Tecnología del ADN recombinante - Contenido educativo
Ajuste de pantallaEl ajuste de pantalla se aprecia al ver el vídeo en pantalla completa. Elige la presentación que más te guste:
Hola a todos, vamos a seguir con las presentaciones y hoy vamos a hablar de, vamos a seguir con
00:00:02
el tema 4 y vamos a ver el punto 4.5 que aquí lo llaman clonación, aislamiento de clones
00:00:13
y amplificación. Bien, pues si os acordáis ya estuvimos viendo que dentro de la ingeniería
00:00:22
genética que se podía hacer con el ADN. Por una parte podemos cortar el ADN en fragmentos,
00:00:32
el ADN es una molécula muy larga, acordaros que hasta 1970 era muy difícil trabajar con
00:00:42
el ADN por su gran longitud y que a partir de ese año se encontraron unas endonucleasas
00:00:48
de restricción o enzimas de restricción con las que podíamos cortar el ADN y así analizarlo
00:00:55
más fácilmente. Y aparte de cortar el ADN, también se podía unir el ADN. Recordad los
00:01:01
fragmentos cohesivos y fragmentos romos. También vimos la técnica de hibridación,
00:01:11
vimos un poco la técnica CRISPR, que consistía en modificar una secuencia, o sea, introducir
00:01:23
una secuencia de ADN diferente. Vimos también la técnica de la PCR, de la reacción en cadena
00:01:29
de la polimerasa. Si os acordáis, consistía en amplificar un fragmento de ADN y hacer
00:01:37
miles de copias. Y nos quedaba por ver secuenciación, que eso lo veremos el próximo día, y hoy
00:01:44
vamos a ver la técnica del ADN recombinante. ¿En qué consiste esta técnica del ADN recombinante?
00:01:50
Pues principalmente es una clonación celular, o sea, vamos a hacer copias de un fragmento
00:02:02
de ADN, pero esas copias de ADN las vamos a hacer en una célula, en células, y por
00:02:10
eso es una clonación celular. Acordaros que en la PCR lo que hacíamos era una clonación
00:02:20
pero es a celular, porque es una clonación, nosotros ponemos el ADN en el termociclador
00:02:26
y ahí a través de las diferentes etapas logramos obtener una gran cantidad de un fragmento
00:02:32
de ADN, pero aquí lo que vamos a utilizar son células para hacer las copias de ese
00:02:40
fragmento de ADN. Bueno, pues vamos a ver primero qué significa esto de ADN recombinante.
00:02:47
Bueno, pues el ADN recombinante es la unión de dos fragmentos de ADN, pero que provienen
00:02:55
de orígenes diferentes. Aquí en el dibujo lo tenéis, este sería el ADN de un fragmento
00:03:01
de ADN de un organismo y este es otro fragmento de ADN. Pues lo que hacemos es unir estos
00:03:09
Estos son los dos fragmentos de ADN y esta sería la técnica del ADN recombinante.
00:03:15
Antes de empezar con la técnica, vamos a recordar también las células prokaryotas.
00:03:24
Recordad que contienen un ADN bacteriano, un ADN cromosómico,
00:03:33
pero aparte también estas células prokaryotas pueden tener un ADN de tipo circular y estos fragmentos de ADN se denominan plasmidos.
00:03:41
Y estos plasmidos tienen la característica de que se replican independientemente del ADN cromosómico y además son muy fáciles de manipular.
00:03:58
Entonces vamos a ver cómo se aplican estos plásmidos en esta técnica.
00:04:07
Bueno, aquí os he puesto un poco en qué consiste esta tecnología.
00:04:18
La tecnología del ADN recombinante nos permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas.
00:04:25
Y además, este fragmento de ADN va a contener un gen, y este gen es un gen que se va a expresar, por ejemplo, en una proteína que nos interesa.
00:04:33
Entonces, por ejemplo, nosotros queremos fabricar insulina en grandes cantidades.
