasa 00:28:41
va a extender 00:28:43
de ahí su nombre de extensión 00:28:45
va a ir añadiendo nucleótidos 00:28:47
de forma complementaria 00:28:49
¿hasta dónde? 00:28:51
hasta que se acabe la molécula 00:28:53
¿cuánto tiempo ponemos de extensión? 00:28:55
esto es muy importante 00:28:57
también 00:28:59
no viene en el libro, así es que 00:29:01
apuntadlo, hay una regla 00:29:03
clásica que dice que 00:29:05
tenemos que poner 00:29:07
de tiempo de extensión 00:29:09
10 segundos 00:29:11
10 segundos de extensión 00:29:13
por cada 100 pares de bases 00:29:15
que tenga que amplificar 00:29:17
la polimerasa 00:29:19
es decir, si quiero 00:29:21
amplificar un fragmento que tiene 00:29:23
200 pares de bases 00:29:25
tendré que poner 00:29:27
20 segundos 00:29:29
20 segundos de extensión 00:29:33
si quiero amplificar 00:29:35
un fragmento que tiene 00:29:37
850 pares 00:29:39
de bases 00:29:41
tendré que poner 85 segundos 00:29:43
de extensión, es decir 00:29:45
1 minuto y 25 segundos 00:29:47
¿se entiende? 00:29:49
por tanto, 10 segundos 00:29:51
de extensión 00:29:53
cada 100 pares de bases que tenga que amplificar 00:29:55
la polimerasa 00:29:57
por tanto, el ciclo básico 00:29:59
de una PCR consta 00:30:01
de tres fases 00:30:03
desnaturalización 00:30:05
anilin y extensión 00:30:07
cada una de estas fases 00:30:09
es a una temperatura diferente 00:30:11
la temperatura de anilin 00:30:15
correspondiente y 72 grados 00:30:17
si os dais cuenta 00:30:19
desnaturalización y extensión siempre son 00:30:21
a la misma temperatura 00:30:23
siempre son 00:30:25
a la misma temperatura 00:30:27
independientemente de si el fragmento es muy largo 00:30:29
el fragmento que queremos amplificar 00:30:31
es muy largo, es muy corto 00:30:33
95 grados, 72 grados 00:30:35
la temperatura de anilin es la que siempre varía 00:30:39
y ya hemos dicho que depende de que 00:30:41
pareja de primers 00:30:43
tenemos aquí 00:30:45
¿cuánto tiempo 00:30:47
tiene que estar 00:30:49
en la desnaturalización? 00:30:51
¿de qué depende? de la longitud del DNA molde 00:30:53
¿cuánto tiempo ponemos 00:30:55
de hibridación? 00:30:57
ya sabemos 00:30:59
se pone poquito tiempo 00:31:01
¿vale? de hibridación 00:31:03
suele estar en torno a 30-60 segundos 00:31:05
¿de acuerdo? 00:31:07
no mucho más, con 30 segundos 00:31:09
es suficiente, incluso con menos 00:31:11
y de extensión ya hemos dicho 00:31:13
que pondremos 10 segundos 00:31:15
de extensión por cada 100 pares 00:31:17
de bases ¿de acuerdo? 00:31:19
por tanto, queremos 00:31:21
hacer una PCR que tiene que tener 00:31:23
30 ciclos 00:31:25
¿de acuerdo? pues hará 30 ciclos 00:31:27
de desnaturaliza 00:31:29
hibrida, extiende 00:31:31
y de nuevo, desnaturaliza 00:31:33
hibrida, extiende 00:31:35
tercer ciclo, desnaturaliza, hibrida 00:31:37
extiende, cuarto ciclo 00:31:39
desnaturaliza, hibrida, extiende 00:31:41
¿se entiende como funciona? 00:31:43
así hasta los 00:31:45
25, 30, 35 ciclos 00:31:47
que dure la PCR 00:31:49
¿de acuerdo? 00:31:51
esto es muy importante 00:31:53
para realizar esta PCR 00:31:55
utilizamos un termociclador 00:31:57
si os acordáis, el termociclador 00:31:59
tiene un termobloque que está 00:32:01
hecho de un material 00:32:03
que por un proceso de impedancias 00:32:05
