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UT6 - Técnicas de secuenciación manual - Contenido educativo

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Subido el 21 de febrero de 2024 por Pedro M.

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Bien, vamos a ver la primera parte del tema de secuenciación de ácidos nucleicos. 00:00:01
Vamos a ver fundamentalmente estos tres primeros puntos, 00:00:07
algunas generalidades sobre la secuenciación de ácidos nucleicos 00:00:11
y vamos a ver los dos primeros métodos, que son métodos manuales, 00:00:15
son los primeros métodos que se diseñaron para poder secuenciar un ácido nucleico, 00:00:21
que es el método químico de Maxan y Gilbert y el método enzimático de Sanger. 00:00:27
Ambos métodos, especialmente el segundo, el método enzimático, es importante 00:00:33
puesto que está en la base para poder entender el resto de técnicas de secuenciación, 00:00:38
especialmente la secuenciación automática de primera generación. 00:00:46
Cuando hablamos de secuenciación, en realidad, ¿a qué nos estamos refiriendo? 00:00:53
Por tanto, secuenciar un ácido nucleico no es ni más ni menos que el proceso por el cual vamos a determinar cuál es la secuencia de nucleótidos que componen una molécula tanto de DNA como de RNA. 00:00:56
Es decir, el orden en el que están las bases nitrogenadas, los nucleótidos, en una secuencia lineal de DNA o de RNA. 00:01:10
Por tanto, cuando hablamos de la secuencia de nucleótidos 00:01:21
nos estamos refiriendo al orden 00:01:27
¿Cuál es el primer nucleótido? ¿El segundo? ¿El tercero? ¿El cuarto? 00:01:30
Hemos de determinar cuál es el orden de cada uno de los nucleótidos 00:01:34
de una secuencia de DNA o de RNA 00:01:38
Ese es el concepto fundamental 00:01:42
Eso es la secuenciación 00:01:46
¿De acuerdo? Una idea importante es que la secuenciación siempre la vamos a tener que dar en dirección 5'-3'. De hecho, en cualquier base de datos donde podamos acceder a secuencias del genoma, siempre vamos a encontrar todas las secuencias en dirección 5'-3'. 00:01:47
Ya sabemos que el DNA es bicatenario, pero solamente nos van a dar la secuencia de una de las hebras. Cinco prima, tres prima. 00:02:14
¿Qué técnicas se utilizan actualmente en la secuenciación o existen? 00:02:22
Lo que vamos a ver hoy son las técnicas manuales. Son técnicas antiguas. Ya están en desuso, completamente en desuso. 00:02:27
Entonces, la primera de ellas es una técnica diseñada por Maxan y por Gilbert 00:02:35
Este de aquí es Gilbert, del cual toma nombre la técnica en sí 00:02:42
Y se basa en reacciones químicas sobre el DNA que queremos secuenciar 00:02:50
Simples reacciones químicas 00:02:55
Sin embargo, el método que tuvo más éxito no fue el de Gilbert 00:02:58
sino que fue el de 00:03:04
Friedrich Sanger que en realidad está 00:03:06
fundamentado en reacciones enzimáticas 00:03:08
porque utiliza polimerasas 00:03:10
polimerasas 00:03:12
más adelante 00:03:14
años más adelante 00:03:19
sobre todo a finales de los años 80 00:03:20
y principio, bueno 00:03:22
los métodos de Max Sanger y de 00:03:23
Friedrich Sanger son de finales 00:03:26
de los años 60-70 00:03:28
¿de acuerdo? 00:03:30
a finales de los años 80 00:03:32
se producen dos mejoras tecnológicas, biotecnológicas 00:03:33
en las técnicas de biología molecular de secuenciación 00:03:41
que es por un lado el desarrollo de la PCR 00:03:44
ya sabemos que Mewlis a principios de los 80 00:03:46
diseña y desarrolla la técnica de PCR 00:03:49
y entonces gracias al desarrollo de la PCR 00:03:53
y a una nueva tecnología de electroforesis 00:04:00
que no se realiza en geles de agarosa ni en geles de poliaclamida 00:04:03
sino que es lo que llamamos una electroforesis en capilar que utiliza otro tipo de polímero 00:04:08
que permitía hacer una electroforesis tremendamente rápida en muy poco tiempo 00:04:12
y con muchísima fiabilidad y resolución 00:04:17
aunando la técnica de PCR con este nuevo tipo de electroforesis capilar 00:04:20
se desarrollan a finales de los años 80 los primeros métodos automáticos 00:04:25
Los anteriores, el de reacciones químicas y reacciones enzimáticas son manuales 00:04:33
Todo se hacía a mano en el laboratorio 00:04:39
Esta es la primera vez que se puede automatizar el proceso de secuenciación 00:04:42
Y entonces hablamos de los métodos automáticos de primera generación 00:04:46
Ya los veremos, ya los veremos más adelante 00:04:50
Estos métodos automáticos de primera generación están basados en la tecnología Sanker 00:04:53
En el método manual de Sanker 00:04:59
como ya veremos. 00:05:01
Estas mejoras tecnológicas, tanto el desarrollo de la PCR 00:05:05
como este nuevo tipo de electroforesis 00:05:09
que permitía una secuenciación rapidísima de pequeños fragmentos de DNA 00:05:11
es lo que pone en marcha a principios de los años 90, 00:05:16
de hecho en el año 90, comience el proyecto Genoma Humano. 00:05:21