00:04:49
pues ¿qué hacemos? Cortamos el gen, un gen de un ADN, ese gen es el que luego se va a codificar en la proteína insulina,
00:04:54
entonces ese gen que hemos cortado lo vamos a introducir en una bacteria y esa bacteria lo que vamos a hacer es,
00:05:09
Al crecer, al multiplicarse, esa bacteria va a generar más fragmentos de ese ADN que a nosotros nos interesa, de ese gen que nos interesa y ese gen de ADN se va a codificar en la insulina.
00:05:15
Entonces vamos a obtener grandes cantidades de insulina.
00:05:34
Ahora os parecerá esto un poco complicado, pero vamos a ir viéndolo paso a paso.
00:05:39
Bueno, tenemos varias etapas en esta técnica, las vamos a ver ahora un poco por encima y luego ya las explicamos individualmente.
00:05:46
Por un lado tenemos el ADN con el fragmento que nosotros queremos copiar.
00:05:58
Bueno, pues este fragmento de ADN lo vamos a cortar y lo vamos a unir a otro ADN y este ADN lo vamos a denominar vector de clonación.
00:06:03
Vamos a unir esos dos ADN, lo que vamos a obtener es el ADN recombinante.
00:06:19
Y ahora este ADN recombinante lo vamos a introducir en una bacteria. La bacteria se va a crecer, se va a multiplicar y vamos a obtener grandes cantidades de la proteína que nos interesa.
00:06:25
que puede ser, por ejemplo, la hormona del crecimiento o, pues eso, lo que hemos dicho, la insulina.
00:06:41
De esta parte ahora no os preocupéis porque luego lo vamos a explicar.
00:06:50
Entonces, tenemos las etapas, aquí os las he explicado.
00:06:57
Ahora las vamos a ver con más detalle.
00:07:03
Vamos a empezar por la primera etapa, que sería reconocer la secuencia que a nosotros nos interesa cortar. ¿Y cómo vamos a cortar esa secuencia de interés? Pues con las enzimas de restricción, con las endonucleasas de restricción, que ya vimos en el tema anterior.
00:07:07
En el punto 4.1 creo que es de este tema.
00:07:32
Bien, pues entonces primero localizamos el gen que a nosotros nos interesa cortar.
00:07:41
Porque este gen va a codificar a la característica que nosotros queremos que exprese el nuevo organismo.
00:07:46
Entonces, por ejemplo, para producir hormonas de crecimiento buscamos una especie animal que posea ese gen y tenemos que identificar dónde se encuentra en su genoma.
00:07:55
Ahora, este de aquí sería el fragmento de ADN que hemos cortado, que es el que nos interesa multiplicar.
00:08:14
Y ahora vamos a cortar también el vector de clonación, que sería esto de aquí en amarillo.
00:08:23
Y lo vamos a cortar con las mismas endonucleasas de restricción, para que luego se nos formen extremos cohesivos, que luego se puedan unir fácilmente.
00:08:32
Si os acordáis, una endonucleasa de restricción que se utiliza mucho es la ECO-R1 y esta va a cortar, recordad que cortaba segmentos palindrómicos y fijaros, va a cortar la misma secuencia.
00:08:42
Aquí tenemos guanina, adenina, adenina, timina, timina, guanina y la secuencia de la otra cadena, guanina, adenina, adenina, timina, timina, aquí no sé si es, creo que es citosina en vez de guanina, sí es citosina.
00:08:58
Bien, pues entonces la eco R1 va a cortar y se van a formar extremos cohesivos y lo mismo va a cortar el fragmento de ADN que a nosotros nos interesa.
00:09:15
Esto de aquí en amarillo sería lo que hemos denominado antes vector de clonación y esto aquí en azul es el ADN que a nosotros nos interesa, que luego este ADN es el que luego va a codificar a la proteína que a nosotros nos interesa.
00:09:28
Bueno, ya tenemos los dos fragmentos de ADN cortados y ahora los tenemos que unir.
00:09:45
Entonces, para unirlos se utiliza otra enzima que es la ADN ligasa.
00:09:53
Esta ADN ligasa va a unir estos dos fragmentos de ADN.
00:10:01
Así obtenemos el ADN recombinante.
00:10:06
Recordad, ADN recombinante, combinación de dos ADN que provienen de organismos diferentes.
00:10:10
Bueno, pues ahora vamos a ver un poco lo que son estos vectores de clonación.