es capaz de cambiar 00:32:07
de 95 a 60 grados 00:32:09
a 72 grados 00:32:11
y vuelta 95, 60, 62 00:32:13
a 72 00:32:15
de forma tremendamente rápida 00:32:17
¿de acuerdo? 00:32:19
de tal manera que la PCR, los 30 ciclos 00:32:21
de PCR puede hacerlos fácilmente 00:32:23
en una hora y media, dos horas 00:32:25
¿de acuerdo? 00:32:27
vale, en cuanto a los productos 00:32:31
de amplificación 00:32:33
es lógico pensar 00:32:35
que después de cada uno de los ciclos 00:32:37
vamos a ir obteniendo 00:32:39
una serie de productos amplificados 00:32:41
es decir 00:32:43
teníamos este DNA molde 00:32:45
hemos hecho el primer ciclo 00:32:47
de PCR, hemos desnaturalizado 00:32:49
hemos hecho 00:32:51
el annealing de los primers 00:32:53
y ha extendido la polimerasa 00:32:55
cuando acabe 00:32:57
este primer ciclo 00:32:59
ya no tenemos solamente DNA molde 00:33:01
en el tubo, tenemos 00:33:03
estas nuevas cadenas también 00:33:05
que están formadas por una parte de primer 00:33:07
y la parte 00:33:09
extendida que ha hecho 00:33:11
la polimerasa 00:33:13
y la otra 00:33:15
¿de acuerdo? por tanto, a cada ciclo 00:33:17
vamos a ir obteniendo una serie 00:33:19
de productos de amplificación 00:33:21
de PCR 00:33:23
¿qué es lo más importante? 00:33:25
de esta parte del tema 00:33:27
de este apartado del libro 00:33:29
lo más importante es tener en cuenta 00:33:31
que hasta que no lleguemos al tercer ciclo 00:33:33
hasta que no lleguemos al tercer ciclo 00:33:37
no vamos a obtener 00:33:39
el fragmento que queremos amplificar 00:33:41
daos cuenta que 00:33:43
el fragmento que queremos amplificar 00:33:45
decimos que lo hemos conseguido 00:33:47
cuando tenemos 00:33:49
y vuelvo 00:33:51
a esta diapositiva 00:33:53
este fragmento que ha amplificado 00:33:55
esta cadena que ha amplificado 00:33:57
¿es la que nosotros 00:33:59
queremos? 00:34:01
no, ¿por qué no es la que nosotros 00:34:03
queremos? porque nosotros queremos 00:34:05
que esta cadena vaya desde aquí 00:34:07
hasta aquí 00:34:09
por tanto 00:34:11
toda esta parte de aquí, de esta primera 00:34:13
cadena, le sobra 00:34:15
igual toda esta parte de aquí, de esta cadena 00:34:17
le sobra, de tal manera que 00:34:19
no hemos obtenido 00:34:21
hemos amplificado dos cadenas 00:34:23
pero ninguna de ellas 00:34:25
desde el principio hasta el final 00:34:29
el fragmento que queremos amplificar 00:34:31
y además, segunda 00:34:33
característica 00:34:35
debe ser de doble cadena 00:34:37
por tanto, no vamos a obtener 00:34:39
el fragmento que queremos amplificar 00:34:41
desde el principio hasta el final 00:34:43
y siendo de doble cadena 00:34:45
hasta que nos lleguemos al tercer ciclo 00:34:47
esto, para los que no lo habéis 00:34:49
visto nunca, es un pelín complejo 00:34:51
tenéis un 00:34:53
dibujo, sí, esquemático 00:34:55
en la página 141 00:34:57
del libro, lo podéis mirar 00:34:59
yo os recomiendo que lo dibujéis 00:35:01
entonces 00:35:03
os dibujáis un DNA molde 00:35:05
y os dibujáis primer ciclo 00:35:07
una vez haya acabado el primer 00:35:09
ciclo, qué productos 00:35:11
de amplificación obtengo 00:35:13
segundo ciclo, partiendo de 00:35:17
los productos 00:35:19
amplificados que he obtenido 00:35:21
en el primer ciclo, a partir de ellos 00:35:23
qué otros productos 00:35:25
