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UT4 - Resolución de problemas de MM y PCR - Contenido educativo

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Subido el 4 de agosto de 2023 por Pedro M.

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Video-tutorial sobre la resolución de problemas y ejercicios de master mix y PCR

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Bien, vamos a comenzar este vídeo explicativo sobre cómo resolver algunos de los ejercicios 00:00:00
prácticos sobre MasterMix y sobre PCR. 00:00:19
Entonces, en este primer ejercicio nos piden que queremos reproducir unas condiciones de 00:00:24
una PCR. 00:00:33
Imaginaos que hemos visto estas condiciones en un artículo científico y queremos intentar 00:00:34
reproducirlo en nuestro laboratorio. 00:00:38
Entonces, nos están diciendo que el volumen final de la mezcla de reacción en cada tubo 00:00:40
es de 50 microlitros. 00:00:46
La concentración final de cada reactivo nos la dan también, 2 milimolar, 400 micromolar, 00:00:48
300 nanomolar para los primers y de la tag polimerasa en cada tubo habrá que poner 1 00:00:55
con 5 unidades. 00:01:01
Entonces, para poder realizar este experimento tenemos un kit comercial. 00:01:03
Esto es muy típico, comprar todos los reactivos a la misma casa comercial y a partir del datasheet, 00:01:09
la hoja de los datos, entonces nosotros extraemos toda esta información, es decir, el tampón 00:01:16
de reacción, el buffer, esta zincopor, el crudo de magnesio a 25 milimolar, los DNTPs 00:01:21
que nos dan están a 10 milimolar, los primers, que también los habremos comprado en alguna 00:01:28
casa comercial, los hemos dejado a una concentración de 10 micromolar y la polimerasa que utilizamos, 00:01:36
la tag polimerasa, la tenemos a 3 unidades microlitros. 00:01:42
Esto sencillamente es las condiciones aquí arriba de lo que nosotros queremos conseguir 00:01:46
en nuestra PCR y aquí es lo que tenemos en el laboratorio, el kit comercial, los reactivos. 00:01:52
Pues nos piden que calculemos la cantidad de cada reactivo para la Mastermix, teniendo 00:01:58
en cuenta que tenemos que hacer 14 PCRs. 00:02:05
Imaginaos que nos piden que hagamos una PCR de un gen determinado en 14 muestras de pacientes, 00:02:08
teniendo en cuenta que añadiremos 200 nanogramos del DNA molde de cada paciente y tenemos el 00:02:15
DNA molde de cada paciente a esta concentración, 2 microgramos microlitros. 00:02:22
Este es el enunciado de un ejercicio de Mastermix típico, ¿cómo resolverlo? 00:02:28
Pues la idea es que tenemos que ir calculando la cantidad de cada reactivo, el volumen de 00:02:36
cada reactivo que tenemos que ir añadiendo al tubo de la Mastermix. 00:02:41
¿Cómo resolverlo? 00:02:46
A mí me parece que la manera más sencilla es hacerlo y ordenar todos los datos en forma 00:02:48
de tabla, algo así. 00:02:54
¿De acuerdo? 00:02:56
Entonces, en esta tabla de una tacada la vamos a ir rellenando con datos, bien los datos 00:02:57
que nos dan el enunciado y bien los datos que vamos a ir calculando, ¿de acuerdo? 00:03:05
Entonces, todos los resultados van a quedar de forma muy ordenada, muy visuales y a mí 00:03:10
me parece que es una manera de hacerlo muy clara y que os va a permitir sobre todo no 00:03:15
confundiros porque confundir datos de un reactivo con otro es muy fácil, ¿de acuerdo? 00:03:21
