UT3 - Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos

Bien, vamos a comenzar la explicación de la última parte del tema sobre la extracción y purificación de los ácidos nucleicos. 00:00:00

Vamos a seguir este orden. Voy a hacer una pequeña introducción, bueno, introduciendo el tema y sobre todo de cara a centrar todas las fases del proceso de extracción, purificación de ácidos nucleicos, 00:00:09

Algunos puntos que me parece que son importantes tenerlos en cuenta. 00:00:26

Y ya entraremos apartado a apartado a las diferentes fases de todo este proceso. 00:00:31

Pretratamiento, como el primero de ellos. 00:00:36

La extracción, la fase de extracción, la fase de purificación. 00:00:40

Una vez hemos realizado estas tres fases, como veremos ahora, 00:00:44

veremos que todos estos procesos se pueden automatizar en los laboratorios actualmente. 00:00:48

Y tendremos que hacer la cuarta fase. La cuarta fase es analizar si los ácidos nucleicos que hemos extraído y purificado son de buena o de mala calidad. Si son de buena calidad, tenemos la garantía de que las técnicas de biología molecular seguramente saldrán bien. 00:00:53

Si los ácidos nucleicos son de mala calidad, seguramente no podremos cumplir ese requisito y las técnicas de biología molecular es posible que nos den errores. 00:01:12

Y al final, en el último apartado, veremos algunas consideraciones sobre cómo almacenar los ácidos nucleicos que acabamos de purificar. 00:01:23

¿De acuerdo? Pues vamos a por ello. 00:01:32

Bien, la primera idea importante que tenemos que tener en cuenta es que los ácidos nucleicos se encuentran confinados 00:01:34

Y esto es importante, ¿dónde? En el interior de las células 00:01:42

Ya sea una célula procariota, este es un esquema de una célula procariota 00:01:45

Sabemos que este material genético corresponde al cromosoma bacteriano, al DNA genómico 00:01:52

Y los plásmidos se encuentran dentro de la célula y está la membrana plasmática por fuera, dependiendo de si son gran positivas o negativas. Hay una pared muy gruesa, están muy protegidos. ¿Por qué? Porque los ácidos nucleicos, especialmente el DNA, como ya sabemos que se encarga de almacenar la información genética, debe permanecer inalterado. 00:01:58

En una célula eucariota animal se encuentra dentro del núcleo. Por tanto, si queremos acceder a los ácidos nucleicos tenemos que atravesar la membrana plasmática y la membrana nuclear. 00:02:23

Pero la membrana nuclear, como bien sabéis, es una membrana doble, es una doble membrana. Pero si son células eucariotas vegetales, además de llegar al núcleo, por fuera también tenemos una pared, en este caso es de celulosa, que la han pintado de verde, que es muy gruesa, muy dura. 00:02:38

Por tanto, de alguna manera, en todo el proceso de extracción y purificación, tenemos que acceder a los ácidos nucleicos que están tremendamente confinados dentro de la célula. 00:02:59

Además de la membrana plasmática, que solo tienen todas las células, hay muchas células que por fuera tienen paredes. 00:03:10

La pared puede ser, bien si son células prokaryotas, es decir, bacterias, la pared celular es de péptido glicano o péptido glucano. 00:03:18

Si es de mureína, células prokaryotas 00:03:36

Pero también hay células eukaryotas que tienen pared celular 00:03:43

Por ejemplo, las de los hongos, además tienen quitina 00:03:50

Junto con el glucano 00:03:53

Son paredes que están por fuera de la membrana 00:03:55

Que tenemos que romperlas para poder acceder a los ácidos nucleicos 00:03:58

Y si es una célula vegetal, la pared es de celulosa 00:04:01

Bien. Esto como primer hilo. De acuerdo. Bien. Para que nos quede claro, para que nos quede claro todo el proceso, fijaos, desde que nos llega al laboratorio una muestra, imaginaos que esto es una biopsia, pues una biopsia de un paciente, imaginaos que le están haciendo un análisis de una biopsia de un nódulo mamario a una paciente, 00:04:06

y nos llega al laboratorio, en un frasquito, esta muestra. 00:04:31

Bien, si yo de esta muestra quiero hacer un análisis genético, 00:04:36

tengo que seguir una serie de fases, y siempre son las mismas fases. 00:04:40

La primera fase es lo que llamamos un pretratamiento. 00:04:45

¿En qué consiste? 00:04:52

Independientemente del tipo de célula, del tipo de muestra que llegue, 00:04:56

Si es un tejido fresco, como una biopsia. Si son cultivos celulares. Si es una muestra sanguínea. Si es una muestra de heces. Independientemente del tipo de muestra, cada muestra hay que hacerle un procesamiento previo, lo que llamamos un pretratamiento. 00:04:59

El objetivo fundamental de este pretratamiento es obtener en un tubito del laboratorio 00:05:16

una suspensión en la que tengamos todas las células de esa muestra en suspensión. 00:05:24

Por tanto, el objetivo del pretratamiento es obtener una suspensión celular. 00:05:34

Es decir, las células de ese tejido, de esa muestra, libres, ¿sí? Libres unas de otras y en el seno de un fluido. 00:05:42

Bien, esta sería siempre la primera fase. Ya digo, dependiendo de la muestra que sea, esta fase y este proceso de pretratamiento es diferente. 00:05:57

A partir de esta suspensión celular que hemos obtenido comienza la segunda fase. La segunda fase de lo que se trata es de la fase de extracción. 00:06:07

Si bien en el pretratamiento muchas veces hay que hacer un proceso de disgregación, un proceso de disgregación en el cual vamos a disgregar las células para obtener la suspensión celular, en el proceso de extracción lo que vamos a hacer es un proceso de lisado o de lisis, de lisis celular. 00:06:20

¿Esto qué significa? En la fase de extracción lo que vamos a hacer va a ser romper la pared y las membranas de estas células. De tal manera que ahora, después, el objetivo fundamental de la fase de extracción es obtener en nuestro tubito un lisado celular. 00:06:53

¿Qué es el lisado celular? Pues el lisado celular no es ni más ni menos que el resultado de haber roto la pared y la membrana de las células 00:07:13

Por tanto, aquí lo que vamos a tener es una mezcla heterogénea de todos los componentes del interior de la célula 00:07:26

Entre ellos los ácidos nucleicos, aquí, pero también muchos otros componentes, muchísimos otros componentes 00:07:32

A veces orgánulos, restos de membrana, núcleos enteros que no se han roto, proteínas, etc. De esta manera, una vez hemos acabado el proceso de extracción y tenemos un lisado celular, comienza la tercera fase. 00:07:41

La tercera fase, ¿en qué consiste? Esta tercera fase consiste en la fase de purificación. ¿Qué hacemos en la purificación? En la purificación, como su nombre indica, lo que vamos a hacer va a ser de esta mezcla heterogénea quedarnos específicamente en nuestro tubito. 00:08:01

ahora ya sí, separar los ácidos nucleicos del resto de componentes del lisado celular. 00:08:26

De tal manera que aquí lo único que vamos a tener ahora ya son las moléculas de DNA o de RNA o de ácidos nucleicos 00:08:34

liberadas, libres, de otros contaminantes, glúcidos, lípidos, proteínas, etc. 00:08:41

De tal manera que aquí lo que obtenemos es lo que llamamos los ácidos nucleicos puros. 00:08:48

¿Sí? Muy bien. Veremos que cada una de estas fases, el pretratamiento, la extracción, la purificación, tiene a su vez diferentes subfases y etapas. Esto lo iremos viendo ahora a lo largo del tema. 00:08:56

Muy bien. Una vez ya hemos obtenido los ácidos nucleicos puros, ahora viene la cuarta fase. Y la cuarta fase es muy importante, que es la fase en la que vamos a evaluar la calidad de estos líneas, ¿sí?, para poder determinar si estos ácidos nucleicos puros que hemos extraído y purificado son de buena o de mala calidad. 00:09:12

Esto es importante. Esto es muy importante. Y cuando hablamos de la calidad nos referimos a que vamos a medir y evaluar tres parámetros fundamentales. 00:09:44

El primer parámetro es la integridad. ¿Qué es la integridad? La integridad nos da una idea de si este DNA, a lo largo de todo este proceso de pretratamiento, extracción y purificación, se ha degradado, se ha fragmentado, se ha estropeado. 00:09:56

Entonces, en lugar de tener las moléculas de DNA, que sabemos que son muy grandes, las tenemos fragmentadas. 00:10:17

El segundo parámetro es la pureza. 00:10:25

En el proceso de purificación hemos intentado pescar de aquí, del lisado celular, hemos intentado pescar todos los ácidos nucleicos y separarlos del resto, que son contaminantes. 00:10:29

El segundo parámetro de calidad es medir realmente la pureza. 00:10:43

¿Hay contaminantes o no? Si hay contaminantes, ¿en qué concentración, en qué cantidad? 00:10:47

Y por último, la concentración. ¿Por qué es importante medir la concentración? Es decir, ¿cuántos ácidos nucleicos tenemos en nuestro tubo de DNA purificado o RNA purificado? 00:10:54

Es muy importante porque algunas de las técnicas de biología molecular requieren una cantidad mínima para que pueda llevarse a cabo. Entonces, hay que llegar a esa cantidad mínima para hacer una PCR, una secuenciación y una cloración. 00:11:10

Bien, si todos estos parámetros nos dicen que son ácidos nucleicos de buena calidad, entonces ya la última fase que vendría, pero ya no de extracción y purificación, sino que ya la última fase que nos quedaría sería el almacenamiento. 00:11:24

Estos ácidos nucleicos 00:11:43

Hemos de almacenarlos 00:11:53

Y esto es muy importante 00:11:55

Porque si tengo unos ácidos nucleicos 00:11:56

De una muestra muy valiosa 00:11:58

Que tienen una integridad perfecta 00:12:00

Son muy puros 00:12:03

Y además a una concentración perfecta 00:12:05

Pero los almaceno mal 00:12:08

Y los guardo mal 00:12:10

Cuando vaya a utilizarlos 00:12:11

Quizás se me han degradado 00:12:13

No por este proceso 00:12:15

Sino porque no los he almacenado bien 00:12:17

¿Entiende? Bien. 00:12:21

Esta diapo es un pedelín, el resumen, 00:12:24

el resumen de todo lo que vamos a ir viendo a lo largo de este tema. 00:12:27

Entonces, de cada una de estas fases vamos a ver lo más importante, 00:12:31

los conceptos más importantes. 00:12:35

Entonces, vamos a comenzar con la fase de pretratamiento 00:12:36

y cuál es el pretratamiento, el procesamiento previo 00:12:39

de cada uno de los tipos de muestras 00:12:44

que son más comunes en el laboratorio, sobre todo en el laboratorio clínico, pero en cualquier laboratorio. 00:12:48

¿De acuerdo? Bien, pues vamos a comenzar. 00:12:54

Perfecto. Como ya sabíamos y ya hemos estado diciendo, los ácidos nucleicos se pueden encontrar prácticamente en cualquier muestra biológica y la podemos extraer. 00:12:59

Dependiendo de cuál sea esta muestra, se requiere un pretratamiento específico para esa muestra. 00:13:10

¿Para qué? Porque el objetivo fundamental es obtener una suspensión celular. Las células de esa muestra, individuales unas de otras, ¿sí? Esto es una suspensión celular. Es una suspensión formada por células libres o pequeños agregados de células, pero que flotan dispersas en el seno del mundo. Normalmente una solución tamponadora de pinche. 00:13:16

¿Sí? Bien. Las muestras más habituales que vamos a ir viendo suelen ser la muestra de sangre, sangre por venopunción. Es un tipo de muestra que se obtiene de forma muy fácil, no invasiva. 00:13:40

A veces son cultivos celulares, tejidos, pero bien, tejidos tanto animales como vegetales que pueden ser frescos o embebidos en parafina. 00:13:57

Estos los veremos, los dos tipos que nos pueden llegar al laboratorio y veremos algunas pinceladas de otro tipo de muestra. 00:14:07

Por ejemplo, esputos o células de la mucosa oral, terias, levaduras, etc. 00:14:13

Entonces, dependiendo del tipo de muestra que nos llegue al laboratorio, el pretratamiento es muy diferente. 00:14:20

En cuanto a la sangre, es la muestra más habitual porque es muy fácil de obtener, no es invasiva. Fijaos, os he puesto aquí este esquema solamente para que veamos la complejidad. Entonces, en la sangre es que en realidad todos son contaminantes. 00:14:25

