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Inmunología y Técnica MALDI TOF - Contenido educativo

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Subido el 2 de febrero de 2025 por Susana A.

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Estos dos métodos, la técnica Malditoff y los ensayos inmunológicos. 00:00:00
Vamos a empezar por la técnica Malditoff. 00:00:07
Esta técnica se basa en la técnica de espectrometría de masas, que seguramente los que hayáis estudiado el módulo de análisis instrumental, a lo mejor lo habéis estudiado ya. 00:00:14
esta técnica de espectrometría de masas 00:00:28
¿en qué consiste? así muy brevemente 00:00:32
lo que vamos a hacer es impactar a nuestra 00:00:34
a una molécula orgánica 00:00:38
que aquí la hemos representado como ABC 00:00:42
la impactamos con un chorro de electrones 00:00:44
y lo que conseguimos es ionizar nuestra muestra 00:00:48
cargarla positivamente 00:00:52
y además esto se hace en fase gaseosa 00:00:53
Entonces vamos a obtener iones a partir de moléculas orgánicas. Y además lo que se hace también es fragmentar esta molécula. La vamos a romper en partes, en trocitos y la vamos a fragmentar. 00:00:57
Y ahora los fragmentos que obtenemos, que serán iones, van a tener diferente masa y carga y se van a detectar estos iones. 00:01:13
Entonces, aquí tenemos un espectro de masas. Aquí, por ejemplo, tendríamos esta molécula, ¿no? Que es el butano CH3, CH2, CH2, CH3. Pues lo que hacemos es impactar esta molécula con un haz de electrones, o sea, con un chorro de electrones y además se fragmenta. 00:01:27
Si os fijáis aquí tenemos un CH3 con carga positiva, aquí tenemos un CH3CH2 con carga positiva, aquí está toda la molécula con carga positiva. 00:01:47
Entonces obtenemos distintas fracciones, o sea distintos iones con distinto tamaño que luego se separan y lo que nos da es un espectro de masas de este tipo con estas señales. 00:01:59
Entonces, claro, esto lo podemos hacer para moléculas de este tipo, moléculas pequeñas. Pero ahora, si queremos hacer esto mismo, pero analizar proteínas, proteínas ya sabemos que son macromoléculas, por lo tanto, imaginaros que aquí, si fragmentamos las proteínas, pues obtendríamos aquí un montón de señales que sería muy difícil identificar. 00:02:14
Pues para eso se elimina ese problema con esta técnica, la técnica MALDI-TOF. 00:02:40
Estas siglas provienen del inglés y MALDI es de Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. 00:02:51
O sea, en español, espectrometría de masas de ionización, distorsión, láser asistida por matriz. 00:03:01
Con esto es con lo que vamos a generar los iones. 00:03:11
Y luego, ¿cómo analizamos los iones? Pues con el Time of Flight, T-O-F, con este sistema, con el TOF. 00:03:15
Aquí os he puesto unos vídeos por si queréis echarles un vistazo. 00:03:27
Vamos a ver entonces qué significa esto de ionización, desorción, láser, asistida por matriz. 00:03:33
Bueno, lo que podemos conseguir con esta técnica es, lo que os decía, ionizar biomoléculas como péptidos y proteínas sin que se produzca la ruptura de los mismos. 00:03:42
Y además también se pueden ionizar moléculas no volátiles. 00:03:52
Si os acordáis, hemos visto que en espectrometría de masas la técnica se hace en fase gas, pues con esta, con la malditoz, se pueden ionizar moléculas no volátiles. 00:03:55
Vamos a ver cómo se logra esto. 00:04:08
Lo que hacemos es poner, tenemos una placa, esta placa suele ser de poliestireno, y en esta placa tenemos muchos pocillos. 00:04:12
Tenemos hasta 96 pocillos, suele ser 96. 00:04:21
Aquí os he puesto como sería uno de estos pocillos. 00:04:25