Entonces, yo os recomiendo que hagáis una tabla de este estilo, en la cual tenemos 00:03:28
todos los reactivos que vamos a necesitar, el buffer, las sales, el magnesio, DNTPs, 00:03:34
el forward y el reverse, la tac polimeras y añadimos una fila para el DNA y la fila 00:03:40
para el agua. 00:03:46
Por supuesto, en el tubo de la PCR necesitamos agua, en una dilución acuosa. 00:03:47
Pongo aquí también este dato para que no se nos olvide porque es muy importante, el 00:03:53
volumen final de cada tubo nos dice que son 50 microlitros, es decir, después de añadir 00:03:56
el buffer, todos los reactivos, el agua y el DNA, el volumen final de cada tubo de 00:04:03
PCR tendría que ser 20 microlitros, ¿de acuerdo? 00:04:07
Bien, en esta tabla ya hay cuatro celdas que de entrada sin calcular nada ya sabemos lo 00:04:11
que tenemos que poner, que son estas, el agua. 00:04:19
Bueno, os cuento, primera columna es concentración inicial, esta concentración inicial es la 00:04:23
concentración de cada reactivo en el kit comercial, la concentración final es la concentración 00:04:30
de cada reactivo, pero ya en el tubo de PCR final, en el tubo de PCR, ¿de acuerdo? 00:04:37
El volumen inicial es el volumen que yo voy a coger de cada reactivo, el volumen del kit 00:04:46
comercial, es el volumen que voy a coger de cada reactivo del kit comercial y que voy 00:04:51
a añadir al tubo de PCR, como si tuviera que hacer un único tubo de PCR, esto es lo 00:04:57
primero que vamos a calcular y luego lo multiplicaremos por el número de tubos de PCR que tenemos 00:05:03
que hacer. 00:05:10
Os recuerdo, tiro para atrás, nos están pidiendo que calculemos la MasterMix para 00:05:11
14 PCRs, es decir, para 14 muestras de pacientes, os recuerdo, como veíamos en clase, que a 00:05:17
esos 14 tubos de PCR hay que añadirle 3, un tubo para el control positivo, un tubo 00:05:25
para el control negativo y un tubo de más, ¿vale?, para, sobre todo, evitar los errores 00:05:32
de pipeteo. 00:05:39
Por tanto, no son 14 tubos, sino que la MasterMix tenemos que calcularla sobre 17 tubos, imagino 00:05:40
que esto todo el mundo lo ve, ya lo comentamos en clase, ¿de acuerdo? 00:05:45
Bien, pues decíamos que en esta tabla hay 4 celdas que ya sabemos lo que tenemos que 00:05:49
poner. 00:05:55
El agua, vamos, el agua no tiene concentración inicial ni concentración final, el agua 00:05:56
es agua. 00:06:01
Por tanto, os las he puesto sombreada porque aquí no tenemos que calcular nada, ¿de acuerdo? 00:06:02
Ya veremos luego después por qué ponemos el agua. 00:06:08
Del DNA, el DNA lo tengo que calcular en los volúmenes para un tubo, pero nunca ponemos 00:06:11
el DNA en el MasterMix, por tanto, esta celda también está sombreada, aquí no tenemos 00:06:20
que ponerlo, ¿de acuerdo? 00:06:26
Y después del buffer, el buffer me lo van a dar en unidades de concentración, la concentración 00:06:28
final del buffer siempre es 1x, es decir, no hay concentración, concentración 1, ¿de 00:06:35
acuerdo? 00:06:42
Muy bien. 00:06:43
Vamos a cómo calculamos, cómo hacemos los cálculos. 00:06:45
Fijaos. 00:06:51
Lo primero que tenemos que hacer es identificar, fijaos que os he puesto aquí un código de 00:06:52
colores por si se entiende mucho mejor. 00:06:56
Hemos dicho que las dos primeras columnas, concentración inicial y concentración final, 00:06:59