Toda esta parte de aquí abajo son contaminantes que están en el plasma. El plasma es el 55% aproximadamente del contenido de la sangre y el 45% son las células o lo que llamamos elementos formes. 00:14:40

Y de ellos, el 90% son los hematíes, eritrocitos. Para extraer y purificar DNA no nos interesan los eritrocitos. ¿Por qué? Porque los eritrocitos no tienen núcleo, no tienen DNA, lo perdieron en su proceso de maduración. 00:14:57

Las plaquetas tampoco nos sirven porque en realidad no son células, son fragmentos celulares, fragmentos citoplasmáticos. La fase que nos interesa de todos los componentes de la sangre son los glucocitos, los glóbulos blancos. En concreto, va a ser posible monocitos y linfocitos. 00:15:13

¿De acuerdo? Entonces, el pretratamiento de la sangre tiene como objetivo fundamental el aislar y purificar el DNA de los leucocitos. Y se pueden hacer dos procedimientos, que los tenéis en los apuntes. 00:15:30

esto solamente 00:15:46

bien, para tener en cuenta 00:15:47

que podamos obtener DNA de buena calidad 00:15:50

bueno, yo hablo de DNA 00:15:53

pero en realidad quiero decir extraer 00:15:54

o purificar ácidos nucleicos en general 00:15:56

¿de acuerdo? la sangre 00:15:58

tiene que estar anticoagulada 00:16:00

con cualquiera de los anticoagulantes 00:16:02

EDTA, heparina o citrato 00:16:04

y se debe realizar 00:16:06

a las 24 horas siguientes de la extracción 00:16:09

eso es importante 00:16:12

Para que no se empiecen a deteriorar los leucocitos. Pero si no se pudiese realizar, se puede conservar hasta cinco días, tres como máximo. Pero vamos, si la muestra es muy valiosa, hasta cinco días en la nieve. ¿De acuerdo? Y después hacer todo el pretratamiento y todo lo que vamos a ver. 00:16:13

Hay dos tipos de pretratamiento. El primer tipo de pretratamiento es, si tú me has dicho que la gran mayoría de las células que hay en la sangre son los hematíes, los eritrocitos, un hematíe para nosotros no es ni más ni menos que una membrana como si fuera una bolsa llena de hemoglobina. 00:16:31

Y la hemoglobina es una proteína muy contaminante, muy contaminante porque es muy grande, tiene cuatro cadenas y además tiene átomos de hierro que van muy mal para las técnicas de biología molecular, nivel APCR, etc. 00:16:49

Bien, pues el primer pretratamiento es, vamos a quitarnos de en medio los hematíes y los lisamos, rompemos los hematíes. Entonces, en este primer tipo de pretratamiento de sangre, lo que se hace es en cuatro pasos, ¿sí? 00:17:05

Aquí lo primero que hacemos es lizar los hematitis. ¿Cómo? Con una solución de lisis. 00:17:22

Ahora veremos la solución de lisis. La solución de lisis puede ser porque es una solución que lleva sales a muy baja concentración, de manera que el agua entra dentro de los eritrocitos y los revienta. 00:17:27

Lisis osmótica. 00:17:48

Y otras soluciones de lisis lo que llevan son detergentes, como por ejemplo el tritón, que lo tenemos aquí abajo. 00:17:50

Entonces lo que hacen es desestabilizar la membrana con todos los detergentes y lisan la célula. 00:17:57

Una vez hemos lisado las células, lo que tenemos en el tubo es una hemólisis. 00:18:02

Tenemos en el tubo todo lleno de hemoglobina junto con las proteínas plasmáticas. 00:18:07

Y lo que hacemos es centrifugar la muestra. 00:18:12

De tal manera que ahora las partículas más gruesas, más grandes son los leucocitos y todos los leucocitos que tenemos pues van a ir migrando por la centrifugación al fondo del tubo y se van a quedar aquí formando un pellet o un sedimento. 00:18:14

Lo único que tenemos que hacer después de centrifugar es eliminar todo el sobrenadante, tiramos y nos quedamos con el segmento y lo resuspendemos en un buffer determinado de tal manera que ahora tendremos en nuestro tubito, en el seno de esta solución tamponadora de pH, vamos a tener todos nuestros leucocitos, la suspensión celular que buscábamos. 00:18:30

Es un proceso rápido y sencillo. Para algunas técnicas en concreto nos piden que obtengamos lo que se llaman los PBMCs, que son las células de sangre periférica pero que son mononucleadas, peripheral blood mononuclear cells en inglés. 00:18:56

¿Cuáles son estas células mononucleadas? 00:19:22

Estas células mononucleadas son fundamentalmente monocitos y linfocitos 00:19:26

Neutrófilos, eosinófilos, vasófilos, que son los granulocitos 00:19:31

No nos sirven porque tienen el núcleo bilobulado 00:19:37

Y en el proceso es muy fácil que se rompan estos tallos 00:19:39

Y entonces aislamos pequeños lóbulos que no tienen todo el material genético de las células 00:19:43

Pero monocitos y linfocitos tienen un núcleo que no es lobulado. Para poder purificar de la sangre específicamente estos leucocitos, pongo aquí más o menos donde están, son estos los monocitos y los linfocitos, se hace un proceso que se llama centrifugación en gradiente de densidad. 00:19:48

Es decir, que vamos a centrifugar, pero con un medio de separación que nos va a permitir obtener los PBMCs de forma selectiva. 00:20:12

Este medio de separación tiene dos componentes. 00:20:24

Por un lado, el ficol, que es un polisacárido muy denso, muy muy muy denso, y el diatrizodato sódico. 00:20:27

Uno aporta la densidad, el ficol, y el otro la osmolaridad, el diatrizodato sódico. 00:20:36

Cada uno tiene su función dentro del medio de separación. ¿Cuál es el procedimiento? Pues el procedimiento es muy sencillo. Cogemos un tubo de centrífuga y ponemos el medio de separación en la parte de abajo. 00:20:42

Muy denso, como es muy denso, se va al fondo del tubo y después con mucho cuidado colocamos la sangre encima, dejándola resbalar por la pared y que se vaya depositando por encima del medio de separación sin que se mezclen, sin que se mezclen con mucho cuidado y así se forman dos fases. 00:20:55

Bien, y lo que hacemos ahora es centrifugamos bastante rato y a baja velocidad. 00:21:16

¿Qué es lo que ocurre? Al centrifugar todos los componentes que hay aquí van a ir atravesando el ficol, ¿sí? 00:21:23

Y a cada uno de los componentes, al atravesar el ficol, le pasan cosas diferentes. 00:21:30

El ficol en los hematíes facilita que se agreguen. 00:21:35

Si los hematíes se agregan, ya no tenemos células pequeñitas, sino que tenemos agregados multiritrocitos de grandísimo tamaño. Podemos tener un montón de eritrocitos. Imaginaos estos agregados de eritrocitos, ¿dónde van? Exactamente, al fondo del tubo. ¿Por qué? Porque ahora ya son agregados de grandísimo tamaño, al fondo del tubo. 00:21:41

Bien, ¿qué ocurre con los granulocitos? Los granulocitos tienen una mayor densidad que el ficol. Si tienen mayor densidad que el ficol, no lo pueden atravesar y se van a quedar encima del ficol, aquí. 00:22:06

Los neutrófilos, por ejemplo, que vayan por aquí, por aquí, por aquí, cuando lleguen con el ficol no lo pueden atravesar porque son más densos. Se quedan ahí arriba. ¿Sí? Perdón, perdón, perdón. Me estoy equivocando con los linfocitos. Eso es. Los granulocitos también se van al fondo del tubo. Cierto. Que me he equivocado. 00:22:19

Y son las células mononucleares las que no pueden atravesarlo porque tienen menor densidad. Eso es, eso es. Disculpa el despido. De tal manera que después de centrifugar tenemos cinco fases. 00:22:38

Red blood cells, los eritrocitos al fondo del tubo, ya hemos dicho que formaban unos agregados de enorme tamaño 00:22:53

Los granulocitos, eosinófilos, vasófilos y neutrófilos, justo por encima de los eritrocitos 00:23:00

Pero atraviesan el ficol porque tienen mayor densidad 00:23:10

A continuación, la capa de ficol 00:23:13

Por encima, los pbmc, porque los pbmc tienen menos densidad, no pueden atravesar el ficol 00:23:15

Y el plasma queda por encima, con todas sus proteínas plasmáticas. ¿Veis? Estas son imágenes reales de un ficol antes de centrifugar. Ya hemos puesto el ficol y hemos depositado la sangre formando estas dos fases. Lo ponemos a centrifugar y aquí se ven las células mononucleares, polimorfonucleares, que son los granulocitos, todo el medio de separación, las células mononucleares, que serían esta interfaz de aquí, y todo el plasma. 00:23:22

¿De acuerdo? Lo único que tenemos que hacer ahora es retirar con cuidado el plasma y coger los PBMCs que estarían aquí. Y ya lo sabríamos. Lo resuspendemos y ya tenemos nuestra suspensión celular de PBMCs. 00:23:50

Bien. Es un poquito lo que os digo. ¿De acuerdo? Bien. Otro tipo de muestra muy habitual en los laboratorios son fragmentos de tejido fresco. Por ejemplo, decíamos antes una biopsia. 00:24:03

biopsia. El pretratamiento no es ni más ni menos que una disgregación. Vamos a disgregar 00:24:21

este tejido para intentar liberar las células de aquí y sacarlas de aquí, porque todas 00:24:28

las células en el tejido están dentro de una matriz extracelular. Esta disgregación 00:24:34

puede ser mecánica, puede ser química, vamos a verlo ahora, para poder obtener una suspensión 00:24:39

Bien, de momento nos quedamos aquí. Muy bien, el pretratamiento para tejidos frescos es lo que llamamos homogeneización. Hay que homogeneizar el tejido, que es un tratamiento bien mecánico o químico al que se somete el tejido para liberar y desintegrar las células que lo integra. 00:24:45

Integra. ¿Cuánto tejido necesito? Pues depende, depende. Depende del tipo de tejido, del proceso que voy a utilizar para homogenizar y después el procedimiento posterior de extracción. 00:25:05

Pero bueno, para tejidos animales y vegetales, no sé bien si vienen los apuntes o no, pero bueno, me parece que no es muy importante, pues se necesita más o menos cantidad. 00:25:19

Tejidos vegetales, como tienen mucha pared, pues claro, necesitan mucha más cantidad de tejido de partida para obtener la misma cantidad de denier. 00:25:29

Bien, un ejemplo es la homogenización mecánica. 00:25:38

Además es una homogenización mecánica que actualmente se lleva de forma automatizada. Y se utilizan trituradores mecánicos. Por ejemplo, este es un ejemplo de esos trituradores mecánicos en los cuales se utilizan unas microsferas, unas bolitas, que pueden ser de látex, de plástico, de cristal, de metal, de un grosor diferente. 00:25:42

Hay diferentes diámetros dependiendo de la dureza y la resistencia del tejido. 00:26:03

No es lo mismo un tejido blando, tejido diposo, que un tejido cartilaginoso que tiene mucho colágeno. 00:26:07

Entonces aquí meteríamos nuestro tejido con un buffer determinado y esto que parece una centrifuga lo único que hace es agitar hacia arriba y hacia abajo continuamente. 00:26:14

Sí, sí, hacia arriba y hacia abajo. 00:26:25

Tan fuerte que obliga a que las esferas choquen continuamente con el tejido y lo, digamos, trituran. 00:26:27

Esto es una trituración mecánica. 00:26:34

Luego lo que haríamos sería recoger todo este sobrenadante que tenemos las células. 00:26:37

Ya no tendremos tejido, sino las células. 00:26:43

Bueno, se puede hacer también de manera manual. 00:26:46

Clásicamente se utilizaban estos morteros. 00:26:49

Actualmente ya no se hace así. 00:26:51

Y aunque lo, creo que está en los apuntes, lo que hacíamos era, lo que se hacía es una congelación rapidísima en nitrógeno líquido, de tal manera que coges el tejido y lo petrificas y después lo conviertes en polvo con el brazo del mortero y ya después añadirías una solución tamponadora para poder resuspender las células. 00:26:53

También se utiliza mucho, en lugar de una homogenización mecánica, una química 00:27:17

Para ello lo que hacemos es coger el tejido y lo incubamos a alta temperatura durante mucho tiempo 00:27:23

Con una solución disigregadora que tiene detergentes y proteasas 00:27:33

La que más se utiliza es la proteína Saka 00:27:40

La veremos también más adelante 00:27:42

La proteína saca es un enzima proteolítico que digiere las proteínas de la matriz extracelular de manera que libera las células de origen. 00:27:45

