Videoconferencia explicación práctica de electroforesis PAGE - Contenido educativo

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Subido el 21 de diciembre de 2024 por Susana A.

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Esto sería electroforesis en gel de poliacrilamida. 00:00:00

Entonces lo primero que hay que hacer es preparar el gel. 00:00:10

Y para preparar el gel tenemos este dispositivo de aquí. 00:00:23

Aquí podríamos preparar dos gels, aquí uno y aquí otro. 00:00:27

Y para ello necesitamos dos cristales. 00:00:32

Estos dos cristales, uno es más grande que el otro 00:00:34

Entonces se pone uno encima del otro 00:00:38

Y el grande tiene aquí en los dos laterales 00:00:41

Tiene como un reborde 00:00:44

Para que cuando introduzcamos la disolución 00:00:46

Entre los dos cristales pueda entrar 00:00:49

¿Vale? Entonces 00:00:52

¿Veis? Ponemos un cristal sobre el otro 00:00:54

Y lo colocamos en el dispositivo 00:01:04

Cerramos el dispositivo 00:01:07

para que se queden bien fijos los cristales y lo ponemos en este otro dispositivo. 00:01:10

Y ahora ya lo que vamos a hacer es, vamos a ir preparando la disolución para que se forme el gel de poliacrilamida. 00:01:18

Entonces, para preparar esta disolución necesitamos una disolución de acrilamida y bisacrilamida, 00:01:28

Se necesita agua, se necesita SDS y luego se va a necesitar también el persulfato, acordaros, el persulfato es el iniciador y se va a necesitar también el TEMED, que es el catalizador. 00:01:35

Entonces ahora va a ir mezclando todos los componentes de la disolución, el agua, a la disolución tampón también se necesita una disolución tampón, que es un tampón de tris y clorhídrico, ahora la disolución de acrilamida y bisacrilamida y el SDS. 00:01:52

Vale, ahora se añade el persulfato de amonio, que es el iniciador de la reacción, y ahora se añade el TEMED, que es el catalizador. 00:02:33

Una vez que se añada el TEMED, enseguida ya hay que introducir la disolución entre los dos cristales que tenemos aquí, porque el TEMED lo que hace es catalizar la reacción. 00:02:50

Entonces, si no lo introducimos rápido, pues se nos va a polimerizar aquí en el vasito. 00:03:03

Lo mezcla un poco y ya con una pipeta Pasteur, lo mezcla un poco con la pipeta y ya va a ir introduciendo entre los dos cristales. 00:03:17

Veis que se va llenando los dos cristales. Este sería el gel separador, donde se van a separar las proteínas. 00:03:29

Ahora tenemos que añadir por arriba, vamos a añadir una capa de agua 00:03:41

Y esta capa de agua lo que hace es aislar a la poliacrilamida 00:03:49

Porque si no, con el oxígeno del aire no gelifica, no polimeriza 00:03:56

Por lo tanto añadimos una capa de agua en el borde superior para que polimerice 00:04:01

Si os fijáis aquí en el vial ya había empezado a polimerizar, por eso hay que hacerlo un poco rápido. 00:04:07

Aquí habría que esperar 45 minutos a que gelifique y el siguiente paso sería quitar el agua que hemos puesto aquí arriba. 00:04:16

Ya quitamos el agua, tendríamos ya ahí el gel separador y ahora va a preparar el gel concentrador, que es la parte de arriba del gel. 00:04:37

Se mezclan los mismos reactivos, lo que pasa que en concentraciones diferentes y a un pH diferente. 00:04:48

Ese sería, aquí ya tendríamos el témed, se mezcla y ya se introduce con la pipeta entre los cristales. 00:04:57

Ahora se introduce el peine, esto de aquí es el peine y esto lo que va a hacer va a generar pocillos. 00:05:09

Va a generar unos huecos, cuando gelifique el gel se van a generar unos huecos aquí y por aquí en estos huecos pues va a ser donde introduzcamos después nuestras muestras. 00:05:18

muestras. Ahora ya lo está introduciendo en la cubeta de electroforesis. Una vez introducido 00:05:32

en la cubeta ya va a aplicar el campo eléctrico. Aquí ya vamos a empezar la electroforesis 00:05:44

como tal. Esta cubeta tiene dos electrodos. Hay que colocar el negro, hay que enchufarlo 00:05:49

al negro y el rojo al rojo. Esta es la cubeta de electroforesis. Y ahora lo que se hace 00:05:57

es añadir aquí a esta cubeta una disolución tampón. Se añade una disolución tampón 00:06:29

por dentro y luego se va a añadir también por fuera y se quita el peine. Ya nos habrán 00:06:47

quedado ahí los pocillos. Ahora tenemos este sistema en amarillo que nos va a ayudar a 00:07:02

introducir las muestras porque si no es difícil ver los pocillos. Entonces se pone este sistema 00:07:13

y así es más fácil introducir las muestras. Veis que tenemos varios pocillos, ocho, entonces 00:07:19