humano. Entonces la secuenciación del genoma humano empieza en el año 90 y gracias a este 00:05:26
método automático de primera generación se concluye en el año 2002, es decir, tardaron 12 años en 00:05:32
secuenciar todo el genoma humano, un genoma tipo, ¿de acuerdo? Sobre el año 2012, aproximadamente 00:05:39
10 años después surge una nueva tecnología de secuenciación tremendamente más rápida que son 00:05:49
los métodos automáticos de segunda generación que también los veremos de acuerdo daos cuenta 00:05:57
que si habían tardado 12 años del año 90 al 2002 que se publica nature in science la secuenciación 00:06:03
del genoma humano esta nueva tecnología permitió en apenas unas semanas secuenciar todo el genoma 00:06:11
humano. De tal manera que estos nuevos métodos de secuenciación de segunda generación, también 00:06:18
llamados NGS o Next Generation Sequencing, permiten un salto cualitativo. De tal manera que ahora para 00:06:23
poder secuenciar no hace falta ya que purifiquemos un DNA y secuenciemos gen a gen, sino que de una 00:06:32
tacada con esta nueva metodología podemos secuenciar el genoma completo de un individuo, 00:06:39
de un paciente en muy poco tiempo. 00:06:46
Actualmente se han desarrollado también 00:06:52
métodos automáticos de tercera generación 00:06:54
y la verdad es que esta parte es bastante alucinante 00:06:57
porque parece que estamos entrando en el mundo 00:07:00
de la ciencia ficción, ¿de acuerdo? 00:07:02
Estos métodos automáticos aunan las técnicas clásicas 00:07:04
de biología molecular con los desarrollos científicos 00:07:08
de la nanotecnología. De tal manera que estos métodos automáticos de tercera generación 00:07:13
están miniaturizados. Entonces, en tarjetas de un tamaño muy pequeño podemos llegar 00:07:19
a secuenciar el genoma completo de un individuo en apenas unas horas. 00:07:27
Una idea importante que tenemos que tener en cuenta cuando estamos hablando de secuenciación 00:07:33
de ácidos nucleicos es que actualmente ya no secuenciamos genes individuales, a no ser que 00:07:39
sea para aplicaciones muy concretas. Por ejemplo, estudiar la mutación en un único gen, una única 00:07:47
mutación para saber si un paciente tiene una mutación u otra, pero se tiende actualmente a 00:07:53
secuenciar el genoma completo de ese individuo, de esa persona. Eso hace que a la biología molecular 00:08:01
se le haya unido una nueva disciplina que surgió también hace ya unas décadas 00:08:07
que es la bioinformática, puesto que de la secuenciación de estos genomas completos 00:08:13
el genoma completo de un individuo, se van a generar cantidades ingentes de información 00:08:20
que debemos saber procesar, gestionar para poder sacar conclusiones e información valiosa 00:08:26
Para ello necesitamos eso, gestionar toda esa información gracias a aplicaciones bioinformáticas. Por tanto, en este campo de la secuenciación, la biología molecular necesita de la bioinformática para poder analizar todos los datos y extraer conclusiones. 00:08:34
¿De acuerdo? Bueno, estas son unas ideas así generales sobre la secuenciación 00:08:54
también como un overview para enmarcar todo el tema que vamos a tratar 00:08:59
¿De acuerdo? Vamos a comenzar con el primer método de secuenciación 00:09:05
El primer método de secuenciación, tanto el método químico de Max-Anne y Gilbert 00:09:10
como el de Sanger, el enzimático de Sanger, son prácticamente coetáneos 00:09:14
Uno surge un poquito antes que otro y este método de secuenciación se basa en reacciones químicas. Vamos a tener nuestro DNA y vamos a hacer sobre él reacciones químicas específicas para modificar algunas bases nitrogenadas, ¿de acuerdo? 00:09:18
dos desventajas 00:09:40
que tienen este método químico 00:09:42
y esto nos tiene que quedar claro ya desde el principio 00:09:44
es que el método químico de Maxan y Gilbert 00:09:46
fue desplazado muy pronto 00:09:48
por el método enzimático de sangre 00:09:50
por estas dos 00:09:53
desventajas, entre otras 00:09:54
primero, porque solamente podemos 00:09:56
secuenciar fragmentos muy pequeños 00:09:58
fragmentos cortitos de DNA 00:10:00
y además 00:10:02
porque para esta secuenciación 00:10:04
requerimos de grandes 00:10:06
cantidades de DNA purificado 00:10:08
claro, esto en la clínica muchas veces es inviable 00:10:10
¿por qué? porque a lo mejor la muestra que tenemos 00:10:14
es una pequeña muestra de una biopsia minúscula 00:10:17
de la cual podemos extraer un poquito de DNA purificado 00:10:21
lo normal es que a partir de ese DNA purificado 00:10:25
ahora en el laboratorio lo amplificamos 00:10:28
o bien por PCR o bien por otras técnicas 00:10:31
como veremos, lo amplificamos 00:10:34
Entonces, da igual tener poco DNA de partida, porque lo vamos a amplificar. Pero en este método químico de Maxán y Gilbert no hay amplificación. Si no hay amplificación, para poder secuenciar el DNA necesito partir de grandes cantidades. Y esto no siempre es posible. ¿De acuerdo? 00:10:36
