UT10 - Cultivos Celulares - 1ª Parte | Mediateca de EducaMadrid

Bien, vamos a comenzar la primera parte de la explicación del tema 10, 00:00:03

la unidad de trabajo 10 sobre cultivos celulares. 00:00:09

Una vez acabada toda la parte de biología molecular del curso, 00:00:12

vamos a comenzar un bloque de temas, tres temas, 00:00:16

el 10, el 11 y el 12, sobre cultivos celulares y citogenética. 00:00:20

En esta primera parte de esta unidad vamos a ver los dos primeros apartados, 00:00:25

lo que hace referencia a la introducción, en la cual veremos una serie de conceptos muy importantes 00:00:30

para poder entender bien cómo se pueden cultivar las células in vitro, 00:00:37

cuál es la biología de las células que son cultivadas in vitro. 00:00:44

En este primer apartado veremos además qué tipos de cultivos celulares podemos realizar en el laboratorio 00:00:48

y algunas de las aplicaciones más importantes que tienen los cultivos celulares, 00:00:54

sobre todo en el campo de la investigación, aunque últimamente también en el campo de la medicina regenerativa y la aplicación más clínica. 00:00:59

En el segundo apartado que veremos en esta primera parte de la unidad estudiaremos la biología de las células en cultivo, 00:01:09

es decir, cómo se comportan las células cuando son extraídas de su ambiente fisiológico y son cultivadas in vitro, 00:01:17

en condiciones estándares, con una serie de requerimientos muy específicos. 00:01:24

En concreto, estudiaremos la curva de crecimiento en general de cualquier tipo de célula que es crecida in vitro, 00:01:29

qué formas de crecimiento existen, realmente existen dos tipos de cultivos celulares según la forma de crecimiento, 00:01:38

fundamentalmente pueden ser en suspensión o en monocapa, como veremos. 00:01:48

y cómo se comportan las células que han sido extraídas de un órgano, que han sido puestas en cultivo después de, digamos, una serie de pases sucesivos, es decir, a lo largo del tiempo. 00:01:52

Dejaremos el resto de puntos, los factores que intervienen en el cultivo y los procedimientos propios, los procesos y procedimientos del laboratorio de cultivo celular, lo dejaremos para la segunda parte del tema 00:02:08

y una breve mención al tema de las contaminaciones. 00:02:21

Bien, comenzamos. 00:02:25

A modo de introducción, ya sabéis que cuando hablamos de cultivos celulares, 00:02:29

recordad que nos estamos refiriendo a cultivos de células eucariotas que proceden de organismos pluricelulares. 00:02:36

Hay otro tipo de cultivos, por ejemplo, cultivos de células prokaryotas, bacterias, 00:02:44

Y el cultivo de levaduras, que son células eucariotas del reino fungi, que al ser organismos unicelulares no se estudian dentro del capítulo de cultivos celulares, sino que se estudian como cultivos microbiológicos. 00:02:50

Bien, ¿qué tipos de células podemos estudiar y podemos cultivar in vitro? 00:03:07

Ahora, insisto, son células eucariotas que proceden de organismos pluricelulares. 00:03:14

Lo primero que tenemos que tener en cuenta es que todas las células que vamos a poder cultivar 00:03:21

y que proceden de un organismo pluricelular adulto proceden de una primera célula que es el cigoto. 00:03:26

Esta primera célula contiene una combinación de genes única y repetible 00:03:35

que hace que tenga una dinámica genética y de desarrollo muy característica. 00:03:39

Ya sabemos que a partir de esta célula se van a generar una serie de células por divisiones mitóticas, 00:03:45

pasando por diferentes estadios, en lo que llamamos el desarrollo embrionario temprano, 00:03:55

por el embrión de dos células, el embrión de cuatro células, 00:04:00

y así sucesivamente el embrión de 8 células, 16 células, etcétera, etcétera, ¿sí? 00:04:04

Todas estas células que se generan a partir del cigoto, como veis están dentro de la zona pelúcida, 00:04:12

que es una zona de protección, es una capa de protección, aunque cumple también otras funciones, 00:04:18

estas primeras células que proceden de las divisiones mitóticas son los blastómeros. 00:04:24

Los blastómeros son células madre, igual que el cigoto. 00:04:30

una serie de características 00:04:34

más adelante en el desarrollo a medida que va avanzando el desarrollo 00:04:38

primero tenemos dos blastómeros 4, 8, 16 00:04:41

esta estructura 00:04:45

en desarrollo embrionario es lo que llamamos 00:04:46

el estadio de embrión en estadio de mórula 00:04:49

parece una mora 00:04:52

dentro de la zona pelucida hay células 00:04:54

bastantes células 16, 32, 64 00:04:56

cada vez más pequeñitas 00:05:00

y a partir de un momento determinado 00:05:02

esta mórula se cavita, es decir, esta mórula se cavita y empieza a entrar un líquido para formar lo que llamamos el blastocele. 00:05:04

Esto es importante, diréis, ¿y por qué es importante esto que no lo estudiemos en cultivos celulares? 00:05:17

Porque en este momento, en esta etapa, la etapa del blastocisto es tremendamente crucial, 00:05:21

porque desde este momento se diferencian ya dos poblaciones celulares muy diferentes. 00:05:28

Entonces, si os dais cuenta, hay una serie de células que están en el exterior, que forman como una corteza, daos cuenta que esto sería como un balón que lo acabamos de cortar. Estas células son las células del trofoblasto. ¿Por qué son importantes estas células? 00:05:33

Porque a partir de todas estas células que están aquí alrededor se van a originar todos los tejidos extraembrionarios. Los tejidos extraembrionarios, por ejemplo, el corium, el amnios, el cordón umbilical, la placenta. 00:05:51

Y en el medio, si os dais cuenta, en el medio, os lo señalo aquí de este colorcito rosita, está lo que llamamos la masa celular interna. 00:06:05

Masa celular interna son células muy pequeñitas, células madre muy pequeñitas, muy juntas, que forman lo que llamamos el embrioblasto. 00:06:19

¿Por qué son importantes estas células del embrioblasto o de la masa celular interna? 00:06:27

Porque a partir de ellas se van a originar todos los tejidos intraembrionarios. 00:06:31

Todos los tipos celulares intraembrionarios se van a originar a partir de la masa celular interna. 00:06:38

Y esto incluye, por supuesto, las neuronas, hepatocitos, células hemáticas, por ejemplo, glóbulos rojos, fibras musculares, células de la mucosa, etc. 00:06:44

Toda esta diversidad de células, estamos hablando de más de 200 tipos diferentes de células diferenciadas, proceden, todas ellas, de la masa celular interna. 00:07:00

Ninguna de ellas procede del trofoblasto y esto es muy importante que lo tengamos en cuenta. 00:07:12

¿Por qué? Porque cuando ponemos aquí en la introducción tipos de células del organismo que podemos cultivar, 00:07:17

en realidad, como se puede ya deducir, hay dos grandes categorías de células que podemos cultivar. 00:07:25

cultivar. Un primer tipo de células que son propias del desarrollo embrionario, todas estas de aquí, 00:07:33

que son lo que llamamos las células madre. Y las células que están presentes en el adulto, que es 00:07:41

lo que llamamos las células diferenciadas. Las células madre son células indiferenciadas, no 00:07:48

pertenecen a ningún tejido, tienen una elevada potencialidad, es decir, a partir de cualquiera 00:07:55

de estas células vamos a poder generar cantidad de células diferenciadas muy diferentes ya veis 00:08:03

que estas células aunque todas tienen la misma carga genética morfológicamente solamente 00:08:10

morfológicamente son muy diferentes a una neurona de un glóbulo rojo entre otras cosas porque el 00:08:15

glóbulo rojo eritrocito no tiene núcleo por tanto las células madres son indiferenciadas tienen una 00:08:20

elevada potencialidad. Tienen capacidad de autorrenovación, de perpetuarse en el tiempo, 00:08:27

de manera que no se agotan ni siquiera en el adulto. Hay células madre residentes en tejido, 00:08:34

que son las células madre adultas. Y además muchas de ellas, sobre todo las adultas, 00:08:41

están en fase G0, están en reposo. Sin embargo, las células diferenciadas, 00:08:46

hablamos de células diferenciadas como aquellas células propias ya de un tejido, 00:08:51

pertenecen a un tejido y cumplen funciones específicas dentro de ese tejido. 00:08:55

En principio, cualquier tipo de célula, tanto células madre como células diferenciadas, 00:09:02

podemos ser capaces de cultivarlas in vitro en el laboratorio. 00:09:07

¿De acuerdo? 00:09:12

Bien. 00:09:13

Pero al hablar de cultivos celulares, en realidad no nos referimos solamente 00:09:15

al cultivo de células individuales, sino que hay diferentes tipos de cultivos celulares. 00:09:18

De manera que así, a nivel general, cuando hablamos de cultivo celular, nos referimos a un conjunto de procedimientos que hacen posible el mantenimiento de células de organismos pluricelulares, falta el apellido, organismos pluricelulares eucariotas, preservando al máximo todas sus características normales, bioquímicas, genéticas y fisiológicas. 00:09:24

Entonces, dentro de cultivos celulares diferenciamos tres grandes tipos de cultivos 00:09:50

Yendo de lo macro a lo micro, el primer tipo de cultivo que podemos realizar en el laboratorio es el cultivo de órganos 00:09:56

Es decir, podemos coger un órgano a partir de un animal de experimentación 00:10:06

Si fuesen células vegetales y tejidos vegetales, los métodos de cultivo son diferentes 00:10:10

Pues aquí no vamos a referir sobre todo organismos pluricelulares, pero animales. 00:10:17

