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Tseparacion - Contenido educativo

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Subido el 24 de abril de 2024 por María Jose De L.

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Muy bien, ya hemos terminado con las técnicas espectroscópicas y pasamos al nuevo tema. 00:00:01
Este tema también se va a dividir en dos temas a su vez. 00:00:08
En tres técnicas de separación tendríamos dos tipos, que serían la cromatografía y la electroforesis. 00:00:13
La cromatografía, como he dicho, es una técnica de separación. 00:00:19
Por tanto, lo primero que tenemos que tener en cuenta es que si vamos a separar, 00:00:23
tenemos que tener al menos dos componentes, porque si no, no tenemos nada que separar. 00:00:27
Es decir, no tiene sentido hacer una cromatografía a una sustancia pura, que tenga un único componente. 00:00:31
Lo que digo, no separaríamos nada, saldría todo junto. 00:00:38
Al igual que al principio del módulo, hacíamos una comparación entre el análisis químico clásico y el análisis instrumental, 00:00:42
pues aquí vamos a comparar un poquito con las técnicas de separación clásicas, con la cromatografía. 00:00:50
Creo que en el módulo de muestreo habéis trabajado, si no lo habéis hecho ya, pues lo haréis, los que todavía no habéis tenido un muestreo, con diferentes técnicas de separación. 00:00:55
Entre esas, pues habéis visto, por ejemplo, la decantación, la filtración, la sedimentación, la extracción, el sol, que la habéis estado haciendo estos días en práctica, los que estáis este año, las otras técnicas, pues la evaporación, hay un montón más. 00:01:06
Bueno, pues a esa lista vamos a añadir la cromatografía 00:01:23
Pero antes de seguir, pues vamos a comparar 00:01:27
¿Qué es lo que hace a la cromatografía tan especial? 00:01:31
¿Por qué no la habéis visto con las técnicas de análisis clásico y la vemos este año con el instrumental? 00:01:36
Bueno, pues la cromatografía nos va a permitir separar componentes que estén íntimamente ligados 00:01:41
Es decir, que no podamos separarlos mediante los métodos convencionales 00:01:46
Como por ejemplo puede ser una mezcla de aminoácidos 00:01:50
En el grupo de técnicas de separación, también lo que os decía, que incluimos la electroforesis, que está en el siguiente tema y también lo habéis visto más detallado en biotecnología. 00:01:53
Pero, ahora, digo yo, si de momento los análisis nos están saliendo bien, lo que hemos estado 00:02:09
haciendo mediante pH, conductividad, las técnicas de análisis químico que habéis visto de 00:02:19
las valoraciones, si están saliendo bien, ¿por qué queremos separar los componentes? 00:02:24
¿Para qué lo hacemos? 00:02:29
¿Merece la pena o es una pérdida de tiempo o qué? 00:02:30
Pues para empezar, no tendremos que ver la cromatografía como un suplemento o una forma 00:02:35
de mejora de otras técnicas, aunque sí es verdad que en muchas ocasiones sí se utiliza 00:02:43
como una técnica híbrida junto a otras técnicas, como por ejemplo la espectroscopía de masas. 00:02:48
Pero la cromatografía es una técnica que es totalmente independiente y que va a aportar 00:02:54
muchísima información. 00:02:58
Pero bueno, vuelvo a la pregunta que estábamos diciendo antes. 00:03:02
¿Qué objetivo buscamos con la cromatografía? 00:03:06
Pues veréis, cuando nosotros estamos aislando un componente y usamos una técnica complementaria a la cromatografía, 00:03:09
pues vamos a obtener una mejor selectividad, ya que no tenemos ningún tipo de interferente. 00:03:17
Recordad que la selectividad estaba relacionada con la especificidad, 00:03:22
con que la técnica o el método aplicado 00:03:26
determine únicamente al analito de interés. 00:03:29
Eso lo vamos a conseguir al separar los componentes mediante la cromatografía. 00:03:33
Además de la selectividad, 00:03:39
también vamos a conseguir mejorar la sensibilidad. 00:03:42