vale, ¿cómo se realiza 00:10:56
el método químico de Maxan y Gilbert? 00:11:00
bueno, pues la primera fase 00:11:02
es una de fosforilación 00:11:04
y una fosforilación, imaginaos que 00:11:06
nosotros tenemos esta 00:11:08
secuencia de DNA, es el DNA que hemos 00:11:09
purificado, pues lo que vamos 00:11:12
a hacer, vamos a marcar en el 00:11:14
extremo 5' 00:11:16
claro, para poder marcar en el 00:11:17
extremo 5' de esta 00:11:20
cadena, lo primero que vamos a hacer va a ser 00:11:22
una de fosforilación 00:11:24
Con una fosfata, ¿sabes? De tal manera que vamos a eliminar este fosfato. Y una vez hemos eliminado este fosfato, lo vamos a fosforilar nosotros. Pero, ojo, lo vamos a fosforilar con un fosfato radioactivo, fósforo 32. 00:11:26
Entonces vamos a utilizar un ATP que es portador de fósforo 32. De tal manera que después de la defosforilación y la fosforilación tenemos nuestro DNA marcado radioactivamente con un fosfato radioactivo en 5'. ¿Por qué no marcamos en 3'? Podríamos marcar en 3'. Pero es mejor siempre marcar en 5'. Ya veremos por qué. 00:11:43
porque esta base, este nucleótido 3' lo vamos a perder. 00:12:13
Todo esto lo vamos a ver ahora más adelante. 00:12:19
Por tanto, la primera fase es, una vez yo he purificado todo mi DNA, 00:12:22
que necesito microgramos y microgramos de DNA, 00:12:26
lo que hago es de fosforilo en 5' y fosforilo con fosfato 32. 00:12:30
De tal manera que ahora todas las hebras del DNA llevan un fosforo 32 00:12:36
y por tanto las puedo detectar por autoradiografía, porque son radioactivos, ¿de acuerdo? 00:12:41
Una vez ya tengo todo el DNA marcado, empieza la segunda fase. 00:12:48
El DNA lo voy a repartir en cuatro tubos, ¿de acuerdo? 00:12:53
En cuatro tubos, tubo 1, 2, 3 y 4, todo el DNA. 00:12:59
Lo reparto en partes iguales en cuatro tubos. 00:13:03
y en cada uno de estos tubos voy a llevar a cabo una reacción química diferente. 00:13:06
En todos tengo el mismo DNA 00:13:12
y lo he repartido equitativamente entre los cuatro epéndromos, los cuatro tubos. 00:13:13
Y lo que voy a hacer va a ser una reacción química con un reactivo químico diferente, 00:13:19
si os dais cuenta, en cada uno de los tubos 00:13:25
para que se produzca una modificación química de una base diferente, 00:13:27
una base nitrogenada diferente. 00:13:32
En el tubo 1 voy a añadir dimetilsulfato. El dimetilsulfato va a modificar aleatoriamente las guaninas. En el tubo 2 añado ácido fórmico que es un ácido orgánico débil porque es un ácido orgánico y va a modificar específicamente todas las bases públicas, es decir, adeninas y guaninas. 00:13:33
En el tubo 3 añado hidracina. La hidracina modifica específicamente las bases pirimidínicas, timina y citosina, si estamos hablando del DNA. Si fuera RNA es diferente. 00:13:59
Y en el tubo 4, además de hidracina, voy a poner una alta concentración de sales, 2 molar de cloruro sódico. Esto produce una modificación específica solo de las citosinas. 00:14:13
¿De acuerdo? Por tanto, en cada tubo he producido modificaciones químicas, por reacciones químicas de estos compuestos, con determinadas bases. 00:14:26
Uno. Y la segunda idea es que la concentración del reactivo la voy a poner a concentración limitante. 00:14:38
¿Eso qué significa? Eso significa que voy a poner poquita concentración. 00:14:47
Solamente la concentración necesaria para que en cada molécula de DNA se modifique una guanina 00:14:51
Una única guanina de todas las que hay en su secuencia 00:14:59
Y se va a modificar de forma aleator 00:15:02
En el tubo 2, una adenina o una guanina 00:15:04
En el tubo 3, una timina o una citosina 00:15:08
En el tubo 4, una citosina 00:15:11
Esto lo vamos a ver ahora ejemplificado 00:15:13
Imaginaos que yo quiero secuenciar este DNA 00:15:17
Es una secuencia de ADN, ya hemos hecho la primera fase, por tanto en 5' tenemos aquí el marcaje radioactivo con fósforo 32 y en el tubo 1 hemos dicho que vamos a modificar las guaninas añadiendo dimetilsulfato e incubando. 00:15:20
De tal manera que después de la reacción química, en el tubo habíamos puesto nuestra secuencia de DNA, nuestro DNA a secuenciar, después del tratamiento con dimetilsulfato voy a obtener toda una colección de fragmentos de DNA en las cuales aleatoriamente voy a tener una guanina modificada. 00:15:35
Las he pintado aquí en verde. Aquí sería esta, aquí esta, aquí esta, aquí esta, la última, la última, ¿de acuerdo? Esto de forma aleatoria. Ya veis que pongo puntos suspensivos porque serían, voy a tener tantos fragmentos de DNA diferentemente marcados, marcados diferentes, tantos como guaninas tiene la secuencia. 00:15:56
Tendría una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho. Por tanto, después de la reacción química en el tubo, lo que voy a tener es una mezcla de ocho tipos de secuencias diferentes con ocho marcajes de guaninas diferentes. 00:16:19