Partiendo de un organismo pluricelular, un animal de experimentación, 00:10:23

podemos directamente cultivar un órgano completo. 00:10:30

Órgano completo, corazón, el riñón. 00:10:32

Esto se realiza mucho, por ejemplo, con órganos embrionarios. 00:10:35

¿De manera qué? ¿Qué es un cultivo de órganos? 00:10:38

¿De qué se trata? 00:10:42

Se trata de intentar mantener el órgano entero, como vemos aquí, 00:10:43

o una parte de él, en una interfase entre un medio de cultivo artificial, nutritivo 00:10:47

y una atmósfera controlada, es decir, un medio líquido y una atmósfera, un medio gaseoso. 00:10:56

Se utilizan este tipo de placas que tenemos aquí abajo, 00:11:04

en los cuales sobre un soporte que contiene medio de cultivo, 00:11:06

Depositamos el órgano y el órgano va a crecer durante unos días 00:11:13

Lo vamos a mantener vivo durante unos días en este cultivo 00:11:18

En la interfase que está entre el medio de cultivo que estaría por aquí abajo 00:11:21

Y toda la atmósfera gaseosa que tenemos encima 00:11:26

Este tipo de cultivos tiene muchos problemas, muchas desventajas 00:11:30

En algunos momentos nos puede convenir, incluso nos permite y nos da mucha información 00:11:36

porque contiene todos los tipos celulares de ese órgano 00:11:41

y podemos estudiar in vitro durante un tiempo limitado 00:11:45

primera característica de este tipo de cultivos 00:11:49

durante un tiempo limitado 00:11:52

una serie de características fisiológicas 00:11:53

una desventaja es que no se puede propagar 00:11:56

es decir, a partir de un órgano no vamos a obtener otro órgano 00:12:00

es decir, que son cultivos, digamos, únicos 00:12:03

Entonces, si yo quiero obtener los mismos resultados, 00:12:10

tengo que replicar el experimento completo con otro órgano diferente. 00:12:12

¿Crecen algunas células? 00:12:17

Pues se puede llegar a dar el crecimiento de algunas células, 00:12:19

pero las que son más indiferenciadas. 00:12:23

Las células que son como más plásticas y que tienen plasticidad dentro del organismo, 00:12:25

dentro del órgano adulto. 00:12:30

¿Para qué se utilizan este tipo de cultivos? 00:12:32

Para el estudio, por ejemplo, de interacciones y relaciones intercelulares. 00:12:34

intercelulares. Es decir, si es el corazón, oye, pues cómo interacciona el endocardio, 00:12:38

que son células endoteliales especializadas, con el miocardio, las células del músculo 00:12:43

del corazón. Si yo les pongo una droga, se acelera la contractilidad, se ralentiza, etcétera, 00:12:48

etcétera. Entonces, son realmente un tipo de cultivos, a ver, no es muy reproducible, 00:12:56

duran unos días in vitro 00:13:04

y da una serie de información 00:13:06

pero que no es 00:13:08

normalmente un pelín escaso 00:13:09

por ello 00:13:12

bueno, en esta otra diapositiva 00:13:14

os he puesto este esquema que se ve 00:13:19

un pelín mejor del tipo de placas que se utilizan 00:13:20

ya veis que lo que ponemos aquí es 00:13:23

tiene dos cámaras, una cámara alrededor 00:13:24

que es esta que estoy señalando 00:13:27

con un gris clarito 00:13:28

donde ponemos agua 00:13:30

agua miliq 00:13:31

sencillamente es una cámara de humedad 00:13:33

para que no se seque el órgano ni se seque todo el sistema. 00:13:35

Tenemos un segundo pocillo, que es este de gris oscuro, que aquí lo vemos, 00:13:40

que es el que está lleno de medio de cultivo. 00:13:44

El medio de cultivo estándar, que lo veremos después, es el de MEM. 00:13:46

Aquí tendríamos la interfaz líquida del medio de cultivo. 00:13:49

Y entonces tenemos un soporte, lo veis aquí, aquí tendríamos el soporte, 00:13:54

encima ponemos el tejido o el órgano. 00:13:59

Y por encima tendríamos la atmósfera gaseosa. 00:14:01

Todo esto de aquí sería la atmósfera gaseosa. Por tanto, el órgano se cultiva en la interfaz entre un medio líquido y un medio gaseoso. 00:14:04

¿Ventajas? Pues mira, se mantiene la estructura tridimensional completa, tal y como está en vivo. Es una ventaja importante. 00:14:15

Vamos a tener varios tipos de células ya diferenciadas, que interactúan entre ellas, pero como desventaja, como hemos dicho, es un crecimiento muy limitado, 00:14:24

no se puede propagar y tiene baja reproducibilidad. 00:14:31

Es decir, si yo quiero obtener el mismo resultado, 00:14:35

tengo que intentar reproducir las mismas condiciones exactas en un cultivo nuevo. 00:14:41

Y eso es muy complicado. 00:14:46

A partir del órgano, podemos establecer un segundo tipo de cultivo, 00:14:52

que es el cultivo de esplantes. 00:14:55

¿Qué es un esplante? 00:14:58

¿O en qué consiste el cultivo de esplantes? 00:15:00

El cultivo de planta no es ni más ni menos que adherir un fragmento de tejido a una superficie y ponerlo con un medio de cultivo. Es decir, yo puedo, como hemos visto antes, cultivar el órgano completo o, mediante un proceso de disección o microdisección del órgano en cuestión, separar el tejido que me interesa estudiar. 00:15:02

estudiar. ¿Entiende? Y este tejido, este explante, explante primario, lo voy a poner en una placa de 00:15:29

cultivo. Lo normal es que en la placa de cultivo yo ponga el explante y el explante, que lo pongo 00:15:36

aquí, se adhiere al fondo de la placa y lo que hago es recubrirlo por encima con medio de cultivo. 00:15:44

Por tanto, el esplante primario es un cultivo en el cual la interfase, vamos a tener el esplante en la interfase entre el sólido, el plástico, si es poliuretano, de la placa, en este caso del frasco, y el líquido, que es el medio de cultivo. 00:15:50

¿Qué ventajas tiene? Pues que aquí sí que va a haber adhesión al sustrato y sí que van a proliferar células. Hay células de este tejido que van a ir escapándose y van a empezar a migrar alrededor. ¿Cuáles? 00:16:08

Las células más periféricas pueden llegar a migrar y proliferar. Entonces estas células sí que crecen de nuevo in vitro y las puedo estudiar. 00:16:19

El cultivo de esplantes, el cultivo de esplantes se utiliza mucho, se utiliza mucho 00:16:31

Por ejemplo, os pongo dos ejemplos 00:16:39

Se pueden hacer cultivo de retina, retina embrionaria de embriones de ratón 00:16:42

Esto está sacado de una revisión científica en la cual vamos a coger en un estadio determinado de desarrollo 00:16:48

hacemos una microdisección importante 00:16:57

para poder hacer un cultivo de esplantes 00:17:00

siempre a partir del órgano completo 00:17:02

debo hacer una microdisección del tejido que quiero estudiar 00:17:05

aquí lo que han hecho es 00:17:08

retiran la lente, retiran el resto de estructuras 00:17:10

y se quedan con la retina 00:17:14

y es la retina la que van a poner en cultivo 00:17:15

durante unos días 00:17:18

¿qué pueden estudiar? 00:17:20

pues si lo tienen de 1 a 14 días 00:17:21

Pueden estudiar cómo se van desarrollando todas las células, tanto los fotorreceptores, conos y bastones, como todas las células nerviosas, las neuronas bipolares, etcétera, etcétera, todo este tipo de neuronas, cómo se van desarrollando, cómo se forman, cómo interactúan unas con otras. 00:17:26

simulando, entre comillas, cómo sería, cómo el proceso que ocurriría, 00:17:47

poder estudiar el proceso que ocurriría en vivo en el embrión, 00:17:53

poderlo estudiar in vitro durante 10-15 días. 00:17:57

El cultivo de esplantes para desarrollo embrionario se utiliza mucho. 00:18:01

Otro ejemplo que os pongo aquí son las rodajas de cerebro. 00:18:05

Este es un cerebro de rata, de roedor, yo creo que es rata, 00:18:09

aunque el de ratón es un pelín más pequeño, pero tiene la misma estructura, 00:18:12

Y lo que se hace realmente es una rodaja, una rodaja gruesa de 2-3 milímetros y esta rodaja gruesa se suele poner en una placa de cultivo para hacer estudios de electrofisiología. Es decir, ahora podemos coger unas micropipetas de vidrio tremendamente finas y podemos estudiar impulsos nerviosos, corrientes de calcio, corrientes de iones, por ejemplo, cuando pongo esta rodaja en presencia de una droga o de un neurotransmisor. 00:18:15

Y estudiar en vivo realmente qué es lo que está ocurriendo, cómo se transmite el impulso nervioso de neuronas a neuronas, en la corteza, en el hipocampo, en determinadas regiones. 00:18:43

Estos ejemplos no es el órgano entero. Lo que ponemos in vitro es un fragmento diseccionado, un tejido diseccionado del órgano. 00:18:54

Por tanto, ya hemos visto que podemos cultivar el órgano, tiene sus limitaciones, pudimos cultivar esplantes, pero lo normal es que del órgano, por medio de un proceso de disección, obtengamos un esplante y del esplante hagamos un cultivo de células. 00:19:05

¿Cómo? A partir o a través de un proceso de disgregación. Es decir, ya no me interesa cultivar el órgano completo, ni me interesa cultivar el esplante que contiene varios tipos de células, sino que lo que voy a intentar es disgregar todas sus células para poder obtener, cuando hablamos de disgregación, la disgregación es un proceso por el cual a partir de un tejido pluricelular con muchas células y muchos tipos de células diferenciadas, 00:19:29

vamos a obtener una suspensión celular. 00:20:00

Por tanto, la disgregación me va a permitir obtener una suspensión celular 00:20:03

en las cuales voy a tener todas las células de ese tejido, de ese esplante, 00:20:08

pero individualizadas. 00:20:13

Y son estas células individuales las que ahora voy a cultivar directamente en la placa. 00:20:17