las vamos a rellenar a partir de la información del enunciado, ¿de acuerdo? 00:07:03
En este sentido, en el enunciado, os he puesto aquí también con el mismo código de colores, 00:07:08
fijaos, en azul las concentraciones finales, las que van a ir en la mezcla de reacción, 00:07:13
la concentración del magnesio, de los DNTPs, de los primers, de la polimerasa, y las concentraciones 00:07:19
iniciales son las concentraciones que me dice que tienen los reactivos en el kit comercial. 00:07:26
Lo único que tengo que hacer es, en el enunciado, identificar cuáles son concentraciones iniciales, 00:07:31
por ejemplo, las he puesto en rojo, y las concentraciones finales en azul, y rellenar 00:07:38
la tabla. 00:07:41
¿De acuerdo? 00:07:42
Ya está rellenado. 00:07:43
Eso os dais cuenta. 00:07:44
Entonces, las concentraciones iniciales de todos los reactivos en el kit comercial, menos 00:07:45
el DNA, que ya lo he purificado y lo he cuantificado yo, ¿de acuerdo? 00:07:52
Pues serían todas estas, ¿de acuerdo? 00:07:57
Sencillamente, lo único que he hecho ha sido copiar los datos del enunciado y las concentraciones 00:08:00
finales que me piden de cada reactivo en la mezcla de reacción, también las he copiado. 00:08:05
¿De acuerdo? 00:08:11
Muy bien. 00:08:13
Para calcular el volumen inicial, es decir, el volumen de cada reactivo en el tubo de 00:08:16
PCR, lo vamos a hacer de tres maneras diferentes. 00:08:20
¿De acuerdo? 00:08:24
Entonces, el buffer. 00:08:26
El buffer me lo dan en unidades de concentración. 00:08:30
Lugar de 5 por significa que en el buffer del kit comercial está 5 veces concentrado. 00:08:32
Esto es como el suavizante de la lavadora. 00:08:39
Suavizante concentrado. 00:08:42
De tal manera que si yo lo quiero utilizar, lo tengo que diluir. 00:08:43
¿De acuerdo? 00:08:47
1 por significa que el buffer ya no está diluido. 00:08:49
Por tanto, si lo tengo 5 veces concentrada, lo tengo que diluir. 00:08:52
¿Cuántas veces? 00:08:57
Pues 5 veces. 00:08:58
Si en lugar de 5 por fuera 10 por, pues tendría que hacer una dilución 1-10, 10 veces diluido, 00:08:59
para que pueda funcionar bien el buffer. 00:09:06
Para hacernos una idea, y que sea más sencillo, yo puedo utilizar esta fórmula que os pongo 00:09:09
aquí. 00:09:14
La fórmula que dice que el volumen inicial de buffer, utilizando unidades de concentración, 00:09:15
¿de acuerdo?, es ni más ni menos que el volumen final del tubo, 50 microlitros que 00:09:20
lo tenemos aquí, partido por el factor de concentración. 00:09:26
En este caso el factor de concentración es 5. 00:09:29
5 veces concentrado. 00:09:32
Muy bien, los siguientes 4 reactivos los vamos a calcular siguiendo esta fórmula. 00:09:33
¿Por qué? 00:09:42
Porque si os dais cuenta me dan unidades de concentración y unidades de concentración. 00:09:43
Inicial y final. 00:09:49
Milimolar, milimolar, milimolar, micromolar, micromolar, nanomolar. 00:09:50
Estas son moles litro, son unidades de concentración. 00:09:56
Estos 4 reactivos los vamos a calcular con esta fórmula. 00:10:00
Esta es una fórmula típica para resolver problemas de diluciones en química de toda 00:10:05
la vida. 00:10:11
Concentración inicial por volumen inicial es igual a concentración final por volumen 00:10:12
final. 00:10:16
¿De acuerdo? 00:10:17
Sencillamente, como quiero calcular el volumen inicial, lo único que hago es en esta ecuación, 00:10:18
