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Videoconferencia martes 19 de marzo - Contenido educativo

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Subido el 20 de marzo de 2024 por Susana A.

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Bueno, pues el otro día ya empezamos a ver el tema 4, que es el tema de clonación de ácidos nucleicos. 00:00:00
Y ya estuvimos viendo cómo es posible cortar el ADN y así estudiarlo más fácilmente. 00:00:19
Antes, hasta los años 70, era muy difícil estudiar el ADN porque el ADN es una molécula muy grande, una gran longitud, entonces era muy complicado estudiarla. 00:00:30
Pero ya en los años 70 se descubrieron las enzimas de restricción y con estas enzimas de restricción lo que se logra es cortar el ADN en zonas, en fragmentos determinados, que se denominan sitios de restricción. 00:00:42
Y estas enzimas de restricción, también vimos el otro día que había más de un millar de enzimas de restricción y que cortan en zonas palindrómicas. 00:00:58
Si os acordáis, las secuencias palindrómicas eran las que se leen igual en una cadena de 3' a 5', se lee igual que en la cadena contraria de 5' a 3'. 00:01:11
Y vimos también que alguna de esas enzimas era la E. coli y que cada una de las enzimas corta en una zona determinada. 00:01:28
También vimos que había dos tipos de cortes que daban lugar a los extremos romos y a los extremos cohesivos. 00:01:41
Los extremos romos cuando se corta el ADN se corta en vertical y ahí no quedan bases desapareadas y en cambio cuando se producen extremos cohesivos ahí se quedan bases desapareadas. 00:01:51
y esto es lo mejor para cuando luego nosotros queremos unir dos ADN que provienen de organismos diferentes 00:02:09
pues si los extremos de estos ADN se han cortado con la misma enzima de restricción 00:02:17
y además han generado extremos cohesivos pues es fácil que luego se puedan volver a unir estos dos ADN 00:02:22
por eso se llaman también extremos cohesivos o pegajosos 00:02:29
Y esto es para cortar el ADN 00:02:34
Vimos también que hay unas enzimas con las que podemos unir fragmentos de ADN 00:02:40
Y estas enzimas se llaman ligasas 00:02:46
Y también vimos que dependiendo de si los extremos eran romos o cohesivos 00:02:50
Pues la unión era de dos formas diferentes 00:02:56
Vale, pues entonces hoy vamos a ver otra técnica de clonación de ADN que se llama hibridación. 00:03:01
Bueno, pues vamos a ver en qué consiste la hibridación. 00:03:12
¿Veis la pantalla, verdad? 00:03:29
Sí. 00:03:41
¿Veis la pantalla? 00:03:42
Sí, pone hibridación. 00:03:51
Sí, vale. 00:03:53
Vale, pues vamos a ver qué es esto de hibridación. 00:03:56
¿Cómo es esta técnica? 00:04:00
Entonces, la hibridación se basa en dos fenómenos, en desnaturalización y renaturalización. 00:04:01
Si os acordáis, la desnaturalización era la ruptura de los enlaces de hidrógeno entre las bases nitrogenadas. 00:04:11
Entre adenina y timina, acordaros que hay dos puentes de hidrógeno, y entre citosina e inguanina hay tres puentes de hidrógeno. 00:04:21
Pues la desnaturalización. Acordaos que hay varias formas de que se desnaturalice el ADN. Una de ellas, por ejemplo, es la temperatura. La desnaturalización lo que hace es romper esas uniones entre las bases nitrogenadas y entonces nos quedan las dos cadenas de ADN separadas. 00:04:29
Y vimos también en el tema anterior que una vez que está desnaturalizado el ADN, se puede volver a renaturalizar. Es decir, estas dos cadenas se pueden volver a unir. 00:04:50
Bueno, pues la hibridación se basa en este fenómeno 00:05:03
Lo que pasa es que en vez de renaturalizarlo con la misma cadena de ADN 00:05:07
Lo que se hace es añadir una cadena de ADN que sea complementaria a una de ellas, a una de estas cadenas de ADN 00:05:14
Entonces, se puede, por un lado, hibridar. Hibridar significa que se va a unir la cadena que teníamos con una cadena nueva que le vamos a añadir. 00:05:25
Hibridar significa que se forman los puentes de hidrógeno entre adenina, timina, citosina o anina. 00:05:41
Y puede ser, podemos hibridar una cadena de ADN con otra cadena de ADN o podemos volver a formar una doble hélice con un segmento de ARN, hibridación de ADN con ARN. 00:05:47
ARN. Entonces, la cuestión es que tenemos nuestro ADN, que sería esto de aquí en rojo y estos segmentos así en negro serían las bases nitrogenadas. Esta es nuestra secuencia de ADN. 00:06:03
Con esta técnica, ¿qué pretendemos? 00:06:26
Pues queremos saber, por ejemplo, si esta secuencia de ADN tiene adenina, timina, adenina, adenina, citosina, citosina, guanina, guanina, adenina 00:06:30
Queremos identificar cuál es la secuencia de nuestro ADN 00:06:39
Lo que hacemos es separamos las dos cadenas de ADN, o sea, desnaturalizamos nuestro ADN 00:06:45
Y luego lo que hacemos es añadir una secuencia de ADN que sea complementaria a la secuencia que estamos nosotros investigando. 00:06:52
Entonces, por ejemplo, a ver aquí, en esta. 00:07:05
Imaginaros que queremos investigar si nuestro ADN tiene esta secuencia. 00:07:08
A, T, G, C, G, A, C, T. 00:07:13
Bueno, pues lo que hacemos es añadir una sonda, se llama, una sonda es una secuencia de un fragmento de ADN que va a ser complementaria a este fragmento de ADN que estamos nosotros investigando. 00:07:16
Por lo tanto, si es complementaria, eso significa que vamos a tener una timina aquí, luego una adenina, porque la adenina es complementaria a la timina. 00:07:33