Luego centrifugaríamos, recogemos el sobranante, que es donde tenemos nuestras células en suspensión. 00:27:56

Bien. 00:28:03

Otras veces, en lugar de quedarnos aquí en la suspensión celular 00:28:04

Si hay poquitas células del tejido, a veces nos conviene ponerlas y cultivarlas 00:28:13

Y hacer lo que llamamos un cultivo primario, si os acordáis 00:28:19

Entonces, estas poquitas células del paciente 00:28:22

Que las hemos desgregado de su tejido, de la biopsia 00:28:25

Las vamos a expandir un litro 00:28:29

Entonces, a veces al laboratorio, para que podamos extraer y purificar el DNA, nos dan una plaquita y de estas células que están en cultivo tenemos que extraer los ácidos nucleicos. El pretratamiento no es ni más ni menos que la recolección de las células. Vamos a coger estas células y ya depende de si es un cultivo en suspensión o un cultivo en monocapa. 00:28:32

Si las células ya están en suspensión y están creciendo en suspensión, lo único que hago es centrifugar la muestra, ¿sí? Centrifugamos la muestra, se van todas las células al fondo del tubo, retiro el sobrenadante, ¿sí? 00:28:54

Y lo que hago es, este pellet ahora lo resusprendo con un medio que a mí me interesa para tener finalmente la suspensión celular. Muy bien, muy fácil. 00:29:11

Si están creciendo en monocapa, antes de centrifugar desde la plaquita donde están creciendo, si os acordáis, esto en el tema de cultivos celulares se ve, lo primero que tenemos que hacer es tripsinizar las células. 00:29:23

y sinizar las células para despegarlas del fondo de la placa. 00:29:37

Y una vez las hemos tripsinizado, seguimos el mismo proceso. 00:29:42

Centrifugamos las células que se irán al fondo del tubo, 00:29:46

retiramos el sobrenatante, añadimos una solución adecuada 00:29:49

y ya tenemos nuestra suspensión. 00:29:52

Esto es un poquito lo que muestran aquí los diferentes tipos de células 00:29:57

y los diferentes tipos de procedimientos. 00:30:01

Los tenéis aquí en la presentación, pero básicamente es como se ha hecho. 00:30:04

¿De acuerdo? 00:30:08

Bien 00:30:08

Vaya, pero algunas veces 00:30:09

Esos tejidos 00:30:12

No nos vienen a nosotros directamente 00:30:13

Es decir 00:30:17

Tiro un poquito para atrás 00:30:19

Este tejido 00:30:22

Antes de llegar al laboratorio clínico 00:30:24

Puede haber pasado por el laboratorio 00:30:27

De anatomía patológica 00:30:29

Entonces en el laboratorio de anatomía patológica 00:30:31

Este tejido lo van a fijar 00:30:34

Por lo tanto ya no es un tejido fresco 00:30:36

Lo han fijado para intentar evitar que se pudra los fenómenos de putrefacción. Lo han metido en parafina para poder hacer cortes finísimos y poder estudiarlo al microscopio. 00:30:38

Entonces nosotros a veces luego, por ejemplo, el oncólogo nos dice, bueno, tenéis que hacer un análisis genético para ver mutaciones en este tejido. 00:30:51

Entonces, lo que nos manda a nosotros al laboratorio son varios cortes. 00:31:01

Entonces, cuando un tejido está fijado en formol, el objetivo fundamental de esta fijación es preservar su arquitectura y la estructura de las células y evitar los fenómenos de putrefacción del tejido. 00:31:09

Y para que se conserve bien y se pueda cortar, son incluidos en bloques de paracina, de cera líquida, que luego solidifica. 00:31:23

Bien, se puede fijar por inyección, tal y como se ve aquí, por inmersión 00:31:31

Pero bueno, una cosa que sí que tenemos que tener en cuenta, que es muy importante a tener en cuenta 00:31:38

Es que la calidad de los ácidos nucleicos que vienen de estas muestras es mucho peor que el resto de muestras frescas 00:31:43

¿Por qué? Porque la fijación deteriora los ácidos nucleicos 00:31:51

Y para incluir en parafina, hemos de incubar la muestra durante mucho tiempo a elevadas temperaturas. Estamos hablando de 65 grados aproximadamente durante mucho tiempo. 00:31:54

Entonces, el proceso para que podamos entender qué es lo que hacemos nosotros en el laboratorio, tenemos que intentar entender qué es lo que hacen los de anatomía patológica en el laboratorio para fijar e incluir en parafina. 00:32:07

Fijaos, cuando llega el tejido, lo que hacen es la fijación, que puede ser por perfusión o por inmersión, en formol normalmente. 00:32:20

Después de un tiempo determinado, según sus protocolos, lo que hacen es deshidratar el tejido. 00:32:31

Lo deshidratan. El tejido está lleno de agua. El 70% del contenido de la célula es agua. 00:32:37

Entonces lo que van haciendo para deshidratar es cambiar el agua de las células y del tejido por etanol 00:32:43

Y para eso incuban y hacen varios lavados, 3 de 10 minutos, en diferentes soluciones 00:32:52

Con etanol, alcohol, cada vez de graduación mayor, hasta que llegan a etanol 100% 00:33:00

Esto lo que permite es que el agua que hay en las células se intercambie 00:33:07

Se diluya, se intercambia con el etanol 00:33:12

De tal manera que ahora, como fuera, hay muchísimo más etanol que agua 00:33:15

El agua del tejido sale y entra dentro de las células etanol 00:33:22

Eso mismo ocurre aquí, ocurre aquí 00:33:26

Y cuando estamos en etanol 100%, el tejido está deshidratado 00:33:30

Ya no hay agua dentro de las células 00:33:34

Lo que hay es etanol puro 00:33:37

Y lo que hacemos ahora es incubar con un líquido intermedio, lo que llamamos un transicional. Por ejemplo, el xileno, el xilol o el butanol, que es otro alcohol de etanol, que después de estos lavados, el etanol es cambiado, sustituido por el xilol, xileno o por el butanol, que también se utiliza mucho. 00:33:38

El butanol. ¿Y esto qué gracia tiene? ¿Por qué no nos vale el etanol? Porque el xilol y el butanol son diluyentes de la parafina. Entonces, ahora lo metemos en una estufa a unos 60 grados y lo que hacemos ahora son diferentes lavados en el que ponemos el tejido que está repleto de xilol y butanol, lo metemos dentro de parafina líquida. 00:34:01

Lavados largos, una hora, una hora, dos horas, de tal manera que ahora como la parafina se diluye en el xilol, donde hay xilol o butanol, entra la parafina y todo el tejido queda embebido, todas las células por dentro ya no tienen xilol. 00:34:28

Donde había agua, pusimos etanol. Donde había etanol, lo cambiamos por xilolbutanol. Y ahora, donde había etanol, xilolbutanol, tenemos cera. Parafina. Perfecto. Tenemos las células repletas hasta arriba de parafina. 00:34:48

Y lo único que hacemos es meter el tejido embebido en parafina en un encastre, ¿sí? Que es como una especie de molde, más o menos, y ya dejamos solidificar, ¿sí? Lo dejamos solidificar y obtenemos nuestro bloque de parafina listo para poder ser corta. 00:35:06

Bien, esto es un ejemplo de un bloque de parafina con diferentes tejidos, uno, dos, tres, que los han embebido, aquí tenemos el molde y después de solidificar aquí lo tenemos. 00:35:25

Y lo que hacemos es con estos bloques, lo metemos aquí en un microtomo y le vamos dando a la manivela. Por cada vuelta de la manivela, esto es como si fuera un émbolo que sube y baja. 00:35:38

Cada vez que sube y baja, aquí tenemos una cuchilla, esta parte de aquí. Cuando baja, realiza un corte del grosor que nosotros le indicamos aquí. 10 micras, 5 micras, 20 micras. Cada giro que da, baja, hace el corte y cuando vuelve a subir, esto sale hacia afuera, lo que le hayamos puesto aquí. 10 micras, 20 micras. Y volvemos a hacer otro corte, y otro corte, y otro corte. 00:35:50

Bien, cuando pedimos una muestra para hacer un análisis genético desde el laboratorio de biología molecular, nos mandan cuatro o cinco cortes de estos, de los cuales tenemos que extraer y purificar el lémina. 00:36:16

Bien, perfecto. Pues entonces, una vez nos han llegado esos cortes, el proceso que tenemos que realizar es el proceso inverso a lo que han hecho en anatomía patológica. 00:36:31

Tenemos el tejido dividido en parafina. Lo primero que hacemos es meterlo a 60 grados para que toda la parafina del tejido se vuelva líquida, se licúe. 00:36:44

Y lo que hacemos ahora es intercambiar y cambiar la parafina por xilol o putanol, haciendo varios lavados. 00:36:54

Después hacemos la serie de etanoles, pero no para deshidratar. En este caso ahora sería para rehidratar. 00:37:05

¿Sí? Rehidratar. Y vamos para atrás. 00:37:14

Y una vez ya tenemos rehidratada la muestra, ahora ya sí, a partir de aquí, podemos deshidratar las células 00:37:20

para tener una suspensión celular. 00:37:26

¿De acuerdo? Bien. 00:37:30

Bueno, aquí os pongo en la presentación un poco el protocolo, 00:37:33

pero básicamente es esto. 00:37:35

¿De acuerdo? Pues acabo. 00:37:37

¿Qué otras muestras biológicas nos pueden llegar al laboratorio? 00:37:39

Por ejemplo, cultivos de bacterias y levaduras del Laboratorio de Microbiología. 00:37:42

Esta es una placa de Agar-Levin con estas colonias muy características verde metalizadas 00:37:46

que son de Escherichia coli. 00:37:53

Pues nada, aquí lo único que tenemos que hacer es coger estas células, estas colonias que están en la célula y hacer una suspensión celular como en un tampón de resuspensión de suspensión. 00:37:54

Bien, y entonces si es un cultivo líquido, pues aquí tendríamos nuestros tubos y aquí tendríamos todas las bacterias, pues jugamos como si fuera un cultivo de células en suspensión. 00:38:06

Serían al fondo del tubo, retiro el niño de cultivo, el sobrenadante, etcétera, como hemos visto antes. 00:38:17

Y si es en un medio sólido, lo que hacemos es recogemos una colonia y la resuspendemos en un tubo en el que tenemos un medio de resuspensión. 00:38:24

Y aquí la resuspendemos. 00:38:34

Y ya lo tenemos. Es sencillo. 00:38:37

Células de la mucosa oral, lo mismo. 00:38:40

Cogemos, centrifugamos la suspensión celular y a veces hay soluciones y kits comerciales que lo hacen en un único paso. 00:38:43

¿Sí? Bien. 00:38:52

se pueden utilizar este tipo de cepillitos 00:38:53

a veces en prácticas 00:38:56

del laboratorio 00:38:58

lo hacemos con los estudiantes para rascar 00:39:00

las mejillas por la parte interior 00:39:02

y así poder coger más células 00:39:04

y más cantidad de ADN 00:39:06

si es una muestra 00:39:07

de esputo por ejemplo de un paciente 00:39:10

que tiene neumonía hay que fluidificar 00:39:12

porque tiene una elevada 00:39:14

cantidad de mucosidad 00:39:16

ya sabéis que se utiliza un agente 00:39:17

mucolítico como es la N-acetil 00:39:20

cisteína, en la disolución de citrato sódico, la acetilcisteína está en todos los jarabes 00:39:22

mucolíticos para descongestionar cuando tenemos un catarro fuerte. Pues hacemos un primer 00:39:30

tratamiento del esputo para fluidificar la muestra y después de ahí extraemos las células. 00:39:38

¿Sí? Bien, pues entonces os recuerdo, independientemente de cuál era la muestra de partida, ¿sí? Sangre, todas las que hemos estado viendo, hemos realizado un pretratamiento, ¿sí? 00:39:44

Y en este pretratamiento, el resultado final ha sido obtener una suspensión celular. 00:39:59

Aquí, en un tubito, en el seno de un fluido, vendría ahora la fase de extracción, que es la segunda parte. 00:40:07

Bien, el proceso de extracción consiste en la obtención del lisado celular. 00:40:16

Por tanto, a las células vamos a romper las paredes y las membranas para obtener un lisado, 00:40:21

que es una mezcla, ni más ni menos, que a partir de esta suspensión celular vamos a obtener en nuestro tubo una mezcla heterogénea de todos los componentes intracelulares, 00:40:27

desde núcleos completos, orgánicos completos, restos de membranas, proteínas, glúcidos, y por aquí entre medias tendremos las hebras de nuestros ácidos nucleicos. 00:40:40

