Videoconferencia 30 abril - Contenido educativo

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Subido el 8 de mayo de 2024 por Susana A.

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Bueno, el otro día ya os expliqué la tecnología del ADN recombinante, lo dejé grabado, no sé si habéis tenido tiempo de verlo y si tenéis alguna duda y si no pues continuamos con el tema. 00:00:09

No, no hay dudas, ¿no? 00:00:42

Bueno, pues hoy vamos a seguir, a terminar ya este tema, el tema 4. 00:00:45

Entonces teníamos, a ver si tengo aquí la… vale, teníamos la ingeniería genética y ya hemos visto el corte, cómo se puede cortar el ADN, cómo se puede unir. 00:00:54

Hoy el otro día vimos la tecnología del ADN recombinante, la PCR, la CRISPR vimos un poquito y la hibridación. 00:01:10

Y hoy nos quedaría la secuenciación. 00:01:21

Vale, pues si recordáis que se hacía en cada técnica, pues por ejemplo en la técnica de la PCR, 00:01:25

la PCR es la reacción en cadena de la polimerasa. 00:01:34

Y veis mi pantalla, ¿verdad? 00:01:40

Sí, Susana, así se ve. 00:01:49

Vale. 00:01:50

Entonces, en la PCR, lo que teníamos era que amplificábamos una secuencia de ADN, un fragmento de ADN, lo que tenemos aquí en verde, 00:01:53

A partir de una pequeña muestra amplificamos un segmento de ADN y hacemos miles de copias de este fragmento y utilizamos un termociclador para ello y después estas copias se pueden analizar. 00:02:16

Esto se llama clonación acelular y para ello se utiliza la polimerasa, la TAC polimerasa. 00:02:36

En cambio, la técnica del ADN, de la tecnología del ADN recombinante, la clonación es celular. 00:02:47

¿Por qué? Porque utilizamos células para hacer copias, también hacemos copias de un pequeño fragmento de ADN, pero estas copias las hacemos, por ejemplo, introduciendo ese pequeño fragmento de ADN en una bacteria y para introducir ese fragmento de ADN en esta bacteria lo que utilizábamos era un vector de clonación, ¿os acordáis? 00:03:04

Es un vector de clonación y este vector de clonación puede ser un plásmido, un virus, un cósmido, pero normalmente lo que se utilizan son plásmidos. 00:03:29

Entonces, ese plásmido se corta, se une al ADN que nos interesa, también se corta, se une el plásmido con el fragmento de ADN, 00:03:40

Ya tendríamos el ADN recombinante que es lo que introducimos en la bacteria y lo que vamos a obtener muchas copias de ese fragmento de ADN recombinante. 00:03:52

Utilizamos una célula para hacer esas copias y además lo que nos interesa es que este fragmento de ADN que estamos copiando va a expresar, va a codificar a una proteína, 00:04:04

a una proteína de interés como puede ser la insulina o puede ser la mona del crecimiento 00:04:17

o puede ser una proteína que tenga propiedades herbicidas cuando nosotros lo que hacemos 00:04:23

es introducirlo en ese ADN en una planta, pues esa proteína que se genera tiene propiedades 00:04:31

herbicidas o insecticidas. Entonces esa es la diferencia entre la PCR y la tecnología 00:04:38

del ADN recombinante. Vimos también al principio lo que era la hibridación. Si os acordáis 00:04:44

en la hibridación lo que hacíamos era, tenemos el ADN que es una doble hélice, la conformación 00:05:08

secundaria es una doble hélice, lo que hacemos era desnaturalizar esa doble hélice, es decir, 00:05:15

desnaturalizar, separamos las dos cadenas de la doble hélice y se separan con, o sea 00:05:22

la desnaturalización se realiza con hidróxido de sodio. Y una vez desnaturalizado lo que 00:05:29

podemos hacer es añadir otro fragmento de ADN que sea complementario a esta secuencia 00:05:39

a una de estas cadenas de ADN que hemos separado y esta secuencia de ADN que añadimos la tenemos marcada con una sonda 00:05:45

y así podemos, si esta secuencia de ADN que añadimos es complementaria al fragmento de ADN que queremos identificar, 00:05:58

pues luego se podrá detectar, porque esta sonda está marcada con un fluorófono. 00:06:08

Bueno, esto es un resumen así un poco rápido de lo que era la hibridación 00:06:13

Y ahora vamos a ver lo que es la secuenciación 00:06:20

Bueno, aquí teníamos la hibridación, la Norder, la Southern, la hibridación in situ 00:06:26

Bueno, pues ahora vamos a ver lo que es la secuenciación, que es el punto 4-3 00:06:34

que dijimos que nos los saltábamos porque a mí me parecía un poquito más complicado 00:06:39

y entonces pues ahora volvemos al punto 4.3. 00:06:45

Entonces, ¿qué es secuenciar el ADN? 00:06:56

Bueno, pues secuenciar lo que significa es que vamos a saber cada uno de los nucleótidos 00:07:02

que están formando esa cadena de ADN. 00:07:06

Vamos a conocer los nucleótidos y el orden en el que están esos nucleótidos. 00:07:09

Vamos a saber si tenemos adenina, timina, timina, adenina, guanina, guanina, citosina, citosina. 00:07:15