00:10:19
Antes de seguir en las siguientes etapas vamos a ver qué características tienen que tener estos vectores de clonación.
00:10:23
Esto que hemos puesto aquí en amarillo.
00:10:31
Bueno, pues el vector de clonación es una molécula que tiene que ser pequeña y que tiene que tener capacidad de autorreplicarse.
00:10:33
Entonces, un vector de clonación muy utilizado son los plasmidos que hemos visto antes.
00:10:46
Y así como son moléculas pequeñas, pues luego se pueden introducir fácilmente en la bacteria o en la célula, que vamos a llamar célula hospedadora, y que luego se van a replicar.
00:10:54
Bueno, pues siguiendo con las características de estos vectores de clonación, tienen que poder replicarse independientemente.
00:11:10
Evidentemente, replicarse junto con el ADN que transporten, o sea, junto con el ADN al que se hayan unido.
00:11:22
El plasmido en amarillo con el ADN al que se han unido tienen que poder replicarse fácilmente dentro de la célula hospedadora.
00:11:30
Otra característica que tienen que tener, tienen que tener sitios de corte para las enzimas de restricción y que estén presentes solamente una vez en el vector.
00:11:41
Estos sitios de restricción tienen que ser iguales a los del ADN que queremos insertar para cortarlo con las mismas enzimas de restricción.
00:11:53
Esto más o menos ya lo acabamos de ver. Vamos a cortar el vector de clonación y el ADN con la misma enzima de restricción.
00:12:05
Por lo tanto, si el ADN lo cortamos con la enzima EcoR1, en el vector de clonación tenemos que tener también esta secuencia de bases nitrogenadas para poder cortarlo con esta misma enzima de restricción.
00:12:15
Si lo cortamos con este ADN, que es el que nos interesa, con otra enzima de restricción, pues este vector de clonación tiene que tener esa secuencia.
00:12:33
Entonces, por un lado, tienen que ver lo que hemos visto, tienen que poder replicarse.
00:12:49
Aquí si os fijáis, esto sería un vector de clonación, en concreto es un plásmido.
00:12:54
Pues entonces, aquí si os fijáis, pone origen de replicación.
00:13:00
Bueno, pues aquí debe haber una secuencia del ADN que hace que se pueda replicar fácilmente este plásmido.
00:13:05
Por otro lado, dice que tiene que tener sitios de corte para enzimas de restricción. Pues mirad, si os fijáis aquí, aquí tiene una secuencia con la que podemos cortar con la Eco R1. Aquí tiene otra secuencia con la que podemos cortar con esta otra enzima de restricción. Aquí otra secuencia y esta sería otra enzima de restricción con la que podemos cortar y esta sería otra.
00:13:13
Pero lo importante, si cortamos el ADN que nos interesa con esta enzima, pues este vector de clonación tiene que tener también una secuencia, un sitio de corte con esta enzima.
00:13:40
Bueno, aquí se ve un poquito mejor. Esto de aquí serían las enzimas de restricción, la BAMH1, SAL1, la PVU2. Estas serían las enzimas de restricción con las que se puede cortar este plasmido.
00:14:00
Bueno, pues la siguiente característica que tiene que tener en este vector de clonación es que tiene que tener un marcador de selección.
00:14:18
¿Por qué es esto? Pues porque nosotros vamos a introducir este vector de clonación en las bacterias.
00:14:35
Pero, ¿qué pasa? Que habrá bacterias en las que sí que se inserte este vector de clonación y otras en las que no se inserte este vector de clonación.
00:14:43
Entonces, tenemos que distinguir entre las bacterias que tienen el vector de clonación y las que no tienen el vector de clonación.
00:14:56
Entonces, deben tener algún marcador de selección.
00:15:06
Por otro lado, se debe introducir de forma fácil en la célula anfitriona y el vector debe ser fácil de recuperar de la célula hospedadora.
00:15:09
Esto que os decía antes de que tiene que tener algún marcador de selección, pues mirad, esto lo podemos ver aquí, en este plasmido de la coli.
00:15:22
Por ejemplo, este plásmido tiene resistencia a la ampicilina y también tiene resistencia a la tetraciclina.