Luego vamos a tener una citosina, una guanina, porque es complementaria a la citosina, otra citosina, timina, guanina, adenina. 00:07:45
Entonces tenemos una secuencia de ADN, un fragmento de ADN que nosotros vamos a añadir a nuestro ADN y que si es complementaria a esta secuencia que estamos buscando pues se va a hibridar, es decir, se van a formar por aquí puentes de hidrógeno entre la citosina y la guanina, entre la adenina y la timina. 00:07:54
se forman puentes de hidrógeno, es decir, se hibrida. 00:08:19
Y ahora, ¿cómo sabemos si se ha hibridado? 00:08:24
¿Cómo confirmamos que tenemos esta secuencia de ADN? 00:08:27
Pues lo que hacemos es, esta sonda de ADN que añadimos, 00:08:32
este ADN, este fragmento de ADN que es complementario en teoría 00:08:37
al fragmento que nosotros estamos investigando, 00:08:42
Este fragmento de ADN contiene un fluoróforo. Un fluoróforo es una molécula que va a emitir fluorescencia y así podemos identificar la secuencia de ADN. 00:08:45
Voy a esperar a ver si pasa nada. Entonces, fluorocromos, se llaman fluoróforos o fluorocromos. Los fluoróforos son componentes de una molécula que hacen que ésta sea fluorescente. 00:09:06
Es un grupo funcional de la molécula que absorberá energía de una longitud de onda específica y la volverá a emitir en otra determinada de mayor longitud de onda, es decir, de menor energía. 00:09:30
Una sonda de ADN es un fragmento de ADN o alguna vez de ARN de pequeño tamaño, normalmente entre 100 y 1000 pares de bases, marcado mediante fluorocromos o marcado también radioactivamente, 00:09:45
usado en biología molecular como herramienta para detectar la presencia de ADN o ARN y de secuencia complementaria parecida o igual. 00:10:02
Vale, entonces tenemos nuestro ADN y queremos identificar a ver si este ADN tiene un fragmento determinado, pues adenina, timina, timina, adenina, adenina, citosina, guanina, pues lo que hacemos es añadir una sonda, esto es una sonda, o sea una sonda es una secuencia, un fragmento de ADN que es complementario a la cadena de ADN que nosotros queremos investigar. 00:10:13
Y además esta sonda tiene una molécula que es un fluoróforo o fluorocromo, es decir, que va a emitir radiación. 00:10:42
Entonces, esta capacidad de aparearse dos hebras de ADN complementarias es muy útil para detectar secuencias de ADN similares de dos especies diferentes o en el genoma de una misma especie. 00:10:56
Es posible detectar un gen o una secuencia específica de ADN en presencia de otras muchas secuencias si se tiene la hebra de ADN complementario adecuada. 00:11:08
Este ADN complementario se marca con radiactividad o con fluorocromos para poder revelar su presencia y una vez marcado se denomina sonda. 00:11:22
Esto es lo que ya he explicado. 00:11:32
Bueno, pues hay tres tipos de hibridación. El primer tipo es la transferencia Southern, transferencia Northern y la hibridación in situ. Se llama también Southern Blot, Blot en inglés es transferencia, o Northern Blot. 00:11:35
Vamos a ver la transferencia Southern 00:11:59
Esta técnica se llama Seed Southern porque la desarrolló Edwin Southern en 1975 00:12:03
¿En qué consiste? 00:12:13
Bueno, pues tiene varias etapas esta técnica 00:12:18
Lo primero que tenemos que hacer es extraer la muestra de ADN 00:12:22
Ya en el tema anterior ya vimos varias formas de extraer una muestra de ADN. Podría ser rompiendo la membrana plasmática o mediante enfriamiento rápido con nitrógeno. Había varias formas. 00:12:26
Una vez que tenemos nuestra muestra de ADN, lo que hacemos es cortar ese ADN en fragmentos. 00:12:47
¿Cómo cortamos ese ADN? Pues con las enzimas de restricción que vimos el otro día. 00:12:54
Estas enzimas de restricción nos van a cortar determinados fragmentos de ADN. 00:13:04
Ahora, una vez que tenemos estos fragmentos de ADN, pues lo que vamos a hacer es separar estos fragmentos 00:13:11
¿Y cómo los separamos? Pues utilizamos la técnica de electroforesis en gel de agarosa 00:13:18
Esta es la técnica que normalmente se utiliza para ADN 00:13:26
Entonces, acordaros, en esta técnica lo que hacíamos era preparar un gel de agarosa 00:13:31
y en el gel hacíamos una serie de pocillos y en estos pocillos insertábamos nuestra muestra, las muestras 00:13:37
y además insertábamos en uno de ellos un patrón de ADN para después comparar con nuestras bandas de nuestra muestra 00:13:49
Y acordaros, como el ADN tiene carga negativa, pues el ADN se va a mover, o sea, nosotros vamos a aplicar un campo eléctrico y el ADN se va a mover hacia la carga positiva. 00:14:01
En este caso sería de aquí hacia aquí, hacia la carga positiva. Y como el gel de agarosa tiene unos agujerillos, pues las moléculas de ADN que sean más pequeñas van a pasar y van a aparecer abajo y en cambio las moléculas de los fragmentos de ADN más grandes, de mayor masa molecular, se van a quedar retenidos más arriba. 00:14:18
Y así podemos separar los fragmentos de ADN de distinto tamaño. 00:14:43
Bueno, pues ya tenemos extraído el ADN, cortado con enzimas de restricción y ya lo tenemos separado. 00:14:50
Bueno, pues ahora lo que tenemos que hacer, ya tenemos nuestro gen con el ADN separado. 00:14:57
Pues ahora acordaros que lo que teníamos en la hibridación consiste en primero desnaturalizar nuestro ADN, desnaturalizar, es decir, romper los enlaces de hidrógeno entre las dos cadenas. 00:15:05
Bueno, pues en esta técnica la desnaturalización se lleva a cabo con hidróxido de sodio. 00:15:20