A esto es a lo que llamamos cultivo de células. 00:20:24

Cultivos de células, en realidad tenemos dos tipos de cultivos. 00:20:27

Cultivos celulares. Esto es lo que sería propiamente cultivos celulares. Pero hablamos de cultivos de células porque cultivos celulares también es cultivo de órganos y de esplantes. Entonces, cultivos de células tenemos de dos tipos. Un cultivo histotípico y cultivo órgano típico. 00:20:31

¿Qué quiere decir un cultivo histotípico? El cultivo histotípico es aquel que procede de un tejido histotípico que después de un proceso de disección y de disgregación obtenemos una suspensión celular con todas las células diferenciadas del tejido y las ponemos in vitro y las dejamos que crezcan. 00:20:46

De tal manera que a lo largo del tiempo, a medida que va pasando el tiempo, las células más resistentes continúan proliferando. 00:21:07

De manera que al final, al cabo de una serie de semanas, lo que vamos a obtener es un cultivo de un único tipo de células. 00:21:17

¿Se entiende? 00:21:27

Por eso hablamos de cultivo histotípico. 00:21:29

¿Qué es un cultivo histotípico? 00:21:32

Un cultivo estotípico es un cultivo de células en el cual hemos obtenido un único tipo de células, normalmente las células más plásticas de ese tejido. 00:21:33

¿Cómo podemos realizar la disgregación? Esto ya lo hemos visto. Cuando vimos el tema de extracción y purificación de DNA, vimos cómo se pueden disgregar las células, pero principalmente se pueden disgregar por métodos mecánicos o por métodos enzimáticos, 00:21:43

utilizando proteasas, que vayan digiriendo la matriz extracelular y liberando las células. 00:21:59

Además del cultivo histotípico, actualmente hay otro tipo de cultivo de células que es el cultivo organotípico. 00:22:10

El cultivo organotípico ya no es un cultivo del órgano completo, ni es un cultivo desplante, 00:22:18

sino que es un cultivo artificial en el que artificialmente 00:22:25

vamos a juntar en la misma placa de cultivo 00:22:33

dos o tres tipos celulares diferenciados. 00:22:37

Por ejemplo, fibroblastos, neutrófilos y células endoteliales. 00:22:41

Todas ellas, estos dos, tres, cuatro tipos diferentes de células, 00:22:47

different cells, co-culture, es lo que llamamos co-cultivos, 00:22:51

con o sin un tipo de matriz de soporte, que ya la veremos más adelante, 00:22:55

las puedo cultivar, co-cultivar a la vez e intentar estudiar cómo interrelacionan entre ellas. 00:23:03

Este tipo de cultivo, que son cultivos de células individuales, por supuesto, 00:23:09

es un cultivo organotípico porque, entre comillas, intentamos simular la formación de un tejido in vitro 00:23:13

con diferentes tipos de células para que se puedan ordenar en el espacio como formando 00:23:22

una estructura pseudotisular. Por tanto, y en resumen, tipos de cultivos. Tenemos el cultivo 00:23:27

de órganos, el cultivo de esplantes y el cultivo de células individuales. Este cultivo de células 00:23:34

individuales puede ser histotípico cuando cultivo un tipo de células o un cultivo organotípico si 00:23:40

al ave, co-cultivo diferentes tipos de células y estudio como interacción. Muy bien, ¿qué es esto 00:23:46

del cultivo celular primario y secundario que vamos a ver ahora? Estamos dentro del tercer tipo, 00:24:01

estamos hablando del cultivo de células. Dentro del cultivo de células tenemos dos tipos, ya hemos 00:24:07

visto, el cultivo histotípico y el cultivo organotípico. Normalmente dentro del cultivo 00:24:14

histotípico, el cultivo histotípico puede ser un cultivo primario o un cultivo secundario. 00:24:21

¿Esto qué significa? Fijaos, volvemos a ver todo el procedimiento que hemos hecho desde 00:24:29

el principio. Desde el órgano anatómicamente, por ejemplo, imaginaos que hemos extraído 00:24:35

el corazón de un animal, del órgano, por un proceso de microdisección hemos obtenido 00:24:43

un tejido, un pedazo, un fragmento de tejido. Esto es lo que llamamos un explante primario. 00:24:50

Por un proceso de disgregación, en este caso es una disgregación mecánica, ya veis que 00:24:56

es un tubo en el cual tengo un émbolo, que es una pala, y lo que hago es meto aquí el 00:25:00

pedazo de tubo y le empiezo de forma mecánica el émbolo hacia arriba y hacia abajo, de 00:25:04

manera que como el espacio que queda aquí en medio es tan finito, se va a empezar a 00:25:09

romper la estructura del tejido y se van a librar las células. A través de, gracias 00:25:14

al proceso de diliración mecánica, obtenemos, que esto ya lo habíamos visto, células en 00:25:20

suspensión. Y estas células en suspensión, hemos dicho que las vamos a poner a cultivar. 00:25:24

Este cultivo de células, de células individuales, es un cultivo histotípico. Al principio no 00:25:32

es histotípico, porque es un cultivo que contiene muchos tipos de células que son 00:25:39

que venían del tejido. Pero este cultivo es lo que llamamos un cultivo primario. ¿Qué es un cultivo 00:25:43

primario? Es un cultivo de células que procede directamente o del órgano o de un esplante. Es 00:25:49

decir, estas células que yo tengo aquí en la placa, que acabo de poner y que acabo de plaquear, es la 00:25:58

primera vez que están in vitro. Antes estaban en el órgano o en el esplante o en el tejido o en el 00:26:05

animal. Como es la primera vez que están in vitro, estas células establecen un cultivo primario. Es 00:26:12

la primera vez que esas células están in vitro. Esas células yo las voy a mantener una serie de 00:26:20

tiempo, 24, 48, 72, 96 horas, depende, dejo que crezcan hasta que llenan la placa. Y una vez que 00:26:26

llenan la placa y ya no caben más, lo que tengo que hacer es despegarlas y hacer un subcultivo. 00:26:34

¿Qué es un subcultivo? Un subcultivo es el procedimiento por el cual voy a volver a coger estas células, despegarlas y ponerlas en una placa nueva. He hecho un subcultivo, también se llama pase, he hecho un pase de las células. He pasado las células de una placa a otra. 00:26:40

¿De acuerdo? La pregunta es, ahora, estas células que tengo aquí después del subcultivo, ¿estas células de dónde proceden directamente? ¿Proceden del órgano? 00:27:04

justo antes de estar en esta placa 00:27:17

donde estaba, ¿ya estaba en in vitro? 00:27:20

sí, por tanto 00:27:23

a partir de aquí 00:27:24

a partir de este momento 00:27:25

desde el primer pase 00:27:28

todo lo que viene 00:27:30

a partir de aquí 00:27:31

lo consideramos cultivo secundario 00:27:33

¿cuál es la diferencia 00:27:36

por tanto entre un cultivo primario y un cultivo secundario? 00:27:38

que las células 00:27:40

del cultivo secundario proceden 00:27:41

de un cultivo primario 00:27:43

Es decir, ya estaban in vitro, no es la primera vez que están in vitro. ¿De acuerdo? A partir de aquí, de este cultivo secundario, yo las puedo dejar crecer más tiempo, volver a hacer otro subcultivo y obtener otra placa. Seguimos siendo, sigue siendo un cultivo secundario porque estas nuevas células de esta nueva placa ya estaban también in vitro, no vienen del órgano directamente. 00:27:45

No se me explico, ¿se entiende? Por tanto, ¿qué es un cultivo primario? Es un cultivo que se obtiene directamente a partir de un esplante, de un órgano, por un proceso de disgregación tisular. 00:28:08

Estas células, ya hemos dicho y veremos más adelante, pueden crecer en monocapa, que son estas que digo que crecen pegaditas en el suelo o en suspensión, por ejemplo los linfocitos, los linfocitos crecen en suspensión. 00:28:25

¿Hasta cuándo proliferan? Hasta un estado que se llama confluencia 00:28:36

Lo veremos ahora después 00:28:41

¿Qué es la confluencia? Es el estado en el cual ya no caben más células 00:28:43

Como no caben más células, lo único que puedo hacer es un pase o un subcultivo 00:28:47

Las tengo que pasar a otra placa 00:28:52

En el momento en que este cultivo primario lo paso y hago un subcultivo 00:28:54

A partir de este momento ya hablamos de cultivos secundarios 00:28:59

Ya no existe el cultivo primario 00:29:03

Importante, si yo parto del órgano o directamente de un pedazo de tejido, de un esplante 00:29:05

y he obtenido estas células y las he puesto in vitro y he obtenido un cultivo primario 00:29:16

ya hemos dicho que en este cultivo primario lo normal es que haya dos o tres tipos de células que proceden del tejido 00:29:24

Con el tiempo, al cabo de dos, tres, cuatro pases 00:29:30

Yo sigo pasando las células 00:29:36

Llegará un momento en el que en la placa 00:29:37

Las células menos resistentes se habrán ido muriendo 00:29:40

Los tipos celulares menos resistentes se habrán ido muriendo 00:29:45

Y me quedarán en la placa uno o dos tipos como mucho 00:29:48

Y el cultivo, a partir más o menos del tercer, cuarto 00:29:52

El cultivo se estabiliza, se homogeneiza 00:29:56

Y así podemos obtener un cultivo realmente histotípico con un único tipo de células. ¿Se entiende? De acuerdo. Por tanto, a partir del cultivo primario, con el tiempo, vamos a establecer un cultivo secundario. 00:29:59

Bien, acordaos, el cultivo primario, cultivo celular primario, viene directamente del órgano o del desplante. Es la primera vez que esas células, esas células es la primera vez que están in vitro. Por eso hablamos de cultivo celular primario. 00:30:25

En cuanto empiezo a realizar pases, y los pongo en una placa, y luego en otra placa, y luego en otra placa, todo esto lo llamamos cultivo celular secundario, porque las células de estos cultivos ya estaban in vitro, no vienen directamente del esplante ni del oro. 00:30:41