¿De acuerdo? ¿De aquí bien? Esto es lo que ocurre en el tubo 1. ¿Qué ocurre en el tubo 2? Pues algo análogo. En el tubo 2 hemos puesto ácido fórmico. Entonces, este ácido fórmico, después de la incubación, sabemos que el ácido fórmico modifica las purinas. 00:16:37
Por tanto, de forma aleatoria, en un fragmento de DNA marca una guanina o marca una adenina, de forma aleatoria, unas u otras. 00:16:55
De tal manera que también al final de la reacción, en el tubo voy a tener una colección de fragmentos con diferente marcaje. 00:17:06
Marcaje quiere decir con diferente base, una base, una guanina o una adenina, modificada químicamente. 00:17:13
¿De acuerdo? 00:17:22
¿Qué ocurre en el tubo 3? 00:17:24
En el tubo 3, como ha puesto hidracina, después de la incubación con hidracina, la modificación se produce en las bases pirilínicas. Por tanto, también de forma aleatoria se modifica una citosina, una timina, una antes, otra después, según la secuencia. 00:17:26
Al final, nuevamente tenemos en el tubo una mezcla de fragmentos con una única base modificada y que está modificada de forma aleatoria. 00:17:42
¿De acuerdo? Y en el último tubo, que es el tubo 4, exactamente lo mismo. Lo que pasa es que al añadir sales a la hidracina, la hidracina ya es incapaz de modificar la timina y por eso solamente modifica aleatoriamente las citosinas. ¿De acuerdo? 00:17:56
¿Verdad? Nuevamente, en este tubo también vamos a tener una mezcla de fragmentos con una citosina aleatoriamente modificada. ¿Sí? ¿Hasta aquí bien? Perfecto. Una vez hemos llevado a cabo la reacción química con estos compuestos, con todos estos compuestos químicos, y ya han sido modificadas unas bases nitrogenadas determinadas de forma aleatoria, lo que hago es una segunda incubación. 00:18:14
Y añado a todos los tubos piperidina. La piperidina es un compuesto que lo que va a hacer es que se va a pegar al DNA, se une al DNA, la piperidina, y va a fragmentar el DNA por donde esté la base nitrogenada modificada. 00:18:40
Es decir, en el tubo 1, ¿qué es lo que ocurre ahora? Una vez hemos puesto el dimetilsulfato y añadimos la piperidina, lo que va a ocurrir es que en estos fragmentos se va a fragmentar el DNA justo por donde se encuentra la base nitrogenada modificada. 00:18:57
Aquí, por tanto, este fragmento ahora me quedaría muy cortito, una secuencia muy cortita. ¿Por qué? Porque la piperidina, pum, fragmenta aquí. Este más largo fragmenta aquí, fragmenta aquí, aquí, aquí, aquí. 00:19:18
De tal manera que después del tratamiento con piperidina en el tubo lo que voy a tener va a ser un pool de fragmentos, ojo, marcados y no marcados porque la secuencia que viene aquí, que ahora no la he dibujado, que sería toda esta secuencia de aquí desde la timina hasta la guanina, ha quedado también libre ahora. 00:19:34
Este fragmento ha quedado libre en el tubo. ¿Me explico? ¿Se entiende? Pero, ¿qué es lo que ocurre? Que este fragmento, desde la timina hasta la guanina, no está marcado radioactivamente. Solamente estará marcado este de aquí. ¿De acuerdo? 00:19:54
De tal manera que después del tratamiento con piperidina lo que obtengo es un montón de fragmentos que proceden del DNA original y que todos ellos, uno, están marcados en 5' y dos, acaban todos en guanina. ¿Os dais cuenta? Todos acaban en guanina. 00:20:10
¿Qué ocurre en el tubo 2? En el tubo 2 lo mismo, ¿de acuerdo? Después del tratamiento con piperidina se fragmentan las secuencias de DNA allá por donde tengan las bases nitrogenadas modificadas, de tal manera que nuevamente voy a obtener un pool de fragmentos marcados radioactivamente en 5' y que en este caso todos acaban o por guanina o por adenina, ¿de acuerdo? 00:20:28
Aquí nuevamente dibujados solo unos pocos, pero serían muchos más. 00:20:58
En el tubo 3, lo mismo, pero todos ellos acaban en citosinas o timinas. 00:21:02
Y en el tubo 4, lo mismo, todos los fragmentos marcados en 5' radioactivamente y todos acaban, en este caso, en citosinas. 00:21:09
¿De acuerdo? 00:21:18
¿En qué se diferencian estos, todos estos fragmentos? 00:21:18
Del tubo 4, del tubo 3, del 2 y del 1. 00:21:23
Todos ellos se diferencian ahora en el tamaño. Unos son más grandes, otros son más cortos, pero todos ellos empiezan igual, marcados en 5' con el fosfato y todos acaban en citosina, ¿de acuerdo? 00:21:26
Muy bien, una vez ya he llevado a cabo las reacciones de modificación de bases nitrogenadas y he hecho el tratamiento con la piperidina, lo que hago ahora es el contenido de cada tubo lo voy a correr en una electroforesis, pero una electroforesis en gel de poliacrilamida. 00:21:43
La poliacrilamida tiene muchísimo mayor poder de resolución que la agarosa y además lo pongo hiperconcentrado. Para que os deis cuenta, normalmente se suelen hacer geles para correr una PCR del 1 al 2%, como mucho, ¿de acuerdo? 00:22:03
Aquí vamos a hacer poliaclamida que va a estar en el entorno 10 veces más, de 10 al 20%. 00:22:22