Simplemente ponemos el gel en hidróxido de sodio y aquí se va a desnaturalizar el ADN. 00:15:27
Ahora, el siguiente paso que vamos a hacer, pues va a ser transferir este ADN, aquí tenemos el gel de agarosa con nuestro ADN desnaturalizado, pues lo que vamos a hacer va a ser transferirlo a un filtro que es de nitrocelulosa, que sería esto de aquí. 00:15:37
Entonces tenemos el ADN ya desnaturalizado, aquí ponemos una disolución tampón y lo que ocurre es que por capilaridad el ADN pasa a este filtro de nitrocerulosa, simplemente esto es para después poder analizarlo mejor. 00:16:00
y aquí tenemos que poner una serie de papel secante, un peso, etc. 00:16:20
Pero lo importante de aquí es esto, que ponemos el gel de agarosa y encima el filtro de nitrocelulosa 00:16:29
y así pasa, el ADN pasa al filtro. 00:16:37
Ahora, una vez que tenemos el ADN ya en el filtro de nitrocelulosa, 00:16:47
lo que hacemos es añadirle la sonda. 00:16:53
La sonda, es decir, unos fragmentos de ADN que son complementarios a la cadena que estamos nosotros buscando, que queremos detectar. 00:16:55
Entonces añadimos esos fragmentos de ADN, si son complementarios a esa cadena, pues se van a hibridar, se van a unir a esa cadena, se van a formar puentes de hidrógeno. 00:17:09
Pues este sería el paso 6, añadir una sonda y ver si los fragmentos de esa sonda se hibridan al ADN 00:17:19
Bueno, pues ahora el siguiente paso lo que vamos a hacer va a ser lavar esa sonda 00:17:29
y ver si la sonda se ha quedado hibridada a nuestro ADN 00:17:40
Vamos a observar fluorescencia. Estos serían los fragmentos de ADN que queremos identificar y veis aquí que vemos esta sonda en verde que se ha quedado adherida y la sonda que no se haya hibridado la lavamos, la eliminamos. 00:17:47
Vale, entonces bueno, pues además de, para lo que os he dicho, de caracterizar el ADN, de identificar secuencias, lo que podemos hacer es mapear sitios de restricción, esto ya es lo que os he dicho, identificar fragmentos de ADN que contienen un gen determinado, 00:18:09
dentro de una mezcla de muchos fragmentos, podemos identificar genes que haya en distintas especies 00:18:33
y también se utiliza para detectar reorganizaciones y duplicaciones en genes asociados a enfermedades genéticas, 00:18:42
humanas y a cánceres. 00:18:49
Entonces, esta sería la hibridación por la Southern Plot, la transferencia Southern. 00:18:53
Aquí tenéis dos vídeos, si queréis en algún momento un poco de ayuda para entender esta técnica. 00:19:00
Esa sería la transferencia Southern, que como os he dicho, el nombre viene del investigador que lo descubrió. 00:19:13
Y ahora vamos a ver la transferencia Northern, la Northern Plot. 00:19:23
Esta transferencia en orden se utiliza para ARN 00:19:27
En este caso, como lo que queremos detectar es ARN y la molécula es más pequeña 00:19:33
Pues el paso de fragmentación nos lo podemos saltar 00:19:41
No se necesita fragmentar la cadena de ADN 00:19:45
Y los siguientes pasos son iguales 00:19:49
Una vez extraído el ARN se hace una electroforesis en gel de agarosa 00:19:53
donde las moléculas se separan de mayor a menor tamaño. 00:19:57
Luego se transfiere a un filtro de nitrocelulosa o a una membrana de nylon. 00:20:02
Ahí se transfiere el ARN. 00:20:08
El ARN en el filtro se hibrida con una sonda marcada específica de la secuencia que se quiere identificar. 00:20:11
Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico que reconocerá la secuencia de ARN inmovilizada en el filtro 00:20:20
a través del reconocimiento de secuencias complementarias de ácidos nucleicos. 00:20:27
Bueno, aquí en este gráfico se ve bien. 00:20:35
Tenemos nuestra muestra. 00:20:37
Ya hemos visto que no hace falta cortar, no hace falta fragmentar. 00:20:39
Extraemos el ARN y hacemos una electroforesis. 00:20:43
El ARN se va a separar por tamaños. 00:20:48
Este sería el gel de agarosa. 00:20:52
Lo transferimos a la membrana de nitrocelulosa. 00:20:56
Y aquí añadimos las ondas marcadas, las ondas marcadas que si son complementarias al ARN que tenemos, pues quedarán ahí fijadas, ¿vale? 00:20:59
Se hibridan con las cadenas de ARN que tenemos aquí y después podemos visualizar el ARN que se ha quedado marcado. 00:21:11
Veremos aquí pues estas tres franjas, estas tres bandas de ARN. 00:21:23
Bueno, aquí tenéis otro vídeo. Entonces, esto sería la transferencia Southern y la Northern. En estas dos tenemos que extraer el ARN o el ADN en la Southern. 00:21:27
Pues ahora vamos a ver el tercer tipo de hibridación, que es la hibridación in situ. Es decir, aquí no necesitamos extraer el ADN. Esta hibridación se realiza marcando directamente con sondas o tejidos de organismos sin que se necesite la extracción. 00:21:45
Esta técnica se denomina FIS, que viene de Fluorescent In-Situ Hybridation, la técnica FIS, que usa sondas marcadas con fluorescencia para detectar la presencia de determinados fragmentos de ADN en cromosomas, haciendo que sean visibles bajo el microscopio de fluorescencia. 00:22:15
Entonces, ¿cómo se lleva a cabo esta técnica? 00:22:41
Pues bueno, el primer paso de la técnica consiste en la desnaturalización del ADN para separar la doble hélice. 00:22:44
Esto sería igual. 00:22:51
Ahora, en nuestra muestra desnaturalizada añadimos la sonda de interés, el fragmento de ADN marcado con un fluoróforo o fluorocromo. 00:22:53
Ahora las ondas, si son complementarias a las regiones de ADN, hibridarán y después ya se tiñen los núcleos con un color de contraste. 00:23:03