Bien, pues lo que vamos a hacer es, vamos a poner en uno de estos pocillos, vamos a poner una matriz, que aquí está representada en color violeta. 00:04:30
Y vamos a mezclar esa matriz con nuestra proteína, con la muestra que nosotros queremos analizar, que sería esto de aquí en verde. 00:04:41
la matriz es simplemente 00:04:50
pensaba que lo tenía 00:04:54
la matriz es simplemente un compuesto orgánico 00:04:58
hay varios tipos de matrices 00:05:03
pero es un compuesto orgánico 00:05:07
y lo que se hace es añadir la matriz 00:05:11
junto con nuestra muestra en estos pocillos 00:05:16
y ahora lo que hacemos es hacer incidir en estos pocillos un rayo láser 00:05:19
y con esto que vamos a conseguir que el sólido que tenemos en cada pocillo pase a fase gas, 00:05:26
que esto sería la desorción, el sólido va a pasar a fase gas y obtendríamos esto de aquí. 00:05:35
al mismo tiempo la matriz se va a cargar positivamente, si veis aquí tenemos cargas positivas 00:05:43
y ahora esta energía que adquiere la matriz la va a pasar a las moléculas de nuestra muestra, 00:05:53
a estas verdes y estas moléculas se van a ionizar, van a adquirir carga positiva, 00:06:03
Lo veis aquí, cargas positivas. Y luego ya estos iones son los que vamos a analizar. Entonces, consiste en irradiar una muestra que está mezclada con una matriz. Al irradiar con un rayo láser, lo que ocurre es que la matriz y la muestra se desorben, o sea, se produce su desorción, pasan a fase gas. 00:06:10
y la matriz se ioniza y a su vez esa energía que adquiere la transmite a nuestras moléculas en verde 00:06:35
que también se van a ionizar. 00:06:45
Y ahora lo que vamos a hacer es separar estos iones, estas cargas positivas 00:06:48
y eso lo separamos con el analizador de tiempo de vuelo, el TOF. 00:06:52
Y así brevemente lo que ocurre es que le vamos a aplicar a estas muestras, 00:06:58
las que tenemos aquí de distinto tamaño, ionizadas, lo que hacemos es aplicarles un campo eléctrico 00:07:04
y lo que hacen es, se van a ir moviendo hasta llegar al detector. 00:07:15
Las de menor masa molecular se van a mover más rápidamente y van a llegar antes al detector 00:07:21
y las de mayor masa molecular van a tardar más en llegar al detector y así es como se detectan. 00:07:27
Por eso se llama tiempo de vuelo, porque van moviéndose por aquí hasta llegar al detector. 00:07:33
Simplemente que os suene, analizador de tiempo de vuelo, time of flight. 00:07:41
Aquí tenemos este vídeo, vamos a verlo un poquito. 00:07:51
Solamente un poquito para que veáis cómo es la técnica. 00:08:15
Aquí tenemos la placa con los 96 pocillos. 00:08:23
Ya la estamos aplicando el láser. 00:08:31
Las moléculas se ionizan y se vaporizan. 00:08:41
Pasan a fase gas. 00:08:44
Se aplica un voltaje y entonces 00:08:50
las moléculas se mueven hasta llegar al detector. 00:08:54
Vamos hasta aquí, porque este ya es otro tipo. 00:09:24
Pues esto sería la técnica Malditoz. 00:09:44
Y ahora vamos a ver los ensayos inmunológicos. 00:09:52
Vamos a ver cómo podemos detectar proteínas mediante estos ensayos inmunológicos. 00:09:55
Entonces, antes de nada vamos a hablar un poquito de, bueno, tenemos estas técnicas, la técnica ELISA y luego tenemos otros ensayos como el Western Blood, la hema glutinación y la glutinación en látex. 00:10:01
Vamos a ver un poco lo que es el sistema inmunitario. El sistema inmunitario proviene del vocablo romano que significa estar libre y es la capacidad que tenemos los seres vivos de no sufrir continuamente enfermedades. 00:10:14