¿Esto qué me va a permitir? Esto me va a permitir en la electroforesis poder diferenciar bandas de secuencias cuya diferencia es un único nucleótido. 00:22:28
¿De acuerdo? Son de altísima resolución. 00:22:41
Una vez hecha la electroforesis, lo único que tengo que hacer es la autoradiografía del gel. 00:22:44
Recordemos que los fragmentos son radioactivos 00:22:48
Y ya analizamos la autoradiografía 00:22:52
Resumiendo 00:22:54
Nosotros teníamos un DNA de partida 00:22:57
¿De acuerdo? 00:23:00
Este DNA de partida, lo primero que hemos hecho ha sido marcarlo en 5' 00:23:01
Con fosfato radioactivo 00:23:05
¿Sí? Fosforo 32 00:23:07
¿Hasta aquí bien? Muy bien 00:23:09
Perfecto 00:23:11
Una vez lo hemos llevado a cabo, el marcaje 00:23:12
Hemos hecho las reacciones de modificación química 00:23:17
Este DNA ya marcado lo hemos repartido en cuatro tubos diferentes y en cada uno de ellos hemos añadido un reactivo químico diferente y se van a llevar a cabo una serie de modificaciones químicas de bases nitrogenadas diferentes. 00:23:20
Después añadimos la piperidina, incubamos, hacemos el tratamiento con piperidina 00:23:35
y lo que tenemos en cada uno de estos tubos, si os dais cuenta, es una colección de fragmentos 00:23:42
unos marcados y otros no 00:23:47
Los no marcados no los voy a ver en la autorreografía, me imagino que estáis viendo 00:23:49
y además que son de diferente tamaño, unos son más pequeños, otros son más largos 00:23:55
pero todos ellos en este tubo acaban por guanina 00:23:59
En este tubo acaban en adenina o guanina, aquí en citosina o timina y aquí todos acaban en citosina. ¿De acuerdo? ¿Qué es lo que hago ahora? Ahora voy a coger el contenido de cada tubo y lo voy a correr en un gel de poliacrilamida al 10-20%. ¿De acuerdo? Cada uno en un carril, en una calle diferente del gel. 00:24:02
Cuando hago esto, ¿de acuerdo? Corro el gel de electrophoresis, obtengo un patrón de bandas. Este patrón de banda corresponde a, desde los fragmentos más pequeños, que están aquí abajo, porque migran más de los fragmentos más pequeños a los fragmentos más grandes, ¿de acuerdo? Que estarían aquí arriba. 00:24:27
Ya veis que las bandas se disponen a diferentes alturas 00:24:50
La diferencia que hay entre este fragmento y el siguiente fragmento 00:24:58
Es un único nucleótido 00:25:05
Entre este y este es un único nucleótido 00:25:06
Entre este y este es un único nucleótido, etc. 00:25:10
De tal manera que si los fragmentos más pequeños son los que más corren, los fragmentos más pequeños, si tiro para atrás, son aquellos, ¿veis? Los fragmentos más pequeños son aquellos que están más cerca del cinco prima, ¿sí? Del marcaje. 00:25:12
Por tanto, los fragmentos que migran más lejos en el gel son los que están en 5'. 00:25:33
Entonces lo único que tengo que ir haciendo ahora es leer la secuencia, 00:25:39
sabiendo que el 5' está aquí abajo y sabiendo que el 3' está aquí arriba, 00:25:48
es ir leyendo la secuencia de abajo arriba. 00:25:53
¿De acuerdo? Y ya tendría la secuencia. 00:25:58
Fijaos, la secuencia en este caso es esta. 00:26:01
Entonces empiezo y ¿cuál es la primera banda que me encuentro? Me encuentro esta primera banda. ¿En qué carril está? Está en este tercer carril. Este tercer carril es aquel en el que se modifican citosinas o timinas. 00:26:05
¿Cómo sé yo si este fragmento, la última base nitrogenada, la base nitrogenada marcada, es una timina o una citosina? 00:26:20
Si fuera una citosina, tendría que aparecer esta banda también en este carril, como este caso, fijaos 00:26:30
Esto yo sé que es una citosina, ¿sí? ¿Por qué? Porque aparece aquí, pero también aparece aquí 00:26:36
Y no es una timina 00:26:43
Esto es una timina, ¿por qué? Porque aparece aquí, pero no aparece aquí 00:26:45
Por tanto, timina. En este caso, una adenina. ¿Por qué? Porque si fuera una guanina, tendría que aparecer también aquí otra banda, como esta. ¿De acuerdo? Guanina. ¿Por qué es guanina? Porque aparece aquí y aparece aquí. Dos bandas. Si solo aparece una banda, significa que es una adenina. 00:26:49
La siguiente, una adenina. Citosina, timina, timina, citosina, guanina, timina, adenina, adenina. Entonces lo único que tenemos que hacer es coger nuestro gel, después de haber hecho la autoradiografía y obtener el patrón de bandas, es leer la secuencia directamente de abajo arriba. Y esta es la secuencia 5'-3' de nuestro fragmento. ¿De acuerdo? 00:27:09
¿Verdad? Pues estos son los fundamentos del método químico de Max and Gilbert, que como ya os decía, está completamente obsoleto, quedó obsoleto al poco tiempo por el desarrollo del método enzimático de sangre, ¿de acuerdo? 00:27:36
Entre otras cosas también porque la radioactividad está en desuso. Siempre que se puedan utilizar otros, otro tipo de sistemas que sean igual de sensibles y específicos, pues mejor que la radioactividad. 00:27:52
¿Sí? Muy bien 00:28:04