00:15:33
Pues esto es lo que va a dar, con lo que podemos identificar si nuestra bacteria se ha modificado,
00:15:44
o sea, si se ha introducido en la bacteria o en la célula hospedadora, si se ha introducido este plásmido.
00:15:55
Luego vamos a ver cómo se comprueba esto, pero ahora recordad que este plásmido tiene resistencia a la ampicilina y resistencia a la tetraciclina.
00:16:00
Entonces, como resumen, los vectores de clonación tienen que tener un origen de replicación para que se puedan replicar fácilmente,
00:16:15
fácilmente, tienen que tener zonas de corte para que puedan cortarles las enzimas de restricción
00:16:22
y estas zonas de estos sitios de corte tienen que ser iguales al corte que se haga en el
00:16:30
ADN que a nosotros nos interesa, tienen que ser pequeños, o sea moléculas pequeñas
00:16:38
y además tienen que tener algo con lo que se les pueda identificar.
00:16:44
Y esta sería la resistencia a la ampicilina o a la tetraciclina.
00:16:53
Esto luego lo vamos a ver con más detalle.
00:16:57
Estos tipos de vectores de clonación, ¿cuáles pueden ser?
00:17:04
Pueden ser plásmidos, que son los más utilizados, pero pueden ser también bacteriófagos. Un bacteriófago es un virus que infecta a una bacteria. Estos bacteriófagos también se pueden utilizar como vectores de clonación.
00:17:09
Pueden ser cósmidos. Los cósmidos son híbridos entre un plásmido y un bacteriófago. Entonces, se pueden insertar fragmentos de ADN más largos, de 35 a 45 kilobases.
00:17:27
kilobases.
00:17:43
Aquí tenéis un ejemplo de cósmido y bacteriófago.
00:17:46
Por otra parte pueden ser cromosomas bacterianos artificiales
00:17:52
y se llaman BAC.
00:17:56
Estos cromosomas son plásmidos que se diseñan en el laboratorio
00:17:59
y nos van a servir para clonar fragmentos de ADN más largos
00:18:04
y se introducen en las bacterias por electroporación.
00:18:10
Estos vectores de clonación pueden ser también cromosomas artificiales de levadura, que son los YAC, o hay otro tipo de vectores de clonación que se llaman vectores lanzadera.
00:18:14
Estos son plásmidos que tienen múltiples orígenes de replicación y otros elementos que hacen posible su uso en más de una especie. Se pueden introducir en una levadura o en una bacteria.
00:18:29
Vale, pues entonces tipos de vectores de clonación serían plásmidos, bacteriófagos, cósmidos, los BAC, los JAK, cromosomas artificiales de levadura y vectores lanzadera.
00:18:44
Vale, bueno, en los apuntes tenéis un ejercicio que esto lo vemos si queréis, mirad, hacedlo en casa y el próximo día lo corregimos en clase.
00:19:00
Ya tenemos el vector de clonación unido al ADN de interés, que es el ADN recombinante.
00:19:17
Ahora este ADN recombinante lo vamos a introducir en una célula hospedadora.
00:19:29
Esta sería la etapa 3.
00:19:38
El vector con el ADN lo introducimos en una célula que se llama células hospedadoras y esta célula hospedadora se va a replicar y entonces se van a producir copias de este ADN que nos interesa.
00:19:39
Ahora, ¿cómo seleccionamos la célula hospedadora? ¿Qué células pueden actuar como células hospedadoras?
00:19:59
Pues tienen que ser células que crezcan rápidamente, que crezcan en un medio de cultivo que sea económico, que no sea muy caro.
00:20:11
Estas células no tienen que ser patógenas, que se puedan transformar fácilmente, o sea, que se les pueda introducir el vector de clonación fácilmente, y además tienen que ser estables en el cultivo.
00:20:24
Bueno, pues vamos a ver qué tipos de células hospedadoras podemos tener.
00:20:43
Bueno, pues estas células hospedadoras pueden ser células prokaryotas, que suelen ser las más utilizadas, porque se replican a muy alta velocidad, el mantenimiento de las colonias es bajo y además son fáciles de manipular.