Si nosotros aislamos un componente y lo transferimos a un menor volumen 00:03:45
de disolvente, va a quedar como más concentrado. 00:03:50
Entonces, estamos haciendo una preconcentración, por decirlo así de una manera. 00:03:56
Entonces, de esta manera estamos consiguiendo, a partir de una cantidad pequeña de analito, 00:04:01
una concentración que nos va a dar señales en las que nos vamos a manejar bastante bien. 00:04:06
Y ahora, con todo esto, utilizar la cromatografía junto con otras técnicas, 00:04:14
En muchos casos se pueden acoplar detectores a las técnicas cromatográficas, se le ponen detectores y así además de separar los componentes y obtener información cualitativa, pues nos estamos identificando, no con el detector y también podemos obtener información cuantitativa para contabilizar a estos componentes que hemos separado. 00:04:20
Según la IUPAC, la cromatografía es un método usado principalmente para la separación de 00:04:44
los componentes de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos 00:04:53
fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es móvil, es decir, 00:04:59
la muestra se va a poner en una fase móvil, que puede ser un gas, un líquido o un fluido 00:05:07
supercrítico. Esta fase móvil se va desplazando sobre una fase estacionaria, que suele ser 00:05:13
un sólido o un líquido ligado a un sólido. Hemos dicho que la fase móvil que lleva la 00:05:21
muestra se desplaza por una fase estacional. En este momento es cuando se produce la separación, 00:05:29
ya que los componentes se van quedando retenidos en la fase estacionaria, unos más que otros. 00:05:36
Es como si hubiera una competencia entre fase móvil y fase estacionaria por el o los analitos. 00:05:42
En el ejemplo que veis aquí en la diapositiva, vemos una mezcla de tres componentes, 00:05:49
que eran uno rojo, uno verde y uno azul. 00:05:56
Ahí está hablando de la fase estacionaria, de por dónde va a ir la fase móvil, 00:06:01
y vemos ahí que al principio están todos juntos, y veis todos los colores que se ven bien. 00:06:06
entran todos juntos, se ve como una pelota ahí como mini partículas de muchos colores 00:06:11
y según avanza la cromatografía pues vemos como esas mini partículas se van organizando 00:06:16
y separando por colores, es ahí que ya van, se van viendo como están separados 00:06:22
el azul coge ventaja, el rojo parece que está entero pero se mezcla un poquito con el verde 00:06:29
entonces esos colores van avanzando a una velocidad diferente 00:06:33
primero van los azules 00:06:36
luego van los rojos 00:06:39
que parece que ya se están ahí 00:06:40
casi separando del todo 00:06:43
y luego por último estarían los verdes 00:06:44
que ya salen los últimos 00:06:47
y están separaditos 00:06:49
ahí ya por ejemplo cuando va a salir, sale el rojo solo 00:06:50
no tiene nada de vejez con el verde 00:06:52
y por último saldría el verde 00:06:54
habéis visto arriba 00:06:56
que sale aquí 00:06:59
una vez que ha salido 00:07:00
un color pues se ha hecho 00:07:01
un pico, ha salido un gráfico 00:07:04
que es con un pico. Ahora, vamos a hablar un poco bien. En vez de llamarlo pelota, mini 00:07:06
partículas, colores, colorichis o lo que sea, pues vamos a llamar a cada cosa por su 00:07:14
nombre. Por un lado tendremos el eluyente. El eluyente es la disolución que entra en 00:07:18
la columna. Al atravesar la columna es donde se produce el proceso de desaparición, ya 00:07:26
que los componentes se van quedando retenidos de forma diferente a la fase estacionaria. 00:07:32
que es lo que pasaba con lo de antes de los colores 00:07:35
y al final 00:07:38
van a conseguir salir por el extremo de la columna 00:07:39
en este caso que estamos 00:07:42
con una columna 00:07:43
a esta disolución que ha salido 00:07:45
es a lo que se llama 00:07:48
el huato 00:07:49
y todo el proceso es la 00:07:51
elusión, pero 00:07:54