Vamos a saber esa secuencia de toda la cadena de ADN. 00:07:22

Bueno, pues esta secuencia de ADN constituye la información genética heredable de un organismo. 00:07:28

Entonces, para determinar la secuencia de ADN es útil en el estudio de la investigación básica de los procesos biológicos fundamentales. 00:07:38

Y las técnicas actuales han aumentado a gran velocidad esta secuenciación, esta detección de la secuencia de ADN. 00:07:48

Y esta técnica también ha sido muy importante para conocer el genoma humano, lo que es el proyecto del genoma humano. El genoma humano tiene como unas 3.000 millones de bases, pues se conoce todo lo que constituye el genoma humano, todas esas bases. 00:08:00

Pues la técnica más importante en secuenciación es denominada secuenciación Sanger. ¿En qué consiste esta secuenciación Sanger? 00:08:23

El principio fundamental de esta secuenciación Sanger es que vamos a utilizar unos nucleótidos trifosfato, o sea, la adenina, la timina, la citosina con el grupo fosfato, 00:08:43

pero esos nucleótidos tienen una característica particular. Esos nucleótidos los vamos a llamar, se llaman didesoxinucleótidos. 00:09:00

Pues esa característica que tienen estos didesoxinucleótidos es la siguiente, y es que nosotros en un nucleótido, el nucleótido normal, lo que teníamos, si os acordáis, teníamos el grupo fosfato, teníamos el azúcar y teníamos la base nitrogenada. 00:09:12

Eso en el nucleótido, un ADN normal, ¿no? Y luego en el azúcar acordaros que teníamos un grupo OH y aquí en este carbono de aquí solamente aquí tenemos un hidrógeno. 00:09:36

recordad que en el ARN 00:09:50

aquí el azúcar es lo que cambia 00:09:53

en el ARN teníamos aquí un OH 00:09:55

y aquí también otro OH 00:09:57

y luego esta de aquí serían eso 00:09:59

las bases nitrogenadas 00:10:02

que en el ADN teníamos 00:10:03

adenina, timina, citosina y guanina 00:10:05

y luego esto de aquí es el grupo fosfato 00:10:08

que es igual en todos los nucleótidos 00:10:11

vale, pues en esta técnica 00:10:14

bueno, perdonad, antes de eso 00:10:17

Y lo que sabemos es que los nucleótidos se unen unos a otros formando toda la cadena de ADN y se unen a través de este carbono de aquí, o sea, a través de este OH de aquí que está en el carbono 3, este OH de aquí y luego el siguiente nucleótido se une por este carbono de aquí, que es el 5. 00:10:20

Entonces, el OH que tiene aquí este azúcar se une al grupo fosfato del siguiente nucleótido. Aquí otra vez, el OH del carbono 3 se une al siguiente nucleótido y por el grupo fosfato. 00:10:47

Recordad que estos eran enlaces fosfodiéster, se llaman fosfodiéster porque tenemos aquí el fósforo y tenemos aquí dos ésteres 00:11:04

Recordad también que las bases nitrogenadas estaban unidas unas a otras pero estos eran puentes de hidrógeno 00:11:15

Unidas a otras con la otra cadena 00:11:24

Pero bueno, aquí lo importante que tenemos que ver aquí es que los nucleótidos tenemos el grupo fosfato, el azúcar con un OH y la base nitrogenada. 00:11:27

Bueno, pues en esta técnica de aquí lo que vamos a hacer es añadir didesoxinucleótidos y los didesoxinucleótidos serían estos de aquí. 00:11:41

Estos tidesoxinucleótidos no tienen OH aquí, ¿veis? Aquí tienen un H y aquí otro, no tienen grupo hidróxilo, no tienen OH aquí en el azúcar. 00:11:53

Por lo tanto, si tenemos este nucleótido, no va a poderse unir aquí ningún otro nucleótido, porque aquí no tenemos grupo OH, aquí no se puede unir este grupo fosfato, porque aquí no tenemos OH, entonces aquí no va a poder continuar la cadena. 00:12:05

Bueno, pues lo que se hace entonces en esta técnica, se hacen una serie de mezclas y los componentes de esta mezcla serían el ADN que queremos codificar, que queremos analizar en forma monocatenaria, o sea, una de las cadenas. 00:12:32

Vamos a necesitar también una ADN polimerasa, la ADN polimerasa que va a ir copiando este ADN. Vamos a necesitar también un cebador, recordad los cebadores son necesarios para que la ADN polimerasa pueda empezar a copiar la cadena. 00:13:02

Pues además vamos a necesitar los cuatro nucleótidos. Estos cuatro nucleótidos son los desoxinucleótidos trifosfáticos. Desoxiadenintrifosfato, desoxicitosintrifosfato. 00:13:22

Esto simplemente es el nucleótido, este de aquí, este nucleótido, pues si esta base de nitrógeno es adenina, pues este es el nucleótido desoxinucleótido, desoxiadenin trifosfato. 00:13:38

Se dice trifosfato porque aquí habría tres grupos fosfato, pero bueno, lo que necesitamos sería eso, el ADN que queremos analizar, la ADN polimerasa, un cebador, los cuatro nucleótidos, porque claro, la ADN polimerasa va a ir copiando la cadena y pues va a tener que ir añadiendo, pues donde haya adenina, pues la ADN polimerasa pone timina, pues coge una timina. 00:13:56