Entonces, de esta técnica simplemente saber que se utiliza sobre tejidos de organismos directamente, que no es necesaria la extracción. 00:23:15
Y también saber que la más importante es la técnica FIS. 00:23:28
Pero lo que es el procedimiento es prácticamente igual a los anteriores, a la SAUDE y a la NORMEN. 00:23:33
Bueno, pues esta sería la hibridación, técnicas de hibridación. 00:23:44
La siguiente técnica que tenéis en los apuntes es la secuenciación. 00:23:48
Secuenciar significa conocer o determinar la secuencia de bases nitrogenadas que tenemos en nuestro ADN. 00:23:54
Y secuenciar significa conocer uno a uno los nucleótidos que los forman y el orden en que aparecen en la cadena de ADN. 00:24:04
Bueno, pues esta técnica es un poco, yo creo que es un poco más complicada de entender y yo creo que es mejor que veamos primero la PCR y ya el próximo día veremos lo que es la secuenciación, porque yo creo que la PCR es un poco más fácil de entender. 00:24:13
Entonces, no sé si hay alguna duda de esta parte de hibridación 00:24:31
Bueno, vosotros mirároslo y ya el próximo día, si tenéis alguna duda, ya lo repasamos 00:24:38
Bueno, pues vamos a ver ahora otra técnica 00:24:50
Que es la PCR, que seguramente os sonará 00:24:55
La PCR, ¿vale? 00:25:01
La PCR, las siglas vienen del inglés, Polymerase Chain Reaction, y significa reacción en cadena de la polimerasa. 00:25:08
La polimerasa, seguro que os suena, como termina en asa, es una enzima, acordaros. 00:25:26
de los nombres de las enzimas, cuando terminan en asa son enzimas. 00:25:38
Bueno, pues vamos a ver un poco cómo es esta técnica. 00:25:44
Bueno, pues esta técnica la descubrió este investigador, este científico, 00:25:52
de la empresa, trabajaba en la empresa Cetrus, que se llama Carimulis, y la descubrió en 1985. 00:26:01
Este investigador era un hombre un poco excéntrico y, bueno, cuentan que, bueno, a él le dieron el premio Nobel en 1993 00:26:12
por haber descubierto esta técnica, pero debía ser un nombre un poco extraño porque le invitaron a una conferencia en Sevilla 00:26:23
después de haber recibido el premio Nobel en el 93 y en vez de hablar de la PCR se puso a hablar del SIDA 00:26:34
y de otras historias que no tenían que ver con la PCR. 00:26:45
Pero bueno, aparte de esto, 00:26:52
Kari Mullis fue el descubridor de esta técnica, de la PCR. 00:26:54
Bueno, ¿en qué consiste esta técnica? 00:26:59
O mejor dicho, ¿cuál es el objetivo de esta técnica? 00:27:02
Lo que queremos es obtener muchas miles de copias 00:27:06
de un fragmento de adn entonces tenemos y bueno partiendo esto es importante 00:27:13
partiendo de una pequeña muestra entonces el fragmento imagen aquí 00:27:23
tenemos nuestro adn en la doble cadena la doble que dice por lo que queremos 00:27:29
es hacer de este fragmento que está en verde queremos obtener miles de copias y 00:27:35
Y poder después identificar este fragmento. 00:27:43
Entonces, para ello, para esto, se necesitan unas enzimas que se llaman ADN polimerasas. 00:27:50
Y en eso se basa esta técnica. 00:27:59
Tenemos, repito otra vez, tenemos nuestra muestra, una pequeña muestra. 00:28:02
Una pequeña muestra que puede ser, por ejemplo, cuando se ha cometido un crimen, 00:28:06
una pequeñísima muestra de sangre y a partir de esa pequeñísima muestra extraer el ADN y de ese ADN amplificar un fragmento de ese ADN 00:28:12
y de ese fragmento de ADN hacer miles de copias y así poder luego hacer un análisis y detectar ese fragmento de ADN con seguridad. 00:28:28
Si os acordáis con el COVID, la técnica de la PCR es muy fiable porque aunque tengamos muy poca carga de virus, si da positivo es totalmente fiable. 00:28:42
No es como las pruebas de antígenos que hacemos nosotros en casa, que son más sencillas y que esas solamente nos podemos fiar cuando ya tenemos alta carga viral. 00:29:01
Pero si tenemos muy poca carga viral, la PCR es muy fiable porque como hacemos muchas copias de ese fragmento, pues es muy fiable. 00:29:13
Bueno, este sería el objetivo de esta técnica. 00:29:25
Vamos a ver cómo se obtiene este fragmento y cómo se hacen tantas copias. 00:29:31
Pues esta técnica, o sea, para realizar esta técnica se llevan a cabo tres etapas, se realizan tres etapas. 00:29:41
Desnaturalización, la segunda es alineamiento y la tercera es elongación. 00:29:53
Y ahora, estas etapas se repiten cíclicamente entre 20 y 40 veces. 00:29:58
Vamos a ver qué es esto y ahora ya veréis cómo lo vais a entender. 00:30:10
Primera etapa. Pues la primera etapa es la, hemos dicho, la desnaturalización. 00:30:18
Es decir, desnaturalización significa romper los puentes de hidrógeno entre las dos cadenas de ADN. 00:30:24
Pues entonces, aquí tenemos las dos cadenas, la 5'-3' y la 3'-5', esto sería una doble hélice. 00:30:34
Pues con la desnaturalización rompemos, separamos esas dos cadenas y esta etapa se lleva a cabo a 94 grados, es decir, con temperatura, con calor, hacemos la desnaturalización. 00:30:43
Si os acordáis, en la técnica de antes, en la hibridación, lo que hacemos es desnaturalizar también, pero si os acordáis, lo hacíamos con hidróxido de sodio. Bueno, pues aquí desnaturalizamos con temperatura. 00:31:00
Ahora, aquí es importante, a mayor cantidad de guanina y citosina que tengamos 00:31:14
pues se va a necesitar algo más de temperatura 00:31:22
porque si os acordáis entre guanina y citosina hay tres puentes de hidrógeno 00:31:25
por lo tanto nos va a costar más separar 00:31:31