ecuación sencilla de primer grado, despejo el volumen inicial. 00:10:22
Y el volumen inicial es concentración final por volumen final dividido entre concentración 00:10:27
inicial. 00:10:32
¿De acuerdo? 00:10:33
Estos 4 reactivos para calcular el volumen inicial podemos utilizar esta fórmula. 00:10:35
¿Por qué puedo utilizar esta fórmula? 00:10:41
Porque tengo concentración y concentración. 00:10:44
¿Qué ocurre con la polimerasi del DNA? 00:10:46
Si os dais cuenta, aquí tengo unidades de concentración, unidades microlitro, microgramos 00:10:48
microlitro, pero aquí me piden cantidad. 00:10:56
No me están diciendo una concentración final en realidad, aunque lo pongamos en esta columna, 00:10:59
esto no son unidades de concentración, sino cantidad. 00:11:04
Es decir, tú tienes la polimerasa a 3 unidades microlitro, pero quiero que me pongas una 00:11:07
con 5 unidades. 00:11:12
Eso es cantidad. 00:11:13
¿En qué volumen? 00:11:14
¿En qué volumen? 00:11:15
Pues en el volumen final. 00:11:16
Perfecto. 00:11:17
Y del DNA quiero que me pongas en cada tubo 200 nanogramos. 00:11:18
Eso es cantidad. 00:11:22
¿De acuerdo? 00:11:23
Entonces hay que calcular qué volumen tengo que coger de polimerasa y de DNA para llevarme 00:11:24
esta cantidad de reactivos. 00:11:28
Aquí son concentraciones, pero aquí son cantidad de reactivos. 00:11:31
Para calcular el volumen inicial de estos 2 reactivos, lo más sencillo a mí me parece 00:11:36
que es utilizar una regla de 3. 00:11:42
Ya sabemos que cuando tenemos una relación de dos variables, si os acordáis, podemos 00:11:46
establecer directamente ya una regla de 3. 00:11:50
Aquí me dicen que tengo 3 unidades por microlitro, entonces el número de unidades por número 00:11:53
de microgramos es el DNA en un microlitro. 00:11:59
Entonces, si tengo tantas unidades en un microlitro de volumen, ¿cuántas unidades tendré en 00:12:02
¿De acuerdo? 00:12:10
¿Se entiende? 00:12:12
Bien, pues vamos a irlos calculando uno a uno. 00:12:13
Vamos a empezar por el buffer. 00:12:18
El buffer hemos dicho que lo calculamos con esta fórmula sencillita. 00:12:19
¿De acuerdo? 00:12:23
Entonces el volumen inicial es volumen final por el factor de concentración. 00:12:24
Volumen final, ya me han dicho en la PCR que son 50 microlitros entre el factor de concentración 00:12:27
que es 5, está 5 veces concentrado, pues 50 entre 5, 5 microlitros. 00:12:34
Ya lo he calculado. 00:12:40
¿Cuánto tengo que poner en un tubo de PCR de buffer? 00:12:41
5 microlitros, perfecto. 00:12:44
Vamos al resto. 00:12:47
Clóbulo de magnesio, hemos dicho que vamos a utilizar esta fórmula, ¿de acuerdo? 00:12:48
Volumen inicial es igual a concentración final por volumen final entre la concentración 00:12:54
inicial. 00:12:58
Lo único que hacemos es sustituir los términos. 00:12:59
La primera que tenemos, volumen inicial es igual a concentración final, 2 milimolar, 00:13:04
por 50 microlitros partido por 25 milimolar. 00:13:10
Importante, importante, las dos concentraciones, inicial y final, tienen que estar en las mismas 00:13:15
unidades. 00:13:22
En este caso coincide, por casualidad, que es la misma, milimolar y milimolar. 00:13:23
¿Por qué? 00:13:27
Porque necesito que una en el numerador, otra en el denominador, ambas concentraciones 00:13:28
se eliminen para que me quede como unidad los microlitros, ¿de acuerdo? 00:13:36
