UT4 - Técnicas de PCR - 1ª Parte - Contenido educativo
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Bien, vamos a comenzar la unidad de trabajo 6, el tema 6, sobre las técnicas de PCR.
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Es uno de los tres grandes temas, quizá de los más complejos de todo el curso de Biología Molecular.
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El tema 6, el tema 7 y el tema 8 son los más difíciles.
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Entonces, con este primer tema vamos a ir despacio.
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Vamos a hacer bastantes actividades para que puedan quedar más o menos claras
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por lo menos las ideas clave de cada uno de los temas.
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Lo primero vamos a ver qué es esto de la reacción en cadena de la polimerasa, la PCR.
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Los que venís de bachillerato y habéis hecho Biología, algo os debe sonar.
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Desde hace bastantes meses, desde que empezó la pandemia, esta palabra de PCR se oye continuamente
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porque una de las aplicaciones que tiene la PCR es con fines diagnósticos.
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Entonces veremos en un segundo apartado las bases teóricas de la PCR,
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es decir, la PCR para que pueda funcionar y funcione bien.
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Teóricamente, cuáles son los cuatro puntos fundamentales que se necesitan tener siempre en cuenta.
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Por un lado los cebadores o los primers, las polimerasas termostables.
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Vamos a ver cómo es un ciclo básico de una PCR
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y cuáles son los productos de amplificación de una PCR o también los llamamos amplicones.
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Los productos de amplificación son amplicones.
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Entonces en esta primera clase veremos estos dos primeros puntos
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y dejaremos los tipos de PCR para las siguientes clases.
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La PCR estándar o convencional será la primera que veremos,
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que es la que más se utiliza de forma rutinaria en los laboratorios.
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No solamente de análisis clínico sino también de investigación
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e iremos viendo qué es una mezcla de reacción, cómo prepararla,
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cómo se preparan las muestras, cómo programamos un termociclador
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para poder realizar una PCR estándar y cómo podemos analizar los productos amplificados.
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Esta PCR estándar o convencional, si conseguimos los reactivos, la haremos en el laboratorio.
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Después veremos qué otras modalidades de PCR estándar podemos hacer.
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La PCR con inicio en caliente, para grandes fragmentos,
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qué tenemos que hacer para tener una PCR de alta fidelidad, etc.
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Además de esta PCR estándar o convencional hay otras técnicas de PCR que se utilizan también bastante,
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que es la PCR anidada o nested,
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la PCR múltiple y la PCR con transcripción inversa o RT-PCR.
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Y por último, en el último apartado veremos lo que llamamos PCR a tiempo real
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que se utiliza también muchísimo sobre todo cuando queremos amplificar y cuantificar
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la cantidad de amplicones y de DNA que teníamos de partida.
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Esta PCR a tiempo real no es tan rutinaria como la PCR convencional,
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puesto que los reactivos y el termociclador son caros.
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¿De acuerdo? Pues vamos a empezar.
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La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es una técnica de amplificación in vitro.
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Y esto es muy importante, es una técnica de amplificación de un DNA molde.
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De tal manera que de un DNA molde que puede proceder de un DNA cromosómico de una bacteria,
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de un cromosoma eucariota o de un cromosoma de una mitocondria,
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cualquier DNA molde, un fragmento de ese DNA molde lo vamos a poder amplificar.
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Amplificar significa que voy a hacer copias, copias de un fragmento pequeño dentro de ese DNA grande.
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Por tanto, es una técnica in vitro de amplificación de DNA que permite obtener millones de copias
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iguales a un fragmento concreto dentro de ese DNA molde.
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¿De acuerdo?
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¿Qué características tiene la PCR?
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Dos características fundamentales.
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Es tremendamente específica, tremendamente sensible.
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¿De acuerdo? Ya las podéis apuntar.
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Tremendamente específica y tremendamente sensible.
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¿Tremendamente sensible qué significa?
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Es una técnica que nos permite amplificar un fragmento concreto,
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aunque tengamos cantidades ínfimas de DNA molde.
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Cantidades pequeñísimas de DNA molde.
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Daos cuenta que se ha llegado a amplificar y a secuenciar el genoma completo del hombre de Neandertal
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a partir de muestras de DNA procedente de huesos fosilizados.
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Para que os hagáis una idea, la cantidad de DNA molde en esos huesos fosilizados es mínima
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y la calidad también debía ser pésima.
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Aún así, gracias a la técnica de PCR, como es muy sensible,
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se ha podido amplificar todo el DNA del genoma de Neandertal que ya está secuenciado.
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Por tanto, por un lado es muy sensible.
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Muy sensible significa que aunque tenga muy poquito DNA molde al principio,
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voy a ser capaz de amplificar el fragmento que quiero y es muy específica.
