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Secuenciación y tipificación - Contenido educativo

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Subido el 11 de abril de 2025 por Susana A.

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secuenciar el ADN. Bueno, pues secuenciar lo que significa es que vamos a saber cada uno de los nucleótidos 00:00:00
que están formando esa cadena de ADN. Vamos a conocer los nucleótidos y el orden en el que están esos nucleótidos. 00:00:07
Vamos a saber si tenemos adenina, timina, timina, adenina, guanina, guanina, citosina, citosina. 00:00:16
Vamos a saber esa secuencia de toda la cadena de ADN. 00:00:23
Bueno, pues esta secuencia de ADN constituye la información genética heredable de un organismo. 00:00:27
Entonces, para determinar la secuencia de ADN es útil en el estudio de la investigación básica de los procesos biológicos fundamentales. 00:00:39
Y las técnicas actuales han aumentado a gran velocidad esta secuenciación, esta detección de la secuencia de ADN. 00:00:47
Y esta técnica también ha sido muy importante para conocer el genoma humano, lo que es el proyecto del genoma humano. 00:01:01
El genoma humano tiene como unas 3.000 millones de bases, pues se conoce todo lo que constituye el genoma humano, todas esas bases. 00:01:14
La técnica más importante en secuenciación se denomina la secuenciación Sanger. 00:01:29
¿En qué consiste esta secuenciación Sanger? 00:01:41
El principio fundamental de esta secuenciación Sanger es que vamos a utilizar unos nucleótidos trifosfato, o sea, la adenina, la timina, la citosina con el grupo fosfato, pero esos nucleótidos tienen una característica particular. 00:01:44
Esos nucleótidos los vamos a llamar, se llaman didesoxinucleótidos 00:02:05
Pues esa característica que tienen estos didesoxinucleótidos es la siguiente 00:02:12
Y es que nosotros en un nucleótido, el nucleótido normal 00:02:22
Lo que teníamos, si os acordáis, teníamos el grupo fosfato 00:02:27
Teníamos el azúcar y teníamos la base nitrogenada 00:02:31
Eso en el nucleótido, un ADN normal 00:02:37
Y luego en el azúcar acordaros que teníamos un grupo OH 00:02:41
Y aquí en este carbono de aquí solamente aquí tenemos un hidrógeno 00:02:45
Recordad que en el ARN aquí el azúcar es lo que cambia 00:02:51
En el ARN teníamos aquí un OH y aquí también otro OH 00:02:55
Y luego esta de aquí serían eso, las bases nitrogenadas 00:03:00
En el ADN teníamos adenina, timina, citosina y guanina. Y luego esto de aquí es el grupo fosfato, que es igual en todos los nucleótidos. 00:03:04
Vale, pues en esta técnica, bueno, perdonad, antes de eso, lo que sabemos es que los nucleótidos se unen unos a otros formando toda la cadena de ADN y se unen a través de este carbono de aquí, 00:03:14
o sea, a través de este OH de aquí, que está en el carbono 3, este OH de aquí, y luego el siguiente nucleótido se une por este carbono de aquí, que es el 5. 00:03:33
Entonces, el OH que tiene aquí este azúcar se une al grupo fosfato del siguiente nucleótido. Aquí otra vez, el OH del carbono 3 se une al siguiente nucleótido y por el grupo fosfato. 00:03:47
Recordad que estos eran enlaces fosfodiéster, se llaman fosfodiéster porque tenemos aquí el fósforo y tenemos aquí dos ésteres 00:04:04
Recordad también que las bases nitrogenadas estaban unidas unas a otras pero estos eran por puentes de hidrógeno 00:04:15
Unidas a otras con la otra cadena 00:04:24
Pero bueno, aquí lo importante que tenemos que ver aquí es que los nucleótidos tenemos el grupo fosfato, el azúcar con un OH y la base nitrogenada. 00:04:27
Bueno, pues en esta técnica de aquí lo que vamos a hacer es añadir didesoxinucleótidos y los didesoxinucleótidos serían estos de aquí. 00:04:41