de amplificación obtengo 00:35:27
y en el tercer ciclo 00:35:29
y así en el cuarto, en el quinto, etc 00:35:31
con que lleguéis al tercero es más que 00:35:33
suficiente, yo no lo voy a 00:35:35
hacer y lo voy a intentar explicar para que 00:35:37
se vea bien, con un vídeo muy sencillito 00:35:39
este es el esquema que os 00:35:41
estoy diciendo, de acuerdo 00:35:43
os pintáis un DNA molde en 00:35:45
negro y luego utilizáis 00:35:47
rotuladores de colorcito, como lo tienen 00:35:49
aquí, si queréis 00:35:51
y una vez hayáis obtenido estos 00:35:53
productos después de acabar el primer 00:35:55
ciclo, podéis hacer 00:35:57
cuáles serían los productos después 00:35:59
de acabar el segundo ciclo 00:36:01
después de acabar el tercer ciclo 00:36:03
y ahí con eso es suficiente 00:36:05
si os dais cuenta 00:36:07
este es el fragmento, estos de aquí 00:36:09
abajo 00:36:11
son los que nosotros queremos 00:36:13
obtener desde el principio 00:36:15
desde el primer primer hasta el 00:36:17
final, desde el forward al reverse 00:36:19
y además de doble cadena 00:36:21
con este 00:36:23
vídeo yo creo que se va a entender 00:36:25
mucho mejor 00:36:27
os lo voy a ir explicando 00:36:29
nosotros tenemos 00:36:31
nuestro tubo, aquí lo han 00:36:33
puesto a 35 grados, estaría a temperatura 00:36:35
ambiente, dentro de nuestro tubo 00:36:37
hemos puesto los primers 00:36:39
hemos puesto 00:36:41
perdón 00:36:43
a ver 00:36:45
un segundito 00:36:51
a ver que tengo 00:36:59
un problema 00:37:01
automático 00:37:05
automático 00:37:07
automático 00:37:09
vamos a ver en el anterior 00:37:11
lo vamos a ir viendo 00:37:13
fijaros, tenemos en nuestro tubo 00:37:15
a 35 grados 00:37:17
podría estar a temperatura ambiente 00:37:19
tenemos todas las moléculas de DNA 00:37:21
molde 00:37:23
imaginaos que son 00:37:25
el cromosoma 1 00:37:27
o un DNA mitocondrial 00:37:29
da igual, son de doble cadena 00:37:31
de tal manera que 00:37:33
nos vamos a quedar con este ejemplo 00:37:35
con esta cadena, ejemplo 00:37:37
todas son iguales, ya veis que tienen 00:37:39
dos 00:37:41
son bicatenarias 00:37:43
una cadena la han pintado en azul 00:37:45
que sería esta de aquí, imaginaos 00:37:47
que es la 5'3' 00:37:49
y la otra es la fucsia 00:37:51
que sería 3'5' 00:37:53
y dentro de toda esta longitud 00:37:55
de esta 00:37:57
molécula de ácido nucleico 00:37:59
de DNA bicatenario tenemos 00:38:01
la secuencia target 00:38:03
el fragmento que queremos amplificar 00:38:05
aquí lo han representado en verde 00:38:07
¿de acuerdo? 00:38:09
a ver 00:38:11
un segundito 00:38:13
tenemos la 00:38:15
secuencia 00:38:17
target, ¿de acuerdo? 00:38:19
el fragmento que nosotros queremos amplificar 00:38:21
comienza el primer ciclo 00:38:23
uy, esto 00:38:25
es que 00:38:27
perdonad, pero es que es un poco 00:38:29
ahora 00:38:31
comienza el primer ciclo, ¿de acuerdo? 00:38:33
el primer ciclo ya sabemos, empieza 00:38:35
primera fase, fase de desnaturalización 00:38:37
ponemos el tubo 00:38:39
a 95º, se produce la 00:38:41
desnaturalización completa 00:38:43
¿de acuerdo? 00:38:45
una vez que ha desnaturalizado 00:38:47
temperatura de anilin 00:38:49
imaginaos que para estos primers 00:38:51
este sería el forward 00:38:53