Es decir, que cuando enfermamos por algún virus, pues nuestro cuerpo genera anticuerpos que se llaman y esos anticuerpos lo que van a hacer es que si nos volvemos a contagiar otra vez con el mismo virus, esos anticuerpos son como un sistema de defensa que ya identifican ese virus y lo eliminan. 00:10:33
Entonces, el sistema inmunitario lo que hace es eso, proteger al organismo de una serie de agentes infecciosos que pueden ser bacterias, hongos, parásitos o virus 00:11:02
y que ocasionan diferentes enfermedades. Entonces, el organismo reconoce a estos componentes y inicia una serie de respuestas. 00:11:12
esta serie de respuestas son lo que llamamos los anticuerpos. 00:11:23
Entonces, el sistema inmunitario, bueno, esto es un poco repetición, es un sistema de defensa 00:11:30
y lo que está formado por la serie de mecanismos que protegen al organismo frente a agentes patógenos. 00:11:35
A estos agentes patógenos los denominamos antígenos. 00:11:44
Entonces, tenemos el agente patógeno, que es el antígeno, que es el que nos infecta, 00:11:48
que puede ser una bacteria, un virus. Y luego tenemos el anticuerpo, que es el sistema de defensa, que son los compuestos que nuestro cuerpo genera para defenderse de estos antígenos. 00:11:55
O sea, antígeno y anticuerpo. Los antígenos se pueden… bueno, vamos a abrirlo aquí. Aquí os he puesto unos vídeos de este investigador, Alfredo Corel, que están muy bien. Por si tenéis tiempo y les echáis un vistazo. 00:12:12
Entonces, antígeno lo representamos como AG y es aquel, cualquier sustancia que va a provocar una respuesta inmunitaria, es decir, que va a estimular la producción de anticuerpos 00:12:29
Son moléculas complejas y son normalmente proteínas o polisacáridos 00:12:43
Estos son los antígenos 00:12:49
Y luego los anticuerpos se llaman también inmunoglobulinas y son glucoproteínas. 00:12:52
Si os acordáis cuando vimos las proteínas teníamos homoproteínas y teníamos heteroproteínas. 00:13:01
Pues este es un caso de heteroproteínas. Son proteínas que están compuestas de proteína y de hidratos de carbono. 00:13:06
Ahora, estos anticuerpos lo que hacen es, lo que ya os he dicho, identificar y neutralizar elementos extraños 00:13:14
tales como bacterias, virus o parásitos y el anticuerpo lo que va a hacer es unirse al antígeno 00:13:22
Ahora, esta unión antígeno-anticuerpo es específica 00:13:30
Mirad, aquí en esta gráfica se ve muy bien 00:13:35
Este sería un anticuerpo 00:13:38
Los anticuerpos hemos dicho que son proteínas y los antígenos hemos dicho que pueden ser proteínas o polisacáridos. 00:13:41
Estos son anticuerpos. Los anticuerpos están formados por cuatro cadenas. 00:13:50
Dos cadenas largas de aminoácidos y dos cadenas más cortas de aminoácidos. 00:13:54
Pues cada anticuerpo tiene aquí un fragmento que se llama epítopo 00:14:02
Y que hace que la reacción antígeno-anticuerpo sea específica. Es decir, que hay un anticuerpo para cada antígeno. Si nos infectamos con la viruela, por ejemplo, hay un anticuerpo específico para ese virus. 00:14:07
Y si os fijáis aquí tenemos varios antígenos de distintos colores y con distintas formas y solamente este es el que encaja aquí, el que reacciona, o sea, se uniría a este anticuerpo. Por eso la reacción es específica. 00:14:30
Las técnicas inmunológicas se basan en esta especificidad de inmunidad antígeno-anticuerpo, porque cuando el antígeno se une al anticuerpo, se producen fenómenos que pueden ser una precipitación, una mutinación, que son visualizables, que se pueden observar, si el antígeno es específico de ese anticuerpo. 00:14:54
Bien, pues vamos a ver esta técnica, la técnica ELISA. Esta técnica ELISA, ELISA viene del acrónimo también del inglés, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Es el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas. 00:15:19