Haciendo este cálculo, 2 por 50 son 100 entre 25, 4 microlitros. 00:13:41
¿Cuánto tengo que poner en un tubo de clóbulo de magnesio? 00:13:47
4 microlitros, ¿de acuerdo? 00:13:50
Lo mismo haríamos con los DNTPs. 00:13:52
Ah, en este caso, ojo, los DNTPs están en milimolar y en micromolar. 00:13:55
Tengo que pasar todo a las mismas unidades. 00:14:01
Yo lo que he hecho ha sido pasar los micromolar a milimolar. 00:14:04
Los 400 micromolar son 0,4 milimolar. 00:14:08
Los milimolar y milimolar se eliminan y ya he calculado el volumen de DNTPs. 00:14:12
Muy bien. 00:14:17
Y con los primers hago lo mismo. 00:14:18
En este caso es nanomolar y micromolar. 00:14:20
He pasado nanomolar a micromolar. 00:14:23
Podéis hacerlo al revés. 00:14:25
El resultado es el mismo. 00:14:26
Micromolar y micromolar se eliminan y ya tengo el volumen. 00:14:28
Lo único que hago ahora es rellenar la tabla otra vez. 00:14:31
Ya tenemos 4 microlitros, 2 microlitros, 1,5 y 1,5. 00:14:35
Ojo, los primers hay que poner los dos de forma individual normalmente. 00:14:39
Si se trata ahora de la polimerasa y del DNA, hemos dicho que los vamos a calcular siguiendo 00:14:45
esta regla de 3. 00:14:52
Muy sencillito. 00:14:53
Por tanto, en la tag polimerasa me dicen que en el kit comercial mi tag polimerasa tengo 00:14:54
3 unidades por cada microlitro y yo necesito 1,5 unidades. 00:15:01
Pues ¿qué volumen necesitaré? 00:15:07
¿De acuerdo? 00:15:10
Pues X es igual a 1,5 por un microlitro entre 3. 00:15:11
Nuevamente unidades y unidades se elimina y el resultado son 0,5 microlitros. 00:15:16
¿De acuerdo? 00:15:21
Muy bien. 00:15:23
De la misma manera calculamos el volumen de DNA. 00:15:24
2 microgramos en cada microlitro. 00:15:28
Pues si yo necesito 0,2 microgramos, ojo, nuevamente tienen que estar en las mismas 00:15:30
unidades. 00:15:35
200 nanogramos son 0,2 microgramos. 00:15:36
¿En qué volumen? 00:15:39
Repetimos la operación y nos sale que de DNA tendría que poner 0,1 microlitros. 00:15:42
¿De acuerdo? 00:15:47
Es así de sencillo. 00:15:50
Y nuevamente rellenamos la taza. 00:15:52
¿De acuerdo? 00:15:54
¿Nos falta algún reactivo? 00:15:55
Sí. 00:15:56
El agua. 00:15:57
Daos cuenta que si sumamos todo esto, todos estos volúmenes, que son los volúmenes de 00:15:58
reactivos, no nos da 50. 00:16:02
Entonces hemos de rellenar el resto del volumen con agua. 00:16:06
¿Cómo lo calculamos? 00:16:09
Pues el volumen de agua, volumen inicial de agua, será el volumen final, 50, menos la 00:16:11
suma de todos los reactivos. 00:16:16
Es decir, 50 microlitros menos la suma del volumen de todos los reactivos, como tenemos 00:16:18
aquí. 00:16:24
Y esto, si yo no me he equivocado, da 35,4. 00:16:25
Por tanto, de agua a cada tubo de PCR tendríamos que añadir 35,4 microlitros. 00:16:30
¿De acuerdo? 00:16:37
Muy bien. 00:16:39
Acabamos de calcular el volumen de cada reactivo que tendríamos que poner en un tubo. 00:16:41
Pero ya sabemos que nosotros hacemos una mastermix, no hacemos tubo a tubo de PCR, sino que hacemos 00:16:46
una mastermix con todos los reactivos, insisto, menos el DNA, y luego repartimos el volumen, 00:16:54
un volumen concreto en todos los tubos, un volumen concreto de la mastermix. 00:17:03
Lo único que tengo que hacer ahora para calcular qué volumen de cada reactivo tengo que añadir 00:17:08