y este sería el reverse, el forward es el 00:38:55
que va al principio de la secuencia 00:38:57
que quiero amplificar, el reverse 00:38:59
como ya hemos dicho es el que va al final 00:39:01
imaginaos que para esta pareja de primers 00:39:05
su temperatura de anilin son 60º 00:39:07
¿de acuerdo? pues 00:39:09
ponemos la reacción a 60º 00:39:11
¿de acuerdo? de tal manera que 00:39:13
favorecemos que se produzca 00:39:15
el anilin, ¿de acuerdo? 00:39:17
cada uno de los primers se une específicamente 00:39:19
al extremo 3' 00:39:21
de su DNA molde, o sea, este de aquí 00:39:23
no se puede unir aquí, sino que se une ahí 00:39:25
y ahora 00:39:27
la pondremos a 72º para 00:39:29
que la TAC polimerasa 00:39:31
en este caso es una TAC polimerasa, pueda 00:39:33
coger los nucleótidos 00:39:35
que se encuentran aquí libres y pueda 00:39:37
amplificar, ¿de acuerdo? 00:39:39
va amplificando, va amplificando 00:39:41
¿hasta dónde amplifica? 00:39:43
hasta que se 00:39:45
acabe el DNA molde, ¿de acuerdo? 00:39:47
o también podría ser 00:39:49
hasta que se acabe el DNA molde 00:39:51
o hasta que acabe el tiempo 00:39:53
acordaos que de extensión 00:39:55
pues imaginaos que le vamos a dar 00:39:57
30 segundos 00:39:59
de extensión 00:40:01
pues si en esos 30 segundos 00:40:03
de extensión ha empezado la polimerasa 00:40:05
acaba el fragmento y se queda aquí 00:40:07
este fragmento 00:40:09
quedaría amplificado hasta aquí, ¿de acuerdo? 00:40:11
muy bien, y acaba 00:40:15
de tal manera que al final 00:40:17
del primer ciclo tenemos 00:40:21
estos productos de 00:40:23
amplificación que aquí 00:40:25
os los ponen esquematizados 00:40:27
¿de acuerdo? tendríamos 00:40:29
perdón, tiro un poquito para atrás 00:40:31
¿de acuerdo? 00:40:33
tenemos 00:40:35
esta hebra y esta hebra 00:40:37
si os acordáis son las originales 00:40:39
y estas dos hebras que son de 00:40:41
nueva síntesis, tenemos 00:40:43
el reverse, a partir del reverse 00:40:45
se ha sintetizado esta cadena 00:40:47
y a partir del forward se ha sintetizado 00:40:49
esta cadena por la polimerasa 00:40:51
¿de acuerdo? estos son los productos 00:40:53
de amplificación y ahora comienza 00:40:55
el segundo ciclo 00:40:57
cuando comienza el segundo ciclo empezamos de nuevo 00:40:59
fase de desnaturalización 00:41:01
a 95 grados 00:41:03
para que se 00:41:05
desnaturalice, ¿de acuerdo? 00:41:07
60 grados, temperatura de anilin 00:41:09
para que los primers nuevamente 00:41:11
se puedan unir, daos cuenta 00:41:13
que ahora los primers 00:41:15
no solamente se van a unir 00:41:17
a las hebras 00:41:19
molde del principio 00:41:21
sino que también se van a unir 00:41:23
a las hebras 00:41:25
de nueva síntesis del primer 00:41:27
ciclo, ¿de acuerdo? entonces los primers 00:41:29
van a hibridar siempre en 00:41:31
aquellas secuencias que sean específicas 00:41:33
independientemente de si son 00:41:35
las de partida o si son las de 00:41:37
nueva síntesis, temperatura 00:41:39
de anilin, 60 grados, se ha producido 00:41:41
el anilin, la hibridación 00:41:43
y empezará a 72 grados 00:41:45
la extensión y se van a extender 00:41:47
todas ellas, en este caso 00:41:49
¿hasta dónde se van a extender? 00:41:51
pues la polimerasa va a ir extendiendo 00:41:53
hasta el final de la cadena 00:41:55