¿Sí? Bien. Ya vendrá después la fase de purificación. 00:40:52

Bien, para poder romper las células, los tejidos y extraer los ácidos nucleicos del interior de la célula 00:40:57

tenemos muchos métodos 00:41:04

Hay métodos mecánicos, por ejemplo, por sonicación con ondas de radiofrecuencia, de elevada energía 00:41:06

que lo que hacen es que rompen al chocar las ondas, que son ondas físicas 00:41:13

al chocar con la membrana, la rompen 00:41:17

podemos utilizar detergentes 00:41:20

o hacerlas pasar a alta presión 00:41:22

por un espacio pequeño, capilar muy estrecho 00:41:25

de tal manera que la membrana no resiste 00:41:27

y se rompe 00:41:29

o por zigzagueamiento 00:41:30

el short cells 00:41:32

es esto, utilizar un émbolo 00:41:35

que va dando vueltas 00:41:36

de tal manera que el espacio que queda entre la pared 00:41:38

y el émbolo es muy estrecho 00:41:41

muy parecido a este método 00:41:42

y entonces las células tienen que quedarse aquí aplastadas 00:41:43

y reventar 00:41:46

Métodos mecánicos, métodos más químicos 00:41:47

Eso ya depende del método 00:41:51

Vamos a ver los que más se utilizan 00:41:53

¿Sí? 00:41:55

Bien 00:41:56

El proceso de extracción implica 00:41:56

Dos etapas 00:42:00

O dos cosas que se pueden hacer a la vez 00:42:02

Y son muy importantes 00:42:04

Por un lado, como hemos dicho, la lisis celular 00:42:05

Para liberar los ácidos nucleicos 00:42:08

Hay que romper la pared 00:42:10

Si es que tienen pared, esas células 00:42:11

Y la membrana 00:42:13

Pero en segundo lugar, hay que inhibir 00:42:14

Inactivas las nucleasas. Es decir, las DNAs y RNAs. Las DNAs son enzimas nucleasas que fragmentan una molécula de DNA. Cogen cualquier molécula de DNA y la empiezan a fragmentar. De tal manera que cuando analicemos la integridad, si hay DNAs, habrá fragmentos de DNA. Trozos. DNA trocea. 00:42:17

Y las RNAs es lo mismo, pero específicamente de las moléculas que son de RNA. 00:42:39

Bien, pues de alguna manera tenemos que llevar a cabo todos los procesos a la hora, a la vez que rompemos las células, intentar inactivar estas nucleasas que están en todos lados. 00:42:46

Las células tienen nucleasas en su interior y sobre todo las RNAs además son muy resistentes. 00:42:57

sistemas. Bien. Esto lo conseguimos incubando la suspensión celular con una solución de 00:43:03

lisis. ¿Qué es esto de una solución de lisis? Una solución con diferentes componentes que 00:43:12

me van a permitir lisar las células e inactivar las nucleasas. ¿Sí? Las células que tienen 00:43:18

pared vegetal, pues a veces, además de incubar con solución de lisis, habrá que hacer alguna 00:43:24

cosa más que lo que veremos después. ¿De acuerdo? Bien. ¿Cuáles son los componentes 00:43:28

de la solución de lisis? Este apartado es muy importante. Podéis poner aquí un asterisco 00:43:36

y poner al lado muy importante. Probabilidad de preguntarlo de una manera o de otra. El 00:43:42

examen estaría en torno al 100%. Por tanto, es muy importante. Primer componente de toda 00:43:49

solución de elixir, toda la solución de elixir 00:43:56

lleva detergentes, primer componente 00:43:58

los detergentes es el componente 00:44:00

principal 00:44:02

el detergente desestabiliza la membrana 00:44:03

desestructura la membrana 00:44:06

esa es su función 00:44:09

de tal manera que una célula 00:44:10

una membrana en presencia 00:44:12

de un detergente se desestabiliza y se rompe 00:44:14

tal cual 00:44:16

el detergente 00:44:18

que más se utiliza es el SDS 00:44:20

por supuesto no hay que saberse 00:44:22

la fórmula química ni la estructura química. 00:44:24

El dodecil sulfato sódico es el detergente que más se utiliza 00:44:28

para muestras humanas animales, células eucariotas animales, 00:44:32

y se suele utilizar en combinación con EDTA. 00:44:37

Detergentes más EDTA. 00:44:43

Hay otros detergentes que también se pueden utilizar 00:44:46

como el tritón X100 o el TUM20, 00:44:49

pero vamos, el que más se utiliza es el SDS. 00:44:52

¿Qué es lo que hacen los detergentes? 00:44:54

Los detergentes tienen una estructura muy parecida a los fosfolípidos de la membrana 00:44:57

Y lo que hacen es que se meten dentro de la estructura de la membrana 00:45:00

Pero claro, no es un fosfolípido 00:45:03

De tal manera que la desestabiliza 00:45:06

Entonces por aquí, por este punto es más frágil 00:45:08

Pero por aquí también, por aquí también 00:45:10

Y de tal manera que al final por aquí, por aquí y por aquí se rompe 00:45:12

Se rompe, se desestabiliza 00:45:16

Esa es la función principal 00:45:18

Segundo componente, ya hemos dicho que además del detergente lo vamos a acompañar de EDTA 00:45:21

El EDTA es un agente quelante de cationes divalentes 00:45:28

Tiene esta estructura, fijaos, esta parte de aquí, todos estos átomos de aquí forman un plano 00:45:32

Y luego tiene un brazo por la parte de arriba y un brazo por la parte de abajo 00:45:37

Y es aquí en este centro donde van a absorber 00:45:42

Cuando decimos agente quelante significa que del medio donde estén, en la disolución en la que estén, van a absorber y a retirar, en este caso, cationes divalentes. 00:45:48

y aquí lo que esto es que las aquí lo atraen del medio y aquí lo atrapa atrapa en este caso 00:46:01

que aquí no es viva lente pues tenemos el calcio el magnesio el manganeso el hierro 00:46:09

donde hay una molécula de dta como hay alguno de estos iones desaparece del mundo porque lo 00:46:21

atrapa. ¿Por qué ponemos EDTA? Porque el EDTA absorbe magnesio del medio de la solución 00:46:26

de lisis. Esto es muy importante porque las DNAs necesitan magnesio. Si yo pongo EDTA, 00:46:34

el EDTA absorbe el magnesio y las DNAs no pueden actuar. Por tanto, en la solución 00:46:42

de lisis, si pongo EDTA, al mismo tiempo que el detergente rompe y lisa la célula, el 00:46:48

BDTA inactiva las adeniasas y por tanto, aunque haya adeniasas, no pueden actuar porque les falta el magnesio. 00:46:56

Entonces no fragmentan el delito. 00:47:04

Muy bien. 00:47:07

Tercer componente, proteasas. 00:47:08

Dependiendo de cómo sean, si sobre todo son tejidos, si son tejidos frescos, es obligatorio poner proteasas para poder digerir las proteínas de la matriz extracelular, especialmente el colágeno. 00:47:10

Las células están embebidas. 00:47:23

en vivo, dentro de la matriz extracelular, pues esto ayuda mucho a que las células se rompan. 00:47:26

Y en la suspensión celular lo que hace es que estas proteasas digieren las proteínas de la membrana. 00:47:35

Todas las membranas celulares tienen proteínas. 00:47:45

Si digerimos las proteínas, también de alguna manera estamos desestabilizando la membrana. 00:47:49

Las que más se utilizan, las proteasas que más se utilizan son, como ya hemos visto, la proteína SAKA, ¿sí? Pero también hay otras, por ejemplo, la tripsina, que ya la conocemos también, la quimiotripsina, la pepsina, etcétera, etcétera. La que más se usa es la proteína SAKA. 00:47:56

Y podemos añadir o no, por ejemplo, agentes caotrópicos. ¿Qué son los agentes caotrópicos? Son agentes, compuestos químicos, que cuando los ponemos en una solución crean el caos. ¿Y eso qué significa? Son moléculas especializadas en desnaturalizar, desestructurar macromoléculas. 00:48:14

uno en concreto 00:48:34

que hay que conocerlo 00:48:37

es el isotiocianato de guanidinio 00:48:38

que desestabiliza 00:48:40

específicamente las RNAs 00:48:43

las RNAs 00:48:45

entonces, si yo quiero inactivar 00:48:46

las RNAs 00:48:48

porque quiero purificar RNA 00:48:50

pondré isotiocianato de guanidinio 00:48:53

en la solución de Mises 00:48:55

¿de acuerdo? 00:48:58

bien 00:49:00

esto es en general 00:49:00

Son los componentes en general. Luego, dependiendo del tipo de muestra, pues hay que añadir diferentes mezclas de detergentes y algún componente más. 00:49:04

¿De acuerdo? De tal manera que podéis hacer como ejercicio, como ejercicio, pensar cuál es la composición, ¿sí? ¿Cuál sería la composición de la delisis buffer, solución delisis, si yo quiero específicamente extraer y purificar de las células el DNA? 00:49:13

¿Y cuál sería la composición si lo que quiero es extraer y purificar? 00:49:38

Específicamente es el de RNA. 00:49:44

Solo DNA, solo RNA. 00:49:46

Lo podéis hacer como ejercicio y ya lo corregimos. 00:49:50

¿De acuerdo? 00:49:53

Bien. 00:49:54

Pero la solución del ISIS, además, si son células que tienen pare celular, hay que hacer un tratamiento aparte. 00:49:55

Se puede hacer un tratamiento enzimático. 00:50:03

Es decir, añadimos enzimas que lo que hacen, bien la lisocima o la liticasa, que son las que más se utilizan, la lisocima degrada la pared, pero específicamente las bacterias granpositivas, el péptido glicano. 00:50:05

Y la liticasa para células vegetales de levaduras y de hongos, es decir, para células eucariotas que tienen el paracelular. 00:50:19

tratamiento enzimático 00:50:28

incubo con estos enzimas durante un tiempo 00:50:30

y rompe la pared celular 00:50:32

y entonces después 00:50:34

las pongo con la solución de lisis 00:50:36

para que se rompan las membranas 00:50:38

pero también puedo hacer un tratamiento 00:50:39

mecánico 00:50:42

y hay de muchos tipos, por ejemplo puedo 00:50:43

llevar a ebullición 00:50:46

en agua destilada las células 00:50:49

de manera que la pared 00:50:50

se rompe 00:50:52

o por sonicación, ondas 00:50:53

de alta radiofrecuencia, de alta energía, o ciclos de congelación-descongelación, congelación-descongelación, de tal manera que al cabo de unos cuantos ciclos, literalmente se resquebraja la pared y se rompe. 00:50:56

O puede hacer un tratamiento con Cetab. El plúmulo de cetiltrimetilamonio es, muchas veces sustituimos el SDS por este detergente fuerte. Es muy fuerte, es tan fuerte que es capaz no solo de desestabilizar las membranas, sino también de romper las paredes. 00:51:10

¿Sí? Bueno, esto facilita, por ejemplo, la rotura de los polisacáridos y derivados polifenólicos que están dentro de algunas de las partes. ¿De acuerdo? Bien. 00:51:31

¿Cómo verificamos si la lisis ha sido completa? 00:51:45

Pues porque en el tubo tiene que haber una solución homogénea 00:51:49

No debe haber grumos 00:51:52

Y esto se ve muy bien 00:51:54

Cuando lo miras al trasluz 00:51:56

Si hay grumos en el tubo 00:51:57

Se ve turbio 00:52:05

Si la mezcla se ve turbia 00:52:06

Es porque hay grumos y partículas en suspensión 00:52:08

Entonces la lisis ha sido incompleta 00:52:11

Habría que repetir la lisis. ¿De acuerdo? Y bien, un componente más que hay que añadir en la solución de lisis, cuando queremos extraer específicamente DNA, añadimos RNAs para cargarnos y para romper el RNA, porque quiero extraer DNA. 00:52:14

Pero si yo lo que quiero extraer es el RNA, puedo añadir deneasa, normalmente deneasa 1. Entonces, dentro de la solución del ISIS, además, puedo añadir deneasas y RNAsas, que son las nucleasas contrarias del ácido nucleico que yo quiero extraer y purificar. 00:52:36

¿De acuerdo? Bien. Muy bien. Perfecto. Yo tenía mi suspensión celular, he utilizado diferentes procedimientos y ahora lo que he obtenido es un lisado celular, todos los componentes de la célula, aquí una mezcla muy muy muy heterogénea, comienza el proceso de purificación. 00:52:55