Estos tidesoxinucleótidos no tienen OH aquí, ¿veis? Aquí tienen un H y aquí otro 00:04:53
No tienen grupo hidróxilo, no tienen OH aquí en el azúcar 00:05:01
Por lo tanto, si este nucleótido se une, o sea, si tenemos este nucleótido 00:05:06
No va a poderse unir aquí ningún otro nucleótido 00:05:16
Porque aquí no tenemos grupo OH, aquí no se puede unir este grupo fosfato, porque aquí no tenemos OH, entonces aquí no va a poder continuar la cadena. 00:05:20
Bueno, pues lo que se hace entonces en esta técnica, se hacen una serie de mezclas y los componentes de esta mezcla serían el ADN que queremos codificar, que queremos analizar en forma monocatenaria, o sea, una de las cadenas. 00:05:33
Vamos a necesitar también una ADN polimerasa, la ADN polimerasa que va a ir copiando este ADN. Vamos a necesitar también un cebador, recordad los cebadores son necesarios para que la ADN polimerasa pueda empezar a copiar la cadena. 00:06:02
Pues además vamos a necesitar los cuatro nucleótidos. Estos cuatro nucleótidos son los desoxinucleótidos trifosfáticos. Desoxiadenintrifosfato, desoxicitosintrifosfato. 00:06:22
Esto simplemente es el nucleótido, este de aquí, este nucleótido, pues si esta base de nitrógeno es adenina, pues este es el nucleótido desoxinucleótido, desoxiadenin trifosfato. 00:06:39
Se dice trifosfato porque aquí habría tres grupos fosfato, pero bueno, lo que necesitamos sería eso, el ADN que queremos analizar, la ADN polimerasa, un cebador, los cuatro nucleotidos, porque claro, la ADN polimerasa va a ir copiando la cadena y pues va a tener que ir añadiendo, pues donde haya adenina, pues la ADN polimerasa pone timina, pues coge una timina. 00:06:57
Que hay una guanina, pues coge un nucleótido que tenga citosina y así va copiando. Pero, además, lo que os decía, vamos a añadir también nucleótidos didesoxinucleótidos, o sea, didesoxinadenitrifosfato, didesoxicitosintrifosfato. 00:07:24
Estos didesoxi no tienen aquí grupo OH 00:07:44
Pues entonces lo que se hace es preparar cuatro disoluciones diferentes 00:07:50
En las cuatro tenemos estos componentes 00:08:00
El ADN, el ADN polimerasa, el cebador y los cuatro nucleótidos 00:08:05
Estos son los componentes comunes en los cuatro tubos de ensayo. 00:08:11
Estos son los cuatro componentes comunes. 00:08:18
Pero luego lo que hacemos es, en uno de ellos añadimos el didesoxiadenin trifosfato. 00:08:21
Por ejemplo, aquí añadimos un nucleótido que como base nitrogenada tiene adenina y que además aquí no tiene grupos OH. 00:08:30
En el siguiente tubo añadimos también el ADN, a descodificar la ADN polimerasa, el cebador, los cuatro nucleótidos y añadimos un D-desoxicitosina, en este caso tenemos la citosina, la citosina sin grupo OH aquí. 00:08:38
En el tercero, pues los mismos, todos estos componentes, pero en este caso la guanina. Aquí como base nitrogenada la guanina y aquí sin OH. Y en el último, pues todos estos componentes más la D-desoxi, esta sería la timina. 00:09:02
Vale, entonces aquí adenina, timina, perdón, citosina, guanina y timina, pero este de aquí, endidesoxi, sino H. 00:09:24
Entonces, ¿qué es lo que va a ocurrir cuando tengamos esta mezcla? 00:09:37
Pues que la ADN polimerasa va a ir copiando, va a ir copiando la cadena, 00:09:43
Pero, por ejemplo, aquí en este tubo de aquí va a llegar un momento en el que va a coger, en vez de coger este nucleótido normal, va a coger este otro, el didesoxi. 00:09:51
Pues cuando la ADN polimerasa coja este didesoxi nucleótido de adenina y lo incorpore a la cadena, ¿qué va a pasar? 00:10:04