pasáis ensayo 00:15:41
en una absorción 00:15:44
ligado a enzimas 00:15:46
bueno, vamos a ver qué significa 00:15:47
en qué consiste 00:15:53
esta técnica 00:15:55
el equipo que se utiliza 00:15:56
para esta técnica es un espectrofotómetro 00:15:58
es un espectrofotómetro 00:16:01
y aquí también tenemos 00:16:03
una placa 00:16:05
parecida a la técnica 00:16:06
Maldito, que tiene una serie 00:16:09
de pocillos 00:16:11
Entonces, un espectrofotómetro lo que va a medir es, por ejemplo, en este caso vamos a medir cambio de color. 00:16:13
Esta sería la placa y aquí vemos los pocillos con distintos colores. 00:16:22
Pues eso es lo que nos va a medir el espectrofotómetro. 00:16:27
Vamos a ver cómo se producen estos diferentes colores. 00:16:31
Entonces, bueno, la técnica consiste en que vamos a reaccionar el antígeno con el anticuerpo. Imaginaros que aquí en rojo tenemos un antígeno, ¿vale? El antígeno es el agente patógeno. 00:16:34
Y le añadimos un anticuerpo que tiene esta forma de aquí, añadimos un anticuerpo, si el antígeno reacciona con el anticuerpo pues se quedará unido. 00:16:51
Ahora le añadimos otro anticuerpo, que sería este de aquí 00:17:07
Pero este anticuerpo tiene unido una enzima, que es esta de aquí en amarillo 00:17:13
Esta enzima 00:17:18
Entonces ahora ya tenemos el antígeno en rojo, un anticuerpo 00:17:20
Y otro anticuerpo que está unido a una enzima, esta de aquí en amarillo 00:17:25
Y ahora le añadimos un sustrato, que sería este de aquí en blanco 00:17:30
Y este sustrato al unirse a la enzima, es un sustrato que reacciona con esta enzima que tenemos aquí, pues al unirse con esta enzima produce un cambio de color y esto es lo que vamos a detectar, este cambio de color. 00:17:35
Vale, ahora no nos va a dar tiempo pero si eso ves este vídeo que he puesto aquí 00:17:51
Entonces tenemos el antígeno en rojo, le añadimos un anticuerpo 00:17:59
Le añadimos otro anticuerpo con una enzima que es esta de aquí de color amarillo 00:18:04
Y le añadimos un sustrato 00:18:10
Y este sustrato va a reaccionar con la enzima y se va a producir un cambio de color en la disolución que tenemos 00:18:12
Y eso es lo que vamos a medir. 00:18:20
Entonces, tenemos varios tipos de técnica ELISA. 00:18:25
Tenemos el ELISA directo, el ELISA indirecto y el ELISA sandwich. 00:18:27
El ELISA directo, este es el más sencillo. 00:18:33
En este simplemente ponemos en los pocillos el antígeno y le añadimos anticuerpos que están marcados, es decir, anticuerpos con una enzima. 00:18:35
Ahora, si le añadimos después el sustrato y observamos si hay presencia o no de antígenos, si la solución cambia de color, es que el anticuerpo es el específico de ese antígeno. 00:18:47
En este caso hay que añadir también controles negativos, es decir, muestras que sabemos que no tienen el antígeno buscado 00:19:04
Y también se ponen controles positivos, muestras que sí sabemos con seguridad que tienen el antígeno buscado 00:19:15
Entonces este es el ELISA directo, que este es el más sencillo 00:19:23
Después tenemos el ELISA indirecto. El ELISA indirecto es el que os he explicado antes. 00:19:27
Tendríamos aquí el antígeno. Esto de aquí es lavar para eliminar los antígenos que no se hayan quedado pegados al pocillo. 00:19:36
Le añadimos un anticuerpo específico para ese antígeno. 00:19:45
Lavamos también para eliminar los anticuerpos que no se hayan quedado pegados. 00:19:50
Le añadimos otro anticuerpo, este anticuerpo tiene una enzima que es esta de aquí y ahora le añadimos un sustrato que es el que va a reaccionar con esa enzima y si os fijáis hay un cambio de color. 00:19:53