igualmente, si os dais cuenta 00:41:57
tenemos 00:42:01
ahora cuatro cadenas 00:42:03
que tienen fragmentos bicatenarios 00:42:05
y fragmentos monocatenarios 00:42:07
si os dais cuenta 00:42:09
y cada una respecto de las otras son 00:42:11
completamente diferentes 00:42:13
ahora yo os pregunto 00:42:15
¿alguna de estas moléculas 00:42:17
ya la secuencia target? 00:42:21
¿es el fragmento que yo quería amplificar? 00:42:23
¿por qué? porque a esta 00:42:27
estas dos, que son las que más se aproximan 00:42:29
a las que más se parecen 00:42:31
les cuelga aquí una cola 00:42:33
todavía una cola 00:42:35
monocatenaria 00:42:37
de tal manera que, aunque ya contengo 00:42:39
desde el principio hasta el final 00:42:41
el fragmento que yo quiero, esta cola 00:42:43
me molesta 00:42:45
por tanto, esta molécula y esta molécula 00:42:47
no son el fragmento que yo quiero 00:42:49
amplificar 00:42:51
¿de acuerdo? 00:42:53
llegamos 00:42:55
al final del segundo ciclo 00:42:57
comienza el tercer 00:42:59
ciclo, aunque se ve un pelín pixelado 00:43:01
¿de acuerdo? 00:43:03
hemos puesto a 95 grados 00:43:05
y todas ellas se han vuelto 00:43:07
a desnaturalizar 00:43:09
temperatura de anilin, nuevamente 00:43:11
los primers se van a unir a todas 00:43:13
ellas en las secuencias específicas 00:43:15
y ahora a 72 grados 00:43:17
¿de acuerdo? 00:43:19
vuelven a amplificar ¿hasta dónde? 00:43:21
nuevamente, hasta que acaba la molécula 00:43:23
pero si os dais cuenta 00:43:25
de todos estos 00:43:27
productos 00:43:29
¿de acuerdo? 00:43:31
hay dos 00:43:33
que ahora sí 00:43:35
estos dos fragmentos, sí que son 00:43:37
el fragmento que yo quería amplificar 00:43:39
desde el principio hasta el final 00:43:41
y de doble cadena 00:43:43
forward, reverse 00:43:45
y doble cadena 00:43:47
¿de acuerdo? entonces, hasta el tercer 00:43:49
ciclo de la PCR, no obtengo 00:43:51
los primeros fragmentos 00:43:53
amplificados 00:43:55
específicos, porque todos 00:43:57
estos de aquí, yo no los quiero 00:43:59
he servido para llegar aquí, pero ahora no los quiero 00:44:01
¿de acuerdo? 00:44:03
al final del tercer ciclo, por tanto 00:44:17
esto es lo que obtenemos, empezaría 00:44:19
el cuarto ciclo y volvemos 00:44:21
nuevamente, desnaturalización 00:44:23
¿de acuerdo? 00:44:27
aniline 00:44:29
se han unido los primers 00:44:31
72 grados, vuelven a amplificar 00:44:33
de tal manera que ahora 00:44:35
¿de acuerdo? 00:44:37
fijaos que poquitas 00:44:39
8, si os dais cuenta antes eran 00:44:41
4 y 2 00:44:43
y ahora ya en el cuarto ciclo tenemos 00:44:45
8 y 8 00:44:47
8 moléculas 00:44:49
largas y 8 moléculas 00:44:51
que son el fragmento que yo quería amplificar 00:44:53
acaba el cuarto ciclo 00:44:55
y comenzará el quinto ciclo 00:44:57
¿de acuerdo? 00:44:59
nuevamente 95 grados 00:45:01
todos ellos desnaturalizan 00:45:03
60 grados, que es la temperatura 00:45:05
de aniline específica 00:45:07
y brindan los primers 00:45:09
72 grados, amplifican 00:45:11
¿de acuerdo? amplificación 00:45:13
extensión, de tal manera 00:45:15
que al final del quinto ciclo 00:45:17
si os dais cuenta, ahora voy a tener 00:45:19
10 y 22 00:45:21
y así sucesivamente 00:45:23
a cada ciclo que va pasando 00:45:25
voy obteniendo 00:45:27
van creciendo 00:45:29
de forma exponencial 00:45:31