que ahí va a terminar la cadena de copiarse, ya no puede seguir copiando la ADN polimerasa porque no hay grupo OH al que se pueda unir el siguiente nucleótido. 00:10:16
Entonces ahí va a terminar la reacción. 00:10:28
En el siguiente tubo pues va a ocurrir algo parecido, lo que pasa que aquí lo que tenemos es la citosina, la diitesoxi citosina. 00:10:34
Entonces, la ADN polimerasa va a ir copiando, va copiando, va copiando. Cuando llegue a una base nitrogenada que haya guanina, la ADN polimerasa copiará como citosina. 00:10:43
Sigue copiando, sigue copiando. Si hay otra guanina, pues coge otro nucleótido que sea citosina. 00:10:56
Pero va a haber un momento en el que en vez de coger la citosina normal, el desoxinucleotido normal con OH, pues va a coger este otro, el didesoxi. 00:11:03
Bueno, pues cuando coja este didesoxinucleotido, ¿qué va a pasar? Que ahí se va a cortar la cadena aquí, ahí ya va a terminar de copiar la ADN polimerasa, ya no se va a poder copiar más. 00:11:15
Aquí tenéis un ejemplo. Esto es más o menos lo que os he explicado. 00:11:30
Para iniciar la secuenciación se deben realizar cuatro mezclas. 00:11:37
Cada una de ellas debe contener el ADN a secuenciar, los cuatro nucleótidos, la ADN polimerasa y el cebador. 00:11:40
Además, en cada una de las mezclas se debe introducir un nucleótido de disoxi distinto. 00:11:47
El proceso que se lleva a cabo se inicia con la adhesión de los cebadores en la parte correspondiente de la cadena de ADN. 00:11:53
Acordaros que siempre tiene que haber un cebador para que pueda empezar a copiar la ADN polimerasa. 00:12:00
Entonces se inicia la replicación del ADN molde gracias a la acción de la enzima. 00:12:07
En el orden en que la cadena molde vaya informando, la enzima añadirá los nucleótidos necesarios para completar la cadena de nueva creación. 00:12:12
Esto es lo que ya os he contado. 00:12:22
Ahora, este proceso se va realizando simultáneamente en una gran cantidad de moléculas de ADN, 00:12:25
por lo que estadísticamente, cada vez que se deba añadir una nueva base, 00:12:31
alguna de esas moléculas no añadirán un nucleótido, sino que añadirán un nucleótido di-desoxi. 00:12:37
Estos últimos tienen la particularidad de haber perdido el grupo OH del carbono 3. 00:12:46
por lo que en el momento en que se incorporan en la cadena que se están formando, finalizan la reacción, 00:12:53
puesto que no disponen de la capacidad de introducir el siguiente nucleótido. 00:13:00
Así pues, la cadena se irá replicando al mismo tiempo los cuatro recipientes, 00:13:05
de tal forma que en cada uno van quedando algunas cadenas finalizadas 00:13:11
cuando se incorpora un nucleótido correspondiente al didesoxi introducido en ese recipiente. 00:13:15
Bueno, pues vamos a ver el ejemplo que tenéis aquí en el documento. Nos tenemos, por ejemplo, esta secuencia que se quiere replicar, citosina, adenina, citosina, guanina, timina, adenina, adenina, guanina, citosina, timina, guanina, guanina, timina, adenina y guanina. 00:13:20
Esto es ADN 00:13:41
Pues ahora, la cadena complementaria que se va a copiar, que se va a replicar 00:13:44
Pues sería, si aquí tenemos citosina, guanina, adenina, timina 00:13:50
Guanina, citosina, adenina, timina, timina, citosina, guanina, adenina, citosina 00:13:55
Si tenemos aquí guanina, pues citosina, guanina, citosina, timina, adenina, adenina, timina, guanina, citosina 00:14:02
Bueno, pues si solamente tuviéramos los nucleótidos normales, los de soxinucleótidos, pues esta cadena se copiaría tal cual. 00:14:10
Pero, lo que os digo, en esta tecnología, tecnología Sanger, utilizamos cuatro tubos diferentes. 00:14:23