El método enzimático de terminación de la cadena 00:28:08
Es el método de Sanker 00:28:11
¿Por qué se le llama así? 00:28:12
Método enzimático 00:28:14
Porque vamos a utilizar polimerasas 00:28:15
Claro, daos cuenta que a finales de los 60 00:28:17
A principios de los 70 00:28:21
No existía la PCR 00:28:22
No existía la PCR 00:28:24
Pero sí que existía porque en los años 50 00:28:27
Se había purificado ya 00:28:29
Se habían aislado las polimerasas 00:28:30
La RNA polimerasa y la DNA polimerasa fueron aisladas y purificadas y descritas por primera vez por Arthur Korver y por Severo Ochoa. 00:28:33
Ambos recibieron el premio Nobel, si no recuerdo mal, en el 59. 00:28:44
¿De acuerdo? 00:28:48
Entonces, se conocían las polimerasas. 00:28:49
¿Qué es lo que hace este método? 00:28:53
¿Qué es lo que idea Sanger? 00:28:56
Bueno, si yo tengo una secuencia de DNA que quiero secuenciar, pues voy a utilizar una polimerasa y voy a hacer primero una copia, pero va a ser una copia un pelín diferente a como lo hace una PCR, ¿de acuerdo? O como lo hace la célula durante la replicación, ¿de acuerdo? 00:28:57
¿En qué se fundamenta este método? En reacciones de polimerización de cadenas complementarias. Y esto es muy importante. Yo quiero secuenciar la cadena 5'-3'. ¿Sí? Pues lo primero que voy a hacer va a ser una reacción de polimerización para copiar esta cadena. 00:29:18
Y la vamos a copiar, si os acordáis, si utilizamos la polimerasa, la vamos a copiar de 3' a 5', ¿de acuerdo? Muy bien. Pero lo que vamos a hacer, vamos a utilizar una mezcla de nucleótidos. Si os acordáis de los DNTPs de la PCR, los DNTPs de la PCR son de este estilo, ¿de acuerdo? 00:29:37
Tendríamos la pentosa, tenemos el trifosfato, los DNTPs trifosfato, si os acordáis, para que pueda utilizarlos la polimerasa, aquí tendríamos la base correspondiente y esta es una desoxi, es un desoxinucleótido. 00:29:59
Aquí en 3' tenemos el OH, el grupo hidróxido 00:30:16
Pues junto con estos 00:30:19
DNTPs 00:30:20
Vamos a utilizar también los 00:30:23
Dideoxinucleótidos 00:30:24
¿Eso qué significa? Son en realidad ribonucleótidos 00:30:26
Si os dais cuenta 00:30:29
En 3' hemos 00:30:29
Deoxidado 00:30:31
De tal manera que en lugar de tener un hidróxido 00:30:34
Ahora tenemos un hidrógeno 00:30:37
¿Sí? 00:30:39
Pues vamos a añadir a la mezcla de reacción 00:30:40
Además de los DNTPs 00:30:42
Dideoxinucleótidos. ¿Qué es lo que ocurre si la polimerasa va, en las reacciones de polimerización, va añadiendo dNTPs, pero por casualidad coge del medio un ddNTPs, un dideoxi, mete un dideoxi y una vez lo ha metido ya no puede continuar la síntesis. 00:30:45
¿Por qué? Porque le falta el hidroxilo en 3' para poder introducir el siguiente nucleótido. 00:31:07
Por tanto, ¿para qué necesitamos estos dideoxi en la reacción? 00:31:13
Para que la polimerasa cuando los introduzca, ¡pum!, termine la secuencia. 00:31:17
Termine y se detenga la síntesis. 00:31:22
¿De acuerdo? Este es el fundamento del T. 00:31:26
Entonces vamos a realizar reacciones de polimerización utilizando una mezcla de reacción en la que tengo dNTPs y dideoxis. 00:31:29
Cuando la polimerasa va metiendo DNTPs, pues continúa, continúa hasta el final de la secuencia, hasta que llega un momento que, por casualidad, introduce un d-deoxy y entonces, ¡pum!, para la síntesis. ¿De acuerdo? Este es el fundamento. 00:31:36
Fundamento. Nuevamente, ya podéis suponer que la gran ventaja que tiene este método respecto del anterior es que podemos partir de DNA, de cantidades pequeñas de DNA. ¿Por qué? Porque en realidad lo que queremos secuenciar lo vamos a amplificar primero, lo vamos a amplificar por reacciones de polificación. 00:31:51
Entonces, aunque parta de cantidades pequeñas de DNA, da igual, porque vamos a amplificar. ¿De acuerdo? Muy bien. ¿Cómo lo hacemos? Bueno, pues este método diseñado por Sanger lo diseñó también para fragmentos pequeños de DNA y monocatenarios. 00:32:14
Por tanto, antes de comenzar, si queremos secuenciar DNA bicatenario, que es lo habitual, lo primero que tenemos que hacer es un paso previo de desnaturalización. 00:32:32
Y a partir de este DNA monocatenario vamos a comenzar las reacciones de polimerización. 00:32:43
Ah, y otra cosa importante, si vamos a utilizar la polimerasa necesitamos, además de los DNTPs, del buffer, de bla bla bla bla bla, todo lo que sabemos, necesitamos un primer. ¿Os acordáis? Porque es uno de los grandes defectos, entre comillas, que tienen las polimerasas, que han de partir de un pequeño fragmento bicatenal. Por tanto, también hemos de diseñar un primer. ¿De acuerdo? 00:32:51
Entonces nosotros, ¿qué es lo que vamos a hacer? 00:33:16
Ese DNA de partida lo vamos a repartir también en cuatro tubos 00:33:20
Vamos a preparar cuatro tubos 00:33:24
Entonces, ¿qué vamos a poner en cada uno de los tubos? 00:33:25
Pues primero vamos a poner el DNA molde, monocatenario, 5'-3', que es el que queremos secuenciar 00:33:28