Que hay una guanina, pues coge un nucleótido que tenga citosina y así va copiando. Pero además, lo que os decía, vamos a añadir también nucleótidos didesoxinucleótidos, o sea, didesoxinadenitrifosfato, didesoxicitosinitrifosfato. 00:14:24

Estos didesoxi, o lo que os digo, no tienen aquí grupo OH. 00:14:45

Pues entonces, lo que se hace es preparar cuatro disoluciones diferentes. 00:14:52

En las cuatro tenemos estos componentes, el ADN, el ADN polimerasa, el cebador y los cuatro nucleótidos. 00:15:01

Estos son los componentes comunes en los cuatro tubos de ensayo. 00:15:11

Estos son los cuatro componentes comunes. 00:15:17

Pero luego lo que hacemos es, en uno de ellos añadimos el didesoxiadenin trifosfato. 00:15:20

Por ejemplo, aquí añadimos un nucleótido que como base nitrogenada tiene adenina y que además aquí no tiene grupos OH. 00:15:30

En el siguiente tubo añadimos también el ADN, a descodificar la ADN polimerasa, el cebador, los cuatro nucleótidos y añadimos un D-desoxicitosina, en este caso tenemos la citosina, la citosina sin grupo OH aquí. 00:15:37

En el tercero, pues los mismos, todos estos componentes, pero en este caso la guanina. Aquí como base nitrogenada la guanina y aquí sin OH. Y en el último, pues todos estos componentes más la didesoxi, esta sería la timina. 00:16:02

Vale, entonces aquí adenina, timina, perdón, citosina, guanina y timina, pero este de aquí, endidesoxi, sino H. 00:16:24

Entonces, ¿qué es lo que va a ocurrir cuando tengamos esta mezcla? 00:16:37

Pues que la ADN polimerasa va a ir copiando. 00:16:42

Va a ir copiando la cadena, pero por ejemplo, aquí en este tubo de aquí, va a llegar un momento en el que va a coger, en vez de coger este nucleótido normal, va a coger este otro, el didesoxi. 00:16:49

Pues cuando la ADN polimerasa coja este disoxinucleotido de adenina y lo incorpore a la cadena, ¿qué va a pasar? 00:17:04

Que ahí va a terminar la cadena de copiarse. Ya no puede seguir copiando la ADN polimerasa porque no hay grupo OH al que se pueda unir el siguiente nucleótido. 00:17:15

Entonces ahí va a terminar la reacción. 00:17:28

En el siguiente tubo va a ocurrir algo parecido, lo que pasa es que aquí lo que tenemos es la citosina, la di-desoxi-citosina. 00:17:34

Entonces, la ADN polimerasa va a ir copiando, va copiando, va copiando. 00:17:43

Cuando llegue a una base nitrogenada que haya guanina, la ADN polimerasa copiará como citosina. 00:17:47

Sigue copiando, sigue copiando, si hay otra guanina, pues coge otro nucleótido que sea citosina. 00:17:55

Pero va a haber un momento en el que en vez de coger la citosina normal, el desoxinucleotido normal, con OH, pues va a coger este otro, el didesoxi. 00:18:02

Bueno, pues cuando coja este didesoxinucleotido, ¿qué va a pasar? Que ahí se va a cortar la cadena aquí, ahí ya va a terminar de copiar la ADN polimerasa, ya no se va a poder copiar más. 00:18:15

Vale, entonces aquí tenéis un ejemplo 00:18:27

Bueno, esto es más o menos lo que os he explicado 00:18:31

Para iniciar la secuenciación se deben realizar cuatro mezclas 00:18:36

Cada una de ellas debe contener el ADN a secuenciar, los cuatro nucleótidos, la ADN polimerasa y el cebador 00:18:39

Además, en cada una de las mezclas se debe introducir un nucleótido de disoxi distinto 00:18:46

El proceso que se lleva a cabo se inicia con la adhesión de los cebadores en la parte correspondiente de la cadena de ADN. 00:18:52

Acordaros que siempre tiene que haber un cebador para que pueda empezar a copiar la ADN polimerasa. 00:19:00

Entonces se inicia la replicación del ADN molde gracias a la acción de la enzima. 00:19:07

En el orden en que la cadena molde vaya informando, la enzima añadirá los nucleótidos necesarios para completar la cadena de nueva creación. 00:19:11

Esto es lo que ya os he contado. Ahora, este proceso se va realizando simultáneamente en una gran cantidad de moléculas de ADN, por lo que estadísticamente cada vez que se deba añadir una nueva base, alguna de esas moléculas no añadirán un nucleótido, sino que añadirán un nucleótido di-desoxi. 00:19:21

Estos últimos tienen la particularidad de haber perdido el grupo OH del carbono 3 00:19:45

por lo que en el momento en que se incorporan en la cadena que se está formando 00:19:53

finalizan la reacción, puesto que no disponen de la capacidad de introducir el siguiente nucleótido 00:19:57