Al cabo del tiempo, hemos dicho que el cultivo, tiro para atrás, se estabiliza. ¿Esto qué significa? Significa que acabo de obtener lo que llamamos una línea celular. ¿Qué es una línea celular? 00:30:58

Una línea celular es un cultivo celular secundario 00:31:13

Un cultivo celular secundario que está formado por un único tipo de células 00:31:19

Entonces no hablamos de cultivo celular, sino que ya hablamos de línea celular 00:31:24

Solo hay un linaje, y hay el nombre de línea celular 00:31:29

Solo hay un linaje, o como máximo dos muy parecidos 00:31:33

¿De acuerdo? 00:31:37

Por tanto, la línea celular se origina a partir de un cultivo primario. Esto es muy importante. A partir del cultivo primario, obtuvimos un cultivo secundario y con el tiempo hemos obtenido la línea celular. ¿Por qué es importante esto? Porque hay líneas celulares que yo las mantengo congeladas. 00:31:39

congeladas. Entonces hablamos de líneas celulares inmortalizadas que no proceden de un cultivo 00:31:57

primario, sino que proceden de un vial que estaba congelado. Normalmente estas son las 00:32:04

características de una línea celular. Se origina a partir de un cultivo primario, hay un predominio 00:32:10

de un tipo celular, a veces dos muy parecidos. La población celular suele ser uniforme y homogénea, 00:32:16

Es decir, normalmente fibroblastos, que crecen muy bien. 00:32:24

Tiene unas características conservadas. 00:32:28

Todas las células más o menos se comportan igual. 00:32:30

Y va aumentando el número de células. 00:32:33

Con cada pase que voy haciendo, voy teniendo más células. 00:32:37

De una placa obtengo dos, de esas dos, cuatro, de las cuatro, ocho, y así sucesivamente. 00:32:40

Entonces una línea celular normalmente se va produciendo un aumento paulativo del número de células. 00:32:45

hasta que llega un momento 00:32:52

y esto es muy importante 00:32:54

esta línea celular 00:32:55

que procede de un cultivo primario 00:32:57

la llamamos 00:33:00

línea celular primaria 00:33:02

¿qué significa primaria? 00:33:04

que procede de un cultivo celular 00:33:08

primario 00:33:11

por tanto viene directamente 00:33:13

del órgano, viene directamente 00:33:15

de un esplante 00:33:17

de un tejido, a partir de un proceso 00:33:18

de disgregación, etcétera 00:33:21

estas células 00:33:22

Línea celular primaria 00:33:24

Tiene una vida finita 00:33:26

Y esto es muy importante 00:33:27

No la voy a poder mantener in vivo 00:33:28

In vitro 00:33:30

No la voy a poder mantener mucho tiempo 00:33:31

Llega un momento 00:33:33

Que esas células entran en un proceso 00:33:35

Que llamamos senescencia 00:33:37

Importante 00:33:39

¿Qué es la senescencia? 00:33:40

Es el proceso de envejecimiento celular 00:33:41

Las células envejecen 00:33:45

Dejan de crecer 00:33:46

¿Qué puedo hacer 00:33:47

Para que esta línea celular 00:33:50

no entra en senescencia 00:33:52

y poderla mantener in vitro 00:33:56

de forma indefinida 00:33:57

puedo establecer lo que llamamos 00:34:00

una línea celular continua 00:34:03

se puede llamar línea celular continua 00:34:06

transformada o inmortal 00:34:09

veremos cómo lo conseguimos 00:34:15

pero estas células que vienen del órgano 00:34:17

Esta línea celular primaria yo la puedo inmortalizar, la puedo transformar en una línea celular continua. Esto es propio de las células tumorales. Las células tumorales crecen forever, in vitro también, y constituyen en sí mismas líneas celulares continuas, transformadas, inmortales. Son inmortales estas células. 00:34:20

A, por la contra, suelen tener un crecimiento aberrante, pueden ser malignas, genéticamente son inestables. 00:34:42

Las células tumorales normalmente acumulan muchas aberraciones cromosómicas, mutaciones y les da igual. 00:34:52

Pero para estudiar determinados tumores nos vienen muy bien este tipo de líneas celulares continuas o transformadas. 00:34:59

¿Cómo una línea celular primaria la puedo transformar en continua inmortalizada? 00:35:06

puede ser de forma espontánea 00:35:10

como hemos dicho 00:35:13

las células que vienen de una biopsia 00:35:14

tumoral 00:35:17

son líneas celulares 00:35:17

directamente continuas 00:35:20

de forma espontánea son inmortales 00:35:22

porque por eso son tumorales 00:35:24

pero yo artificialmente 00:35:27

como veremos después 00:35:29

puedo inducir la inmortalización 00:35:30

esto es muy importante 00:35:32

¿por qué? porque entonces a partir de una línea celular 00:35:34

primaria, si yo soy capaz 00:35:37

de inmortalizarla 00:35:38

si soy capaz de inmortalizarla 00:35:40

la puedo estudiar ya para siempre 00:35:42

una línea celular primaria 00:35:43

que no consigo inmortalizarla 00:35:47

podré trabajar con ella 00:35:49

relativamente poco tiempo 00:35:50

si yo quiero volver a trabajar con ellas 00:35:53

tengo que partir nuevamente 00:35:55

de un cultivo primario 00:35:57

estirpar el órgano 00:35:58

diseccionar el tejido 00:36:00

disgregar las células 00:36:01

y volver a establecer una línea celular primaria 00:36:02

¿se ve la diferencia? 00:36:05

por tanto una línea celular primaria 00:36:07

es una línea celular finita 00:36:09

que procede de un cultivo primario 00:36:11

que entra al final en senescencia 00:36:12

una línea celular 00:36:15

continua es una línea celular 00:36:17

inmortal 00:36:18

no deja de crecer in vitro nunca 00:36:19

y esto es porque 00:36:23

o bien de forma espontánea 00:36:24

esas células son inmortales 00:36:26

como el caso de las células tumorales 00:36:28

o bien porque yo he cogido una línea celular primaria 00:36:29

y por un proceso de inmortalización 00:36:33

las he transformado 00:36:35

esto lo veremos ahora 00:36:37

¿De acuerdo? Aquí os dejo el link de un vídeo que tenéis en el aula virtual de cómo se puede establecer un cultivo celular primario y una línea celular primaria del hipocampo, hipocampo de, me parece que es cerebro, del cerebro de ratón, me parece. 00:36:38

Es muy curioso cómo a partir del cerebro diseccionan el hipocampo, del hipocampo diseccionan las células y van explicando paso a paso cómo establecen una línea celular primaria. 00:36:56

¿De acuerdo? Bien. 00:37:09

Os pongo otro ejemplo. Aquí en imágenes se pueden obtener, por ejemplo, MEF, CEFS. 00:37:11

¿Qué son los CEFS? Son células que se utilizan mucho. Los CEFS son fibroblastos embrionarios de chicken. 00:37:17

de pollo. Partiendo de embriones de pollo, se hace una microdisección de una serie de tejidos 00:37:26

donde son muy ricos en fibroblastos, tejido conjuntivo, y a partir de ellos se hace una 00:37:33

disgregación mecánica y enzimática, se cuentan las células y al final en nuestra placa de cultivo 00:37:40

vamos a poner la suspensión celular. Vamos a cultivarlas, estas células, y a lo largo de 00:37:46

Varios pases pasan de ser un cultivo primario a establecerse un cultivo secundario, una línea celular primaria. 00:37:53

¿De acuerdo? 00:38:00

Esta línea celular primaria tiene una vida finita, pero nos permite estudiar muchas cosas. 00:38:01

Este es un ejemplo de una micrografía de crecimiento epitelial de un esplante. 00:38:06

¿De acuerdo? 00:38:12

Aquí hemos hecho un esplante primario de mucosa. 00:38:12

Habría que ver qué mucosa es. 00:38:15

Es mucosa bucal. 00:38:16

Suele ser intestinal, que es muy fácil y crece muy bien. 00:38:18

¿Veis? 00:38:21

Han puesto aquí el esplante, que sería esta parte de aquí, lo han dejado aproximadamente 10 días y después de 10 días ya veis todas las células que hay alrededor, que han crecido y que han ido migrando hacia la periferia. 00:38:21

Estas células, si yo ahora cojo y quito el esplante, estas células las puedo recoger y ponerlas in vitro y a partir de ellas también podría establecer una línea celular primaria. ¿De acuerdo? Muy bien. 00:38:36

¿Qué aplicaciones tienen los cultivos celulares? Pues como bien sabéis, aplicaciones de cultivos celulares es un único módulo, un único módulo del curso de especialización en cultivos celulares. Es decir, aplicaciones muy variopintas, tanto en investigación básica, acordaos, investigación básica es la investigación para poder entender los procesos, cómo funciona una célula, cómo funciona un gen, qué función cumple una proteína en la membrana, dónde estás, si está en el núcleo. 00:38:51

Para eso los cultivos celulares son muy útiles. Investigación aplicada, por ejemplo, screening de fármacos. Yo puedo tener células cardiomiocitos in vitro en este tipo de placas que tienen multipocillos y en cada uno de ellos puedo poner un fármaco o el mismo fármaco a diferentes dosis y hacer un estudio de toxicidad para intentar establecer qué dosis es tóxica y qué dosis no es tóxica o qué dosis produce un efecto que yo espero. 00:39:18