Entonces, en este tenemos la didesoxiadenina y entonces cuando la cadena, cuando la ADN polimerasa empieza a copiar, pues empieza a copiar, ¿no? La citosina, pues pone guanina, adenina, timina, citosina, guanina, guanina, citosina. 00:14:33
Ahora, llega aquí timina y tiene que poner una adenina, pues resulta que esta adenina que ha cogido es la didersoxi, por lo tanto ya no puede continuar la cadena copiándose. 00:14:51
Aquí termina este fragmento de ADN que se copia. 00:15:06
Entonces, esto es, estadísticamente se van formando todas estas secuencias. 00:15:11
Entonces, habrá otro momento en el que la adenopolimerasa va copiando, va copiando, va copiando, va copiando hasta que llega, por ejemplo, aquí a esta timina. 00:15:17
Entonces, en esta timina, en vez de coger la adenina normal, la desoxiadenina con el grupo 8, coge la didesoxi. 00:15:29
Por lo tanto, aquí, si se une una adenina didesoxi, pues aquí termina la cadena de copiarse. 00:15:37
En cambio, en este tubo de aquí, que tenemos la didesoxicitosina, pues la ADN polimerasa va copiando. 00:15:47
Copia citosina, guanina, adenina, timina, citosina, guanina. 00:15:58
Ahora, aquí por ejemplo, guanina, citosina. 00:16:03
Pues aquí es probable que en vez de coger una citosina normal, coja la didesoxi. 00:16:06
Pues aquí se pararía de copiar la ADN polimerasa. 00:16:11
ya no puede continuar de copiar 00:16:16
luego se va a formar otro fragmento 00:16:18
que llegue hasta aquí 00:16:21
hasta esta citosina que se copia 00:16:25
y ya aquí pare 00:16:27
en este caso de aquí que tenemos la didesoxiguanina 00:16:29
la didesoxiguanina puede ser que 00:16:33
en el primer nucleótido 00:16:37
que tenemos citosina y que lo copiamos 00:16:39
con la adn polimerasa tiene que poner guanina 00:16:42
puede ser que la ADN polimerasa ya coja el D-desoxi y entonces ya la cadena para de copiarse y así sucesivamente. 00:16:45
En este de aquí tenemos la D-desoxi timina, pues la ADN polimerasa copia citosina o adenina timina, pues aquí timina, aquí ya ha cogido la D-desoxi, aquí ya se para de copiar la cadena. 00:16:57
Para analizar todos estos fragmentos de ADN, lo que se hace es una electroforesis en gel de agarosa. 00:17:13
Los que habéis hecho las prácticas ya habéis visto cómo es la técnica. 00:17:23
Entonces prepararíamos el gel de agarosa y le haríamos, si os acordáis, una serie de pocillos. 00:17:29
Aquí hacemos cuatro pocillos y en cada uno de los pocillos lo que vamos a introducir es cada una de estas disoluciones. 00:17:37
Entonces, en cada una de estas disoluciones vamos a tener diferentes fragmentos de ADN y además cada uno de ellos tiene diferente masa molecular. 00:17:48
Acordaros, los de mayor masa molecular quedan retenidos arriba, porque el gel de agarosa tiene una serie de poros, y por esos poros, los de mayor peso molecular no pueden atravesar esos poros y el ADN queda retenido arriba. 00:17:58
En cambio, los de menor peso molecular, que serían estos, la guanina, guanina timina, eso sí que van a ir atravesando los poros y nos aparecerán en la parte de abajo del gel. 00:18:19
Bueno, pues entonces, como hemos introducido en cada pocillo, introducimos estas disoluciones, esta aquí, esta por aquí, esta por aquí y esta aquí en el 4. 00:18:33
Por ejemplo, en el pocillo 3, en el que teníamos la didesoxi guanina, en este pocillo nos va a aparecer una banda en la que solamente vamos a tener guanina, que será esta de aquí. 00:18:45
tendremos otra banda en la que vamos a tener 00:19:01
guanina, timina y guanina 00:19:05
que sería esta de aquí 00:19:07
otra banda en la que vamos a tener 00:19:08
estas hasta aquí 00:19:11
hasta este fragmento 00:19:14
en este de aquí que sería la timina 00:19:18
pues algo parecido 00:19:22
en el primero tenemos guanina, timina 00:19:24