Así pues, la cadena se irá replicando al mismo tiempo los cuatro recipientes 00:20:03

de tal forma que en cada uno van quedando algunas cadenas finalizadas 00:20:10

cuando se incorpora un nucleótido correspondiente al didesoxi introducido en ese recipiente. 00:20:14

Bueno, pues vamos a ver el ejemplo que tenéis aquí en el documento. 00:20:23

Tenemos, por ejemplo, esta secuencia que se quiere replicar. 00:20:28

Citosina, adenina, citosina, guanina, timina, adenina, adenina, guanina, citosina, timina, guanina, guanina, timina, adenina y guanina. 00:20:32

Esto es ADN. 00:20:42

Pues ahora, la cadena complementaria que se va a copiar, que se va a replicar, pues sería, si aquí tenemos citosina, guanina, adenina, timina, guanina, citosina, adenina, timina, timina, citosina, guanina, adenina, citosina, ¿ves? 00:20:43

Si tenemos aquí guanina, pues citosina, guanina, citosina, timina, adenina, adenina, timina, guanina, citosina. 00:21:03

Bueno, pues si solamente tuviéramos los nucleótidos normales, los de soxinucleótidos, pues esta cadena se copiaría tal cual. 00:21:09

Pero, lo que os digo, en esta tecnología, tecnología Sanger, utilizamos cuatro tubos diferentes. 00:21:23

Entonces, en este tenemos la didesoxiadenina y entonces cuando la cadena, cuando la ADN polimerasa empieza a copiar, pues empieza a copiar, ¿no? La citosina, pues pone guanina, adenina, timina, citosina, guanina, guanina, citosina. 00:21:32

Ahora, llega aquí timina y tiene que poner una adenina. Pues resulta que esta adenina que ha cogido es la didesoxi, por lo tanto ya no puede continuar la cadena copiándose. 00:21:51

Aquí termina este fragmento de ADN que se copia. Entonces, estadísticamente se van formando todas estas secuencias. 00:22:06

Habrá otro momento en el que la adenopolimerasa va copiando, va copiando, va copiando, va copiando 00:22:16

hasta que llega, por ejemplo, aquí a esta timina 00:22:25

Entonces, en esta timina, en vez de coger la adenina normal, la desoxiadenina con el grupo H 00:22:28

coge la didesoxi 00:22:35

Por lo tanto, aquí, si se une una adenina didesoxi, pues aquí termina la cadena de copiarse 00:22:37

En cambio, en este tubo de aquí, que tenemos la didesoxicitosina, pues la ADN polimerasa va copiando. 00:22:46

Copia citosina, guanina, adenina, timina, citosina, guanina. 00:22:58

Ahora, aquí por ejemplo, guanina, citosina. 00:23:02

Pues aquí es probable que en vez de coger una citosina normal, coja la didesoxi. 00:23:06

Pues aquí se pararía de copiar la ADN polimerasa. 00:23:11

ya no puede continuar de copiar. Luego se va a formar otro fragmento que llegue hasta 00:23:16

aquí, hasta esta citosina que se copia y ya aquí pare. En este caso de aquí que tenemos 00:23:24

la didesoxiguanina, puede ser que en el primer nucleótido que tenemos citosina y que lo 00:23:31

copiamos con la ADN polimerasa, tiene que poner guanina, puede ser que la ADN polimerasa 00:23:41

ya coja el didesoxi y entonces ya la cadena para de copiarse. Y así sucesivamente. En 00:23:47

este de aquí tenemos la didesoxi timina, pues la ADN polimerasa copia citosina, guanina, 00:23:57

adenina, timina. Pues aquí timina, aquí ya ha cogido la timina, la didesoxi, aquí 00:24:03

ya se para de copiar la cadena. Para analizar todos estos fragmentos de ADN, lo que se hace 00:24:10

es una electroforesis en gel de agarosa. A los que habéis hecho las prácticas ya habéis 00:24:19

visto cómo es la técnica. Entonces, prepararíamos el gel de agarosa y le haríamos, si os acordáis, 00:24:25

le hacíamos una serie de pocillos, aquí hacemos 4 pocillos y en cada uno de los pocillos 00:24:35

lo que vamos a introducir es cada una de estas disoluciones, entonces en cada una de 00:24:42

estas disoluciones vamos a tener diferentes fragmentos de ADN y además cada uno de ellos 00:24:49

tiene diferente masa molecular, acordaros los de mayor masa molecular quedan retenidos 00:24:55

arriba, porque el gel de agarosa tiene una serie de poros, y por esos poros, los de mayor 00:25:04

peso molecular no pueden atravesar esos poros y el ADN queda retenido arriba. En cambio 00:25:14

los de menor peso molecular, que serían estos, la guanina, guanina timina, esos sí que van 00:25:20

a ir atravesando los poros y nos aparecerán en la parte de abajo del gel. Bueno, pues 00:25:28