si hay más guanina y citosina nos va a costar más separar esas dos cadenas 00:31:33
Bien, esta sería la primera etapa, ya tenemos las cadenas separadas 00:31:38
Ahora, la segunda etapa se llama alineamiento 00:31:44
Lo que se hace en esta etapa es bajar la temperatura entre 50 y 60, y 75 grados centígrados 00:31:49
En esta etapa, ¿qué vamos a hacer? 00:31:56
Pues lo que vamos a hacer va a ser añadir dos primers o cebadores 00:32:01
Si os acordáis, en la etapa de replicación, os acordáis que había una enzima, la ARN primasa, que lo que hacía era poner un primer en las cadenas de ADN para que luego la ADN polimerasa pudiera ir copiando. 00:32:06
pues en realidad esto es lo mismo 00:32:27
lo que pasa que aquí lo que hacemos es 00:32:30
nosotros añadimos dos primers 00:32:33
porque tiene que ir uno en cada cadena 00:32:35
y estos primers se sintetizan 00:32:39
en el laboratorio 00:32:42
y estos primers lo que van a hacer es 00:32:44
delimitar el fragmento 00:32:48
que queremos ampliar 00:32:52
aquí hay este en rojo sería un primer 00:32:53
un primer, acordaros, es una secuencia de nucleótidos 00:32:57
y esto otra secuencia de nucleótidos 00:33:01
que son complementarios, este es a una cadena 00:33:04
y este primer es complementario a esta otra cadena 00:33:08
pues estos dos primers van a ser los que delimiten 00:33:12
el fragmento que vamos a ampliar 00:33:17
¿Os acordáis? Aquí tenemos este fragmento en verde, es el que queremos ampliar 00:33:21
Pues este fragmento lo delimitan los primers que vamos a añadir, primers o cebadores 00:33:27
Y esta etapa es la etapa de alineamiento 00:33:34
Y los primers se hibridan, es decir, se unen a las dos cadenas, a cada una de las cadenas 00:33:38
se unen, es decir, se forman puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas de la cadena 00:33:50
y las bases nitrogenadas del primer. 00:33:56
Bueno, pues esta sería la etapa de alineamiento. 00:34:01
Y nos queda la última etapa, que es la tercera. 00:34:04
En esta etapa se vuelve a subir otra vez la temperatura a 70-80 grados centígrados. 00:34:07
Entonces, en la primera, en la desnaturalización, calentamos a 94. 00:34:15
Para que se unan los primers, para que se hibriden, bajamos a 50-65 grados centígrados y ahora es la etapa de elongación. Elongación significa que encima la ADN polimerasa va a ir copiando las cadenas del fragmento. 00:34:18
La ADN polimerasa empieza a copiar esta cadena por aquí y esta otra cadena la copia hacia acá 00:34:41
Si tenemos aquí una adenina pues va a copiar y va a poner una timina 00:34:49
Guanina, citosina, timina, adenina y así va copiando 00:34:54
Va copiando toda la cadena por este lado y va copiando esta cadena también 00:35:01
Si os acordáis de la replicación es parecida 00:35:05
la replicación, teníamos el primer y luego lo que era la elongación, la copia de las 00:35:09
dos cadenas. En este gráfico se pueden ver las tres etapas. Tenemos la doble hélice, 00:35:17
subimos la temperatura, esto es temperatura y esto es tiempo. Aumentamos la temperatura 00:35:26
a en torno de 94 grados, se desnaturaliza el ADN. Bajamos la temperatura entre 50-65 00:35:33
grados, se hibridan los primers o cebadores. Subimos otra vez la temperatura en torno a 00:35:41
70 grados y la ADN polimerasa comienza a copiar. Pues entonces, este sería el primer 00:35:51
ciclo. Entonces, en el primer ciclo vamos a obtener cuatro cadenas de ADN. Veis aquí 00:36:00
la roja, azul, roja y azul. En el primer ciclo vamos a obtener cuatro cadenas de ADN y el 00:36:08
aumento, este ciclo se va a repetir, como os he dicho antes, entre 20 y 40 veces. En 00:36:17
el primer ciclo, cuatro cadenas. Repetimos otra vez el ciclo, desnaturalización, alineamiento, 00:36:26
extensión, pues ahora se van a duplicar cada una de las dos cadenas y por lo tanto vamos 00:36:32
a obtener de esta cadena 2, de esta cadena 2, de esta cadena 2 y de esta cadena 2, pues 00:36:38
en el ciclo 2 vamos a obtener 8 cadenas, en el ciclo 3, como es exponencial, 16 cadenas, 00:36:44
en el ciclo 4, 32 cadenas y así se va haciendo copias del fragmento de ADN que nosotros queremos 00:36:53
copiar. Ahora, vamos a ver, aunque ya hemos visto un poco lo que es, qué componentes 00:37:01
se necesitan para la PCR, vamos a verlas un poquito más en profundidad. Por un lado 00:37:13
necesitamos el ADN que queremos copiar, esto es evidente, necesitamos el ADN. Por otro 00:37:19
necesitamos la una una adn polimerasa esta adn polimerasa la que se utiliza en 00:37:27
la actualidad es la tac polimerasa no lo he puesto aquí no sólo tenéis en los 00:37:37
apuntes la que se utiliza es la tac polimerasa al principio cuando se 00:37:44
empezó a utilizar esta técnica, se utilizaba la enzima de la E. coli, pero el problema 00:37:49
era que esta enzima no aguantaba temperaturas, cambios de temperatura, y entonces había 00:37:59
que ir volviendo a poner otra vez, a ir cambiando la enzima. En cambio aquí con la TAC polimerasa, 00:38:07
TAC viene de Cermus Aquaticus. Cermus, o sea que es una polimerasa que aguanta, resiste, vamos, quiero decir, la bacteria resiste a los cambios de temperatura. Bien, pues esta sería la ADN polimerasa que se obtiene de la bacteria de la TAC polimerasa. 00:38:18
Ahora, vamos a necesitar también unos primers, en concreto dos, dos primers 00:38:42
Uno para una cadena y el otro para la otra cadena 00:38:50
Estos primers, acordaros, delimitan el fragmento que se va a amplificar 00:38:54