Es decir, el proceso por el cual de esta mezcla heterogénea que hemos llamado lisado celular, de aquí vamos a extraer y purificar específicamente estos ácidos nucleicos y los vamos a separar del resto de componentes, proteínas, orgánulos, de bricelular, resto de orgánulos. 00:53:17

Importante, importante, todos los métodos de purificación se basan en mayor o menor medida en las propiedades físico-químicas de los ácidos nucleicos, que ya las hemos estudiado. 00:53:39

¿De acuerdo? Muy bien. Aquí las tenemos. Ya sabemos que son diácidos, elevada viscosidad, etc. 00:53:52

En base a estas propiedades, que son únicas de los ácidos nucleicos y las diferencian de proteínas, glúcidos, lípidos, en base a estas propiedades se han ideado diferentes métodos de publicación, que son los que vamos a ver. 00:54:00

Este orden está un poquito diferente al orden que sigue en los apuntes, pero están todos los métodos. 00:54:15

Todos estos son métodos que se utilizan mucho en los laboratorios y los vamos a ir viendo uno. 00:54:25

Bien. Purificación con solventes orgánicos. ¿En qué se basan? En que dentro del lisado celular hay algunos componentes que son apolares, hidrófobos, y entonces se diluyen muy bien en solventes orgánicos, digamos como oleosos, tipo como si fueran lipídicos. 00:54:30

Y otros componentes que se llevan muy bien y se disuelven muy bien en solventes acuosos, porque son polares, porque son hidrosolubles. Genial. Pues en base a esta característica, yo puedo separar algunos componentes de otros, los acuosos y los orgánicos. 00:54:51

Entonces, se basa en la distinta solubilidad de los componentes del lisado en solventes orgánicos y acuosos. 00:55:10

El procedimiento tiene varias fases, pero la primera fase es eliminar los compuestos que son solubles en solventes orgánicos. 00:55:18

Los ácidos nucleicos son solubles en solventes acuosos. 00:55:28

Aquí, por ejemplo, las proteínas. 00:55:33

¡Uf! Es una gran mayoría. 00:55:38

Y una vez hemos eliminado todos estos componentes, estas fases las vamos a ver una única vez, 00:55:40

porque son las tres fases que siempre se realizan en todos los métodos al final. 00:55:47

Precipitamos el DNA, lavamos el DNA y resuspendemos el DNA. 00:55:51

Lo vamos a ver. 00:55:56

Bien, lo pongo aquí en este esquema. 00:55:57

Nosotros del lisado celular lo que hacemos es añadir una mezcla. 00:56:01

El lisado celular es una solución acuosa, porque tiene un bafo. Esta es la solución acuosa. Y lo que hacemos es añadir una fase orgánica que no se llevan bien, que no se mezclan. Forman dos fases. Es como el agua y el aceite. Por mucho que yo los mezcle, nunca jamás se van a disolver uno en el otro. 00:56:05

Y entonces, esta fase orgánica es una mezcla de fenol, cloroformo y ácido isoamínico, tres componentes de naturaleza orgánica polar. 00:56:27

Lo añado, ¿sí? Se forma una fase superior, una fase inferior y lo que hago ahora es un vórtex, un vórtex de una excitación muy fuerte, 00:56:37

de tal manera que se van a mezclar una fase con la otra y todos los componentes unos con otros. 00:56:48

De tal manera que todos los componentes que están aquí, que sean orgánicos, al mezclarse con la fase superior, van a sentirse atraídos por la fase orgánica y por los componentes orgánicos. 00:56:53

Y lo que hago ahora, si yo esto cojo el tubo después de agitarlo tanto y lo dejo de forma pasiva, como el aceite y el agua se separan. 00:57:06

Lo que hacemos nosotros es, para acelerar el proceso, lo que hacemos es una centrifugación. 00:57:14

Antifugamos a una determinada velocidad y vuelven a formarse las dos fases. 00:57:21

Abajo quedará la fase orgánica con todos los componentes orgánicos y arriba la fase acuosa. 00:57:26

En esa fase acuosa, entre otros componentes, estarán los ácidos nucleótidos. 00:57:34

Lo que hago ahora es, recojo la fase acuosa intentándonos llevar a la fase orgánica y la pongo en un tubo limpio. 00:57:39

Bien, ya he separado los solventes orgánicos de los acuosos. Era la primera fase, si os acordáis. Y ahora, bien, la precipitación del DNA, el lavado y la suspensión. 00:57:46

¿Qué es lo que hacemos ahora? Claro, aquí yo tengo las fibras de DNA que estarán por aquí, de RNA que son grandes, pero hay glúcidos, hay aminoácidos, hay sal y minerales. Todos esos son contaminantes y también se llevan muy bien con el agua. 00:58:00

Lo que hago ahora es que como las moléculas más grandes son las de ácidos nucleicos, pongo una serie de condiciones físico-químicas en el tubo que hacen que las moléculas de ADN agreguen unas con otras y se vayan al fondo. Eso es lo que llamamos precipitar el ADN. 00:58:16

¿Cómo lo conseguimos? Añadiendo una sal fuerte, elevada concentración de acetato sódico y un alcohol frío, etanol 100%, isopropanol, cualquiera de ellos. 00:58:33

Esta mezcla hace que las moléculas de DNA formen ovillos, ovillos fibilares que se ven muy bien, fijaos que se ven aquí muy bien, ovillos fibilares de gran tamaño y lo que hago ahora es centrifugar y al centrifugar estos ovillos se van al fondo líquido. 00:58:48

Nada, lo que tengo que hacer ahora es, retiro el sobrenadante y en este sobrenadante van el resto de componentes del lisado de la fase acusa. Glúcidos, aminoácidos, nucleótidos sueltos, sales minerales, etc. Los he eliminado en este sobrenadante. 00:59:06

Y lo que hago ahora es lavo el DNA. Este DNA que al precipitar puede haber atrapado sales minerales, que es lo más habitual, o algún otro componente, añado etanol 70 para lavarlo. Lo mezclo muy bien para retirar todas las sales minerales. 00:59:30

minerales, vuelvo a centrifugar, vuelve a quedarse en el fondo del tubo, retiro esto 00:59:47

de aquí con toda la suciedad que se ha lavado y última fase, resuspendo. Resuspender el 00:59:56

DNA en un tampón adecuado, tampón T, el tampón O, agua bidestilada, lo resuspendería 01:00:07

Y ya tendría, como vemos aquí, nuestros ácidos nucleicos purificados. Tampón T es un tampón que lleva tris, que mantiene el pH constante y lleva RTA. De ahí el nombre TE. RTA para inhibir las nucleasas, las DNAs es especial. 01:00:15

ya ves 01:00:31

un primer método 01:00:33

sencillo, es largo 01:00:35

pero fácil 01:00:37

el siguiente método 01:00:39

bueno, esto normalmente se lleva a cabo 01:00:40

ya no hace falta poner fenol 01:00:43

cloroform, isoamílico 01:00:45

en concentraciones creo que eran 25-24-1 01:00:46

o algo así 01:00:50

sino que ya venden reactivos 01:00:50

el trizol, por ejemplo 01:00:53

que ya lleva la mezcla orgánica 01:00:54

que ponemos al disal 01:00:56

y lo hace todo más fácil 01:00:57

Bien 01:00:59

El segundo método es la precipitación 01:01:03

Con sales 01:01:06

¿En qué se basa? 01:01:07

Se llama el saltino 01:01:10

En que a elevadísimas concentraciones salinas 01:01:11

Las proteínas agregan y precipitan 01:01:14

Solo las proteínas, el DNA no 01:01:16

Bien 01:01:18

¿En qué se basa este procedimiento? 01:01:20

Este procedimiento entonces tiene también cuatro fases 01:01:22

Ya veis que estas fases son las mismas que las anteriores 01:01:24

La diferencia es la primera 01:01:26

Lo primero que vamos a hacer es 01:01:28

Coger el lisado celular, ponerle una elevada concentración de sales para que precipite las proteínas y luego precipitamos el DNA, lavamos y resuspendemos. Esto siempre es igual. 01:01:29

Bien, este método se utiliza mucho para muestras de sangre, sangre anticoagulada, a la cual lo que vamos a hacer es, como ya hemos visto antes, por ejemplo, el método de lisis de eritrocitos. Se rompen los eritrocitos, nos quedamos con todos los glucocitos, añadimos fase de extracción la solución de lisis, tendríamos nuestro lisaoce. 01:01:41

Perfecto. ¿Qué es lo que hacemos ahora? Añadimos una solución precipitante de proteínas, ¿sí? Esta solución precipitante de proteínas tiene una elevada concentración de sales, ¿sí? 01:02:04

Entonces, inmediatamente todas las proteínas que tenemos aquí empiezan a agregar unas con otras, unas con otras, unas con otras. 01:02:17

¿Por qué se utiliza mucho muestra de sangre? Porque el plasma está lleno de proteínas, albuminas, globulinas, inmunoglobulinas, todas precipitan. 01:02:26

Si yo centro el jugo después, todas las proteínas se vienen al fondo del tubo. 01:02:34

Lo único que tengo que hacer ahora es, recojo esta fase de aquí, que es una fase acuosa, y la pongo en un tubo nuevo. 01:02:39

Entonces, a partir de ahora, lo que hago es, esas tres fases, precipitamos el DNA, lavamos el DNA y lo resuspendemos. En este caso, se puede añadir una mezcla de isopropanol, frío, o etanol 96 con acetato sódico otra vez, se forman los ovidos de DNA, centrifugo y todo el DNA va al fondo del tubo. 01:02:46

¿Sí? Retiro todo el sobrenadante, resustendo y la hago con etanol 70 este pellet, vuelvo a centrifugar, retiro el sobrenadante y ya lo único que tendría que hacer es resustender el pellet. 01:03:09

Ya tendría el mismo. ¿Sí? Un método también bastante sencillo. 01:03:27

Bien, el tercer y cuarto método son cromatografías. 01:03:32

Las cromatografías, como aquí un poquito lo veréis, esto se ve en TGL, la cromatografía es una técnica de separación en la cual se va a utilizar una fase o matriz, una fase estacionaria, también se llama matriz, como su nombre indica, es una serie de componentes que no se mueven y a través de ella vamos a hacer pasar una fase móvil. 01:03:39

La fase móvil es la que tiene los componentes que yo quiero separar. Por tanto, para nosotros la fase móvil es el lisado celular. 01:04:03

hay dos tipos de cromatografía que utilizamos 01:04:11

suelen ser cromatografías en columnas 01:04:16

que utilizan este tipo de columnas 01:04:18

donde por la parte de arriba podemos ir 01:04:20

añadiendo un montón de soluciones 01:04:22

y aquí en medio tenemos nuevamente 01:04:24

las matrices cromatográficas 01:04:26

o fase estacionaria 01:04:28

que está formada normalmente por esferas 01:04:29

de diferente naturaleza 01:04:32

esferas de látex, de vidrio, etc 01:04:34

¿sí? bien 01:04:36

a través 01:04:38

de esta columna cromatográfica 01:04:40

donde está la fase estacionaria 01:04:42

vamos a añadir nuestra fase móvil 01:04:44

que es el lisado 01:04:46

de manera que 01:04:47

dependiendo de las características 01:04:48

fisicoquímicas de la fase estacionaria 01:04:51

unos componentes 01:04:53

del lisado quedan 01:04:55

retenidos 01:04:57

y el resto de componentes 01:04:59

atraviesan y se van por la parte de abajo 01:05:01

¿sí? 01:05:04

entonces, esto no es ni más 01:05:05

el fundamento no es ni más ni menos que 01:05:07

idear una fase estacionaria que permita 01:05:09

retener los ácidos nucleicos 01:05:12

y que el resto de componentes pase 01:05:14

luego ya 01:05:16

al final de todo, cuando han pasado todos los componentes 01:05:17

lo que hacemos es eluir 01:05:20

eluimos el DNA 01:05:22

para que se suelte 01:05:23

bien 01:05:25

en este caso 01:05:27

en este caso 01:05:28

en la cromatografía de intercambio iónico 01:05:31

se fundamenta en que 01:05:34

la fase sólida 01:05:36

las fases estacionarias son bolitas que están cargadas positivamente. 01:05:37

He puesto grupos químicos positivos. 01:05:42

De tal manera que van a estar cubiertas por moléculas 01:05:44

y van a traer moléculas con carga negativa. 01:05:48

Pero no es lo mismo moléculas que tienen poquita carga negativa 01:05:51

que moléculas que tienen mucha carga negativa. 01:05:54

Estas se van a unir con una determinada fuerza 01:05:57

y estas se van a unir con elevadísima fuerza. 01:05:59

Bien, ¿cuáles son las moléculas más negativas de la célula? 01:06:02

Los ácidos nucleicos. 01:06:07

También hay que cuando yo, a través de la columna, pase el lisado, los ácidos nucleicos quedan anclados a las columnas. 01:06:09