ahora te digo yo 00:07:55
hemos dicho que hay 00:07:57
una competencia 00:08:00
entre una fase móvil 00:08:01
y una fase estacionaria 00:08:04
Pero esta competencia, esta retención, ¿por qué se produce? ¿En qué nos basamos? ¿Qué va a ser? 00:08:05
Pues esto va a depender de parámetros como son la solubilidad, la absorción, la volatilidad, el tamaño de las partículas, la carga, todo lo que sea de los diferentes amiguitos. 00:08:10
Entonces, el principio de separación junto con la fase móvil y la fase estacionaria utilizada nos van a permitir hacer varias clasificaciones. 00:08:27
En los apuntes he puesto un enlace a una tabla que he hecho yo por si no os gusta la que hay en los propios apuntes. 00:08:40
Pero bueno, que dentro de los apuntes hay también tabletas. 00:08:47
Eso ya como venga mejor. 00:08:52
Las separaciones que vamos a hacer o las clasificaciones que vamos a hacer 00:08:54
las podemos hacer en base a varias cosas 00:08:59
Lo primero, lo haríamos en base al estado de la fase móvil 00:09:02
Si la fase móvil es un líquido, se habla de cromatografía de líquidos 00:09:07
En estos casos, la fase estacionaria suele ser o bien un sólido 00:09:12
o un sólido recubierto por un líquido 00:09:15
que no es visible con la fase móvil 00:09:18
Un ejemplo de cromatografía de líquidos, el HPLF, que igual es el que más os puede sonar, o el que más tenéis ganas de hacer. 00:09:21
Luego, si la fase móvil es un gas, pues se llama cromatografía de gases, y la fase estacionaria, pues como antes, o un sólido o un sólido recubierto por un líquido. 00:09:31
Aquí destacar que para que la fase móvil no sirva cualquier gas, tiene que ser un gas inerte. 00:09:41
Y luego, si la fase móvil no usamos ni líquido ni gas, sino que usamos un fluido supercrítico, pues cromatografía de fluidos supercríticos. 00:09:49
Aquí la fase estacionaria, pues o un sólido o un líquido. 00:09:59
Pero bueno, como veis, con los nombres tampoco se han conflictado mucho. 00:10:03
Ahora, otra opción que tenemos, o otro tipo de clasificación que se hace, es según cómo se encuentra la fase estacionaria. 00:10:07
esta va a ser la cromatografía en columna 00:10:15
en la que la fase estacionaria está dentro de un tubo 00:10:20
por el que se hace pasar la fase móvil 00:10:23
de hecho la cromatografía cuando se descubrió 00:10:24
fue por eso, porque se quisieron separar 00:10:28
los pigmentos vegetales y se hizo pasar 00:10:32
la mezcla de los pigmentos a través de una columna 00:10:34
y se vio que se iban separando, entonces fue la primera que se hizo 00:10:38
y luego puede ser otra 00:10:41
que es la cromatografía en capa fina, ¿vale? 00:10:43
En este tipo la fase móvil es líquida y se desplaza por la fase estacionaria por capilaridad, ¿vale? 00:10:46
Así va a ser el movimiento. 00:10:54
De este tipo tendríamos dos tipos o dos partes de cromatografía en capa fina, 00:10:56
que sería la capa fina llamada así, que es esta que tenéis aquí en el dibujo, 00:11:02
o la cromatografía en papel, ¿vale? 00:11:08
Que también se mete dentro de la capa fina, ¿vale? 00:11:09
el TLC es por 00:11:12
cromatografía de capa fina en inglés. 00:11:14
Por último, pues vamos a hacer una 00:11:16
clasificación en función del principio 00:11:18
de separación, de por qué se produce 00:11:20
esta separación o esta competencia. 00:11:22
Aquí vamos a tener 00:11:25
la primera, la cromatografía 00:11:25
de absorción, ¿vale? Repito, 00:11:28
absorción con D. 00:11:30
Aquí la fase estacionaria es sólida 00:11:32
y la fase móvil, pues suele ser 00:11:34
generalmente líquida o aseosa. 00:11:35
En este caso, 00:11:38
las sustancias del analito de interés 00:11:40
quedan absorbidas en la superficie de las partículas sólidas de la fase estacionaria. 00:11:41
Y esto es por fuerzas de Van der Waals. 00:11:48
Luego tendríamos la cromatografía de reparto, 00:11:53
que la fase estacionaria es un líquido retenido sobre un soporte sólido 00:11:57