este de aquí 00:19:26
El siguiente sería guanina timina, guanina citosina, adenina timina 00:19:27
Pues sería este de aquí, guanina timina, guanina citosina, adenina timina 00:19:33
Y así sucesivamente, acordaros, los de mayor peso molecular arriba 00:19:38
Pues así vamos a poder saber la secuencia de nucleótidos de nuestro ADN 00:19:43
Bueno, pues esta técnica nos sirve para secuencias de ADN más bien cortas, entre comillas, como hasta 500 fragmentos. 00:19:50
Pero claro, si queremos, por ejemplo, para el estudio del genoma humano, que la longitud es de 3.000 millones de bases, 00:20:08
por lo que tenemos que, claro, no podemos hacer tantas secuencias de este tipo, sería muy difícil. 00:20:14
Entonces lo que se hace es una técnica Sanger modificada. 00:20:23
Pero antes de eso, vamos a ver, bueno, aquí tenemos en resumen cada vez que se introduce un nucleótido 00:20:28
existe la probabilidad, y de hecho sucede, de que en alguna de las cadenas, en lugar de desoxi, X, lo que sea, 00:20:35
se introduzca la D-desoxy-X. 00:20:44
Esto es lo que ya os he dicho. 00:20:48
A continuación se colocan muestras de los cuatro recipientes en cuatro carriles distintos del gel 00:20:50
y se separan por electrofloresis. 00:20:54
Las posiciones relativas entre las cuatro calles se utilizan entonces para leer de abajo a arriba 00:20:58
la secuencia de ADN como se indica. 00:21:02
De esta manera se puede deducir el orden y la composición de la cadena que se ha sintetizado. 00:21:04
A su vez esta es la cadena complementaria de la cadena inicial. 00:21:11
Vale, entonces, vamos a ver este vídeo que hay aquí, a ver, lo tenía aquí abierto, 00:21:16
como no tiene voz, solo tiene música, vale, hay que desnaturalizar el ADN, y ahora lo 00:21:32
que se ve mucho es que esta sería la secuencia que queremos copiar, añadimos el timer y 00:21:48
Y ponemos lo común, añadimos también los dióxidos, los óptimos dióxidos, y añadimos los didesóxidos, cada uno uno. 00:21:54
Y otro referente, didesóxido. 00:22:22
Voy a quitar el volumen. 00:22:27
Vale, hemos añadido, entonces aquí tenemos, a ver un segundo, vuelvo atrás. 00:22:30
Aquí tenemos la cadena, el primer que ya se ha hibridado a la cadena, tenemos los nucleótidos normales y el didesoxi en cada uno, en cada tubo uno diferente. 00:22:35
Ahora la ADN polimerasa va copiando hasta que, por ejemplo, en este caso ha llegado esta base nitrogenada que no tiene grupo H, esto lo identifican así. 00:22:49
Pues ahí ya para de copiar la ADN polimerasa. Ahí ya para. Ahí ya tendríamos un fragmento donde se van formando diferentes fragmentos en cada tubo. 00:23:02
Luego haríamos la gel. Bueno, aquí lo hacen en gel de poliacrilamida. Se aplica una carga. Acordaros, como el ADN tiene carga negativa debido a los grupos fosfato, 00:23:38
pues la carga negativa se va a dirigir hacia el polo positivo 00:23:53
y así obtenemos los diferentes fragmentos 00:23:58
cuando más pequeño pues van a aparecer más abajo 00:24:03
menos masa molecular más abajo 00:24:19
y así vemos todos los 00:24:22
vamos a obtener el ADN 00:24:27
la secuencia 00:24:32
Aquí en este caso la primera es adenina, luego anina, bueno aquí lo ponen un poco diferente y así podemos conocer la secuencia de este fragmento de ADN. 00:24:33
Vale, pues lo que os decía. Esto nos sirve para diferenciar como unos 500 fragmentos, pero para el estudio del genoma humano, si necesitamos analizar unos 3.000 millones de bases, esto no es viable. 00:24:59
Se ha hecho una técnica de Sanger modificada. ¿En qué consiste esta técnica modificada? 00:25:45
Pues mirad, hay dos formas. Una sería la secuenciación utilizando colorantes que se acoplan al cebador. 00:25:56