Entonces, como hemos introducido en cada pocillo, introducimos estas disoluciones, esta aquí, esta por aquí, esta por aquí y esta aquí en el 4, 00:25:33

pues por ejemplo, en el pocillo 3, en el que teníamos la didesoxi guanina, pues en este pocillo nos va a aparecer una banda en la que solamente vamos a tener guanina, que será esta de aquí. 00:25:45

tendremos otra banda en la que vamos a tener 00:26:01

guanina, timina y guanina 00:26:04

que sería esta de aquí 00:26:06

otra banda en la que vamos a tener 00:26:08

estas hasta aquí 00:26:11

hasta este fragmento 00:26:14

en este de aquí que sería la timina 00:26:17

pues algo parecido 00:26:22

en el primero tendremos guanina, timina 00:26:23

este de aquí 00:26:26

El siguiente sería guanina timina, guanina citosina, adenina timina. Pues sería este de aquí, guanina timina, guanina citosina, adenina timina. Y así sucesivamente, acordaros, los de mayor peso molecular arriba. 00:26:27

Pues así vamos a poder saber la secuencia de nucleótidos de nuestro ADN. 00:26:43

Bueno, pues esta técnica nos sirve para secuencias de ADN más bien cortas, entre comillas, como hasta 500 fragmentos. 00:26:52

Pero claro, si queremos, por ejemplo, para el estudio del genoma humano, que la longitud es de 3.000 millones de bases, pues lo que tenemos que, claro, no podemos hacer tantas secuencias de este tipo, sería muy difícil. 00:27:07

Y entonces lo que se hace es una técnica Sanger modificada. 00:27:22

Pero antes de eso, vamos a ver, bueno, aquí tenemos en resumen, cada vez que se introduce un nucleótido, 00:27:27

existe la probabilidad, y de hecho sucede, de que en alguna de las cadenas, en lugar de desoxi-X, lo que sea, 00:27:36

se introduzca la di-desoxi-X. 00:27:44

y esto es lo que ya os he dicho 00:27:47

a continuación se colocan muestras de los cuatro recipientes 00:27:49

en cuatro carriles distintos del gel 00:27:52

y se separan por electrofloresis 00:27:54

las posiciones relativas entre las cuatro calles 00:27:56

se utilizan entonces para leer de abajo a arriba 00:27:59

la secuencia de ADN como se indica 00:28:01

de esta manera se puede deducir el orden 00:28:03

y la composición de la cadena que se ha sintetizado 00:28:06

a su vez esta es la cadena complementaria 00:28:09

de la cadena inicial 00:28:12

Vale, entonces vamos a ver este vídeo que hay aquí, a ver, lo tenía aquí abierto. 00:28:13

Veis en la pantalla, ahora he puesto, voy a poner un vídeo de Youtube. 00:28:31

Vale, gracias. 00:28:44

Vale, pues entonces voy a poner este vídeo que dura poquito, son dos minutos, para que 00:28:46

entendáis como no tiene voz, sólo tiene música, porque así no lo escucha. 00:28:52

Ahora hay que desnaturalizar el ADN. 00:29:04

Y ahora lo que se escucha sería la secuencia que queremos copiar. 00:29:11

Añadimos el timer y ponemos lo común. 00:29:18

Añadimos también los dióxidos, los óxidos dióxidos. 00:29:37

y añadimos los didesoxi en cada uno 00:29:44

y otro referente 00:29:46

didesoxi 00:29:50

voy a echar el volumen 00:29:51

vale, hemos añadido 00:29:55

entonces aquí tenemos 00:29:57

un segundo, vuelvo atrás 00:29:59

aquí tenemos la cadena 00:30:01

el primer que ya se 00:30:04

ha hibridado a la cadena 00:30:05

tenemos los nucleótidos 00:30:07

normales y el 00:30:10

y el didesoxi en cada uno 00:30:11

en cada tubo uno diferente 00:30:14

Ahora la ADN polimerasa va copiando, va copiando hasta que por ejemplo en este caso ha llegado esta base nitrogenada que no tiene grupo H, esto lo identifican así, pues ahí ya para de copiar la ADN polimerasa, ahí ya para, ahí ya tendríamos un fragmento. 00:30:16

donde se van formando diferentes fragmentos en cada tubo 00:30:39

luego haríamos la gel, bueno aquí lo hacen en gel de poliacrilamida 00:31:05

se aplica una carga, acordaros como el ADN tiene carga negativa debido a los grupos fosfato 00:31:09

pues la carga negativa se va a dirigir hacia el polo positivo 00:31:19

y así obtenemos los diferentes fragmentos 00:31:24

cuando más pequeño pues van a aparecer más abajo 00:31:29

menor masa molecular más abajo 00:31:46

y así 00:31:49

vemos todos los 00:31:51

podemos obtener 00:31:54

el ADN, la secuencia 00:31:57

aquí en este caso 00:32:00

la primera es adenina 00:32:08

luego anina 00:32:10

bueno aquí lo ponen un poco 00:32:11

diferente 00:32:14

y así podemos conocer 00:32:15

la secuencia de este fragmento 00:32:21

de ADN 00:32:24

vale, pues lo que os decía 00:32:26

vale, lo que os decía 00:32:35

esto nos sirve pues para 00:32:50

diferenciar 00:32:52

como unos 500 00:32:53

fragmentos 00:32:55

pero para el 00:32:57

para el, por ejemplo 00:33:00

para el estudio del genoma humano 00:33:04

si necesitamos analizar 00:33:05

unos 3.000 millones de bases 00:33:08

esto no es viable 00:33:09

Se ha hecho una técnica de Sanger modificada. ¿En qué consiste esta técnica modificada? 00:33:11