En uno de ellos, ya está introduciendo una muestra, esta podría ser la de referencia, se van llenando los pocillos y entonces aquí vamos a ir poniendo distintas muestras. 00:07:32

Pueden ser, por ejemplo, muestras de distintos pescados, de atún, de lubina, de salmón y luego vamos a poder ver qué proteínas tienen esos pescados. 00:07:50

Nos van a salir aquí diferentes proteínas y vamos a poder comparar, pues igual hay dos pescados que son parecidos y nos aparecen proteínas también parecidas. 00:08:01

Y ya la última, y ahora ya, bueno esta sería ya la última, y ya conectaríamos la cubeta al campo, o sea aplicaríamos ya el campo eléctrico. 00:08:20

Cerramos la cubeta, el cable negro con el cable negro y el rojo con el rojo 00:08:49

Le vamos a aplicar aquí un voltaje 00:08:58

Y ahí hay que esperar a que las proteínas se vayan desplazando a través del gel separador 00:09:00

¿Vale? ¿Veis? Ahora las proteínas se van a dirigir hacia el cátodo 00:09:09

Y se van a ir empezando a separar 00:09:25

Ahora ya termina la electroforesis 00:09:30

Y ya vamos a obtener nuestro gel 00:09:40

Lo que pasa es que el gel, lo que os comentaba antes, ahora mismo no se van a ver bien las proteínas y lo tenemos que teñir y se tiñe con una disolución de azul de como así. 00:09:44

Ahí tendríamos los dos cristales que los tenemos que separar. 00:10:09

Primero se le añade agua para limpiar de la disolución tampón y ahora vamos a separar los dos cristales. 00:10:14

Separamos los dos cristales con esta cuña verde 00:10:22

Y en uno de los dos cristales se nos quedará el gel 00:10:25

¿Veis? Ahí tenemos el gel 00:10:29

Este sería el gel 00:10:34

Y ahora tenemos que teñirlo 00:10:35

Se lava primero con agua 00:10:39

¿Veis cómo es el gel? 00:10:43

¿Vale? 00:10:53

Y entonces ahora lo ponemos en una disolución de azul de coma 00:10:54

Y se deja ahí un tiempo agitando 00:10:57

se pone un balancín en este aparato y ahí se deja agitando 00:11:06

y lo siguiente que tendremos que hacer es desteñir el gel 00:11:15

para que solamente veamos las proteínas porque si no ahora no veríamos nada 00:11:21

guardamos la disolución de tinción 00:11:27

¿Veis? Ahora se nos ha quedado todo el gel azul y ahora tenemos que lavarlo 00:11:33

Y ya nos aparecerán las bandas de las proteínas 00:11:40

Tendríamos que quitar la parte del gel concentrador 00:11:46

Para contar a partir del gel separador 00:12:12

Ahora está añadiendo la disolución que va a desteñir 00:12:20

lo vuelvo a poner ahí en el balancín 00:12:25

y veis ya empiezan a aparecer las bandas de proteínas 00:12:35

hay que sacar el gel con cuidado que no se rompa 00:12:54

y ahí ya tendríamos las bandas 00:13:02

y entonces ahí ya mediríamos los RFs 00:13:05

compararíamos con nuestra muestra de referencia 00:13:09

y mediríamos los RFs de nuestras muestras 00:13:12

vale, pues este es el vídeo 00:13:17

Ya os digo que hay otros dos vídeos de la Universidad de Valencia y de Sevilla que también están muy bien. 00:13:19

Y ahora vamos a ver de la página de Biomodel, vamos a ver una simulación de electroforesis. 00:13:26

Entonces, en esta página entráis en Biomodel, en la página de la Universidad de Alcalá de Henares 00:13:37

y aquí tendríamos, esto en gris sería el gel, lo que pasa es que aquí solamente tenemos dos pocillos 00:13:45

Y lo que tenemos que hacer es, bueno aquí hay unos ejercicios, vamos a entrar aquí, entonces aquí lo que nos pregunta es la influencia de la diferencia de potencial aplicada, o sea si ponemos más voltaje o menos, ¿qué es lo que ocurre? 00:13:51

Entonces, se separan más los patrones, se separan menos, avanzan más rápido o avanzan más lento. 00:14:11

Entonces, lo vamos a comprobar. 00:14:17

Esto de aquí serían los patrones de nuestra muestra de referencia. 00:14:19

Entonces, son distintas proteínas que conocemos su masa molecular. 00:14:24

Las marcamos y las introducimos en el pocillo, en el primer pocillo. 00:14:32

Vale, aquí, a añadir patrón, que no lo veía. Vale, pues añadimos el patrón. Esta sería nuestra muestra de referencia. 00:14:39

Y ahora vamos a añadir nuestra muestra y de las muestras tenemos 10 problemas. Pues vamos a hacer el 2, por ejemplo. 00:15:01

vale pues le damos a añadir muestra y aquí se nos añade nuestra muestra 00:15:10

vamos a ponerle por ejemplo un voltaje muy bajo de 50 y le damos a comenzar 00:15:18

lo demás lo dejamos igual la velocidad y el tanto por ciento de acrilamida lo dejamos igual 00:15:26

y ahora le vamos a dar a comenzar 00:15:31

¿Veis? Esta sería nuestra muestra de referencia, cómo se van separando las proteínas. 00:15:33