y este cebador se puede marcar en su extremo 5' mediante un colorante fluorescente 00:26:06
y así luego puedes detectar las secuencias de ADN. 00:26:15
Pero la técnica más novedosa sería esta, que es la secuenciación por terminador fluorescente. 00:26:23
La ventaja que tiene esta técnica es que en una sola reacción se obtiene la secuencia de ADN 00:26:31
Es decir, no necesitamos poner los cuatro didesoxinucleótidos en cada tubo 00:26:42
Sino que en un mismo tubo se puede hacer toda la reacción 00:26:48
Y ahora lo que se hace es marcar cada uno de los cuatro didesoxinucleótidos con un colorante fluorescente diferente 00:26:53
y luego se separan por cromatografía. 00:27:00
Entonces, de esta técnica es simplemente saber eso, 00:27:05
que es una técnica mejorada de la técnica Sanger. 00:27:09
Vamos a ver este vídeo de Javier Novo, de este científico, para que lo entendáis. 00:27:14
Pero lo que quiero que sepáis es lo que es la técnica Sanger, la sencilla, 00:27:22
Y luego esta, simplemente saber que hay una técnica mejor, que se utilizan colorantes florescentes. 00:27:30
Y mirad, vamos a ver este vídeo. 00:27:40
Creo que lo tengo aquí abierto también. 00:27:42
Voy a poner... 00:28:00
La secuenciación consta de un cebador. 00:28:07
Voy a poner los subtítulos, que de paso no lo escucháis. 00:28:11
Una reacción de secuenciación... 00:28:15
A ver, paro. 00:28:16
los subtítulos. Una reacción de secuenciación consta de un cebador, una cadena de ADN molde 00:28:19
que queremos secuenciar, obsérvese la dirección 5'3' de esta cadena y del cebador, nucleótidos 00:28:34
libres y una molécula de ADN polimerasa que es la que va a llevar a cabo la síntesis. 00:28:42
El cebador se une a la cadena molde por complementariedad de bases y la ADN polimerasa va a sintetizar ADN extendiendo el cebador a partir de su extremo 3', incorporando los nucleótidos complementarios a cada una de las posiciones de la cadena molde que queremos secuenciar. 00:28:47
La reacción comienza cuando los nucleótidos se van incorporando por acción de la polimerasa a la cadena molde que se quiere secuenciar 00:29:13
En la mezcla de nucleótidos hay algunos que están marcados con un fluorocromo 00:29:22
y a su vez terminan la síntesis de la cadena 00:29:28
Cuando uno de estos nucleótidos se incorpora la extensión de la cadena se termina 00:29:32
como sucede en este caso con esta adenina que va marcada con un fluorocromo específico 00:29:37
específico y que termina la cadena. Lógicamente hay cuatro tipos de moléculas terminadoras, 00:29:42
cada una de ellas marcadas con un fluorocromo distinto, de manera que al final de la reacción 00:29:48
tenemos cadenas que han sido extendidas en todos los posibles tamaños, cada una de ellas terminada 00:29:53
por un fluorocromo distinto. Así se pueden obtener lecturas de unos 500-800 nucleótidos de longitud. 00:30:01
Todos estos fragmentos hay que introducirlos después en un aparato especial, un secuenciador, que hace una electroforesis en un capilar para separar cada uno de estos fragmentos por tamaños, de manera que los fragmentos más pequeños migran más rápido que los fragmentos de tamaños mayores. 00:30:07
Esto lo vemos aquí ejemplificado muy bien con todos los fragmentos que hemos obtenido al ir leyendo esta secuencia molde, cada uno de ellos terminado por un fluorocromo distinto. 00:30:29
Cuando todos estos fragmentos se introducen en el capilar donde tiene lugar la electroforesis, la migración es distinta. 00:30:42
Los fragmentos más pequeños avanzan más rápido que los fragmentos mayores. 00:30:51