Es importante tener en cuenta que esta unión electrostática por cargas es reversible. 01:06:16

También hay que yo, en un momento determinado, puedo obligar a que estos DNAs o moléculas muy, muy, muy negativas, 01:06:22

en un momento determinado, esta unión se rompa y se suelta. 01:06:28

¿De acuerdo? Para poderlo recuperar. 01:06:34

Pues este es el fundamento. El procedimiento es, dependiendo del pH y de la concentración de sales, la salinidad, la columna cromatográfica la vamos a cargar y vamos a permitir que se unan unos componentes o que se unan otros componentes. 01:06:35

¿De acuerdo? Bien, pues primero hacemos pasar un buffer, una solución, la disolución del lisado, que está en un tampón de baja salinidad y pH neutro. 01:06:54

A estas concentraciones todo lo que tenga carga negativa queda unido, de tal manera que aquí lo que vamos a eliminar es todo lo que tenga carga positiva o carga cero neutra. 01:07:07

Todos estos componentes positivos o neutros salen de la columna y no los hemos quitado. Y lo que hacemos ahora, el segundo paso, es ir añadiendo tampones de lavado, soluciones tampón, de concentración salina cada vez mayor y de pH también mayor. 01:07:18

¿De acuerdo? De tal manera que todas aquellas moléculas con poquita carga negativa se van soltando, se van soltando. 01:07:41

Solamente van a quedar adheridas y pegadas las moléculas de DNA, que son tremendamente negativas. 01:07:48

El último paso es, después de haber realizado todos estos lavados, cada vez a concentración salina superior, 01:07:55

el último paso es eluir la ilusión del DNA con tampón de máxima salinidad y pH máximo. 01:08:02

¿De acuerdo? Y ya eluye solamente el DNA, que es lo que ha quedado unido. ¿De acuerdo? Entonces, de tal manera que nosotros añadimos el lisado celular, todo lo que es positivo ya eluye, ¿sí? 01:08:08

De tal manera que después vamos a ir haciendo lavados con baja concentración de sales, salinidad media y de tal manera que se van a ir soltando y van a ir pasando y vamos a ir recolectando componentes de pequeña carga negativa con más carga negativa o con elevadísima carga negativa al final. 01:08:24

¿De acuerdo? De esta manera podemos llegar a eluir diferentes tipos de ácidos nucleicos. El mensajero que eluye antes que el ribosómico y antes que el líquido. ¿De acuerdo? 01:08:46

Bueno, esto sencillamente para que veáis qué grupos químicos tiene, si esto es la superficie de las bolitas de vidrio, pues hay un pequeño espaciador. 01:08:59

Esta es la molécula que tiene la carga positiva, que atrae al niño. 01:09:14

Pues esta es la cromatografía de intercambio. 01:09:21

La cromatografía de absorción es muy parecida, pero aquí no jugamos con las cargas. 01:09:23

Lo que jugamos se basa en la capacidad de absorción, absorción con D, de adherir, no de absorber con B, de unirse, adherirse los ácidos nucleicos al vidrio. Esto es algo al óxido de sílice, es algo propio de la sílice, ¿vale? Siempre y cuando haya sales caotrópicas. 01:09:29

Vamos a ver esto, fijaos, imaginaos que esto es la superficie de la bolita, que es una bolita de óxido de sílice que tiene esta estructura, esta estructura química, el óxido de sílice es polar, de tal manera que normalmente estas bolitas, si yo cojo la bolita y la meto en un tubo con agua, se forma a su alrededor, porque es una molécula polar, atrae moléculas de agua que forman toda una capa que llamamos desolvatación o hidratación alrededor, ¿sí? 01:09:51

Perfecto. Muy bien. Por su parte, el DNA también. El DNA a través de los grupos fosfatos, si os acordáis, que el esqueleto azúcar-fosfato que tiene carga negativa, también interacciona formando puentes de hidrógeno con moléculas de agua. Bien. Es decir, el DNA en solución acuosa también tiene una capa de hidratación y solvación. 01:10:21

¿Qué ocurre si yo pongo una bolita de sílice que está recubierta de agua, con el DNA también recubierto en su capa de solvatación? No pueden interaccionar. ¿Por qué? Porque agua y agua están cubiertos por agua. No pueden interaccionar, no quedan ateridos, no son ateridos. 01:10:40

Para que esto ocurra, entren. ¿Veis? No pueden interaccionar porque es agua y agua. Resbalan. No se pueden unir. La única manera de que la bolita y el DNA se puedan unir es retirar todas estas moléculas de agua. ¿Cómo? Amigo, añadiendo una sal caotrópica. 01:10:59

Las sales caotrópicas, que ya conocemos el isotiocianato de guanidinio, que es este de aquí, perdón, perdón, perdón, es este de aquí abajo, el isotiocianato es este. Ya veis que los agentes caotrópicos, algunos tienen efecto estabilizante y otros desestabilizante, que son los que nos interesan en estos métodos. 01:11:19

El isotiocinato tiene una capacidad desestabilizante brutal. Es de los que más. Es una serie o como una escala de este buen señor que ideó de estas sales caotrópicas. Cuando yo pongo una sal caotrópica, ¿por qué crea el caos alrededor? ¿Por qué desestabiliza macromoléculas? ¿Por qué absorben las moléculas de agua? Las absorbe. 01:11:37

Si yo cojo las bolitas en la cromatografía, añado una sal cautrófica, tanto el DNA como la superficie del sílice pierden sus moléculas de agua y aquí se crea un ambiente hidrofóbico donde no hay agua. 01:12:00

Como aquí no hay agua, esto automáticamente hace que el sílice y el DNA se adhieran, se peguen uno a otro y ya quedaría pegado. Formando una especie de puentes de hidrógeno, también pueden ser puentes con cationes de sodio. 01:12:14

Entonces, la purificación, la cromatografía, la absorción, se basa en la absorción y desorción, porque es un proceso reversible, de los ácidos nucleicos en presencia de sales caotrópicas para crear un entorno hidrofóbico alrededor del denier. 01:12:35

De tal manera que yo tengo el lisado celular, el lisado celular lo voy a hacer pasar por esta columnita donde aquí tengo las bolitas, en esta parte de aquí tengo las bolitas, en presencia de una sal caotrópica, pasarán todos los componentes y quedará adherido el DNA. 01:12:53

Cuando yo quiera que se suelte el DNA, lo que hago en este caso es añadir una solución de hidratación para que se vuelva a formar la capa de suelatación y se separen automáticamente DNA y bolitas. 01:13:10

Añadimos el lisado, centrifugamos para favorecer que pasen 01:13:25

Las moléculas de DNA quedan adheridas porque hemos puesto una salcada trópica 01:13:33

Y luego ya hacemos diferentes lavados 01:13:39

Y lo último es un tampón de hidratación, tampón TI o agua bidestilada 01:13:41

Que permite la ilusión del DNA y lo recoge 01:13:46

Pues bien, la purificación mediante esferas magnéticas es muy parecida a la anterior 01:13:48

Lo que hemos visto que ocurre con la sílice en presencia de sales caotrópicas también ocurre si las esferas son metálicas. Entonces utilizamos microsferas magnéticas en presencia de sales caotrópicas. Es el mismo proceso. ¿En qué se diferencia? ¿O por qué lo utilizamos? 01:13:57

Porque al ser microesferas magnéticas, yo con un imán puedo magnetizarlas y el proceso lo puedo automatizar. 01:14:15

¿Veis? Aquí hay aparatos. 01:14:25

Y todo el proceso de los lavados. 01:14:26

Si os dais cuenta, yo no lo hago en una columna, sino que lo hago en unos pocillos. 01:14:28

Añado al lisador celular estas esferas magnéticas, pongo una sal caotrópica y el DNA se une a las esferas. 01:14:33

¿Que yo quiero hacer lavados y tal y cual? Pongo el imán. 01:14:40

Todas las esferas con el DNA quedan atraídas y quedan inmovilizadas 01:14:43

Retiro el sobrenadante, pongo soluciones de lavado 01:14:48

Esto lo hago siempre que quiera inmovilizar el DNA 01:14:53

Pongo limón, quito limón, pongo limón, quito limón 01:14:56

Hago un lavado, hago otro lavado 01:14:59

Cuando me interesa, añado una solución de hidratación 01:15:00

Se suelta el DNA y lo recojo 01:15:04

Lo bueno de esto es que se puede automatizar 01:15:05

Fijaos, utilizan este tipo de plaquitas 01:15:09

y entre cada cuatro 01:15:11

pocillos de estos 01:15:13

aquí abajo tenemos el imán 01:15:15

un imán, si os dais cuenta 01:15:17

aquí no hemos puesto el imán 01:15:19

y están todas las bolitas por aquí 01:15:20

en cuanto pongo el imán 01:15:22

todas las bolitas se vienen para acá 01:15:24

si pongo una salcaotrópica 01:15:26

a estas esferas 01:15:28

aquí, visto lateral 01:15:29

pongo el imán 01:15:32

y aquí tengo todas las microsferas 01:15:33

puedo hacer lavar 01:15:36

y esto me permite automatizar 01:15:37

Y por último tenemos la ultrafiltración 01:15:39

La fundamentación es, ni más ni menos, que es una retención por tamaño 01:15:45

Utilizamos ultrafiltros a través de los cuales vamos a obligar y vamos a pasar todo el lisado celular 01:15:50

De manera que los componentes más pequeños lo van a atravesar y los más grandes que detenemos 01:15:57

esto se utiliza mucho 01:16:03

para productos de PCR 01:16:09

cuando hacemos una PCR 01:16:12

y tenemos los amplicones 01:16:13

y los queremos 01:16:15

amplicones porque es de 01:16:16

después de haber amplificado un fragmento 01:16:19

y los queremos separar del resto 01:16:22

de componentes, utilizamos 01:16:23

la ultracultración 01:16:25

¿de acuerdo? 01:16:26

bien, pues aquí tenéis 01:16:29

el procedimiento, pero es muy sencillo 01:16:31

Utilizan filtros de poro muy pequeñito, de manera que el DNA jamás lo va a poder atravesar. 01:16:33

Pongo todos los componentes, solamente las moléculas de DNA quedan atrapadas, el resto de componentes después de centrifugar lo atraviesan 01:16:40

y cuando yo quiera añado aquí un buffer de rehidratación y recojo las moléculas de DNA. 01:16:48

Bien, hay algunas consideraciones especiales cuando realmente lo que queremos extraer y purificar son moléculas de RNA. 01:16:55

El gran problema de las moléculas de RNA, si recordamos, es que son monocatenarias 01:17:03

y a nivel experimental en el laboratorio son tremendamente termolábiles. 01:17:08

Eso significa que se degradan con muchísima facilidad a temperatura ambiente, incluso a 4 grados. 01:17:15

Esto hace que todo el proceso, especialmente tengamos que tener mucho cuidado con el gran enemigo del RNA, 01:17:23

que son las erremiasas. De alguna manera hay que intentar inactivarlas, ya sabemos, poniendo isotiocianato de guanidinio, que ya lo hemos visto, ponerlo en la solución del ISIS y trabajar siempre a temperaturas bajas. 01:17:31

Es todo el proceso que hemos visto de pretratamiento. Desde la muestra biológica, la fase de extracción para obtener el lisado celular y toda la fase de purificación debe realizarse a temperaturas bajas. 01:17:46

En hielo o en condiciones que mantengan inactivadas las RNAs, al menos parcialmente, por trabajar a temperaturas bajas. 01:17:59

Además, hay que intentar trabajar en cabina de flujo laminar, cabina de bioseguridad, para asegurar un ambiente lo más estéril posible para que no se contaminen reactivos y la muestra con RNAs. 01:18:12