Lo que hay que hacer es parar cuando justo esté llegando casi al final, lo paramos. 00:15:42

Y esto de aquí, la banda esta aquí morada, es el disolvente, que es el bromofenol. 00:15:51

Y este es el que nos va a servir para calcular el RF. 00:15:58

Pues entonces, en este caso hemos aplicado un voltaje de 50 y ahora vamos a aplicar un voltaje de 200 00:16:04

Y vamos a ver si va más... Ah bueno, tendríamos que volver a introducir nuestras muestras 00:16:12

Añadimos el patrón, añadimos la muestra a muestra que era la muestra 2 00:16:19

Y le damos a comenzar y vamos a ver que diferencia hay 00:16:25

vale, pues si os fijáis estaba bastante más rápido que la anterior 00:16:34

vamos a ver otra vez la de 50 00:16:42

añadimos patrón, añadimos muestra 00:16:44

y le damos, estaba bastante más lenta que a 200 00:16:55

entonces el voltaje influye en la rapidez de separación 00:17:04

Y después tendríamos la influencia de la concentración de acrilamida. 00:17:08

Entonces, dependiendo de la concentración, puede ser que los patrones se separan más, se separan menos, tienen mayor movilidad o tienen menor movilidad. 00:17:15

Bueno, pues vamos a verlo. Tenemos aquí concentraciones de acrilamida que van del 7,5% al 15%. 00:17:25

Pues vamos a empezar por la de 7,5%. 00:17:34

Vamos a hacerlo con la muestra 4, por ejemplo. Los patrones los ponemos igual, el voltaje vamos a ponerlo a 150 y le vamos a añadir el patrón. 00:17:37

añadimos patrón y añadimos muestra 00:17:54

y le damos a comenzar 00:18:00

pues fijaros, quedaros con esta imagen 00:18:13

fijaros la azul, la amarilla, la banda azul 00:18:25

está bastante separada de la amarilla, estas un poquito más juntas 00:18:29

y estas un poquito más separadas, pues vamos a quedarnos con esta 00:18:32

imagen y ahora vamos a cambiar la concentración 00:18:37

de acrilamida y vamos a poner el máximo 15. Volvemos a introducir el patrón, introducimos 00:18:41

la muestra y le damos a comenzar. Como hemos puesto mucha acrilamida, aquí estas bandas 00:18:57

si os fijáis están más pegadas, las bandas de mayor masa molecular están aquí más 00:19:14

pegadas antes nos salían más separadas. Pues dependiendo de qué zona queramos ver, 00:19:20

pues vamos a elegir un tanto por ciento de acrilamida mayor o menor. Y ahora vamos a 00:19:27

ver la gráfica, cómo se analiza la gráfica. Pues en este caso, bueno, vamos a volver a 00:19:34

hacer la anterior si vamos a volver a hacerla vamos a volver a hacer a 10 por 00:19:50

ejemplo añadimos patrón añadimos muestra no se separa este vamos a coger otra 00:20:02

porque aquí no sé por qué no se separa este se necesitará a verla vamos a 00:20:29

hacer la 1. La 1, vamos a hacer al 12%, añadimos patrón, añadimos muestra y le damos a comenzar. 00:20:35

Bien, pues le damos a detener y ahora vamos a ver la gráfica. Esta sería la gráfica, 00:21:10

esta sería la representación de estas bandas, de estas proteínas que tenemos en la muestra 00:21:17

de referencia. La movilidad relativa es el RF que yo os comentaba antes, que es la distancia 00:21:23

desde aquí hasta la primera banda dividida entre la distancia desde aquí hasta lo que 00:21:29

recorre el disolvente y se va representando frente al logaritmo de la masa molecular. 00:21:37

En este caso nos sale una recta cuya pendiente es menos 0,94 y la ordenada en el origen es 00:21:43

4,81. Pues entonces tendríamos que medir esta distancia de aquí, la distancia de nuestra muestra, que si pinchamos aquí la tenemos, tenemos aquí la movilidad relativa, que es, o sea, esto sería el avance en milímetros, son 3,08, dividido entre lo que ha recorrido el disolvente, nos va a dar la movilidad relativa, que son 0,05, ¿vale? 00:21:50

pues este valor de movilidad relativa lo metemos en la recta y de ahí vamos a sacar la masa molecular. 00:22:14

Vale, entonces si pinchamos aquí, vale, no, pues eso ya habría que calcularlo. 00:22:26

Bueno, pues esta es una simulación de la electroforesis, de lo que se hace, 00:22:36

cómo se lleva a cabo 00:22:43

una electroforesis 00:22:47

en gel de poliacrilamida 00:22:48

si queréis vosotros 00:22:50

en casa podéis 00:22:53

también practicar 00:22:54

Materias:

Biología

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