Por tanto llegan antes al final del capilar donde hay un láser que excita los fluorocromos que emiten una luz en una longitud de onda distinta y de esta forma podemos ir viendo la secuencia de nucleótidos que se han ido incorporando en la reacción, que no es otra que la secuencia complementaria a la de la cadena molde original que queríamos secuenciar. 00:30:56
Al final obtenemos archivos de este tipo con una gran cantidad de picos 00:31:21
que indican la secuencia de nucleótidos de la molécula original. 00:31:26
Bueno, pues en este punto lo que nos hablan es identificar microorganismos. 00:31:31
Entonces, nosotros normalmente lo que se hace es, por ejemplo, cuando hay un crimen, 00:31:41
Lo que se hace es analizar las huellas dactilares, por ejemplo, o analizar la sangre o saliva y de ahí sacar el ADN de ese posible sospechoso. 00:31:48
Hay veces que no tenemos material biológico para analizar, no hay cantidad suficiente de sangre o no hay huellas, entonces hay una técnica que sería analizar los microorganismos, o sea las bacterias. 00:32:06
En estos casos las bacterias podrían aportar información complementaria 00:32:30
Voy a leer esto de aquí 00:32:37
Las huellas dactilares y el estudio del ADN humano son herramientas de probada eficacia en el lugar de un hecho criminal 00:32:39
Sin embargo no siempre es posible disponer de ellas 00:32:47
Hay situaciones en las que por falta de materiales biológicos, tales como por ejemplo sangre o saliva 00:32:50
no se tienen posibilidades de tomar muestras de ADN humano, 00:32:57
o bien los objetos susceptibles de presentar huellas tienen superficies en donde no quedan impresas de forma satisfactoria. 00:33:01
En estos casos, las bacterias podrían aportar información complementaria. 00:33:09
Numerosos estudios en el campo de la microbiología ya habían dejado clara 00:33:13
la gran variabilidad de comunidades de bacterias presentes entre las personas. 00:33:17
No todos los individuos tienen las mismas bacterias en sus manos. 00:33:23
Las huellas dactilares bacterianas dejarán rastros que ayudarán a identificar rápidamente al sospechoso y resolverán el caso. 00:33:27
Es decir, por medio del análisis de las bacterias que se hayan quedado podemos identificar al sospechoso. 00:33:34
Bueno, pues hay dos métodos de identificación, los métodos fenotípicos y los métodos genotípicos. 00:33:44
fenotípicos. Los métodos fenotípicos, pues esto seguramente habéis estudiado en biología, ¿no? 00:33:50
¿Cómo se pueden estudiar? Pues las propiedades bioquímicas o la morfología de los microorganismos, 00:33:58
el color de las colonias y a partir de estas propiedades podemos tipificar un tipo de bacteria 00:34:06
u otra. Ahora, ¿qué ocurre con estos métodos genotípicos? Pues que el poder de tipificar 00:34:14
es limitado. No se pueden tipificar todas las bacterias porque cada una es aplicable 00:34:21
a un número reducido de especies bacterianas. Cada ensayo de estos, cada estudio, pues es 00:34:27
aplicable solamente a una serie de especies bacterianas. Bueno, pues para resolver esto 00:34:33
tenemos los métodos genotípicos. Entonces, en estos, ¿qué se analiza? Pues la genética, 00:34:40
genotípico, se analiza la estructura genética de ese organismo y estos tienen la ventaja 00:34:46
de que se pueden aplicar a cualquier especie bacteriana. Vale, pues entonces, dentro de 00:34:53
estos métodos genotípicos tenemos tres tipos. Podemos analizar los perfiles plasmídicos, 00:35:00
Podemos analizar los perfiles de restricción del ADN genómico o podemos analizar, o sea, se puede hacer un perfil de amplificación génica basado en la PCR, la reacción en cadena de la polimerasa. 00:35:07
Bueno, pues, por ejemplo, los perfiles plasmídicos. El plasmido, acordaros, que es un cromosoma que se replica independiente del cromosoma de la célula, de la bacteria. 00:35:21