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Eso significa que aunque yo tenga un DNA cromosómico, un cromosoma completo eucariota,
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que tiene miles y miles y miles y miles de pares de bases,
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de todas esas miles y miles y miles de pares de bases,
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voy a ser capaz de amplificar única y exclusivamente, de forma específica, el fragmento que yo quiero.
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¿De acuerdo?
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Por tanto, la PCR es una técnica muy poderosa.
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Tremendamente sensible, tremendamente específica y por eso se utiliza muchísimo en los laboratorios.
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La PCR permite hacer un montón de cosas en los laboratorios. Muchísimas.
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Aquí en el libro os pone estas tres.
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Permite amplificar varios fragmentos distintos en una única reacción.
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Es decir, en una única reacción de PCR puedo amplificar dos o tres fragmentos diferentes.
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Y esto lo vamos a ver más adelante.
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Podemos amplificar fragmentos de RNA. Ojo, de RNA, no de DNA.
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Podemos cuantificar la concentración de una molécula de DNA concreta en una célula.
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Es decir, cuántas copias tiene esa célula, etcétera, etcétera.
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Pero bueno, esto es un botón de muestra.
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Las aplicaciones que tiene la PCR y lo que nos permite realizar en el laboratorio
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van muchísimo más allá de estas tres simples...
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de estos tres ítems que pone aquí en el libro.
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¿Qué ventajas tiene la PCR respecto a otras técnicas?
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Pues muchas.
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Por ejemplo, como técnica de amplificación, ya hemos dicho que la PCR
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nos permite amplificar un fragmento concreto y amplificar...
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acordaos que significa que de una copia puedo obtener mil millones de copias.
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Mil millones de copias, como ya veréis, se obtienen con 30 ciclos de PCR.
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¿De acuerdo? Eso es...
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Por eso decimos que la PCR es una técnica de amplificación.
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¿Hay otras técnicas de amplificación? Sí.
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Las técnicas de clonación.
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¿Cuál es la gran ventaja de la PCR respecto a las técnicas de clonación
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que veremos en el tema siguiente?
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Que la PCR es tremendamente más rápida.
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En dos horitas, tres horas, ya tienes la amplificación completa.
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¿Vale? Y estamos hablando de una PCR convencional.
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Mientras que en las técnicas de clonación necesitamos mínimo 24-48 horas.
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¿De acuerdo?
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Como técnica de detección, si queremos detectar una secuencia concreta,
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la PCR también nos sirve para detectar.
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¿Qué otras técnicas de detección de secuencias específicas tenemos?
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Las que ya habéis estudiado.
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En el tema 4, en el tema 5, que son las técnicas de hibridación.
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Respecto a las técnicas de hibridación,
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la PCR es muchísimo más específica que las técnicas de hibridación.
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Y además nos permite cuantificar.
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Cosa que las técnicas de detección por hibridación muchas veces es complicada la cuantificación.
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¿De acuerdo?
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Estas son las dos principales ventajas que tiene la técnica de PCR
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respecto a otras técnicas de biología molecular.
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Y en cuanto a ejemplos de aplicaciones, pues son ejemplos.
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Os han puesto unos cuantos en el libro.
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Hay muchísimos más.
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Actualmente se está utilizando mucho la PCR con fines diagnósticos.
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¿De acuerdo?
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Pero se pueden hacer estudios de mutagénesis.
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Es decir, con la PCR yo puedo introducir mutaciones.
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Concretas en una secuencia de DNA.
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Podemos hacer estudios de genotipado.
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Estudios filogenéticos.
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Es decir, de parentesco entre especies, etcétera, etcétera.
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Las aplicaciones son múltiples.
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Y cada día aparecen más aplicaciones.
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¿De acuerdo?
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Una cosa muy importante que tenemos que tener en cuenta
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en la reacción de la PCR
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es que su principal ventaja,
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que hemos dicho que es muy sensible y muy específica,
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es su principal inconveniente.
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¿Esto qué significa?
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Que el hecho de que sea tan sensible,
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tan, tan sensible,
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que ya hemos dicho que lo que significa es que
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aunque yo tenga una cantidad muy pequeña de un DNA de partida,
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voy a ser capaz de amplificarlo.
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Esta gran ventaja de ser una técnica muy sensible
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también es un inconveniente.
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¿Por qué?
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Porque si se me contamina la mezcla de la reacción
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con un DNA que no es el de mi paciente
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o no es el DNA el que yo quiero estudiar, por ejemplo,
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es DNA de unas células que se me han desescamado de la piel.
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Por tanto, es mi DNA, no es el DNA del paciente.
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Aunque tenga cantidades ínfimas de ese DNA contaminante,
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también se va a amplificar.
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¿Se entiende?