También vamos a necesitar una serie de nucleótidos 00:39:00
Porque la ADN polimerasa va a ir copiando el fragmento 00:39:06
Pero claro, necesita de nucleótidos para ir poniendo nucleótidos, que acordaros, los nucleótidos tienen el grupo fosfato, el azúcar y la base nitrogenada. 00:39:11
Así que vamos a necesitar un nucleótido que tenga adenina, otro nucleótido que tenga aquí como base nitrogenada timina, otro que tenga citosina y otro que tenga guanina. 00:39:22
Y así la TAC polimerasa va a ir cogiendo estos nucleótidos y va a ir copiando la cadena. 00:39:33
Además también vamos a necesitar cationes magnesio. 00:39:44
¿Y estas cationes para qué nos van a servir? 00:39:51
Pues nos van a servir como estimulantes de la enzima. 00:39:53
Para acordaros que las enzimas, había algunas enzimas que necesitaban de un cofactor 00:39:59
Pues esta enzima necesita de cationes de magnesio 2+, que provienen de una disolución de cloruro de magnesio 00:40:09
Estos cationes van a estimular a la enzima TAC polimerasa 00:40:21
Y por último vamos a necesitar también que estos componentes estén en una disolución buffer o tampón, una disolución tampón para que no haya cambios de pH y con los cambios de pH acordaros que las enzimas se podían degradar. 00:40:25
porque las enzimas son proteínas que con cambios de pH se pueden degradar, pues necesitamos trabajar con que los componentes se encuentren en una disolución tampón. 00:40:48
Bueno, pues ya tenemos todos los componentes, esto sería un ependorf, aquí es donde vamos a poner todos los componentes 00:41:01
Y ahora, ¿qué hacemos para repetir? Hemos dicho que repetíamos los ciclos de desnaturalización, alineamiento y elongación, se repiten entre 20 y 40 veces. 00:41:09
Bueno, pues para repetir estos ciclos lo que utilizamos es un termociclador 00:41:23
Que es un aparato de este tipo 00:41:31
Aquí, no se ve muy bien, pero aquí pondríamos los ependors 00:41:35
Que son así muy pequeñitos 00:41:43
Aquí pondremos toda la serie de ependors 00:41:46
Y aquí lo que hacemos es programar el ciclo 00:41:49
Porque, bueno, generalmente se trabaja con los cambios de temperatura que hemos visto, pero se pueden hacer otras programaciones diferentes. 00:41:53
Bueno, pues esto se llama termociclador. Es el aparato donde se hace la PCR y es el aparato donde se pueden hacer los cambios de temperatura. 00:42:07
Pues esta sería la CR 00:42:19
Profe, una pregunta con respecto a lo del termociclador 00:42:31
En función de lo que nosotros queramos conseguir 00:42:35
¿Será el tiempo que le vamos a poner en el termociclador? 00:42:39
¿Los ciclos te refieres? 00:42:46
Es que el tiempo depende de... 00:42:48
Sí, depende también 00:42:50
Pues si tenemos muy poca cantidad de muestra 00:42:52
pues pondremos más ciclos 00:42:55
sí, más ciclos 00:42:57
en cambio si a lo mejor con 20 ciclos 00:43:00
si tenemos suficiente cantidad de muestra 00:43:03
a lo mejor con 20 ciclos ya nos vale 00:43:05
y por lo tanto el tiempo va a depender 00:43:07
de cuántos ciclos pongamos 00:43:10
no sé si te he respondido 00:43:12
sí, eso era lo que quería saber 00:43:14
si había algo exacto 00:43:17
o en función de lo que yo quiero encontrar 00:43:18
o cuánta cantidad quiero conseguir 00:43:20
es la cantidad de ciclos que voy a ponerle a... 00:43:22
Eso, en función de la muestra que tengas, 00:43:26
en función también de la seguridad 00:43:30
con la que quieras luego determinar tu muestra, 00:43:33
el ADN que has amplificado. 00:43:37
Si necesitas una fiabilidad muy alta, 00:43:40
pues tendrás que hacer más ciclos. 00:43:42
Tendrás que repetir las tres etapas más veces 00:43:44
y así puedes tener más seguridad. 00:43:48
Una vez que tenemos ya esos fragmentos, ya miles de fragmentos de ese ADN, lo que queremos es saber si hemos fragmentado la secuencia que nosotros queríamos. 00:43:52
porque a lo mejor hemos hecho copias de un fragmento que no es el que nosotros queríamos. 00:44:11
Pues eso se comprueba haciendo una electroforesis en gel de agarosa. 00:44:21
Entonces, bueno, lo mismo que antes, como el ADN tiene carga negativa al aplicar un campo eléctrico, 00:44:26
el ADN se va a desplazar hacia el polo positivo y según el tamaño de ADN se va a desplazar más o menos. 00:44:33
Pues así, de este modo, vamos a comprobar si hemos amplificado el fragmento que nosotros queríamos. 00:44:41
Hacemos eso, la electroforesis. 00:44:54
Normalmente se suele hacer en gel de agarosa, pero a veces también se utiliza el gel de poliacrilamida, que es el que vimos para proteínas. 00:44:58
Esto sería lo que obtendríamos en el gel de agarosa, esto sería la secuencia patrón. 00:45:07
Y esto sería cada una de nuestras muestras que estemos analizando. 00:45:14
Bueno, aquí os he puesto un ejemplo, que esto será lo que hagamos en las prácticas para determinar si un maíz es transgénico, si un alimento tiene maíz transgénico. 00:45:23
Y entonces se puede ver, esto ya lo explicaré, pero aquí se puede ver por ejemplo el maíz normal que serían los carriles el 3 y el 6 solamente tienen una banda y en cambio el 2, el 4, el 5 y el 7 tienen dos bandas. 00:45:35
Aquí ya esto nos está indicando que hay un fragmento de ADN que es este de aquí, que es el que se corresponde a alimentos transgénicos, por lo tanto estas muestras, la 2, la 4, la 5 y la 7 son transgénicos. 00:45:55
Esto es una de las aplicaciones de la PCR. Bueno, aquí estarían los pasos. Sería poner todos los componentes en nuestro Ependor, luego se ponen en el termociclador, se hace la PCR, se analiza por electroforesis y estas serían las secuencias en una PCR normal. 00:46:10