¿Cómo podemos estudiar estos plásmidos? 00:35:38
Haríamos un análisis celular, o sea, romper la membrana plasmática 00:35:45
obtener el ADN plasmídico, o sea, separar el ADN 00:35:48
lo que es el plasmídico del cromosómico, esto ya lo vimos 00:35:52
cuando vimos la obtención de ADN 00:35:57
y después podríamos hacer una electroforesis en gel de agarosa 00:36:00
¿Cuál es el problema de esta técnica? 00:36:05
Pues es que como los plásmidos tienen su ADN circular, ¿qué pasa? Que pueden presentar diferentes conformaciones. El ADN del plásmido puede estar así, en un círculo, pero puede estar así también, o de esta otra forma, o de esta otra forma. 00:36:08
¿Qué ocurre? Que cuando hagamos la electroforesis en gel de agarosa, aunque tengamos el mismo plásmido, si este plásmido está en esta conformación y el mismo plásmido está en otra conformación, pues nos van a aparecer bandas en zonas diferentes, por lo que no vamos a poder distinguirse ese plásmido. 00:36:23
Bueno, pues para resolver esto, lo que se puede hacer es cortar ese plásmido con enzimas de restricción. 00:36:47
Nosotros tenemos un plásmido que es circular, pues lo cortamos con alguna enzima de restricción y lo que nos va a quedar es un ADN lineal. 00:36:57
Y así ya podemos analizarlo sin problemas con el troforesis en gel de agarosa. 00:37:05
Otra forma de analizar la genética de estas bacterias sería analizar el ADN genómico, no el plasmídico, sino el genómico. 00:37:11
Para ello, que se utilizan por lo mismo endonucleasas de restricción que van a cortar ese ADN genómico en muchos fragmentos. 00:37:28
Y esos fragmentos luego lo mismo, los separamos haciendo una electroforesis en gel de agarosa. 00:37:36
Ahora, una forma de interpretar estos resultados más fácil sería la combinación de este método con el uso de sondas. 00:37:46
Una sonda, acordaros, es una secuencia de ADN que tiene a lo mejor un grupo fluoróforo que emite radiación. 00:37:57
y luego se transferiría a una membrana nitrocelulosa, acordaros que esto en la técnica de hibridación lo hemos visto, 00:38:05
y después ya se separaría por electroforesis. 00:38:16
Entonces los que hayan hibridado con esa secuencia de ADN que teníamos, pues quedarán fijados en la membrana. 00:38:20
Bueno, este sería la técnica de perfiles de restricción de ADN genómico. Cortar el ADN con endonucleasas de restricción y luego hacer una hibridación con sondas y después ya la electroforesis a gel de agarosa. 00:38:28
Y por último tendríamos los perfiles de amplificación génica. ¿En qué consiste? Pues consiste en hacer una PCR, una reacción en cadena de la polimerasa. 00:38:50
Si os acordáis en la PCR, por cada fragmento de ADN que queríamos amplificar, ¿qué utilizábamos? Pues utilizábamos dos cebadores o primers. Esos cebadores o primers eran los que delimitaban la secuencia que queríamos amplificar. 00:39:08
Pues en este caso lo que hacemos es utilizar solamente un único oligogonucleotido, o sea, un único cebador. Normalmente eso de 10 pares de bases. 00:39:24
Y entonces ese único cebador se va a unir aleatoriamente a la cadena de ADN y se van a obtener fragmentos de diferente masa molecular de esa cadena de ADN. 00:39:37
Y esta técnica se denomina RAPD, Random, Aleatorio, Amplification, Polymorphic DNA o ADN. 00:39:57
O sea, se amplifica de forma aleatoria. 00:40:09
Se utiliza solamente un único nucleótido que se va a unir a diferentes zonas del ADN 00:40:13
y entonces se van a ir amplificando, se van a ir haciendo copias de diferentes fragmentos de ese ADN. 00:40:21
Materias:
Biología
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