00:20:49
Esta sería la más utilizada, es la célula de E. coli, porque se conoce, es de fácil manejo, no es patógena y además crece rápidamente.
00:21:06
También podemos tener como célula hospedadora una célula eucariota
00:21:22
Podemos tener una levadura, que más se utiliza es la Saccharomyces cerevisae
00:21:28
Porque también es muy conocida, es fácil de manejar, crece a gran velocidad y además no es patógena
00:21:34
Y también podemos tener como células hospedadoras células de plantas o células de animales
00:21:42
Entonces, lo más común es tener como vector de clonación un plásmido y como célula hospedadora una bacteria. Y cuando tenemos esto, se denomina transformación del ADN.
00:21:48
A la transferencia de este vector de clonación en la bacteria se denomina transformación en este caso.
00:22:12
¿Cómo introducimos este plásmido en la bacteria, en la célula prokaryota? Hay varias formas. Puede ser por competencia natural, es decir, simplemente mezclamos la bacteria con este ADN recombinante y el ADN recombinante se introduce en la bacteria.
00:22:23
Puede ser por competencia artificial, esto lo hacemos en el laboratorio y utilizamos, bueno, sería este proceso, sería mezclar la bacteria con una disolución de cloruro de calcio,
00:22:53
introducir el plásmido y se pone en hielo y luego se le da un shock térmico, se calienta a 42 grados
00:23:12
y con este método introduciríamos el ADN recombinante en la bacteria.
00:23:23
Y luego hay otra técnica que es la electroporación, que simplemente es aplicando electricidad a la célula, pues creamos agujeros y se introduce el plasmido con el ADN, es decir, el ADN recombinante se introduce en la célula.
00:23:32
podéis ver este vídeo para ver cómo es esta técnica
00:23:59
entonces hemos dicho cuando es un plásmido que se introduce en una bacteria
00:24:05
lo llamamos transformación
00:24:15
y ahora si lo que tenemos es un bacteriófago, o sea un virus
00:24:20
y la célula hospedadora es una bacteria
00:24:27
pues a este proceso se le llama infección.
00:24:30
Bien, pues la siguiente etapa, nosotros ya hemos introducido el ADN recombinante en la célula, en la célula hospedadora
00:24:41
Y ahora tenemos que saber en qué células se ha introducido este vector de clonación, perdón, este ADN recombinante.
00:24:53
Entonces, podemos tener células en las que no tengamos el ADN recombinante.
00:25:11
Este es el ADN de la bacteria, pero aquí no tenemos ADN recombinante. Esto por un lado, tenemos que distinguir las células que no tienen el ADN recombinante de las que sí que tienen. Esta sí que tiene, esta también y esta también.
00:25:20
Entonces, identificar las células que han adquirido el plasmido. Cuando hablo aquí de plasmido, significa también el plasmido junto con el ADN de interés.
00:25:36
Ahora, de las que sí que tienen el plásmido, tenemos que saber cuáles tienen el ADN de interés.
00:25:50
Estas, si os fijáis, tienen aquí una parte en rojo. Este sería el vector de clonación o el plásmido con el ADN que se ha insertado.
00:26:00
Este también tendría el vector de clonación, el plásmido, con el ADN en rojo.
00:26:11
Esta también lo tiene, pero sin embargo esta no.
00:26:20
Esta sí que se ha introducido el plásmido, pero este plásmido no tiene el ADN.
00:26:23
El ADN de interés es todo azul, es solamente el plásmido.
00:26:30
Aquí no se ha unido el plásmido con el ADN que nos interesa.
00:26:35
Entonces, lo que os digo, tenemos que hacer dos análisis.
00:26:38
Aquí tenemos el vector con el inserto, se introduce en la célula, pero fijaros, aquí esta sí que tiene el vector con el inserto,
00:26:48
sin embargo, aquí no, esta célula no se ha transformado.
00:27:00
Entonces tenemos que distinguir primero estas dos. Esta sí que tiene el plásmido, en cambio esta célula aquí no hay plásmido.
00:27:04
Y por otra parte tenemos que distinguir si nuestras células tienen solamente el plásmido o tienen el vector, el ADN recombinante, o sea el plásmido con el ADN de interés.