¿Qué más vamos a añadir al tubo? 00:33:35
Pues vamos a poner el primer, ¿de acuerdo? 00:33:38
El primer, pero aquí está lo importante 00:33:41
el primer, en este caso igual que en el método anterior, va a ir marcado radioactivamente, ¿de acuerdo? 00:33:44
Le vamos a poner en 5' un fosforo de enteros, un fosfato radioactivo. 00:33:51
Por tanto, los primers que voy a utilizar es el mismo primer en todos, 00:33:57
porque quiero secuenciar el mismo fragmento, este primer va marcado. 00:34:00
Ahora no marcamos el DNA, sino que marcamos el primer que vamos a utilizar, ¿de acuerdo? 00:34:05
Una diferencia importante con el método anterior. 00:34:11
¿Qué más añadimos en cada tubo? Por supuesto, la polimerasa, la adenina polimerasa. ¿Qué más añadimos? El buffer, el cloruro de magnesio, aquí no lo pongo, pero me imagino que es fundamental, ¿no? Es básico, todo el mundo lo ve. 00:34:14
¿Qué más añadimos? Los DNTPs, la mezcla de los cuatro DNTPs, adeninas, nucleótidos de adenina, citosina, timina y guanina, la mezcla. Y además, y esto es lo importante, en cada tubo vamos a poner un dideoxi diferente. 00:34:28
En el tubo 1 ponemos el dideoxi pero de adenina, solo el de adenina. En el segundo, el de timina. En el tercero, el de citosina. Y en el cuarto, el de guanina. 00:34:46
Por tanto, si os dais cuenta, en los cuatro tubos que he preparado, insisto, en cada uno hay que añadir también el báfer, el cloruro de magnesio, pero no lo pongo aquí. En lo único que se diferencian los cuatro tubos es en el dideoxinucleótido que voy a utilizar. 00:35:00
¿De acuerdo? Muy bien. ¿Qué consigo con esto? Pues fijaos, si yo tengo aquí el DNA de partida y yo este fragmento aquí en rojo es el que quiero secuenciar, he diseñado un cebador que va a estar en 5'. 00:35:17
Claro, si yo quiero secuenciar 5' a 3', este cebador que está en 5' a 3' hibrida aquí. Por tanto, la síntesis va a ir en este sentido, hacia allá, hacia la izquierda. 00:35:33
¿De acuerdo? Esto me parece que es obvio y lo conocemos. 00:35:45
Aquí tenemos, después de realizar las reacciones de polimerización en cada uno de los tubos, ¿qué es lo que va a ocurrir? 00:35:50
Pues a partir del primer, la polimerasa va a ir extendiendo, va a ir extendiendo, aquí va a ir metiendo los DNTPs, 00:35:57
Como hemos metido el dideóxido de adenina, pues va a ir metiendo nucleótidos complementarios, 00:36:05
aunque hasta que llega un momento que por casualidad mete un dideóxido. 00:36:11
Cuando mete un dideóxido, la síntesis finaliza. 00:36:16
Por tanto, este fragmento llega hasta aquí. 00:36:21
Otro fragmento, pues puede ser que cuando toque introducir la adenina, 00:36:25
meta un dNTP de adenina normal, continúa la síntesis, 00:36:29
hasta que da la casualidad que mete un di de óxido de adenina, plum, para la síntesis. 00:36:33
Y aquí lo mismo, ¿de acuerdo? 00:36:39
Esta es una secuencia muy cortita y lo han hecho para que en cada tubo se generen tres, 00:36:41
está diseñada a posta para que en cada tubo se generen tres fragmentos, ¿de acuerdo? 00:36:46
Si la secuencia es mucho más larga, 200 pares de base, bueno, pues imaginaos, 00:36:51
en cada tubo vamos a tener una colección de fragmentos que cumplen dos características. 00:36:55
Una, todos estos fragmentos, acordaos, en 5' está fosforilado radioactivamente, por tanto, todos ellos en 5' están marcados radioactivamente y en este tubo todos acaban por adenina. 00:37:02
En el segundo tubo todos están marcados y todos los fragmentos de diferentes tamaños acaban en citosina, aquí en guanina y aquí en tina. 00:37:16
¿De acuerdo? Muy bien, ya hemos llevado a cabo las reacciones de polimerización y hemos conseguido en cada uno de los tubos un pool de fragmentos de diferente tamaño 00:37:25
que todos acaban en el mismo tipo de base nitrógena. Muy bien, ¿qué es lo que hacemos ahora? Igual que en el método anterior vamos a hacer una electroforesis 00:37:39
pero en este caso también es de poliaquilamida de alta resolución 00:37:50
por tanto podemos llegar a diferenciar dos fragmentos 00:37:55
cuyo tamaño es diferente en un nucleótido 00:37:58
que se diferencian en un nucleótido 00:38:03
pero antes vamos a desnaturalizar 00:38:05
por tanto desnaturalizamos todo el denero 00:38:09
en condiciones desnaturalizantes vamos a realizar el gel de poliaquilamida 00:38:11
y la electroforesis de alta resolución 00:38:16
De tal manera que lo que vamos a hacer después de la electroforesis es hacer la autoradiografía que vamos a obtener un patrón de bandas y analizar ese patrón de bandas. ¿Cuál es la gran diferencia entre este gel de electroforesis y la secuencia que obtenemos y el método anterior? 00:38:19
Que nuevamente obtenemos una secuencia escalonada hacia arriba 00:38:36
La vamos a leer de abajo a arriba 00:38:40
Pero es la secuencia reversa y complementaria 00:38:42
¿De acuerdo? 00:38:46
Volvemos atrás 00:38:48
Yo la secuencia que quiero es esta 00:38:49