Eso sería una investigación aplicada porque busco una aplicación concreta. Y luego hay mil aplicaciones modernas en medicina regenerativa, en toxicología, en estudios de células madre, terapia celular, terapia génica, ingeniería de tejidos, pero básicamente lo dejo aquí. 00:39:48

solamente quiero que os pique un poquito la curiosidad 00:40:09

por el mundo de la ciencia y de la investigación 00:40:12

y si os animáis a hacer el curso de especialización en cultivos celulares 00:40:14

vais a disfrutar como chinos 00:40:18

eso lo aseguro 00:40:20

bien 00:40:21

después de esta introducción vamos a ver brevemente 00:40:23

cómo se comportan las células 00:40:27

cuando están fuera de su ambiente fisiológico 00:40:28

y las ponemos en una placa 00:40:31

por supuesto una placa de poliuretano, de cristal 00:40:34

ya veremos de muchos materiales 00:40:37

pero no es ni muchísimo menos su ambiente fisiológico. 00:40:38

Bien, lo primero que tenemos que tener en cuenta es que cualquier tipo de célula diferenciada, 00:40:42

hablamos ahora de células diferenciadas, células madre es otro mundo, 00:40:47

cualquier tipo de células diferenciadas, especialmente las epiteliales, 00:40:51

siguen la misma dinámica de crecimiento. 00:40:55

De tal manera que nosotros, a lo largo del tiempo, podemos ir contando el número de células, 00:40:58

concentración de células por mililitro, a lo largo del tiempo, días de cultivo 00:41:03

y establecer una curva de crecimiento. 00:41:08

¿Qué es la curva de crecimiento de un cultivo? 00:41:10

Pues es una gráfica, una representación gráfica de la dinámica, 00:41:12

de cómo crece ese cultivo, 00:41:16

en la cual vamos a representar cómo crece el número de células, 00:41:18

la concentración, la relación entre la concentración de células 00:41:23

y los días de cultivo a lo largo del tiempo. 00:41:26

Y como no podía ser de otra manera, 00:41:29

esta curva de crecimiento, igual que mil parámetros en el mundo de la biología, 00:41:32

sigue una dinámica sigmoidea. 00:41:36

Como toda dinámica sigmoidea que ya hemos estudiado, 00:41:39

tiene tres fases fundamentales. 00:41:43

En este caso, tenemos una primera fase, 00:41:45

que es la fase de latencia. 00:41:47

Si os dais cuenta, yo voy a partir, 00:41:49

¿esto qué significa? 00:41:52

A día cero, el día cero es el día en el que yo pongo 00:41:53

las células por primera vez en la placa. 00:41:56

Bien, si es un cultivo primario, 00:41:59

porque viene directamente de la deshidratación del tejido, 00:42:02

o bien porque viene de un subcultivo. 00:42:05

Da igual. 00:42:07

Esas células es la primera vez que están en esa placa. 00:42:09

Si os dais cuenta, en esta fase de latencia, 00:42:13

cuando hablamos de la PCR a tiempo real y de otros parámetros, 00:42:16

era una fase recta y luego empezaba a crecer. 00:42:19

Aquí no. 00:42:23

Aquí normalmente partimos de un número de células 00:42:24

y algunas de ellas se produce una disminución en el número de células. 00:42:26

Y esto es importante porque hay células que al principio se mueren. 00:42:30

Por tanto, en esta fase de latencia, ¿qué es lo que ocurre? En esta fase de latencia, digamos que es la fase en la que las células se están adaptando al nuevo ambiente, adaptando al nuevo medio de cultivo, adaptándose a la nueva placa, adaptándose a crecer, a crecer, digamos, entre comillas, in vitro. ¿Cuánto dura? Aproximadamente 24 horas. 00:42:33

Un día, aproximadamente 00:42:56

Sobre todo si son células que crecen en monocapa 00:42:59

Las células en suspensión, como veremos ahora 00:43:01

La fase de latencia es más corta 00:43:04

¿De qué depende la fase de latencia? 00:43:07

¿De qué depende? 00:43:11

¿Puede ser la fase de latencia más larga o más corta? 00:43:12

Sí, depende de diferentes factores 00:43:16

Algunos los veremos ahora 00:43:18

Por lo tanto, la fase de latencia es la fase de adaptación 00:43:19

El número de células suele disminuir un pelín hasta que llega un momento pasado a las 24 horas en el cual entramos en la fase exponencial. 00:43:24

¿Qué es la fase exponencial? La fase exponencial no es ni más ni menos que la fase de crecimiento activo. 00:43:33

Las células ya están a gusto, están creciendo a tope, el medio de cultivo que vamos a ver es súper nutritivo, 00:43:38

tienen todo lo que necesitan y además lo tienen sin limitación. 00:43:45

Tiene una atmósfera gaseosa, con dióxido de carbono, con oxígeno, todo lo que necesitan. En la fase exponencial se produce el crecimiento activo. Aproximadamente en 5, 6, 7 días, suele ser lo normal, depende del tipo de células, llegamos al tope máximo de crecimiento. 00:43:49

Y por tanto entramos en la tercera fase, que es la fase que llamamos estacionario. ¿Qué ocurre en la fase estacionaria? Bien, el crecimiento se ralentiza completamente hasta que llega un momento que ya se para. Las células no crecen más. Y esto es por dos motivos fundamentales. 00:44:10

Uno. Las células entran en fase estacionaria, uno, porque no caben más. Ya hay suficientes células. No caben más células, uno. Es lo que llamamos la inhibición por contacto en las células que crecen en monocapa o inhibición por densidad. Ya no caben más células. Por tanto, paran el crecimiento. La tasa de crecimiento baja prácticamente a cero. 00:44:26

Y el segundo motivo es porque se han agotado los reactivos del medio de cultivo, los nutrientes, de tal manera que se ha gastado la glucosa, los aminoácidos, todo lo que veremos en la composición del medio de cultivo y se han ido acumulando sustancias de desecho. 00:44:48

Las sustancias de desecho también ralentizan el crecimiento y la división celular. 00:45:06

Como veis aquí, antes de llegar a la fase de latencia 00:45:11

Antes de entrar en fase de latencia 00:45:16

Y que se pare el crecimiento de esas células 00:45:18

Tendríamos que realizar el subcultivo o el pase 00:45:21

Es muy importante 00:45:23

Todas las células, todas las células eucariotas de organismos pluricelulares 00:45:27

Siguen esta dinámica 00:45:31

Cada vez que yo cojo las células y las pongo en una placa 00:45:32

Hay una fase de latencia, de adaptación 00:45:36

Todas se tienen que volver a adaptar a esa placa 00:45:38

una fase exponencial y al final 00:45:40

si no hago el subcultivo 00:45:43

las células dejan de crecer 00:45:45

y entran en una fase estacional 00:45:47

¿entienden? 00:45:48

esta parte es muy importante 00:45:51

y claro que la voy a preguntar en el examen 00:45:53

bien 00:45:55

esto hay que adaptarlo 00:45:57

porque hay dos maneras 00:45:59

de cultivar las células, porque hay dos tipos de células 00:46:01

dos formas de realizar 00:46:03

los cultivos celulares dependiendo del tipo de célula 00:46:05

que cultivamos 00:46:07

Por un lado, el más abundante son las células que crecen en monocapa, son células endoteliales, son células epiteliales, son hepatocitos, son células que crecen, ¿qué quiere decir en monocapa? Crecen adheridas al sustrato, ¿sí? 00:46:08

Aquí tenemos el sustrato, que es el plástico. 00:46:24

Normalmente en el organismo están pegadas y ancladas a la matriz extracelular. 00:46:27

Son lo que llamamos células dependientes de anclaje. 00:46:32

Si estas células, yo las pongo en la placa, 00:46:36

y estas células no son capaces de anclarse al plástico, 00:46:39

como son células dependientes de anclaje, 00:46:43

sufren un proceso denominado anoiquis. 00:46:45

¿Qué es la anoiquis? 00:46:50

La anoiquis es un tipo de apoptosis de muerte celular programada que se produce por la falta de anclaje al sustrato. Eso es el anoiquis. 00:46:52

Entonces, cuando yo cojo las células y las pongo por primera vez en la placa, todas aquellas que son capaces de anclarse, aquellas células que son capaces de anclarse, empezarán a proliferar. 00:47:06

La célula que por cualquier circunstancia no es capaz de anclarse, sufrirá un proceso automático que está programado genéticamente de anoitis y esa célula morirá por apoptosis. 00:47:20

Las células en monocapa, si os dais cuenta, las etapas del desarrollo de un cultivo, de un crecimiento en monocapa tiene tres fases. 00:47:33

la fase de adhesión 00:47:42

esta fase de adhesión 00:47:44

de adhesión a la superficie 00:47:47

coincide con la fase de latencia 00:47:49

por supuesto 00:47:52

de la curva de crecimiento 00:47:52

pues en la fase de latencia 00:47:54

las células que crecen en monocapa 00:47:56

¿qué es lo que hacen durante la fase de latencia? 00:47:57

en la fase de latencia 00:48:00

hemos dicho que las células se adaptan 00:48:01

¿qué es eso de adaptarse? 00:48:04

en un cultivo en monocapa 00:48:06

significa que estas células 00:48:07

se van a adherir a la superficie 00:48:09

Es decir, la célula se va a ir depositando y va a ir decantando sobre el sustrato, en este caso es el plástico de la placa, que yo le puedo poner algún tipo de, por ejemplo, gelatina, algo que parezca la matriz extracelular, y la célula, esta fase de adhesión se lleva a cabo en tres etapas. 00:48:11

La primera etapa es el attachment, el anclaje. Lo primero que hace es decantar y anclarse. Ves que la célula está redondita. La segunda etapa es el self-spreading. La célula se empieza a extender y empieza a formar pequeñas uniones a través de una serie de prolongaciones de la membrana. 00:48:33

y empieza a formar pequeñas uniones, está tocando, es como cuando metemos el pie en la piscina 00:48:56

para ver si está muy hondo o poco hondo, metemos primero un pie, esto es lo que está haciendo. 00:49:02

¿Se pueden establecer aquí bien los contactos, la matriz extracelular o el plástico es adecuado? 00:49:09

Sí o no, esto ya veis que es un proceso reversible, puede ir para adelante y puede ir para atrás. 00:49:14

Si el sustrato es adecuado, entonces se lleva a cabo la tercera etapa que es la adhesión. 00:49:20