La disolución de azul ha pasado a amarilla. 00:20:10
Pues esto es lo que vamos a detectar. 00:20:13
La mayor cantidad de antígeno, pues más color se producirá aquí. 00:20:15
Y eso es lo que medimos en el espectrofotómetro. 00:20:20
Y el siguiente que tenemos es el ELISA sandwich. 00:20:26
Es parecido, lo que pasa que aquí en vez de poner antígeno, en el pocillo primero ponemos un anticuerpo. 00:20:29
Pones el anticuerpo, le añadimos el antígeno, o sea, el agente patógeno. 00:20:36
que va a reaccionar con ese anticuerpo que tenemos. 00:20:41
Lavamos y añadimos otro segundo anticuerpo que este tiene la enzima, tiene unida una enzima. 00:20:46
Y lo mismo, aquí añadimos un sustrato, pues cuando reaccione ese sustrato con esa enzima se va a producir un cambio de color. 00:20:54
Si fuera que hemos añadido, o sea, que esta reacción no se produce, que ese anticuerpo no es específico de este antígeno, pues cuando lleguemos aquí no se va a observar cambio de color, porque este antígeno no se va a quedar unido al anticuerpo. 00:21:03
Vale, entonces no observaremos cambio de color. Pues este es el ELISA sandwich. Tenemos ELISA directo, ELISA indirecto. Estos dos, el directo y el indirecto, son los que primero ponemos el antígeno y el ELISA sandwich son los que primero ponemos el anticuerpo. 00:21:23
Entonces, esta técnica lisa, ¿para qué nos sirve? Pues podemos diagnosticar una infección por un virus, por ejemplo, podemos detectar una hormona, podemos detectar la presencia de drogas, podemos diagnosticar una infección, pero analizando los anticuerpos que se han creado. 00:21:45
Cuando nosotros nos infectamos, generan anticuerpos en nuestro organismo, pues podemos analizar esos anticuerpos. 00:22:13
Nosotros, por ejemplo, podemos haber pasado una enfermedad, pero de forma leve y a lo mejor no nos hemos dado cuenta. 00:22:24
y al cabo de los años nos hacen un análisis, nos miran los anticuerpos y observan que nos dicen 00:22:33
bueno pues si tú has pasado la hepatitis A por ejemplo, porque tienes anticuerpos de haber pasado la hepatitis A 00:22:42
entonces lo que podemos diagnosticar son anticuerpos o diagnosticar directamente los antígenos 00:22:49
pues los antígenos del virus del HIV, el virus de cólera, etc. 00:22:57
Vale, y hay otros ensayos inmunológicos. Este sería el Western Blot. Si os acordáis, en ADN también vimos el Southern Blot y el Northern Blot. Si os acordáis, el Northern era para ARN. Pues este es parecido, lo que pasa que este es para proteínas y se llama Western Blot. 00:23:06
Y lo que se hace es separar las proteínas mediante electroforesis, aquí sería electroforesis en gel de poliacrilamida, este sería el gel de poliacrilamida, ya hecha la electroforesis y lo que hacemos es pasar este ADN a una membrana de nitrocelulosa. 00:23:28
Y ahora con esta membrana de nitrocelulosa lo que hacemos es incubar este ADN que tenemos aquí con un anticuerpo y así podemos detectar si hay una reacción específica entre este antígeno que teníamos y el anticuerpo que hemos añadido. 00:23:51
Esta sería otra forma de hacer el análisis inmunológico. 00:24:14
Materias:
Biología
Etiquetas:
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    • Ciclo formativo de grado superior
      • Segundo Curso
Autor/es:
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Subido por:
Susana A.
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Fecha:
2 de febrero de 2025 - 11:55
Visibilidad:
Clave
Centro:
IES LOPE DE VEGA
Duración:
24′ 21″
Relación de aspecto:
1.78:1
Resolución:
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Tamaño:
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