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Es decir, que esta sensibilidad,
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que es una gran ventaja de la técnica de la PCR,
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si no tenemos cuidado,
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puede ser un gran inconveniente siempre que haya contaminación.
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¿De acuerdo?
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Porque aunque la contaminación sea con una cantidad muy pequeña
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de DNA contaminante,
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también lo vamos a amplificar
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y también lo vamos a detectar.
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Y esta contaminación que era ínfima se va a amplificar también.
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¿De acuerdo?
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Esto es muy importante que lo tengamos siempre en cuenta.
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Ya veremos cómo hemos de trabajar
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para intentar minimizar la contaminación
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sin perder sensibilidad.
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¿De acuerdo?
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Voy.
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Vale.
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La PCR la diseñó Cari Meulis en 1883.
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Y esto es muy importante,
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porque en 1883 se conocían muchas cosas
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del DNA, de la replicación, de la transcripción,
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de cómo funcionaba todo el dogma central de la biología molecular,
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pero muchas cosas,
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daos cuenta que es prácticamente hace 40 años,
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hace 37 años,
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que se diseñó y publicó Meulis la técnica de PCR.
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Se conocían muchas cosas,
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pero hay muchas cosas que conocemos ahora
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que antes no las conocíamos.
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Entonces vamos a hacer un ejercicio
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de intentar meternos en la cabeza de Meulis
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y a Meulis, en realidad,
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el único objetivo que él tenía,
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Meulis estuvo estudiando la replicación del DNA
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y dijo, esto que las células,
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esta replicación del DNA
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que hemos estudiado nosotros en el tema 2
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el trimestre pasado,
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esta replicación que hacen las células en vivo,
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¿sería yo capaz de hacerlo in vitro, en un tubo?
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Es decir, si yo cogiese un tubo,
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le meto un DNA
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y meto todos los enzimas que utiliza
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la célula para replicar ese DNA,
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in vitro, en el tubo,
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¿sería capaz de reproducir la replicación del DNA?
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¿Ese DNA se podría replicar?
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Esta fue la hipótesis de partida de Meulis,
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él pensaba que sí, que se podría replicar,
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solamente tenía que dar
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con las condiciones idóneas,
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óptimas, para que se pudiese replicar en el tubo,
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in vitro.
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Y después de conseguirlo por primera vez,
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hizo un diseño repetitivo,
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es decir,
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la PCR se basa en un diseño repetitivo,
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es decir, repetir de forma secuencial,
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cíclica,
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una vez, un segundo ciclo,
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un tercer ciclo,
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ciclos de replicación del DNA.
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Por tanto, son repeticiones secuenciales
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de ciclos de replicación del DNA.
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Entonces, vamos a hacer un ejercicio
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que me parece que es
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muy saludable.
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Es decir, nosotros ya sabemos
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qué es lo que ocurre en la replicación en vivo.
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¿De acuerdo?
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Ya lo hemos estudiado en el tema 2.
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Entonces, vais a hacer aquí un ejercicio,
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una lista,
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los estudiantes que...
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los estudiantes que queréis aprender de verdad
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y que sois mínimamente inteligentes,
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le daréis al pause del vídeo,
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vais a hacer el ejercicio que os digo
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y luego ya lo corregimos.
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¿De acuerdo?
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Entonces, en vivo,
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lo que tendréis que hacer es
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os cogéis del tema 2
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y vais a poner aquí una lista
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de todos los elementos que son necesarios,
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toda la maquinaria celular necesaria,
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para que se pueda realizar
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la replicación del DNA en vivo,
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en la célula.
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¿Qué enzimas utilizamos?
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¿Y qué características y condiciones
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físico-químicas son necesarias
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para que el DNA replique dentro de la célula?
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Y una vez lo tengáis,
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vais a hacer el esfuerzo
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que hizo Mulis,
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de decir, esto es lo que yo sé
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que la célula necesita.
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De todo esto,
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¿qué es lo que yo tendría que poner in vitro
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en mi tubo,
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en mi tubo de ensayo,
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para que esa replicación
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se produzca in vitro?
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Pues ahora le dais al pause,
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hacéis este pequeño ejercicio
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y ahora lo corregimos.
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¿De acuerdo?
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- Idioma/s:
- Autor/es:
- Pedro Melgar-Rojas
- Subido por:
- Pedro M.
- Licencia:
- Reconocimiento - No comercial - Sin obra derivada
- Visualizaciones:
- 24
- Fecha:
- 1 de diciembre de 2023 - 9:53
- Visibilidad:
- Clave
- Centro:
- IES BENJAMIN RUA
- Duración:
- 15′ 26″
- Relación de aspecto:
- 1.78:1
- Resolución:
- 1280x720 píxeles
- Tamaño:
- 20.27 MBytes