Pues mirad, hay dos formas. Una sería la secuenciación utilizando colorantes que se acoplan al cebador. 00:33:23

y este cebador se puede marcar en su extremo 5' mediante un colorante fluorescente 00:33:33

y así luego puedes detectar las secuencias de ADN. 00:33:42

Pero la técnica más novedosa sería esta, que es la secuenciación por terminador fluorescente. 00:33:49

La ventaja que tiene esta técnica es que en una sola reacción se obtiene la secuencia de ADN 00:33:57

Es decir, no necesitamos poner los cuatro didesoxinucleótidos en cada tubo 00:34:08

Sino que en un mismo tubo se puede hacer toda la reacción 00:34:14

Y ahora lo que se hace es marcar cada uno de los cuatro didesoxinucleótidos con un colorante fluorescente diferente 00:34:19

y luego se separan por cromatografía. 00:34:27

Entonces, de esta técnica, simplemente saber eso que es una técnica mejorada, de la técnica Sanger, 00:34:32

vamos a ver este vídeo de Javier Novo, de este científico, para que lo entendáis. 00:34:40

Pero lo que quiero que sepáis es lo que es la técnica Sanger, la sencilla, 00:34:48

Y luego esta, simplemente saber que hay una técnica mejor, que se utilizan colorantes florescentes. 00:34:57

Y mirad, vamos a ver este vídeo. 00:35:06

Creo que lo tengo aquí abierto también. 00:35:09

Voy a poner... 00:35:27

La secuenciación consta de un cebador. 00:35:34

Voy a poner los subtítulos, que de paso no lo escucháis. 00:35:37

Una reacción de secuenciación... 00:35:41

A ver, paro. 00:35:43

Una reacción de secuenciación consta de un cebador, una cadena de ADN molde que queremos secuenciar, 00:35:46

obsérvese la dirección 5'-3' de esta cadena y del cebador, nucleótidos libres y una molécula de ADN polimerasa que es la que va a llevar a cabo la síntesis. 00:36:03

El cebador se une a la cadena molde por complementariedad de bases y la ADN polimerasa va a sintetizar ADN extendiendo el cebador a partir de su extremo 3', incorporando los nucleótidos complementarios a cada una de las posiciones de la cadena molde que queremos secuenciar. 00:36:13

La reacción comienza cuando los nucleótidos se van incorporando por acción de la polimerasa a la cadena molde que se quiere secuenciar 00:36:39

En la mezcla de nucleótidos hay algunos que están marcados con un fluorocromo 00:36:49

y a su vez terminan la síntesis de la cadena 00:36:54

Cuando uno de estos nucleótidos se incorpora, la extensión de la cadena se termina 00:36:58

como sucede en este caso con esta adenina que va marcada con un fluorocromo específico 00:37:03

específico y que termina la cadena. Lógicamente hay cuatro tipos de moléculas terminadoras, 00:37:08

cada una de ellas marcadas con un fluorocromo distinto, de manera que al final de la reacción 00:37:14

tenemos cadenas que han sido extendidas en todos los posibles tamaños, cada una de ellas terminada 00:37:20

por un fluorocromo distinto. Así se pueden obtener lecturas de unos 500-800 nucleótidos de longitud. 00:37:27

Todos estos fragmentos hay que introducirlos después en un aparato especial, un secuenciador, que hace una electroforesis en un capilar para separar cada uno de estos fragmentos por tamaños, de manera que los fragmentos más pequeños migran más rápido que los fragmentos de tamaños mayores. 00:37:34

Esto lo vemos aquí ejemplificado muy bien con todos los fragmentos que hemos obtenido al ir leyendo esta secuencia molde, cada uno de ellos terminado por un fluorocromo distinto. 00:37:56

Cuando todos estos fragmentos se introducen en el capilar donde tiene lugar la electroforesis, la migración es distinta. 00:38:09

Los fragmentos más pequeños avanzan más rápido que los fragmentos mayores. 00:38:18

Por tanto llegan antes al final del capilar donde hay un láser que excita los fluorocromos que emiten una luz en una longitud de onda distinta y de esta forma podemos ir viendo la secuencia de nucleótidos que se han ido incorporando en la reacción, que no es otra que la secuencia complementaria a la de la cadena molde original que queríamos secuenciar. 00:38:22

Al final obtenemos archivos de este tipo con una gran cantidad de picos que indican la secuencia de nucleótidos de la molécula original. 00:38:47

Si quieres un café con leche, no pidas café con leche. 00:38:58

Vale, pues bueno, como veis, esta técnica es mucho más útil, ¿no? 00:39:01

más rápida sobre todo 00:39:08

en un mismo tubo 00:39:16

ya podemos analizar 00:39:19

toda la secuencia de ADN 00:39:21

bien, pues esto sería la secuenciación 00:39:24

entonces 00:39:29

de este tema de aquí nos quedaría 00:39:31

como hemos saltado 00:39:34

hemos visto, vimos el punto 4-1 00:39:35

que era el corte y unión de moléculas de ADN, luego el 4-2, que era la hibridación, que eso lo vimos ya hace tiempo, 00:39:39

ahora hemos visto la secuenciación, que es el punto 4-3, después está el punto 4-4, que es la PCR, la reacción en cadena de la polimerasa, 00:39:52