al tubo de la mastermix, lo único que tengo que hacer es multiplicar cada uno de estos 00:17:13
volúmenes iniciales por el número de tubos, 17. 00:17:18
Si hago esto, pues me salen estos volúmenes, ¿de acuerdo? 00:17:23
Ya he calculado todos los volúmenes de reactivos de forma individual que tengo que añadir 00:17:29
en el tubo de la mastermix. 00:17:35
A nivel experimental, desde un punto de vista experimental, se van añadiendo siempre al 00:17:37
tubo los reactivos de mayor volumen hasta los reactivos de menor volumen. 00:17:42
Entonces primero añado el agua, luego añado el buffer, el magnesio, los DNTPs, cada uno 00:17:47
de los primers y luego la polimerasa, es el último reactivo que añadimos. 00:17:55
Claro, ¿por qué hacemos una mastermix? 00:17:59
Ahora lo veis, fijaos, si yo tengo que añadir 0,5 microlitros de la polimerasa, es más 00:18:01
fácil que cometa un error de pipeteo, así tengo que añadir 8,5 microlitros, porque 00:18:08
no es lo mismo añadir 0,6 microlitros o 0,4 en cada tubo que añadir 8,6 u 8,4 en un tubo 00:18:15
de mastermix. 00:18:23
El error es muchísimo menor, se diluye, ¿de acuerdo? 00:18:24
¿Cuántas veces? 00:18:28
17 veces, ¿de acuerdo? 00:18:29
Entonces así ya tendríamos, bueno, ya tendríamos calculado los volúmenes de cada reactivo que 00:18:32
tengo que poner en la mastermix. 00:18:39
Lo único que haría ahora es calcular qué volumen de mastermix tengo que poner en cada 00:18:41
uno de los 17 tubos de PCR, y eso es muy sencillo, es añadir, ¿cuál es el volumen final? 00:18:47
menos el DNA, que es 0,1, a cada tubo añadiría 49,9 microlitros de mastermix, y cuando ya 00:18:56
tengo la mastermix repartida en los 17 tubos, añado ya de forma individual, eso sí, el 00:19:03
DNA, 0,1 microlitro de DNA a cada tubo. 00:19:08
¿De acuerdo? 00:19:12
Muy bien, pues este ejercicio 1 ya estaría resuelto, de una forma muy sencilla, muy fácil 00:19:13
y utilizando prácticamente 3 formulitas. 00:19:20
Bien, el segundo ejercicio que nos piden, es uno de los ejercicios del libro, nos dice 00:19:23
que se analizan 6 muestras de PCR, imaginaos que de la muestra 2 a la muestra 6 son las 00:19:30
PCR que hemos hecho a las muestras de 6 pacientes. 00:19:37
La PCR se realiza con cebadores específicos que amplifican un fragmento de 250 pares 00:19:40
de bases. 00:19:46
Entonces si venimos al marcador de pesos moleculares, 200, 300, esta debe ser la banda 00:19:47
específica que yo quiero amplificar en el DNA del paciente, pues del gen de interés 00:19:52
que quiero analizar. 00:20:00
Pero nos están diciendo que es una PCR múltiple, porque junto con estos cebadores específicos 00:20:01
hemos añadido primers para un control positivo, de la beta globina, y amplifica un fragmento 00:20:08
de 400 pares de bases. 00:20:14
Si nos vamos a nuestro marcador de pesos moleculares, 400 pares de bases, esta debe de ser la banda 00:20:16
del control positivo. 00:20:25
Dice que finalizada la reacción, hemos corrido este gel de electroforesis, junto con el marcador 00:20:26
de pesos moleculares, y nos piden que indiquemos el resultado de cada muestra, individualmente 00:20:33
y que apazanemos, por supuesto, la respuesta. 00:20:39
Entonces, como es una PCR múltiple, lo primero en que me tengo que fijar es en el control 00:20:43
positivo. 00:20:48
¿De acuerdo? 00:20:49
¿Dónde está la banda del control positivo? 00:20:50
Pues la banda del control positivo es esta. 00:20:52