00:27:16
Bien, pues ¿cómo hacemos esta distinción? Primero vamos a identificar las células que sí que tienen el plasmido.
00:27:30
Pues si os acordáis, antes hemos hablado de que estos plasmidos tienen que tener un sistema de selección y hemos hablado de que este plasmido, por ejemplo, tiene un gen que le da resistencia a la ampicilina.
00:27:43
que es un antibiótico y también tiene otro gen, o sea, otra secuencia de ADN que le da resistencia a la tetraciclina.
00:28:01
Bueno, pues entonces vamos a poner estas células en ampicilina o en tetraciclina.
00:28:11
Pues solamente las células que contengan este plásmido, que tiene resistencia a la ampicilina,
00:28:20
solamente estas células van a crecer. En cambio aquí estas células que no tienen el plasmido, o sea, no resisten a la ampicilina, no van a crecer.
00:28:29
Lo mismo va a ocurrir si nosotros ponemos estas células en tetraciclina, pues las que contengan este plasmido sí que van a crecer porque tienen resistencia a la tetraciclina
00:28:40
y en cambio las que no tienen el plasmido no van a crecer porque no tienen el plasmido con resistencia a la tetraciclina.
00:28:52
Por lo tanto vamos a poder distinguir las células que contienen el plasmido.
00:29:03
Ahora, una vez que hemos distinguido estas células que contienen el plasmido, tenemos que distinguir si estas células tienen el ADN recombinante.
00:29:09
Ese sería el ADN del vector de clonación más el ADN que nosotros queremos, que nos interesa.
00:29:20
¿Cómo hacemos esto? Hay varias formas, pero una de las formas es que el plásmido contiene una secuencia
00:29:30
Y esta secuencia de ADN codifica a una proteína que produce colonias de color azul.
00:29:41
Esta secuencia de aquí de ADN codifica a una proteína que produce colonias de color azul.
00:29:55
Pues ¿qué hacemos? Insertamos el ADN de interés, el ADN que nosotros queremos copiar, lo insertamos en esta secuencia.
00:30:04
O sea que rompemos este gen. Si rompemos este gen ya las proteínas ya no se van a producir colonias de color azul.
00:30:17
porque ya no se va a codificar en esa proteína. Por lo tanto, se nos producirán colonias de color blanco.
00:30:26
Pues estas colonias de color blanco son las que tienen el ADN recombinante.
00:30:36
Un ejemplo de aplicación del ADN recombinante sería en el caso de que para producir maíz que resista el ataque de insectos.
00:30:41
Por una parte tenemos el organismo dador que es la bacteria del suelo que es esta, Bacillus zurigensis, la BT.
00:31:02
De estas se extraen genes que van a sintetizar proteínas que tienen carácter insecticida
00:31:13
y estos genes se introducen en la planta de maíz.
00:31:21
Cuando lo que estamos modificando son plantas o células animales,
00:31:33
O sea, cuando la célula hospedadora es eucariota se denomina transfección. Y podemos modificar lo que os decía, plantas o células de animales o podemos modificar levaduras y hongos.
00:31:40
Esto se modifica con acetato de litio por congelación, por biolística o por electroporación. Electroporación acordaros que era darle un choque eléctrico y se crean poros en las células y por ahí se introduce el ADN recombinante.
00:31:59
Y ahora por biolística o biovalística, vale, pues esto os lo enseño el próximo día, lo de la biolística.
00:32:25
Y ahora como aplicaciones, pues se pueden obtener proteínas recombinantes, podemos obtener vacunas recombinantes, enzimas recombinantes, plantas transgénicas, que sería por el método que os he explicado del maíz, o otra aplicación sería como para terapia génica.
00:32:42
- Autor/es:
- S.A.
- Subido por:
- Susana A.
- Licencia:
- Todos los derechos reservados
- Visualizaciones:
- 31
- Fecha:
- 22 de abril de 2024 - 21:00
- Visibilidad:
- Clave
- Centro:
- IES LOPE DE VEGA
- Duración:
- 33′ 25″
- Relación de aspecto:
- 1.78:1
- Resolución:
- 1092x614 píxeles
- Tamaño:
- 56.23 MBytes