En la adhesión, ya veis que se forman múltiples puntos de adhesión, de adhesiones focales, focal adhesions en inglés, adhesiones focales. ¿Qué son las adhesiones focales? Son puntos concretos de la membrana de la célula a través de los cuales se va a anclar al sustrato. 00:49:25

Ya hemos dicho 00:49:46

La célula que no es capaz de llegar aquí 00:49:48

Se va a morir por Anoikis 00:49:50

Esto hay que tenerlo en cuenta 00:49:52

Hemos terminado la primera fase 00:49:55

La fase de latencia 00:49:58

Se ha llevado a cabo la adhesión a la superficie 00:49:59

Las células ya están adheridas 00:50:02

La célula 00:50:03

Comienza la fase exponencial 00:50:04

¿Qué es lo que ocurre? 00:50:07

La célula prolifera 00:50:09

Y forma colonias 00:50:10

Para que la célula pueda proliferar 00:50:12

y formar colonias, la célula se tiene que desaderir, desanclar parcialmente. Fijaos aquí 00:50:15

en esta imagen, estas células redonditas que os he puesto aquí en estos círculos, son células que 00:50:23

están dividiéndose. La morfología normal de estas células, que deben ser fibroblastos, es esta que 00:50:28

señala la flecha. Son células fusiformes con forma estrellada. Esa es su morfología normal. 00:50:34

Esta morfología es propia de las células que están completamente ancladas. Estas células que están completamente ancladas no pueden proliferar así. Para poder proliferar, como ya hemos dicho, puesto que este proceso de adhesión es reversible, la célula debe revertir el proceso de anclaje parcialmente. 00:50:41

De tal manera que la célula pasa de estar estirada, formando en este caso esta forma estrellada, fusiforme, bien aplanada, pasa de estar con esa morfología a tener una morfología más redondeada en la cual podríamos decir que la célula queda anclada únicamente por un pequeño tallo de anclaje en un punto concreto. 00:51:07

De esta manera, la célula, la morfología de la célula, vuelve a ser redondeada. Una vez acabada la mitosis, este proceso, como es reversible, la célula vuelve a hacer el cell spreading y nuevamente cell adhesion. 00:51:35

adhesión. Por tanto, durante toda la fase exponencial de proliferación y de formación 00:51:52

de colonias, la célula está haciendo continuamente el proceso reversible de célula adherida 00:52:01

a célula anclada. De célula anclada al cell spreading, la expansión, la extensión y 00:52:10

otra vez la adhesión. Si os dais cuenta, ¿por qué pone proliferación y formación 00:52:18

de colonias porque normalmente si os dais cuenta las células empiezan a proliferar y las células 00:52:23

hijas quedan cerca de la célula madre de tal manera que se empiezan a formar pequeñas colonias 00:52:29

pequeñas agrupaciones que son estas que os pongo aquí aquí tenemos una colonia aquí tendríamos 00:52:34

otra colonia aquí tendríamos otra colonia de células aquí tenemos otra colonia grande se está 00:52:40

formando otra colonia aquí, si os dais cuenta, de tal manera que se van formando pequeños núcleos 00:52:48

de células proliferativas. ¿Cuándo para? ¿Cuándo acaba la fase exponencial? Cuando la célula llega 00:52:54

a la fase de meseta, llega a la saturación, de tal manera que deja de crecer. Esa es la tercera etapa 00:53:02

del desarrollo de un cultivo en monocapa. ¿Por qué la célula deja de crecer? Decíamos antes en la 00:53:11

diapositiva anterior que la célula entra en fase estacionaria por dos motivos. Una, porque ya no 00:53:18

caben más y por tanto entra en confluencia y dos, porque se están agotando los reactivos, los 00:53:23

nutrientes y se están acumulando demasiadas sustancias de desecho. Esto es lo que ocurre 00:53:30

en la tercera etapa del desarrollo del crecimiento de células en monocapo. 00:53:36

Es lo que llamamos la inhibición por contacto. 00:53:43

¿Qué es la inhibición por contacto? 00:53:47

La inhibición por contacto es el proceso que sufren las células, 00:53:49

es el proceso fisiológico que sufren las células que crecen en monocapa in vitro, 00:53:53

por el cual cuando ya se ha cubierto completamente toda la superficie disponible, las células unas a otras se envían, aquí abajo tenemos una placa completamente confluente y ya inhibida por contacto, 00:53:59

Las células en este estado se envían señales inhibitorias unas a otras. Esta célula a esta célula y a esta célula y a esta célula. Unas células a otras se envían señales inhibitorias que detienen su proliferación. 00:54:20

Y las células entran en una fase, digamos, como quiescente, como de reposo. ¿De acuerdo? Mantienen su metabolismo a mínimos porque ya no caben más células. Por tanto, la inhibición por contacto es la responsable de que las células entren en confluencia. 00:54:40

Cuando hablamos de confluencia, cuando decimos que las células están confluentes, cuando han ocupado toda la superficie disponible de la placa del frasco de cultivo. ¿De acuerdo? ¿Se entiende? Bien. Aquí tenemos una pequeña animación que lo explica, aunque sea brevemente, que yo creo que se va a entender mejor. 00:54:59

Cuando se introduce un pequeño número de células normales en una placa de Petri, 00:55:31

empiezan a dividirse y a proliferar. A medida que las células entran en contacto con las otras 00:55:37

células, disminuye su tasa de división. Este comportamiento es una consecuencia del proceso 00:55:50

llamado inhibición por contacto. Cuando las células han llenado la superficie de la placa, 00:55:55

la tasa de división celular disminuye aún más y se equilibra con la tasa de muerte celular, 00:56:00

de manera que el número total de células permanece constante. A este estado se le llama 00:56:05

de confluencia. La inhibición por contacto asegura que las células generen una capa de una sola 00:56:10

célula de grosor, una monocapa. El comportamiento de las células cancerígenas es bastante diferente. 00:56:19

Si se siembra una célula cancerígena entre células normales, todas las células proliferarán 00:56:29

como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, cuando se llega a la confluencia, las células 00:56:33

normales regularán su crecimiento, mientras que las células cancerosas continuarán dividiéndose 00:56:38

de forma descontrolada, produciendo un grupo de células a menudo llamado foco. La inhibición por 00:56:44

contacto se puede demostrar in vitro quitando células de una monocapa en confluencia. En este 00:56:53

experimento, las células se eliminan raspando la monocapa con una aguja. Las células supervivientes 00:56:59

de los márgenes de la herida hacen dos cosas. Empiezan a proliferar más rápidamente, puesto 00:57:07

que ya no están completamente inhibidas por contacto y migran hacia el área vacía intentando 00:57:12

llenarla. ¿Se entiende? Por tanto, implícitamente ya nos ha dicho que las células normales que 00:57:19

crecen en monocapa sufren inhibición por contacto cuando llegan a confluencia. La inhibición por 00:57:42

contacto es el proceso por el cual unas células a otras se señalizan inhibitoriamente, negativamente 00:57:49

para que dejen de proliferar. 00:57:56

Las células tumorales, ya hemos dicho antes que todas las células tumorales 00:57:58

forman líneas celulares inmortalizadas, no sufren inhibición por contacto. 00:58:02

Y esta es una gran diferencia. 00:58:08

Son células que crecen, crecen, crecen y aunque lleguen a confluencia 00:58:10

siguen creciendo muchas veces formando pseudoestructuras tridimensionales 00:58:13

parecidas a las que se han visto aquí en el vídeo. 00:58:18

Pero estructuras pseudo tridimensionales que se les denominan focos, ¿de acuerdo? Independientemente de si son epiteliales, si son renales, pulmonares, da igual, ¿de acuerdo? 00:58:22

Bien, pero el crecimiento en monocapa es una forma de crecimiento in vitro de la gran mayoría de las células, pero hay otras células que tienen otra forma de crecimiento, que son aquellas células que crecen en suspensión. 00:58:38

Por ejemplo, las células hematológicas, los linfocitos, los neutrófilos que cultivamos in vitro, son células que crecen en suspensión. No se adhieren a ninguna superficie, ni a las paredes, ni al fondo de la placa. Crecen en suspensión. 00:59:02

Las etapas de las células de los cultivos en suspensión también se lleva a cabo el crecimiento en tres etapas 00:59:20

La primera es la adaptación al medio de cultivo 00:59:30

Adaptación al medio de cultivo coincide con la fase de latencia de crecimiento 00:59:33

Pero en este caso suele ser más rápida 00:59:37

¿Por qué? Porque no se tienen que adherir, no se tienen que anclar 00:59:40

Y muchas veces con 8 horas, 10, 12 horas como máximo es suficiente para que las células se adapten al nuevo medio de cultivo y al nuevo recipiente de cultivo. 00:59:44

La segunda fase, una vez ya están adaptadas, coincide con la fase exponencial y es la proliferación en suspensión. 00:59:59

Las células se dividen, se dividen en suspensión, de tal manera que a partir de un grupito de células que tenemos aquí, en este primer frasco, ya veremos que es un frasco de cultivo con aspas, rotatorio, de tal manera que estas aspas van girando continuamente, van girando para mantener un movimiento y un flujo continuo en el medio de cultivo. 01:00:05

es un movimiento suave que impide que las células se peguen unas con otras, ¿de acuerdo? 01:00:31

Daos cuenta que si estamos cultivando linfocitos, los linfocitos en el torrente sanguíneo están en continuo movimiento. 01:00:37

Entonces, este tipo de cultivos en suspensión intenta imitar estas condiciones de cultivo, 01:00:43

estas condiciones fisiológicas de movimiento, de flujo, ¿de acuerdo? 01:00:49

Hasta cuando crecen, hasta que no caben más, entre comillas. 01:00:55

Las células en suspensión no sufren inhibición por contacto, ¿de acuerdo? Ya que normalmente vamos a intentar evitar que contacten unas con otras. Sufren lo que llamamos un proceso de inhibición por densidad. Si os dais cuenta, aquí hay una gran diferencia entre estas células que fueron sembradas y estas células que llevan un tiempo creciendo, ¿de acuerdo? 01:00:59