Por tanto, lo primero que hago es, en todas las muestras, me fijo en esta región. 00:20:55
¿Por qué? 00:21:01
Porque es la región donde tiene que aparecer la banda del control positivo. 00:21:02
Este es el primer paso. 00:21:06
¿De acuerdo? 00:21:08
Bien. 00:21:10
¿Qué indica el control positivo? 00:21:11
Si observo banda, la PCR es fiable. 00:21:13
Si no observo banda, la PCR no es fiable. 00:21:16
Por tanto, si os dais cuenta, solo hay tres de las seis muestras que van a ser fiables. 00:21:19
De tal manera que ya de entrada, yo podría decir, mira, de esta no me fío, de esta no 00:21:24
me fío, de esta tampoco me fío, ¿por qué? 00:21:31
Porque no amplifica el control positivo y de esta no me fío tampoco. 00:21:36
Ahora vamos a analizar en detalle estas tres, la 2, la 3 y la 6, ¿me explico? 00:21:42
Muy bien. 00:21:50
Vamos con la primera. 00:21:51
La muestra 2. 00:21:52
¿Es una PCR fiable? 00:21:53
Sí, porque tiene banda de control positivo. 00:21:54
Muy bien. 00:21:56
¿Cuál es el resultado? 00:21:57
¿Tiene la banda específica? 00:21:58
Sí, el paciente 1 que hemos corrido en el carril 2 es un paciente positivo, ¿de acuerdo? 00:22:00
No sabemos muy bien a qué gen es, pero bueno, es positivo, es una PCR. 00:22:08
Diríamos, la muestra del paciente 1 es una muestra, la PCR es fiable y ha salido positiva. 00:22:13
¿Sí? 00:22:19
Vamos al 6, el ejemplo opuesto. 00:22:22
El ejemplo opuesto. 00:22:27
¿Es una PCR fiable? 00:22:28
Sí. 00:22:30
¿Me creo los resultados? 00:22:31
Sí. 00:22:32
¿Qué ha pasado? 00:22:33
No hay banda. 00:22:34
Por tanto, el paciente 6 es un paciente negativo, ¿de acuerdo? 00:22:35
Y lo informaríamos al facultativo. 00:22:39
Este paciente es negativo, en realidad es el paciente 5, aunque esté en el carril 6. 00:22:41
¿El paciente 3? 00:22:46
Pues el paciente 3 es positivo también. 00:22:48
Ay, ¿y esta banda de aquí qué es? 00:22:51
Bueno, pues esta banda de aquí, cuando aparece en una PCR una banda por debajo de la banda 00:22:54
de 100 pares de bases, esto de aquí son dimeros de primers, es decir, los primers han hibridado 00:23:01
unos con otros y forman una banda, normalmente entre 50-75 pares de bases, ¿de acuerdo? 00:23:07
Y siempre aparece eso, por debajo de 100 pares de bases. 00:23:15
Es una banda, si miráis las soluciones del libro, nos dicen que habría que descartarla 00:23:19
o repetirla. 00:23:24
En la práctica, en la clínica, esta muestra se da por buena, porque es muy fácil que 00:23:25
los primers formen dimeros y en el gel de electroforesis los veamos como una banda tenue 00:23:31
al fondo. 00:23:36
Esto no es inespecificidad, esta banda no es inespecífica, ¿de acuerdo? 00:23:37
Es sencillamente que los primers forman dimeros y se ven aquí abajo. 00:23:41
Por tanto, aunque teóricamente habría que repetirla, en la práctica nunca se repite 00:23:46
y se da por buena. 00:23:50
Por tanto, el paciente 2, que hemos corrido su muestra en el carril 3, nos da una PCR 00:23:52
fiable y además es positivo para el gen que estamos analizando. 00:23:56
¿De acuerdo? 00:24:03
¿Qué podríamos decir en el, por ejemplo, el paciente 5, que es muy fácil también? 00:24:04
¡Uy! 00:24:08
No ha amplificado nada. 00:24:09
Esta, por supuesto, hay que repetirla, pero ¿qué puede haber pasado? 00:24:10
Seguramente hemos puesto la Mastermix en todos los tubos, luego hemos ido añadiendo, hemos 00:24:15