De la PCR me faltan un poco las aplicaciones, eso lo vamos a ver el próximo día, eso se me quedó por explicar. 00:40:02

Y luego tenemos el punto 4.5 que es la clonación o la tecnología del ADN recombinante, que eso es lo que os puse la clase grabada. 00:40:15

Y de esta también me queda un poco explicaros un poco mejor la parte final de las aplicaciones y también alguna cosilla, la biobalística también me parece que me faltó por explicar. 00:40:26

Pero yo creo que esto mejor lo vemos el próximo día. 00:40:42

haciendo ese ejercicio, pues aplicamos la bioinformática. Y entonces luego, así ya 00:41:12

terminaríamos este tema. El tema 4.6 nos quedaría también por repasar pues alguna 00:41:20

de las autoevaluaciones que tenéis ahí, que aparecen a lo largo del documento y que 00:41:28

no tenemos hecho. Y bueno, voy a explicaros este punto, el punto 4-6, a ver si nos da 00:41:34

tiempo. Este punto es cortito, ya os digo que tampoco vamos a entrar en demasiado detalle. 00:41:45

Yo creo que es más importante las otras técnicas. Bueno, pues en este punto lo que 00:42:05

nos hablan es identificar microorganismos. Entonces, nosotros normalmente lo que se hace 00:42:13

es, por ejemplo, cuando hay un crimen, lo que se hace es analizar las huellas dactilares, 00:42:23

por ejemplo, o analizar la sangre o saliva y de ahí sacar el ADN de ese posible sospechoso. 00:42:31

Hay veces que no tenemos material biológico para analizar, no hay cantidad suficiente de sangre 00:42:46

o no hay huellas. Entonces, hay una técnica que sería analizar los microorganismos, o sea, las bacterias. 00:42:57

Entonces, en estos casos las bacterias podrían aportar información complementaria. Bueno, voy a leer esto de aquí. 00:43:10

Las huellas dactilares y el estudio del ADN humano son herramientas de probada eficacia en el lugar de un hecho criminal. 00:43:18

sin embargo no siempre es posible disponer de ellas. Hay situaciones en las que por falta de 00:43:25

materiales biológicos tales como por ejemplo sangre o saliva no se tienen posibilidades de 00:43:30

tomar muestras de ADN humano o bien los objetos susceptibles de presentar huellas tienen superficies 00:43:37

en donde no quedan impresas de forma satisfactoria. En estos casos las bacterias podrían aportar 00:43:44

información complementaria. Numerosos estudios en el campo de la microbiología ya habían 00:43:50

dejado clara la gran variabilidad de comunidades de bacterias presentes entre las personas. 00:43:55

No todos los individuos tienen las mismas bacterias en sus manos. Las huellas dactilares 00:44:02

bacterianas dejarán rastros que ayudarán a identificar rápidamente al sospechoso y 00:44:06

resolverán el caso. Es decir, por medio del análisis de las bacterias que se hayan quedado 00:44:11

podemos identificar al sospechoso. 00:44:18

Bueno, pues hay dos métodos de identificación, los métodos fenotípicos y los métodos genotípicos. 00:44:23

Los métodos fenotípicos, pues esto seguramente habéis estudiado en biología, ¿no? 00:44:30

¿Cómo se pueden estudiar? Pues las propiedades bioquímicas o la morfología de los microorganismos, 00:44:37

organismos, el color de las colonias y a partir de estas propiedades podemos tipificar un 00:44:44

tipo de bacteria u otra. Ahora, ¿qué ocurre con estos métodos fenotípicos? Pues que 00:44:51

el poder de tipificar es limitado, no se pueden tipificar todas las bacterias porque cada 00:44:57

uno es aplicable a un número reducido de especies bacterianas. Cada ensayo de estos, 00:45:05

pues cada estudio es aplicable solamente a una serie de especies bacterianas. 00:45:11

Bueno, pues para resolver esto tenemos los métodos genotípicos. 00:45:16

Entonces, en estos, ¿qué se analiza? Pues la genética, genotípico. 00:45:21

Se analiza la estructura genética de ese organismo. 00:45:26

Y estos tienen la ventaja de que se pueden aplicar a cualquier especie bacteriana. 00:45:29

Vale, pues entonces, dentro de estos métodos genotípicos tenemos tres tipos. 00:45:37

Podemos analizar los perfiles plasmídicos, podemos analizar los perfiles de restricción del ADN genómico o podemos analizar, o sea, se puede hacer un perfil de amplificación génica basado en la PCR, la reacción en cadena de la polimerasa. 00:45:41

Bueno, pues por ejemplo, los perfiles plasmídicos. El plasmido, acordaros que es un cromosoma que se replica independiente del cromosoma de la célula, de la bacteria. 00:46:00

¿Cómo podemos estudiar estos plásmidos? 00:46:16

Haríamos un análisis celular, o sea, romper la membrana plasmática 00:46:23

obtener el ADN plasmídico, o sea, separar el ADN 00:46:27

lo que es el plasmídico del cromosómico, esto ya lo vimos 00:46:31

cuando vimos la obtención de ADN 00:46:35

y después podríamos hacer una electroforesis en gel de agarosa 00:46:38

¿Cuál es el problema de esta técnica? 00:46:43

Pues es que como los plásmidos tienen su ADN circular, ¿qué pasa? Que pueden presentar diferentes conformaciones. El ADN del plásmido puede estar así, en un círculo, pero puede estar así también, o de esta otra forma, o de esta otra forma. 00:46:46