Entonces, ¿qué es la inhibición por densidad? Es un proceso parecido a la inhibición por contacto. Cuando hay una densidad, cuando se alcanza un umbral de densidad máximo, a partir de ese momento, unas células a otras empiezan a señalizarse de forma negativa para parar el crecimiento y dejan de crecer. 01:01:22

¿de acuerdo? 01:01:42

entonces tendríamos así la fase de latencia 01:01:44

la fase exponencial y aquí llegaríamos a la fase transita 01:01:46

importante 01:01:48

importante 01:01:50

tiro para atrás 01:01:51

tanto en el crecimiento 01:01:54

en monocapa 01:01:57

como en el crecimiento en suspensión 01:01:57

hemos de intentar pasar las células 01:02:00

antes de que lleguen a confluencia 01:02:03

o a la densidad máxima 01:02:04

hay que intentar evitar 01:02:07

que atraviesen 01:02:08

y entren en la fase estacionaria. 01:02:10

Entrar en la fase estacionaria significa que van a poner en reposo 01:02:14

todo su metabolismo y luego reactivarla es mucho más complicado. 01:02:17

Por eso siempre vamos a intentar pasar las células 01:02:22

y cambiarlas a otra placa nueva 01:02:25

cuando estén aproximadamente al 80% de confluencia 01:02:27

o al 80% de la densidad máxima. 01:02:32

¿De acuerdo? 01:02:36

Eso es importante. 01:02:37

Se me había olvidado comentarlo. 01:02:38

Muy bien, ya sabemos los tipos de cultivos que tenemos, ya hemos visto las fases de la curva de crecimiento de las células y las formas que tienen las células para poder crecer, bien si crecen en monocapa o bien si crecen en suspensión. 01:02:40

¿De acuerdo? Ahora, ¿estas células cómo se comportan in vitro a lo largo del tiempo? Esto es lo que vamos a ver ahora en lo que llamamos el comportamiento vital tras sucesivos pases. 01:02:58

Entonces, una línea celular primaria, por repasar lo que hemos comentado anteriormente 01:03:14

Una línea celular primaria es un cultivo secundario que viene directamente de un cultivo primario 01:03:21

El cual venía directamente de un órgano o de un tejido 01:03:27

La línea celular primaria es aquella obtenida a partir del tejido del órgano 01:03:31

Mediante un cultivo primario 01:03:36

¿Os acordáis? Este cultivo primario lo hemos ido manteniendo in vitro hasta que en la placa solo nos ha quedado un tipo de célula. Es un cultivo ya celular, un cultivo de célula histotípico normalmente, un tipo celular. 01:03:39

¿Cuánto tiempo lo podemos mantener in vitro? 01:03:57

Pues ya hemos dicho que es un tiempo limitado 01:04:01

Las células no están en su ambiente fisiológico y en la placa 01:04:02

pues no pueden crecer ilimitadamente 01:04:06

y entran en el proceso de senescencia 01:04:09

Ya hemos comentado anteriormente que el proceso de senescencia 01:04:11

sería algo parecido a un proceso de envejecimiento de las células 01:04:15

La senescencia se define como la etapa vital 01:04:21

en la que las células van perdiendo la capacidad de dividirse 01:04:26

y al final ese cultivo acaba muriendo. 01:04:29

Las células envejecen, paran de dividirse, paran de crecer, 01:04:34

empiezan a crecer más despacio hasta que llega un momento que las células in vitro se mueren. 01:04:39

¿Qué podemos hacer para que las células no entren en senescencia? 01:04:43

¿O no lleguen a la senescencia? 01:04:47

Pues en cada subcultivo, en cada pase, podemos ir congelando viales. 01:04:49

Vamos a ver ahora. Es decir, imaginaos que podemos graficar ahora a lo largo del tiempo, aquí tenemos semanas y aquí tenemos el recuento acumulativo de células. 01:04:56

¿Esto qué significa? Esta gráfica que significa que desde el momento cero, desde el primer día, el día cero, cuando ponemos en marcha el cultivo, obtenemos las células del órgano del tejido por disgregación y las ponemos in vitro y establecemos un cultivo primario. 01:05:10

Esto ya lo sabemos. Estas células normalmente van a sufrir un periodo de latencia largo, que son semanas de cultivo, aquí son 7 días, no nos confundamos, no son 24 horas, son 7 días, es una semana. 01:05:28

A lo largo de la primera semana, hasta que se empieza a reactivar y empiezan a crecer las células, pues pasa tiempo. Pero llega un momento en el que esas células ahora ya entran como en sus fases exponenciales. Empiezan a crecer. 01:05:45

Cuando llegan a la primera confluencia 01:06:00

Hacemos el primer pase 01:06:03

Aquí hacemos el primer pase 01:06:05

Las cambiamos 01:06:06

De plaquita 01:06:09

Y siguen creciendo 01:06:10

Y aquí haríamos 01:06:12

El segundo pase 01:06:13

El segundo pase 01:06:15

¿Sí? 01:06:19

Siguen creciendo 01:06:22

Daos cuenta que aquí es el recuento acumulativo 01:06:23

¿Eso qué significa? 01:06:25

El recuento acumulativo significa que si yo partía de 10 millones de células 01:06:27

aquí a día 0 01:06:31

pues en el primer pase igual obtengo el doble 01:06:34

20 millones de células 01:06:37

esas 20 millones de células 01:06:39

hago el primer pase y las pongo en dos plaquitas 01:06:41

10 millones y 10 millones 01:06:45

cuando llegan a confluencia 01:06:46

tendré 20 millones y 20 millones 01:06:49

por tanto el número de células acumulativos son 40 millones 01:06:51

vuelvo a hacer el segundo pase 01:06:55

de las cuatro placas 01:06:57

de las dos placas, ahora paso 01:07:00

a cuatro. Y así cada vez 01:07:02

en cada pase 01:07:04

voy obteniendo mayor 01:07:05

número de células. Hasta que 01:07:08

llega un momento que después del tercer, cuarto, 01:07:10

quinto pase, obtenemos ya 01:07:12

si os acordáis, la línea celular primaria. 01:07:14

La línea celular primaria es 01:07:16

aquella en la que mayoritariamente 01:07:18

vamos a tener 01:07:21

un único tipo de células. 01:07:22

Estas células 01:07:25

son las que decimos que con el tiempo 01:07:25

van a entrar en senescencia. 01:07:28

Ojo, y esto es importante, no confundir esta gráfica donde lo que estamos viendo es desde el principio hasta que estas células entran en senescencia y se mueren después de no sé cuántas semanas en cultivo y meses, no confundir esta gráfica donde vemos el recuento acumulativo con la gráfica, la curva de crecimiento exponencial, ¿sí? 01:07:30

la curva de crecimiento en cada pase, es decir, en cada pase que yo voy haciendo, las células van 01:07:56

experimentando un crecimiento que sigue esta curva, es decir, estas primeras células, cuando yo he hecho 01:08:04

este primer pase y las vuelvo a poner en la plaquita, en este segundo pase, estas células, aquí en este 01:08:11

punto, las células que están en una nueva placa, empiezan una fase de latencia que se tienen que 01:08:18

adaptar tendrán una fase exponencial y al final entrarán en una fase estacionaria ya hemos dicho 01:08:25

que antes de que entre en la fase estacionaria aquí vamos a realizar el subcultivo es decir 01:08:31

haríamos el tercer subcultivo aquí una vez hecho el tercer subcultivo el tercer pase estas células 01:08:37

las voy a volver a poner en una nueva plaquita y en este punto estas células se tienen que volver 01:08:45

a adaptar al cultivo 01:08:51

y por tanto comienzan de nuevo 01:08:52

una nueva curva con su 01:08:55

fase exponencial, su fase 01:08:57

de latencia exponencial y fase estacionaria 01:08:59

y así en cada fase. 01:09:01

¿Se entiende? 01:09:04

Una vez obtenido 01:09:05

la línea celular primaria, 01:09:07

esta línea celular primaria, hemos dicho que tiene 01:09:09

dura un tiempo limitado 01:09:11

y con el tiempo entra en 01:09:13

senescencia. 01:09:15

Es decir, estas células 01:09:17

entran en senescencia. 01:09:19

Llega un momento, hay un punto de inflexión, un punto en el tiempo que depende del tipo de células que son, 01:09:21

si son fibroblastos, si son células epiteliales, en el que estas células dejan de crecer, 01:09:27

paran su crecimiento y empezamos a perder células. 01:09:34

Es decir, las células empiezan a morir. 01:09:37

¿De acuerdo? 01:09:40

¿Qué es lo que podemos hacer para que las células no entren en senescencia, no llegaran a senescencia? 01:09:41

Lo que se suele hacer es, en cada uno de estos pases, dividir las células en dos. 01:09:47

Unas células, la mitad de las células, se siembran en una nueva plaquita para que sigan creciendo, que serían estas. 01:09:54

Son las células que voy a poner en el segundo pase. 01:10:03

Y la otra mitad la vamos a utilizar para congelar un vial. 01:10:07

Es decir, en un tubito, lo que llamamos un criotubo, voy a congelar esas células 01:10:12

Y las voy a mantener ya congeladas a menos 80 01:10:19

Estos procedimientos ya los veremos 01:10:23

Entonces estas células que están a menos 80 lo importante es poner que son de pase 1 01:10:25

Es decir, son muy jóvenes 01:10:29

Cuando yo tenga que hacer el segundo pase haré lo mismo 01:10:30

Estas células las voy a dividir en dos 01:10:35

Por un lado, sembraré una placa nueva y continuaré el crecimiento, que son estas, que van a ir a pase 3, y la otra mitad de las células congelaré nuevamente otro vial. 01:10:38