ido añadiendo los DNAs individualmente en cada tubo y como normalmente tenemos muchas 00:24:21
muestras en este paciente, es posible que se nos haya olvidado poner el DNA, porque 00:24:26
ha salido como un control negativo. 00:24:30
Entonces, esta habría que repetirla, el paciente 4, carril 5, habría que repetirla asegurándonos 00:24:32
de poner DNA. 00:24:38
¿De acuerdo? 00:24:39
El paciente 4, bueno, pues tenemos bandas inespecíficas. 00:24:41
Esta no es fiable, ni mucho menos, habría que repetirla, pero como hay tantas bandas 00:24:45
inespecíficas y ni siquiera el control positivo aparece, aquí hay que ir un poquito a un 00:24:48
estamento superior, hay que analizar el DNA. 00:24:56
Entonces, es posible que el DNA tenga contaminantes o inhibidores de la… habría que ver qué 00:24:58
es lo que está pasando. 00:25:03
Nuevamente, pues habría que volver a… habría que ver las absorbancias otra vez, cómo salen, 00:25:04
si hay contaminantes, no hay contaminantes y es posible que hubiese o bien que tirar 00:25:11
la muestra y volver a purificarla o a lo mejor purificarlo por otro método. 00:25:15
¿De acuerdo? 00:25:20
Y es algo parecido al 7. 00:25:21
Sin embargo, el 7, fijaos, si os dais cuenta, el 7 es como el 3, pero no es fiable porque 00:25:25
no ha amplificado el control positivo. 00:25:30
Aquí en esta muestra ha pasado algo. 00:25:32
La muestra del paciente 6, carril 7, algo ha pasado. 00:25:34
Diríamos que es positiva porque tiene lavanda y además hay dímeros de primers que tampoco 00:25:37
nos importan mucho, pero como no tiene control positivo, hay que repetirla. 00:25:41
Por tanto, la muestra 2, la muestra 3, son positivos y son PCR fiables. 00:25:46
La muestra 6 es negativo, un paciente negativo, bueno, sería el paciente 5, es un paciente 00:25:55
negativo y es una PCR fiable. 00:26:01
La PCR 5, del carril 5, esta hay que repetirla, asegurándonos de poner DNA. 00:26:04
La del 4, la que se ha corrido aquí, la muestra del paciente 3, esta hay que analizar el DNA, 00:26:11
a ver qué le pasa. 00:26:16
Y la del 7 habría que repetirla, habría que repetirla a ver qué es lo que ha pasado 00:26:17
con el control positivo. 00:26:23
Si ya no sale otra vez el control positivo, entonces habría que ver cómo está suena. 00:26:24
¿De acuerdo? 00:26:28
Entonces, así. 00:26:29
Brevemente ya hemos visto cómo se resuelven estos problemas de MasterMix y algún problema 00:26:30
de estos de PCR, en este caso es un ejemplo de PCR múltiple. 00:26:37
¿De acuerdo? 00:26:42
Pues venga, con esto ya podéis resolver el resto de problemas de las hojas de ejercicio. 00:26:43
Si tenéis alguna duda, pues me vais preguntando, ¿de acuerdo? 00:26:50
Venga. 00:26:53
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Idioma/s:
es
Idioma/s subtítulos:
es
Materias:
Biología, Ciencias, Ciencias Naturales
Niveles educativos:
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  • Formación Profesional
    • Ciclo formativo de grado superior
      • Primer Curso
Autor/es:
Pedro Melgar-Rojas
Subido por:
Pedro M.
Licencia:
Reconocimiento - No comercial - Sin obra derivada
Visualizaciones:
64
Fecha:
4 de agosto de 2023 - 16:51
Visibilidad:
Clave
Centro:
IES BENJAMIN RUA
Duración:
26′ 56″
Relación de aspecto:
1.78:1
Resolución:
1280x720 píxeles
Tamaño:
282.90 MBytes

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