¿Qué ventajas tiene la PCR? Bueno, ya hemos dicho que desde una muestra mínima a una muestra pequeña se puede amplificar y por lo tanto es una técnica muy sensible, tiene alta sensibilidad. 00:46:39
Otra ventaja sería la automatización 00:46:55
Y otra de las ventajas sería la sencillez 00:47:01
Porque en realidad, fijaros que simplemente con tener los componentes 00:47:06
Y el termociclador, que es un aparato más o menos sencillo 00:47:11
Pues se hace fácil una PCR 00:47:18
Simplemente es poner los ependors, programar la secuencia y lo único que luego hay que analizarlo por electroforesis en gel de agarosa. 00:47:21
Ahora, ¿qué problema tiene la PCR importante? 00:47:35
Pues que claro, como es tan sensible, como ya os digo, a partir de una muestra mínima podemos amplificar un fragmento de ese ADN, de esa muestra. 00:47:38
Claro, si hay contaminación, pues es posible que amplifiquemos un fragmento de ADN que no sea el que nosotros queremos, que haya algún contaminante por ahí y estemos amplificando ADN falso. 00:47:49
Por lo tanto, en la PCR hay que tener muchísimo cuidado, muchísima limpieza al hacer la PCR. 00:48:05
Por otra parte, ¿qué es importante también en la PCR o qué otra limitación tiene la PCR normal? Pues que no se puede cuantificar, no podemos saber cuánto ADN estamos amplificando. 00:48:15
Pues para eso tenemos la PCR a tiempo real o PCR cuantitativa. Tenemos que tener cuidado porque también hay otra PCR de transferencia inversa que a veces también se pone como, porque es transferencia en inglés es TR-PCR. 00:48:30
Y entonces hay veces que se confunden. Aquí he puesto esta QPCR, ¿vale? Porque es cuantitativa. Q es del inglés, pero hay veces que también se pone TR, de tiempo real, aquí TR en pequeñito, que se puede confundir con la PCR de transferencia inversa, que se pone también a veces TR, pero bueno, simplemente porque lo sepáis. 00:48:58
Pues esta PCR a tiempo real, como os digo, nos permite cuantificar, nos permite saber qué cantidad de ADN tenemos 00:49:22
Y para esto se utilizan unas moléculas que son fluorescentes 00:49:32
Acordaros que antes ya hemos visto los fluorocromos 00:49:38
Estas moléculas cuando las excitamos con luz, pues absorben luz y emiten otra luz 00:49:41
Y esa luz que emiten la podemos identificar, o sea, se puede detectar. 00:49:48
Entonces, la cuantificación de la fluorescencia emitida durante cada ciclo de la PCR es proporcionar a la cantidad de ADN que se está amplificando. 00:50:00
Para que sea válida esta técnica es necesario realizar en paralelo una curva patrón en las mismas condiciones para conocer la cantidad total de ADN que se está amplificando. 00:50:09
Bueno, hay dos formas de hacer esta PCR a tiempo real. Una forma es añadiendo agentes intercalantes y otra forma es añadiendo sondas específicas marcadas con fluorocromos. 00:50:18
Bueno, como en el documento solamente viene explicada esta, la de sondas, pues no nos vamos a liar con los agentes intercalantes 00:50:34
Los agentes intercalantes simplemente son fluorocromos, moléculas, que lo que hacen es meterse entre las dos cadenas de ADN 00:50:43
Es decir, que según se va amplificando el ADN, se va metiendo ahí esa molécula entre la doble hélice y entonces vamos a ir detectando, detectamos ese fluorocromo y vamos a ir detectando cómo va aumentando. 00:50:54
Pero bueno, ya os digo, vamos a ver mejor esta, que es las ondas específicas, que es lo que tenéis explicado en el documento. 00:51:12
Bueno, ¿qué consisten las ondas? 00:51:21
Estas ondas son secuencias de nucleótidos 00:51:22
Lo que pasa es que estas secuencias de nucleótidos llevan adherido en un extremo una molécula fluorescente 00:51:27
Y en el otro extremo una molécula que inhibe la fluorescencia y que se llama cuenches 00:51:37
Esto es un poco complicado pero ya el próximo día si queréis lo repasamos 00:51:43
Pero vamos a intentar, hoy os lo explico y os lo miráis y ya el próximo día lo repasamos. 00:51:49
Entonces, mirad, vamos a ver si lo tengo aquí. 00:51:58
Tenemos nuestra cadena de ADN, esta de aquí. 00:52:02
Tenemos nuestro primer, este de aquí. 00:52:06
Y además de nuestro primer, añadimos una sonda. 00:52:08
Esta sonda tiene, por un lado, esto aquí en verde sería el fluorocromo. 00:52:13
Y esto de aquí en rojo sería lo que se llama cuencher. Este fluorocromo, esta molécula, va a emitir radiación, lo que pasa es que este cuencher de aquí va a inhibir esta radiación que está emitiendo. 00:52:18
Por lo tanto, al principio no vamos a ver fluorescencia. 00:52:33
Ahora, el primer se hibrida a la molécula de ADN y la sombra también se hibrida a la molécula de ADN. 00:52:39
Este sería el paso 2, que sería, hemos dicho, alineamiento. 00:52:50
Ahora, en el paso 3, que es la elongación, la ADN polimerasa, esto que está aquí dibujado en naranja, empieza a copiar. 00:52:54
Copia, va copiando ADN, ADN, va copiando las bases nitrogenadas hasta que de repente llega a la sonda. 00:53:03
Pues cuando llega a la sonda lo que va a hacer es romper esta molécula. 00:53:12
Rompe esta molécula y entonces vamos a empezar a ver fluorescencia. 00:53:17
Esta molécula va a emitir fluorescencia y se va a poder ver. 00:53:24
antes no podíamos ver la fluorescencia que está emitiendo 00:53:27
porque este quencher nos lo está absorbiendo 00:53:31
pero ahora como la ADN polimerasa ha roto esta sonda 00:53:34