¿Qué ocurre? Que cuando hagamos la electroforesis en gel de agarosa, aunque tengamos el mismo plásmido, si este plásmido está en esta conformación y el mismo plásmido está en otra conformación, pues nos van a aparecer bandas en zonas diferentes, por lo que no vamos a poder distinguirse ese plásmido. 00:47:02

Bueno, pues para resolver esto lo que se puede hacer es cortar ese plásmido con enzimas de restricción. 00:47:25

Nosotros tenemos un plásmido que es circular, pues lo cortamos con alguna enzima de restricción y lo que nos va a quedar es un ADN lineal y así ya podemos analizarlo sin problemas con el troforesis en gel de agarosa. 00:47:36

Otra forma de analizar la genética de estas bacterias sería analizar el ADN genómico, no el plasmídico, sino el genómico. 00:47:50

Para ello, que se utilizan por lo mismo endonucleasas de restricción que van a cortar ese ADN genómico en muchos fragmentos. 00:48:07

Y esos fragmentos luego lo mismo, los separamos haciendo una electroforesis en gel de agarosa. 00:48:14

Ahora, una forma de interpretar estos resultados más fácil sería la combinación de este método con el uso de sondas. 00:48:25

Una sonda, acordaros, una sonda es una secuencia de ADN que tiene a lo mejor un grupo fluoróforo que emite radiación. 00:48:36

Y luego se transferiría a una membrana nitrocelulosa, acordaros que esto en la técnica de hibridación lo hemos visto, y después ya se separaría por electroforesis. 00:48:43

Entonces los que hayan hibridado con esa secuencia de ADN que teníamos, pues quedarán fijados en la membrana. 00:48:58

Bueno, este sería la técnica de perfiles de restricción de ADN genómico. Cortar el ADN con endonucleasas de restricción y luego hacer una hibridación con sondas y después ya la electroforesis a gel de agarosa. 00:49:07

Y por último tendríamos los perfiles de amplificación génica. ¿En qué consiste? Pues consiste en hacer una PCR, una reacción en cadena de la polimerasa. 00:49:28

Si os acordáis en la PCR, por cada fragmento de ADN que queríamos amplificar, ¿qué utilizábamos? Pues utilizábamos dos cebadores o primers. Esos cebadores o primers eran los que delimitaban la secuencia que queríamos amplificar. 00:49:47

Pues en este caso lo que hacemos es utilizar solamente un único oligogonucleotido, o sea, un único cebador. Normalmente eso de 10 pares de bases. 00:50:02

Y entonces ese único cebador se va a unir aleatoriamente a la cadena de ADN y se van a obtener fragmentos de diferente masa molecular de esa cadena de ADN. 00:50:16

Y esta técnica se denomina RAPD, Random, Aleatorio, Amplification, Polymorphic DNA o ADN. 00:50:35

O sea, se amplifica de forma aleatoria. 00:50:48

Se utiliza solamente un único nucleótido que se va a unir a diferentes zonas del ADN 00:50:52

Y entonces se van a ir amplificando, se van a ir haciendo copias de diferentes fragmentos de ese ADN. 00:50:59

Bueno, pues eso es lo que os decía. Esta técnica la vemos así un poquito más por encima, pero lo importante es eso, que sepáis que hay otras formas de hacer una identificación de ADN que sería eso a través de las bacterias. 00:51:08

Y estas bacterias se pueden analizar con los métodos fenotípicos, pero estos métodos son un poco limitados y luego podemos hacer el análisis por métodos genotípicos, analizar la genética de ese organismo. 00:51:25

¿Qué podemos analizar de esas bacterias? Pues podemos analizar los plásmidos que tienen, podemos analizar si no el ADN cromosómico o se puede hacer una reacción en cadena de la polimerasa, una PCR, pero ya os digo, utilizando solamente un primer. 00:51:48

Bien, pues entonces de este tema nos quedaría la parte de informática, que haremos un ejercicio el martes que viene y lo que os he comentado antes de ver un poquito más las aplicaciones. 00:52:12

Entonces, pues nos quedaría por ver, el siguiente tema es el 5, el siguiente tema no es tan largo, es bastante más corto que este, este yo creo que es el más largo y tenemos que, nos queda también por ver un tema de proteínas, de identificación de proteínas. 00:52:32

Entonces en este puente intentad miraros este tema de clonación de ácidos nucleicos 00:52:55

Es fundamental primero que hayáis entendido el tema 3 00:53:03

De lo que es un ácido nucleico, de cómo son los enlaces entre las bases nitrogenadas 00:53:07

Lo que es un nucleótido, ese tema lo tenéis que saber bien para poder entender el tema 4 00:53:13

entonces intentad 00:53:19

este puente si podéis 00:53:22

veros 00:53:24

entender 00:53:25

lo que es la hibridación, la secuenciación 00:53:27

la PCR, el ADN 00:53:30

recombinante 00:53:32

y así para el próximo día 00:53:33