daos cuenta 00:45:33
de forma exponencial 00:45:35
y esto es así 00:45:37
obtendré 60 moléculas después de 00:45:39
30 ciclos, 60 moléculas 00:45:41
de las largas y 00:45:43
más de mil millones 00:45:45
de copias de la 00:45:47
molécula que yo quería 00:45:49
obtener 00:45:51
espero que con este vídeo 00:45:53
lo podéis repasar, lo podéis poner todas las veces 00:45:55
que queráis 00:45:57
y haciendo el ejercicio que os he dicho 00:45:59
de dibujarlo 00:46:01
también, por lo menos hasta el 00:46:03
tercer, cuarto ciclo 00:46:05
espero que se entienda bien 00:46:07
todos 00:46:09
los ciclos de amplificación 00:46:11
y cuál es la dinámica de amplificación 00:46:13
en las reacciones de PCR 00:46:15
¿de acuerdo? aún así 00:46:17
os he puesto aquí también este segundo 00:46:19
vídeo que os lo voy a poner también 00:46:21
en el que se ve 00:46:23
os lo subiré a la plataforma 00:46:25
y lo podéis ver también todas las veces que queráis 00:46:27
¿de acuerdo? 00:46:29
con esto acabaríamos 00:46:31
estos dos primeros puntos 00:46:33
del 00:46:35
tema 6 00:46:37
de las técnicas 00:46:39
de PCR y de las bases teóricas 00:46:41
de la PCR 00:46:43
como actividad 00:46:45
como actividad 00:46:47
vais a hacer una actividad de diseño de primers 00:46:50
os la voy a explicar 00:46:52
más en concreto os la voy a subir 00:46:54
y os la voy a explicar en la plataforma 00:46:56
qué es lo que tenéis que hacer pero 00:46:58
para que os hagáis una idea 00:47:00
yo os he puesto aquí la secuencia de un gen 00:47:02
en este caso es del mensajero 00:47:04
¿de acuerdo? 00:47:06
no es la secuencia 00:47:08
es de un gen que es el GPX1 00:47:10
la glutatón peroxidasa 1 00:47:12
porque hay varias 00:47:14
de ellas 00:47:16
pero en este caso 00:47:18
no es el gen completo 00:47:20
sino que es la secuencia del mensajero 00:47:22
es decir aquí tenemos pegado 00:47:24
uno detrás de otro la secuencia 00:47:26
de todos 00:47:28
los exones del gen 00:47:30
¿de acuerdo? 00:47:32
de tal manera que a partir 00:47:34
de esta secuencia tenemos que diseñar 00:47:36
unos primers que sean 00:47:38
específicos por tanto 00:47:40
únicos 00:47:42
un forward y un reverse 00:47:44
con una serie de características 00:47:46
que yo os voy a dar pues una longitud determinada 00:47:48
que tengan una temperatura 00:47:50
de melting determinada 00:47:52
que tengan una temperatura de annealing 00:47:54
determinada que la amplicón 00:47:56
sea de 00:47:58
es decir la longitud del fragmento 00:48:00
que queremos amplificar sea de tanto etc. 00:48:02
Ya os digo 00:48:04
que no hay una única pareja 00:48:06
de primers específicos sino que hay 00:48:08
un montón de parejas 00:48:10
es decir que cada uno 00:48:12
puede obtener una pareja de primers 00:48:14
completamente diferente 00:48:16
y es posible ¿de acuerdo? 00:48:18
con las características que yo os voy a pedir 00:48:20
¿de acuerdo? 00:48:22
Idioma/s:
es
Autor/es:
Pedro Melgar-Rojas
Subido por:
Pedro M.
Licencia:
Reconocimiento - No comercial - Sin obra derivada
Visualizaciones:
36
Fecha:
1 de diciembre de 2023 - 10:14
Visibilidad:
Clave
Centro:
IES BENJAMIN RUA
Duración:
48′ 23″
Relación de aspecto:
1.78:1
Resolución:
1280x720 píxeles
Tamaño:
81.02 MBytes

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