y la fase móvil es líquida o gaseosa. 00:12:01
El reparto se va a producir entre las dos fases. 00:12:05
Luego tenemos la cromatografía de intercambio iónico 00:12:09
Este tipo de cromatografía se va a basar en la unión de aniones o cationes a la fase estacionaria 00:12:14
La fase estacionaria es sólida, de forma que se va a coger una carga neta 00:12:23
Este tipo de unión es una unión covalente 00:12:30
Es decir, la fase estacionaria está cargada 00:12:32
los iones de la muestra también 00:12:36
pero de una carga opuesta a la fase estacionaria 00:12:38
por lo que son atraídos 00:12:40
por fuerzas electrostáticas 00:12:42
la fase móvil es líquida 00:12:43
y ahora digo yo 00:12:46
el analito 00:12:48
es atraído por la fase estacionaria 00:12:50
si están todos cargados 00:12:52
¿cómo vamos a separarlos? 00:12:54
en la fase estacionaria, ¿vale? 00:12:56
porque si van a quedarse ahí retenidos y no van a salir 00:12:57
y se quedan todos igual, ¿qué hacemos? 00:13:00
bueno, pues 00:13:03
no nos interriemos de si se separan 00:13:03
o no, o no sé qué sé 00:13:06
¿cómo separamos? 00:13:08
pues la separación 00:13:10
va a depender de la fuerza de atracción 00:13:12
que hay entre el analito 00:13:14
y la fase estacionaria, estas fuerzas electrostáticas 00:13:16
que estamos diciendo 00:13:18
lo que se suele hacer para separarlos 00:13:19
de la fase estacionaria, cuando quedan muy muy 00:13:22
retenidos y no conseguimos que avancen 00:13:24
para separarlos de la fase estacionaria 00:13:26
lo que hacemos es cambiar la fase 00:13:28
móvil 00:13:30
para formar una fase móvil que tenga una mayor atracción 00:13:31
y compita más por el analito que la fase estacionaria. 00:13:37
En general, si el analito es negativo, 00:13:41
la fase estacionaria tendría que ser positiva, 00:13:44
pues la fase móvil sería mucho más positiva 00:13:47
para que atraiga mucho más al analito. 00:13:49
Otro tipo serían las cromatografías de afinidad. 00:13:51
Esta, para compararlo, no sé si os suena el modelo de llave cerradura. 00:13:54
no todas las llaves abren todas las puertas 00:13:59
cada una tiene unos dientes, unas moscas 00:14:03
que se van a corresponder con la cerradura de la puerta que tienen que abrir 00:14:05
pues aquí pasa igual 00:14:08
vamos a intentar que haya una interacción muy específica 00:14:09
entre un tipo de moléculas de la muestra y la fase estacional 00:14:13
entonces se van a quedar retenidas solamente 00:14:16
un tipo de sustancias que nos interesen a nosotros 00:14:18
y por último la cromatografía de exclusión molecular 00:14:22
Este tipo de cromatografía se trata de una cromatografía de separación por tamaño 00:14:26
No hay una interacción o no buscamos una interacción entre la fase estacionaria y la muestra 00:14:31
La fase estacionaria al final va a actuar como un tamiz por el que se desplaza la fase móvil 00:14:37
La fase móvil pues sí, o líquida o gaseosa 00:14:42
Pero la fase móvil pues lleva los componentes que va a separar 00:14:45
Tiene que atravesar la fase estacionaria que es como un tamiz y ahí es donde se produce la separación 00:14:50
Por ejemplo, en un tamiz, ¿vale? Que también lo habéis visto en muestre. ¿Qué va a pasar? Pues lo que ocurre es que poco a poco vais disminuyendo el poro, vais disminuyendo el... o sea, en el último tamiz es el luz de malla más pequeño, ¿vale? El ciego no, el otro. Es el luz de malla más pequeño. 00:14:54
Entonces aquí cada vez vamos dejando pasar partículas más pequeñas 00:15:14
Las grandes se quedan arriba y cada vez vamos con partículas más pequeñas 00:15:18
¿Vale? 00:15:22
Entonces aquí va a ser algo parecido pero al revés 00:15:24
La fase estacionaria, pues lo digo, es como si fuera, no sé, imaginaros como si fuera un gel 00:15:27
¿Vale? 00:15:32
En este gel tiene poros 00:15:33
¿Vale? 00:15:35
Pero los poros son muy, muy, muy chiquititos 00:15:36