pues vamos a poder ver fluorescencia 00:53:39
y así según se va amplificando 00:53:41
las cadenas del fragmento de ADN 00:53:45
vamos a ir viendo más fluorescencia 00:53:48
y así se puede cuantificar 00:53:50
Aquí tenéis un vídeo desde donde he sacado estos dibujos y ahí si lo veis os va a poder ayudar a entender esta técnica. 00:53:53
Ahora, para analizar la fluorescencia lo que necesitamos es un termociclador pero que tenga también lector de fluorescencia 00:54:11
porque claro, a nuestras muestras que tenemos aquí les vamos a tener que incidir con una luz ultravioleta 00:54:25
estas muestras absorben parte de esa luz y emiten fluorescencia 00:54:32
Pues esa fluorescencia que van a emitir la tenemos que detectar y para ello necesitamos un lector de fluorescencia. 00:54:37
Entonces necesitamos un termociclador que tenga lector de fluorescencia. 00:54:46
Ahora, ¿qué ventajas tiene la PCR a tiempo real? 00:54:53
Pues sobre todo que podemos cuantificar y además como luego no vamos a tener que hacer ninguna electroforesis pues se van a minimizar los problemas que teníamos de contaminación. 00:54:56
Bueno, aquí tenemos algunas de las aplicaciones que serían aplicaciones en medicina, lo que hemos visto de la detección del virus, del COVID, también en ciencias forenses, lo que os explicaba antes. 00:55:10
También a partir de una muestra de ADN, de sangre, de semen, podemos detectar el ADN de un sospechoso, comprobar si el sospechoso ha sido el que ha hecho ese crimen. 00:55:30
También en antropología, en paleontología, mirad por ejemplo, bueno esto el próximo día ya os lo amplío un poquito más 00:55:49
Bueno también en detección de organismos transgénicos, es lo que os comentaba antes, en paleontología, en ciencias forenses, en medicina 00:56:00
Y esto os lo he puesto aquí porque hay una exposición, no sé si todavía está, de Pompeya, de cuando el volcán, el Vesubio, la erupción del Vesubio, y bueno, si tenéis tiempo y está todavía esa exposición, está muy bien, es con realidad virtual. 00:56:07
Y esto lo hice una foto porque aquí se decía, ponían que investigadores de la Universidad de Copenhague habían caracterizado el ADN, el genoma humano, de un individuo víctima de esta erupción del Vesuvio y habían detectado que había tenido tuberculosis. 00:56:31
Bueno, os lo he puesto aquí como curiosidad. Bien, pues bueno, el próximo día ya vemos un poco más las aplicaciones. No sé si tenéis alguna duda. Me imagino que ya... Hoy igual os he dado un poco de paliza, pero quería ampliar para... Como luego ya viene Semana Santa, para que tuvierais este... 00:56:58
Yo le iba a preguntar, nosotros tenemos clase el martes siguiente de Semana Santa 00:57:28
y después el jueves es que es la práctica, ¿cierto? 00:57:38
El martes en principio no hay clases, cuando hay prácticas en principio no hay clases 00:57:41
lo que pasa que igual lo que hago es subir una clase de la siguiente técnica 00:57:48
que es la del ADN recombinante 00:57:58
para poder ir avanzando 00:58:00
pero en principio el martes 00:58:02
le voy a preguntar a María José por si acaso 00:58:04
pero en principio 00:58:06
no habría clase el martes 00:58:08
empezaríamos eso, la práctica 00:58:10
el jueves 00:58:12
o sea, no hay clase pero de igual 00:58:13
forma usted sube a una clase 00:58:16
para que nosotros podamos continuar 00:58:18
el tema 00:58:20
eso es, sí 00:58:21
¿Qué más os iba a decir? 00:58:24
Vale, la vuelta sería eso 00:58:29
El día 00:58:30
Sería el 4 00:58:31
El 4 de abril 00:58:34
Es la práctica, ¿verdad? 00:58:36
Esa las 00:58:40
Creo que es 00:58:40
La práctica usted no las va a poner en el 00:58:41
En el aula 00:58:44
Para que la podamos imprimir 00:58:46
Eso es, la práctica 00:58:48
La pongo en el aula 00:58:50
Y lo que vamos a hacer 00:58:52
es analizar un organismo transgénico. Entonces el jueves primero vamos a extraer el ADN y 00:58:54
después el jueves siguiente haremos la PCR y tenemos que hacer también una electroforesis 00:59:03
en gel de agarosa. Lo que no estoy muy segura es si quizá necesitemos otro día, pero dejadme 00:59:12
que lo hable con Mari José 00:59:22
y ya 00:59:23
os lo confirmo, porque no sé 00:59:25
si nos va a dar tiempo, en dos días 00:59:27
no creo que nos dé tiempo 00:59:29
os he puesto también, os puse 00:59:31
el otro día ya los vídeos, los últimos 00:59:37
me falta el del último día 00:59:39
el del martes pasado 00:59:41
y a ver si 00:59:42
mañana ya puedo poneros 00:59:45
el del 00:59:48
martes pasado y este de hoy, para que 00:59:50
así los tengáis en Semana Santa. 00:59:52
Y os pondré también 00:59:55
la... Intentaré poneros 00:59:56
también la presentación 00:59:58
de esto último que hemos visto. 00:59:59
Y no sé 01:00:03
si me queda algo más. ¿Qué tal vais 01:00:04
con el...? ¿Habéis hecho 01:00:06
la práctica 01:00:07
del ADN 01:00:09
de la cebolla? 01:00:12
Yo sí lo hice en 01:00:18
estos días. 01:00:19
Yo tenía una duda. 01:00:25
Ahí decía que solamente se podía subir una foto. Bueno, las otras fotos las puse en el informe, no hay problema, ¿cierto? 01:00:26
Vale, no hay problema. A ver, un segundo que voy a… 01:00:34
Autor/es:
S.A.
Subido por:
Susana A.
Licencia:
Todos los derechos reservados
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Fecha:
20 de marzo de 2024 - 15:51
Visibilidad:
Clave
Centro:
IES LOPE DE VEGA
Duración:
1h′ 00′ 38″
Relación de aspecto:
1.78:1
Resolución:
1092x614 píxeles
Tamaño:
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