Tenemos hernias en las manos, hay hernias en las superficies en las que trabajamos, por eso siempre hay que trabajar con guantes. Al trabajar con hernia, estas consideraciones son muy importantes. Por tanto, trabajar con guantes sería la primera y trabajar en cabina de bioseguridad. 01:18:27

o seguridad. Antes de ponernos a trabajar durante el proceso y después del proceso 01:18:44

que impermueve las superficies, hay que utilizar todo el material fungible que esté certificado 01:18:49

que es libre de RNAsas, lo que llaman en inglés RNAs free. Esto se ve muy bien en el paquete 01:18:56

de las puntas de las pipetas, las pipetas, los tubos de prendor. Hemos de asegurarnos 01:19:05

que todo el material fungible que utilicemos 01:19:10

sea y esté certificado 01:19:12

por casas comerciales 01:19:14

RNAs free. 01:19:15

La solución del ISIS debe contener 01:19:17

un agente caotrópico 01:19:20

que inactive las RNAs 01:19:21

y esto es esencial. 01:19:23

Ya hemos visto cuál era, que era el isotiocianato 01:19:25

de guanidinio, que es el cellón 01:19:28

y el isotiocianato de guanidinio 01:19:30

inhibe específicamente las RNAs. 01:19:32

Y además, 01:19:35

todos los reactivos y el agua 01:19:36

destilada que utilicemos deben 01:19:38

estar también certificados libres de 01:19:39

RNAs. Para esto nosotros 01:19:41

podemos tratar 01:19:43

el agua y algunos de los reactivos 01:19:46

en diferentes tratamientos 01:19:48

elevada concentración de hidróxido 01:19:52

de sodio, por ejemplo 01:19:54

y o 01:19:56

elevadísima temperatura. 01:19:58

¿De acuerdo? 01:20:00

Aún así las RNAs son tremendamente 01:20:01

resistentes, muy, muy resistentes. 01:20:04

¿De acuerdo? 01:20:07

Bien. 01:20:08

Todo este proceso de extracción y purificación se puede automatizar y actualmente existen aparatos, un equipamiento específico en los laboratorios de biología molecular que muchas de estas fases se pueden automatizar. 01:20:09

¿Sí? Esto implica o garantiza que obtenemos ácidos nucleicos altamente purificados, minimizando la contaminación. ¿Por qué? Porque metemos la muestra en el aparato, si es una biopsia, por ejemplo, la metemos en el aparato, el aparato tiene todos los reactivos en un ambiente tremendamente controlado y nos saca en un tubito nuestros ácidos nucleicos ya purificados. 01:20:24

Evita también la contaminación cruzada, es decir, al aparato le podemos meter las muestras de 15 pacientes y en ningún momento se va a contaminar una muestra con otra, porque trabajan en canales diferentes. 01:20:48

¿De acuerdo? Y además aporta una gran rapidez. Yo puedo meter las muestras por la noche, por la tarde antes de cuando ya acaba la jornada, lo dejo y lo programo toda la noche y al día siguiente, por la mañana, obtengo de todas las muestras que tenía el DNA purificado o el RNA purificado. 01:21:06

¿De acuerdo? Hay diferentes métodos. Aquí en las diapositivas tenéis algunos. No es muy importante cómo funcionan, pero muchos de ellos funcionan con partículas magnéticas. 01:21:25

Ya hemos visto la cromatografía de absorción, pero con partículas magnéticas, lo que nos permite aglutinar en un momento determinado las partículas con el DNA, etc. 01:21:38

Y otros basados en cromatografía de absorción, en la cual en las columnas se pone una bomba de vacío que hace que todo el lisado a través de las bolitas pase más rápido, etc. 01:21:48

Os dejo aquí también, por si os viene bien, para que os hagáis una idea de la automatización de estos procesos, algunos links de YouTube los tenéis en la presentación por si queréis echarle un vistacito y así os hacéis una idea de cómo funciona este proceso de automatización. 01:22:01

¿De acuerdo? Bien. Perfecto. Nos llegó una muestra al laboratorio. Después de una primera fase de pretratamiento, extracción y una última fase de purificación, teóricamente tenemos en un tubito los ácidos núcleicos puros. 01:22:15

puros. Perfecto. La última fase es evaluar la calidad. Unos ácidos nucleicos de buena 01:22:32

calidad significan buenos resultados en cualquier técnica de biología molecular. Por eso es 01:22:40

muy importante evaluar la calidad de los ácidos nucleicos con estos tres parámetros. A final 01:22:46

de tema vamos a ver cuatro pinceladas de cómo se deben almacenar. Bien. Cuando hablamos 01:22:52

de la calidad de los ácidos nucleicos nos referimos a evaluar tres parámetros. El primer 01:22:58

parámetro es la integridad. Cuando decimos integridad queremos decir el tamaño. Si el 01:23:04

tamaño final de las moléculas de DNA o de RNA es el que tenía el original. Entonces 01:23:13

hablamos de tamaño, vamos a estudiarlo y si ha habido o no degradación. Si ha habido 01:23:18

o no degradación. Perfecto. ¿Cómo lo miramos? Esto lo estudiamos en el laboratorio haciendo 01:23:28

un gel de agarosa y corriendo por electroforesis una pequeña cantidad, un pequeño volumen 01:23:34

del ácido nucleico que acabamos de purificar. ¿De acuerdo? Bien. El segundo parámetro, 01:23:48

Ahora lo iremos viendo poco a poco. El segundo parámetro es la pureza. La pureza hace referencia a si hay o no contaminantes. Esto es importante. Si yo estoy purificando específicamente DNA, el DNA de la muestra del paciente, el RNA es un contaminante, igual que las proteínas, y lo tengo que eliminar. No me vale. 01:23:57

Si yo estoy purificando RNA, el DNA es un contaminante. Entonces, la medida de la pureza nos va a decir si hay, además del ácido nucleico que queremos aislar, extraer y purificar, si hay además otros componentes que son contaminantes. 01:24:28

Para poderlo medir, medimos cocientes de absorbancias, ¿sí? Y son dos cocientes. Los pongo aquí ya para que los tengamos. Es el cociente absorbancia 2,60 y absorbancia 2,80. 01:24:44

y nos dice, nos da la idea de cuántos ácidos nucleicos tenemos 01:25:05

respecto de las proteínas y fenoles que hayamos podido arrastrar. 01:25:10

Bien. 01:25:15

Y el cociente A260 es A230 01:25:16

y nos da una idea de cuántos ácidos nucleicos tenemos 01:25:22

respecto de moléculas de pequeño tamaño, 01:25:27

glúcidos, aminoácidos, algunas sales minerales, etc. 01:25:30

Si la integridad es buena, 01:25:34

Si la pureza es buena, entonces vamos al tercer parámetro. El tercer parámetro es la concentración. Y para calcular la concentración, ¿cuánto DNA tengo? Solamente necesito una absorbancia, la absorbancia 260. 01:25:36

Con el valor de esta absorbancia de la muestra y una fórmula, que ahora la veremos, vamos a obtener el resultado de la concentración en nanogramos por microlitro. 01:25:56

Bien, si estos tres parámetros, integridad, pureza y concentración, son buenos, significa que el DNA es de buena calidad y por tanto puedo seguir adelante. 01:26:15

Si estos parámetros no son buenos, no dan buenos resultados, significa que el DNA no es de buena calidad y entonces quizá vale la pena que no continúe adelante porque las técnicas de biología molecular no saldrán bien, ¿de acuerdo? Tendría que volver a extraer y purificar o ya iremos viendo, por ejemplo, si hay contaminantes, qué cosas puedo hacer para intentar recuperar esa muestra, ¿de acuerdo? 01:26:25

Bien, pues vamos a ver uno a uno estos parámetros de calidad. 01:26:49

El primero de ellos es la integridad. 01:26:53

La integridad nos indica si los ácidos nucleicos que hemos purificado conservan su tamaño original o si se han fragmentado. 01:26:56

¿Veis? Esta molécula, si se ha fragmentado, se ha degradado. 01:27:06

Ya hemos dicho que esto lo vamos a mirar haciendo un gel de electroforesis 01:27:11

y observando una pequeña alícuota, unos microlitros, de la muestra del DNA o RNA purificado. 01:27:15

Entonces, cuando miramos la integridad, importante, hemos de conocer cada tipo de ácido nucleico, 01:27:26

qué patrón de bandas nos da. 01:27:35

Vamos con el primero. 01:27:38

El DNA genómico son moléculas gigantescas, enormes, son tan enormes, tan grandes, tienen tal cantidad, el tamaño es tan grande, que cuando yo cargo el pocillo con las muestras, que serían aquí el pocillo 2, 3 y 4, 01:27:39

aquí lo que hemos cargado es un marcador de peso moleculares 01:27:57

ya veremos más adelante por qué lo cargo 01:28:01

son tan grandes estas moléculas 01:28:03

que apenas avanzan en el gel 01:28:06

tienen que atravesar poros muy pequeñitos 01:28:09

son moléculas tan grandes que apenas avanzan 01:28:11

¿cómo se ve un DNA genómico de buena integridad? 01:28:15

pues es la muestra dos 01:28:20

se tendría que observar una única banda 01:28:21

en la parte superior del gel 01:28:24

Y el resto del gel, como veis aquí, sin bandas. 01:28:27

Esta muestra 2 tiene muy buena calidad. 01:28:33

¿Qué ha pasado en la muestra 4? 01:28:36

Este DNA se ha fragmentado. 01:28:38

Y entonces, todo el DNA que se ha fragmentado, ahora obtenemos de forma aleatoria fragmentitos pequeños, unos más grandes, otros más pequeños, fragmentitos pequeños, que son los fragmentos de degradación. 01:28:41

Cuando todo esto que lo tengo en la muestra lo pongo a correr y cargo el pocillo, lo que veo es esta parte de aquí, esta sombra de aquí. Aquí estarían las moléculas más grandes que no se han degradado, pero la gran mayoría, si os dais cuenta, forma lo que llamamos un smear, una sombra. 01:28:54

Lo vemos aquí, continua, que está formada por multitud de fragmentos de todos los tamaños. 01:29:15

Unos muy pequeños que emigrarán aquí abajo, otros de tamaño mediano, otros ya más grandes. 01:29:22

Esta muestra, la muestra del carril 4, no nos vale. La integridad es malísima. Habría que desecharla. 01:29:28

En el carril 3 hay una muestra del mineral genómico, pero que está parcialmente degradada. 01:29:36

La gran mayoría de moléculas están aquí arriba y conservan su tamaño y ha habido un poquito de degradación, pero casi nada. ¿Por qué? Porque la gran mayoría son moléculas todavía muy grandes. ¿De acuerdo? 01:29:43

Bien, pues este es el patrón que se tendría que ver cuando lo que estamos corriendo en el gel de agarosa es un, o hemos extraído un DNA genómico. 01:29:55

Cuando es un DNA plasmídico, los plasmidos, se tiene que ver un patrón, el patrón normal son tres bandas. 01:30:07

Tres bandas que están formadas por una banda inferior, ya veis que están aquí en la parte superior del gel. 01:30:15

Aquí están los pocillos, aquí hemos cargado las muestras, luego hemos puesto las cargas, positiva abajo, como ya sabéis, negativa arriba. Cuando ha ocurrido la electroforesis se tendrían que ver tres válvulas. ¿A qué corresponde? 01:30:22

Esta es la estructura nativa del plásmido. Ya sabemos que los plásmidos son moléculas bicatenarias, pero circulares. 01:30:37

Entonces, la manera en la que suelen estar en la célula no es así de forma relajada que se llama, es decir, estiradas. Esta es la forma relajada. 01:30:50

normalmente cuando están en la célula 01:31:03

los plámidos, la célula prokaryota 01:31:07

los plámidos están 01:31:09

súper enrollados 01:31:10

así, formando este tipo 01:31:12

de estructuras 01:31:15

súper enrolladas como si fuera un churrillo 01:31:16

el mismo se plega sobre sí mismo 01:31:20

la gran mayoría de los plasmidos 01:31:22

en la célula están así, por tanto 01:31:24

esta banda es la estructura nativa 01:31:26

esta es la estructura nativa 01:31:28

así como 01:31:29

digamos como haciéndose un churrillo 01:31:30

súper enrollado, como si fuera el cable de un teléfono 01:31:33

antiguo, si os acordáis 01:31:36

ya veis que la banda es mucho más intensa 01:31:37

luego, por encima, se tiene que ver 01:31:40

una segunda banda, que es la estructura relajada 01:31:43

que sería esta de aquí 01:31:46

¿de acuerdo? 01:31:47

y un poquito más arriba 01:31:49

serían dímeros, es decir, son súper 01:31:51

estructuras formadas por la asociación 01:31:53

¿sí? de un plásmido 01:31:56

con otro plásmido 01:31:58

¿sí? 01:32:01

Entonces, esta superestructura superenrollada, claro, pesa el doble y por tanto migra mucho menos, porque es de mucho mayor tamaño. 01:32:03

Bien, esta muestra es de un DNA plasmídico, hay que conocer el patrón de bandas, es un DNA plasmídico en la que vemos sus tres bandas. 01:32:11