Pero los fragmentos que están marcados son reversos 00:38:51
Porque van de aquí a aquí 00:38:57
Y además son el complementario 00:38:58
¿De acuerdo? 00:39:00
Por tanto, la secuencia que yo voy a obtener en el gel de electroforesis es la secuencia reversa y complementaria de la que yo estoy secuenciando, ¿de acuerdo? 00:39:01
Entonces, esto es lo que hemos realizado aquí. Una vez ya hemos hecho las reacciones de polimerización, lo que hacemos es nuevamente nuestro gel de electroforesis 00:39:14
y en cada uno de los carriles, en cuatro carriles diferentes, lo que vamos a hacer va a ser correr el contenido de cada tubo, ¿sí? 00:39:22
dependiendo del tamaño pues migrarán cuanto más migren es que son fragmentos más pequeños aquí 00:39:30
el que más migra es este de aquí este fragmento de aquí es el más pequeño de todos porque contiene 00:39:37
solamente el primer y una timina pues este es el que encontramos aquí entonces una vez obtengo aquí 00:39:43
mi patrón de bandas nuevamente hago lo mismo 5 prima 3 prima vamos a irla leyendo pero en este 00:39:49
caso, la banda que obtengo ya me dice directamente cuál es el nucleótido. Timina, timina, citosina, 00:39:57
guanina, guanina, adenina, guanina, citosina, timina, citosina, adenina, adenina. ¿De acuerdo? 00:40:05
Pero esta secuencia que acabo de obtener es una secuencia que está 5'-3', pero no es la que yo 00:40:12
quiero, la secuencia que yo quiero para obtenerla tengo que hacer la complementaria reversa, si aquí 00:40:20
tenía 5 prima, 3 prima, ahora aquí abajo voy a tener 3 prima y 5 prima y tengo que hacer la 00:40:27
complementaria, timina, timina, guanina, adenina, guanina, citosina, timina, citosina, citosina, 00:40:32
guanina, adenina, adenina, si os dais cuenta esta secuencia es la que yo quería secuenciar y que 00:40:39
tengo. ¿De acuerdo? Bueno, es un método diferente, partimos de cantidades mucho menores de DNA, no 00:40:46
necesitamos mucha cantidad de DNA, vamos a amplificar, vamos a utilizar la polimerasa, por 00:40:56
tanto necesitamos un primer, necesitamos una mezcla de reacción en la cual vamos a poner los 00:41:02
DNTPs y dideoxis, ¿de acuerdo? Que son nucleótidos que tienen la pentosa modificada y que actúan como 00:41:07
terminadores de síntesis, acaban las síntesis, ¿de acuerdo? 00:41:14
Bien, pues así hemos visto ya los métodos manuales, el método 00:41:19
químico y el método enzimático, Max-San y Gilbert y el método de Sanger 00:41:23
¿de acuerdo? Este es un ejemplo de un gel, este Sanger 00:41:26
con un macro gel de los que él corría, fijaos que aquí 00:41:33
cada uno de estos son conjuntos de cuatro carriles 00:41:36
cuatro carriles, cuatro carriles, cuatro, cuatro, cuatro, ¿de acuerdo? De tal manera que aquí tienen 00:41:40
un gel, fijaos que 00:41:45
tamaño tienen estos gels 00:41:46
de poliacrilamida, hay que correrlos 00:41:49
muchísimo tiempo 00:41:50
porque tienen una capacidad 00:41:52
de resolución elevadísima, ¿de acuerdo? 00:41:54
Aquí lo que ha corrido en cada grupo 00:41:57
de cuatro carriles son secuencias diferentes 00:41:58
¿de acuerdo? Y luego lo único que tenía que hacer 00:42:00
era ir hacia arriba, ¿no? 00:42:03
Lo leemos hacia arriba, aquí tendríamos la secuencia 00:42:04
de mina, de mina, guanina, quimina 00:42:06
hacia arriba, ¿de acuerdo? 00:42:08
Aquí os propongo 00:42:11
un ejercicio 00:42:12
imaginaos que esta es la secuencia 00:42:13
un ejercicio práctico 00:42:17
esta es la secuencia que yo quiero secuenciar 00:42:18
os la doy en 5'3' 00:42:21
es sencillo 00:42:24
yo os pido, oye, ¿me puedes dibujar 00:42:26
el patrón de bandas 00:42:29
de electroforesis que obtendrías 00:42:31
si esta 00:42:32
secuencia 00:42:34
las secuencias 00:42:35
por el método 00:42:39
químico de Max and Gilbert 00:42:41
o por el método de sangre? 00:42:42
¿Cuál sería el patrón de bandas 00:42:44
por el método de Max-Hann y Gilbert que saldría? 00:42:46
¿Y cuál sería el patrón de bandas 00:42:50
por el método enzimático de sangre? 00:42:52
¿De acuerdo? 00:42:55
Este es un ejercicio práctico que yo os propongo. 00:42:56
Lo podéis hacer y ya lo corregimos. 00:42:58
Luego lo corregiremos en clase. 00:43:00
¿De acuerdo? 00:43:03
Pues nada, con esto acabamos la primera parte 00:43:04
de la explicación del tema de secuenciación 00:43:06
de ácidos nucleicos. 00:43:10
Y ya con esta base, estos fundamentos, estamos preparados para poder entender ya los métodos automáticos que son los que se utilizan en los laboratorios actuales. ¿De acuerdo? Pues venga. 00:43:11
Idioma/s:
es
Autor/es:
Pedro Melgar-Rojas
Subido por:
Pedro M.
Licencia:
Todos los derechos reservados
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Fecha:
21 de febrero de 2024 - 12:11
Visibilidad:
Clave
Centro:
IES BENJAMIN RUA
Duración:
43′ 24″
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1.78:1
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Tamaño:
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