¿se entiende? 01:10:54

entonces de esta manera 01:10:57

a ver, esto es una caricatura 01:10:59

en este vial pondré que son 01:11:01

jóvenes todavía pero oye 01:11:03

son de pase 2, ya no son de pase 1 01:11:05

estas son todavía más jóvenes y tienen 01:11:07

más vitalidad que estas 01:11:09

en realidad esto 01:11:10

no se hace con un criotubo 01:11:12

y una placa, lo que se 01:11:15

hace a partir del pase 2 es 01:11:17

una expansión y utilizamos 01:11:19

placas muy grandes y de cada 01:11:21

placa, en lugar de utilizar, sembramos una placa muy grande 01:11:23

y en lugar de congelar un vial, congelamos 10 viales 01:11:28

de pase 1, es decir, por 10 01:11:32

en el segundo pase hacemos lo mismo y volvemos a congelar otros 01:11:35

10 viales, de tal manera que así pase a pase 01:11:40

yo voy a poder ir estudiando las células con las 01:11:44

placas que voy pasando y al mismo tiempo 01:11:48

voy acumulando viales. Cuando llegue y haya hecho 15 pases, en realidad tendré 150 viales congelados. 01:11:52

Estas células llegarán a un momento que lleguen a senescencia. Cuando la placa que yo he ido 01:12:02

manteniendo pase tras pase llegue al final y entre en senescencia, esta placa la tiro 01:12:06

Y descongelo un vial. De tal manera que al descongelar un vial ya no necesito otra vez volver al órgano, volver al tejido, establecer un cultivo primario y comenzar todo de cero. 01:12:14

No sé si me explico. ¿Se entiende? Muy bien. Este es el comportamiento normal de una línea celular primaria. 01:12:31

Con el tiempo obtenemos la línea celular primaria, vamos haciendo pases, vamos utilizando las células que necesitamos para los experimentos y el resto las vamos congelando hasta que llega un momento que entran en senescencia. 01:12:41

Cuando esas células entran en senescencia, tiro esas células, porque se están muriendo, y descongelo un vial nuevo. ¿Sí? Bien. Pero hay otra manera de intentar que no entren en senescencia, y es convertir esta línea celular primaria, ¿sí? En una línea celular, perdón. 01:12:55

Bueno, aquí tenéis un ejemplo. Los pongo aquí. Esto es un cultivo primario de osteoblastos. Los osteoblastos son las células formadoras de hueso. Osteoblastos muy bonitos. Fijaos qué forma fusiforme tienen. Y esto es un cultivo de esos osteoblastos que ya han llegado a su inocencia. 01:13:17

Fijaos, la morfología es tremendamente fea, horrible 01:13:35

Veis estas partículas, esto es lo que llamamos el detritus celular 01:13:39

Son restos celulares, restos citoplasmáticos de células que van muriendo 01:13:41

Este cultivo está envejecido 01:13:45

Este cultivo, los resultados que se pueden obtener con este cultivo 01:13:47

Son malos siempre y están muy sesgados 01:13:50

¿De acuerdo? 01:13:54

Por tanto, cuando observamos que nuestro cultivo primario 01:13:55

Nuestra línea celular primaria empieza a tener signos de envejecimiento 01:13:57

lo mejor que podemos hacer es tirarla, tirar esta placa y descongelar un nuevo vial para establecer un nuevo cultivo, en este caso de línea celular primaria, ¿de acuerdo? 01:14:03

Bien, pero podemos intentar transformar esta línea celular primaria, para evitar que entre en senescencia, podemos intentar inmortalizarla. 01:14:17

Si esta línea celular primaria yo consiguiese inmortalizarla o transformarla 01:14:29

Pasaría a ser una línea celular continua, transformada o inmortalizada 01:14:37

De tal manera que ya no necesitaría congelar las células 01:14:42

Las células ya no entrarían en senescencia, sino que serían células transformadas e inmortales 01:14:47

¿Cómo lo conseguimos? 01:14:52

Esto lo podemos conseguir de muchas maneras 01:14:56

De hecho, nosotros directamente ya podemos trabajar en el laboratorio con líneas celulares continuas, líneas celulares inmortalizadas o transformadas. 01:14:58

La definición de una línea celular inmortalizada es aquella línea obtenida a partir de un cultivo primario, del cual se generó una línea celular primaria y la vamos a mantener en el cultivo un tiempo ilimitado. 01:15:09

Para que esto pueda realizarse solo hay dos caminos. Uno, partir de entrada de células inmortales. Las células inmortales son las células tumorales. Esas células normalmente a partir de un cultivo primario obtenemos directamente, en lugar de una línea celular primaria, obtenemos una línea celular inmortalizada porque son células tumorales. 01:15:27

pero la otra manera es 01:15:50

a partir de una línea celular primaria 01:15:53

intentar inmortalizarla y convertirla en células inmortales 01:15:57

estas líneas inmortales transformadas 01:16:00

estas células transformadas tienen 01:16:04

cinco características fundamentales que hay que saberles 01:16:06

especiales 01:16:09

estas características son digamos exclusivas de las células transformadas 01:16:10

de las líneas celulares continuas 01:16:15

crecimiento indefinido 01:16:16

nunca van a dejar de crecer 01:16:18

aunque lleguen a confluencia 01:16:20

no son dependientes de anclaje 01:16:22

y esto es importante, lo hemos visto en la animación de antes 01:16:24

las células tumorales no tienen inhibición 01:16:27

por contacto 01:16:29

no entran en confluencia 01:16:30

les da igual, no son dependientes de anclaje 01:16:33

eso significa, y esto es muy importante 01:16:35

que no entran en anoiquis 01:16:37

aunque sean células epiteliales 01:16:39

que en el tumor 01:16:42

tienen que estar ancladas in vitro 01:16:43

no sufren anoiquis 01:16:45

Aunque lleguen a confluencia no sufren inhibición por contacto, por tanto nunca entran en confluencia 01:16:47

Además tienen capacidad invasiva, esto significa que pueden invadir tejidos 01:16:55

Si yo cojo estas células y las implanto ahora, por ejemplo, haciendo un xenograf, un injerto subcutáneo en un animal de proliferación 01:17:01

invaden el tejido subcutáneo y forman una masa tumoral 01:17:12

¿De acuerdo? Aunque no sea su ambiente, aunque sean células humanas y lo he hecho en ratón 01:17:17

Eso es capacidad invasiva, pueden invadir tejidos 01:17:21

Y además suelen ser células que acumulan muchas anomalías genéticas y aberraciones cromosómicas 01:17:26

Y les da igual 01:17:33

¿De acuerdo? ¿Cómo podemos transformar una línea celular primaria? 01:17:34

¿Qué métodos tenemos para inducir en estas líneas la inmortalización? 01:17:40

¿Cómo las podemos transformar? 01:17:44

fundamentalmente tenemos tres métodos 01:17:46

a ver, esto es muy sencillo 01:17:49

de lo que se trata es de coger la línea celular primaria 01:17:51

e inducirle mutaciones 01:17:55

esas mutaciones se pueden hacer clásicamente 01:17:56

se han hecho al azar 01:18:00

mutaciones al azar 01:18:01

de tal manera que la gran mayoría de las células mutadas 01:18:02

se van a morir 01:18:05

las que vienen de la línea celular primaria 01:18:05

pero muchas otras por casualidad 01:18:08

a lo mejor muta un gen 01:18:10

que hace que se vuelvan inmortales 01:18:12

esto se ha conseguido clásicamente con métodos físicos 01:18:16

¿qué se hacía? 01:18:19

se radiaba con radiación gamma 01:18:20

o con rayos X 01:18:22

o con luz ultravioleta 01:18:23

sobre todo luz ultravioleta 01:18:25

se irradiaban las células 01:18:27

entonces la luz ultravioleta es un carcinógeno brutal 01:18:28

y esto lo sabemos por la incidencia de melanoma 01:18:32

entonces se inducían 01:18:35

se exponían a radiación ultravioleta 01:18:38

se inducían de forma masiva 01:18:42

mutaciones espontáneas y la célula que conseguía sobrevivir muchas veces se inmortalizaba. 01:18:45

Se pueden utilizar carcinógenos, sustancias químicas que producen tumores. Están en 01:18:52

la base de muchos tipos de, por ejemplo, la nicotina, del tabaco. Tiene carcinógenos 01:18:59

a expuertas. Podemos coger esas sustancias químicas carcinogénicas, el bromuro de tibio 01:19:04

que utilizamos para los geles de agarosa, son carcinógenos. 01:19:10

Podemos poner estos carcinógenos a determinada concentración 01:19:15

de tal manera que puedan producir también de forma espontánea mutaciones en genes clave. 01:19:18

Pero el método más fino, digamos, son los métodos genéticos. 01:19:26

Y es que desde hace ya bastantes décadas se vio que la introducción de una parte del genoma del virus SV40 01:19:31

No se sabe muy bien por qué 01:19:39

Produce la inmortalización de las células 01:19:41

Entonces, ¿qué es lo que se hace? 01:19:43

Se coge esa región del genoma 01:19:46

Que se tiene clonada en un vector 01:19:48

En un vector de expresión 01:19:50

Se coge toda esa zona 01:19:53

En un vector de expresión 01:19:54

Y se introduce en las células 01:19:56

¿Sí? 01:19:58

Entonces estas células introducen el gen 01:20:00

Al azar 01:20:02

Teóricamente al azar 01:20:03

En uno de los cromosomas 01:20:05

de tal manera que se produce una serie de alteraciones genéticas dirigidas por ese genoma viral 01:20:07

que hace que esta célula se transforme en una célula inmortalizada, ¿de acuerdo? 01:20:12

Bueno, pues en esta primera parte hemos visto, en esta primera parte de la unidad, 01:20:19

hemos visto qué tipos de cultivos tenemos, cultivos de órganos, cultivos de esplantes, 01:20:24

cultivos de células que pueden ser histotípicos u organotípicos, 01:20:29

Cómo se comportan las células in vitro, la curva de crecimiento, cómo hay células que crecen en monocapa, otras en suspensión y cómo se comportan las líneas celulares primarias a lo largo del tiempo y cómo podemos transformarlas en líneas inmortalizadas. 01:20:33