Y hay que conocer, en segundo lugar, cuál es el patrón normal. Este es el patrón normal. 01:32:21

Sin embargo, ¿qué ha pasado en esta muestra? 01:32:27

Se ha degradado y aquí no observamos la banda. 01:32:30

Significa que hay degradación parcial. 01:32:33

Cuando hay degradación prácticamente total, perdemos las dos bandas superiores. 01:32:35

Aquí no hay y aquí tampoco. 01:32:39

Y esta banda se ve muchísimo más degradada. 01:32:41

¿De acuerdo? 01:32:45

Bien, con esta muestra seguiríamos adelante. 01:32:47

Esta habría que ver si es muy valiosa o no, pero con esta no podemos seguir adelante. 01:32:49

porque no nos va a salir 01:32:54

la técnica que utilicemos de dilución 01:32:56

bien 01:32:58

si es una muestra de RNA 01:32:59

lo que vamos a ver son 01:33:01

los dos RNA ribosómicos 01:33:04

que son los más abundantes 01:33:06

y los de mayor tamaño 01:33:07

si es una célula cariota, el 28S y el 13S 01:33:09

formando dos grandes bandas 01:33:12

y han de cumplir 01:33:15

dos características 01:33:18

uno, cuando es una muestra de RNA 01:33:19

hay que fijarse en dos parámetros 01:33:22

1. ¿Aparecen dos bandas? Por ejemplo, en esta muestra, sí. Perfecto. Y ahora vemos. Segunda característica. La banda superior, la de 28S, tiene que ser el doble de gruesa y el doble de intensa que la de abajo. ¿Eso se cumple en esta muestra? Sí. Perfecto. Esta muestra está genial. ¿Y en esta muestra? También. ¿Tiene dos bandas? Sí. ¿La de arriba es el doble de gruesa y doble de intensa que la de abajo? Sí. Pues también. 01:33:23

¿Cuál es la diferencia entre esta y esta? Que aquí han cargado más cantidad. Este RNA está mucho más concentrado que este de aquí. ¿De acuerdo? Bien. Se puede observar una banda inferior. Si hay mucho RNA, se puede observar. Y pertenece a los RNA ribosómicos pequeños y al RNA de transferencia. 01:33:52

¿Qué ha pasado en la muestra 2? Todo el RNA está degradado. 01:34:14

No se observan ninguna de las dos bandas que se tendrían que observar y lo que se observa es nuevamente toda una sombra. 01:34:19

Este RNA está completamente degradado. 01:34:25

Bien, pues este es el primer parámetro que evaluamos para ver cómo está la calidad de nuestros ácidos nucleóticos. 01:34:29

Si la integridad es buena, entonces miramos la pureza. 01:34:36

La pureza ya hemos dicho que es, vamos a medir si hay o no hay posibilidad de contaminar. Para ello utilizamos un aparato que es un espectrofotómetro que mide cuatro absorbancias. 01:34:40

La absorbancia 320, la absorbancia 260, la absorbancia 280 y la absorbancia 230. 01:34:55

Bien, cada una de estas absorbancias nos da idea de un componente o de un posible contaminante. 01:35:07

¿Por qué? Porque cada contaminante absorbe luz de una longitud de onda determinada. 01:35:16

Por ejemplo, y esto ya lo sabemos, es una de las características físico-químicas de los ácidos nucleicos, los ácidos nucleicos absorben específicamente la luz a 260 nanómetros, pero las proteínas y los fenoles absorben luz de 280 nanómetros. 01:35:21

¿De acuerdo? Bien. Por tanto, aquí tenemos los ácidos nucleicos. 280 lo absorben las proteínas y los fenoles. ¿Cuándo tendremos fenoles? Cuando hemos purificado por solventes orgánicos. 01:35:42

230 es la absorbancia de moléculas de pequeño tamaño. Por ejemplo, glúcidos, aminoácidos, algunas sales minerales, ¿de acuerdo? Bien. 01:35:58

Y la 320 es una longitud de onda que es absorbida por partículas de gran tamaño. 01:36:15

Entonces, ¿qué partículas estas son de gran tamaño? 01:36:25

Estas partículas de gran tamaño pueden ser por gánulos que hemos arrastrado, restos de membrana, o sea, partículas en suspensión. 01:36:30

Entonces veríamos un aspecto tuve. 01:36:38

Bien. 01:36:40

El aparato nos da el valor de estas cuatro absorbancias 01:36:40

Y lo que tenemos que hacer nosotros es calcular los dos cocientes 01:36:45

Dos cocientes 01:36:49

El primer cociente, bueno, lo primero que hacemos siempre 01:36:51

Y esto lo vamos a trabajar en los problemas 01:36:53

Lo primero que hacemos siempre es 01:36:56

A cada una de estas absorbancias 01:36:58

260, 280, 230 01:37:00

Le tenemos que restar el valor de 320 01:37:03

Entonces, haremos absorbancia 260 menos absorbancia 320, y así obtenemos lo que podríamos llamar una absorbancia 260 corregida, vamos a llamar prima. 01:37:07

Una absorbancia 280 prima corregida y una absorbancia 230 también corregida, prima. 01:37:21

Es con estas tres absorbancias con las que vamos a calcular dos cocientes. 01:37:32

Primer cociente, el cociente 260-280, como aquí prima y prima, porque son los valores corregidos. 01:37:36

Bien, este cociente nos da una idea de cuántos ácidos nucleicos tenemos, absorbancia de 260, respecto de las proteínas y los fenoles. 01:37:44

Si hemos purificado ADN, el valor, para que consideremos un cociente normal, tendría que estar entre 1,7 y 2. 01:37:55

Si es ARN, varía un poquito. 1,8 y 2. ¿Sí? Bien. ¿Qué ocurre si el cociente, el valor del cociente es menor? Si el valor del cociente es menor, significa que hay, si este valor es menor, es porque el denominador es demasiado grande. 01:38:06

Entonces hay contaminación por proteínas y fenoles. 01:38:28

¿Y qué podemos hacer? ¿Tiramos ya la muestra? No. 01:38:35

Podemos hacer un tratamiento con proteasas y luego purificar por un método diferente al de los fenoles. 01:38:40

Y volvemos a medir el cociente. 01:38:48

Seguramente se habrá limpiado de las proteínas. 01:38:51

Pero si el valor es mayor, significa que el numerador es demasiado grande. Tengo un exceso de ácidos nucleicos. Si he purificado DNA, significa que he arrastrado RNA. Pero si he purificado RNA, significa que he arrastrado DNA. 01:38:54

¿Qué puedo hacer? Pues tratar con RNAsas para quitarme la de en medio o tratar con DNAsas para quitarme el DNA de en medio y entonces volver a purificar, por otro método. 01:39:15

Bien, pues este es el primer cociente. El segundo cociente es el cociente 260 corregido, 230 corregido. Es decir, cuántos ácidos nucleicos tenemos respecto de posibles contaminantes de pequeños. 01:39:30

Su valor del cociente tendría que estar entre 1,5 y 2,2. 01:39:45

Nuevamente, un valor superior significa que hay un exceso de ácidos nucleicos. 01:39:51

Y habría que ver, ocurre lo mismo que aquí. 01:39:57

Si es DNA o RNA, para hacer un tratamiento con DNA y RNA. 01:40:00

Pero si el valor es menor de 1,5, significa que hay, en la purificación de arrastrados, sobre todo, sales minerales. 01:40:04

¿Qué tendría que hacer? 01:40:14

¿Qué puedo hacer si el valor es menor? Pues tengo que lavar otra vez el DNA, precipitar el DNA y volverlo a purificar. 01:40:15

¿De acuerdo? Bien. Imaginemos que el DNA tiene buena integridad, tiene buena pureza. Perfecto. 01:40:25

Pues entonces, fijaos, aquí sencillamente para que veáis, en una extracción donde no se ha utilizado fenoles, 01:40:36

Fijaos que el pico de absorbancia está justo en 260. Esta absorbancia pertenece a los ácidos nucleicos. Pero si se nos ha contaminado con fenol, este pico se desplaza hacia acá. ¿Por qué? Porque los fenoles absorben hacia 280. 01:40:45

Entonces, el cociente 260-280 aquí es el correcto, pero el cociente 260-280, si os dais cuenta, ahora es mucho menor. 01:41:02

¿De acuerdo? ¿Se entiende? Bien. 01:41:20

Bueno, esto es una manera gráfica, pues si se entiende mejor lo he puesto aquí. 01:41:22

¿De acuerdo? Bien. 01:41:26

El tercer parámetro de calidad es la concentración. 01:41:27

Para calcular la concentración solo necesitamos la absorbancia 260, siempre la corregida, ¿de acuerdo? Y lo calculamos con esta fórmula. Es decir, la concentración de los ácidos nucleicos, os la escribo aquí por si es más sencillo, es igual a la absorbancia 260 corregida. 01:41:30

Ya veis aquí, 260 menos 320. Perfecto. Por el factor de dilución, normalmente el DNA, para poder medir las absorbancias, se diluye. Pues por ese factor de dilución, si he hecho una dilución en 1,4, lo he diluido 4 veces, pues aquí sería 4. Por lo que llamamos un factor de conversión. 01:41:54

Y el factor de conversión es siempre el mismo. Y este factor de conversión depende del tipo de ácido nucleico que hayamos purificado. Si es un DNA de doble cadena, doble strand DNA, es diferente a si es un DNA de cadena sencilla o si es un RNA. 01:42:15

En el caso del DNA doble cadena es 50 nanogramos por microlitro. En el caso del DNA de cadena sencilla es 40 nanogramos por microlitro. En el caso del RNA son 33 nanogramos por microlitro. 01:42:35

Uno de estos valores es el que iría, porque esto es una constante, en el factor de conversión 01:42:55

¿De acuerdo? 01:43:02

Entonces, con esta fórmula obtenemos la concentración de los ácidos nucleicos en nanogramos por microlitro 01:43:04

Esto actualmente también se hace de forma automatizada 01:43:12

Os dejo aquí un par de vídeos 01:43:15

No se utiliza un espectrofotómetro normal, sino un espectrofotómetro que se llama nanodrop 01:43:17

Bueno, y aquí tenéis algunos vídeos, pues, de curiosidad para saber cómo funcionan, ¿de acuerdo? Bien, ya hemos dicho, una buena calidad, unos buenos, unos parámetros de calidad que son buenos, nos aseguran una buena funcionalidad del DNA y, por tanto, buenos resultados, buenos resultados en las técnicas de biología móvil. 01:43:24

Una vez hemos extraído y purificado los ácidos nucleicos 01:43:46

Hemos medido su calidad, ya hay que almacenarlos 01:43:51

Y esto es muy importante 01:43:54

El almacenamiento nos asegura que el DNA se mantiene inalterado 01:43:55

Entonces las condiciones para mantener la integridad 01:44:02

De gran peligro es que se degrada el DNA 01:44:06

Vamos a utilizar, por un lado, criotubos de cierre hermético 01:44:08

Muy importante 01:44:12

Y además que sean libres de nucleasas 01:44:14

2. Se almacenan en frío. Entonces, el DNA, que es muy termoestable, si el DNA lo vamos a utilizar pronto, por ejemplo, la semana que viene, lo podemos almacenar a 4 grados. Para almacenarlo a largo plazo, entonces habría que congelarlo, pero en el congelador normal, a menos 20. 01:44:16

Si es un RNA que vamos a utilizar pronto, lo tenemos que almacenar siempre congelado, porque es mucho más termodábil. 01:44:37

Y si lo vamos a almacenar para mucho tiempo, hay que almacenarlo en un ultracongelador a menos 80 grados centígrados. 01:44:49

Y esto es muy importante. 01:44:55

¿De acuerdo? 01:44:58

Y después hemos de asegurar la trazabilidad de las muestras, porque estas muestras yo las voy a guardar en un congelador 01:45:00

y entonces esto ya hay programas de gestión que a cada una de las muestras de cada paciente 01:45:06

le ponen etiqueta con un sistema de identificación, etcétera, etcétera, etcétera. 01:45:12

Pero esto también es muy importante. 01:45:17

Muy bien, pues a modo de resumen, en este tema hemos visto todas las fases 01:45:19

para poder llevar a cabo una extracción y una purificación 01:45:23

desde una muestra que nos llega al laboratorio 01:45:26

hasta la evaluación de la calidad del ácido nucleico extraído y purificado 01:45:29

y su almacenamiento para futuras técnicas de biología molécula. 01:45:35

UT3 - Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos - Contenido educativo

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