¿Vale? 00:15:38
Son muy pequeños 00:15:38
Y no va a dejar que pasen por ahí pues moléculas que sean más grandes que el poro del gel 00:15:39
las moléculas que son más grandes 00:15:43
pues son eluidas por la fase móvil 00:15:45
y salen las primeras 00:15:47
y las pequeñas pues van penetrando 00:15:49
por dichos poros 00:15:52
entonces se van como entreteniendo 00:15:53
y tienen un recorrido más largo 00:15:55
para poder salir, por eso se recargan más 00:15:57
y saldrían las últimas 00:15:59
vale, sale todo, no es como en el 00:16:01
camis que he dicho de muestreo 00:16:03
que se va quedando arriba 00:16:04
lo más grande y abajo lo más pequeño 00:16:06
aquí saldría todo, pero a diferente tiempo 00:16:09
pues primero salen las grandes 00:16:11
que bajan por los huecos grandes que hay 00:16:13
y luego saldrían las pequeñas 00:16:15
que se van metiendo por todos los poros 00:16:17
de la fase estacionaria que tienen 00:16:18
por eso tardan más tiempo 00:16:20
pero ahora, todo eso del reparto que he dicho yo 00:16:22
¿qué es? 00:16:25
también en muestreo habéis visto algo 00:16:26
voy a irme con el ejemplo 00:16:28
de los apuntes 00:16:31
para seguirlo un poco y que quede claro 00:16:32
vamos a imaginar 00:16:34
que ponemos en un vaso 00:16:36
agua con hexano 00:16:38
Estos dos son inestibles, por lo tanto, se van a formar dos fases 00:16:40
Y las dos fases se van a distribuir en función de la densidad de cada uno 00:16:45
El hexano, que es menos denso, se va a quedar arriba y el agua se va a quedar abajo 00:16:50
Ahora, a esta mezcla que tenemos vamos a añadir una tercera cosa 00:16:55
Vamos a añadirle acetona 00:16:59
Pues ahí tendríamos que ver cómo se distribuye cuando añadimos el acetona 00:17:01
Se va a formar una tercera fase, se va a disolver el acetona en el agua 00:17:05
se va a disolver en el exano. ¿Qué hacemos? ¿Vale? ¿O qué pasa 00:17:10
como lo vemos nosotros? Pues debido a las características de la cetona 00:17:14
esta puede estar distribuida en las dos fases, ¿vale? 00:17:18
Puede disolverse tanto en el agua como en el exano. Pero 00:17:22
aquí viene la cosa, ¿vale? Que no va a estar en la misma concentración, no 00:17:25
se va a repartir igual en el agua con el exano, ¿vale? Va a tener 00:17:30
más ganas de irse con uno que con otro. Entonces aquí es donde definimos 00:17:34
el coeficiente de reparto, ¿vale? 00:17:37
Que es la relación entre la concentración de acetona en cada una de las fases. 00:17:40
¿Vale? 00:17:46
Entonces ya quedaría la mezcla, es que si conseguiríamos, un poco se vería a lo mejor 00:17:46
alguna fase por ahí, pero bueno, con la acetona se consigue bastante. 00:17:50
En cromatografía, pues pasa algo parecido, pero en vez de llamarlo coeficiente de reparto, 00:17:55
se va a llamar coeficiente de distribución, ¿vale? 00:17:59
y pues igual, es la relación que hay entre la concentración de una muestra 00:18:02
entre la fase estacionaria y la concentración que hay en la fase móvil 00:18:07
y esto es lo que nos va a ayudar a separar 00:18:12
cuando hablamos de cromatografía de reparto, se basa esto al reparto que hay 00:18:14
en los componentes de una muestra, ya que estos se van a disolver 00:18:19
mejor en la fase móvil o en la fase estacionaria 00:18:23
aquellos que se vayan a disolver mejor en la fase móvil 00:18:27
irán arrastrados por esta 00:18:31
y los que estén más 00:18:34
o mejor en la fase 00:18:36
estacionaria van a quedar retenidos 00:18:38
y les va a costar más desplazarse y salir 00:18:40
de la fase estacionaria 00:18:42
de donde estén, sea una columna, una placa 00:18:44
o lo que sea 00:18:46
ya sabemos separar los componentes 00:18:47
pero hemos dicho 00:18:50
que la técnica la da información 00:18:52
cualitativa e información 00:18:53
cuantitativa, pues vamos a ver 00:18:56
que sacamos nosotros de ahí, como lo interpretamos 00:18:58
todo eso, igual que las técnicas espectroscópicas 00:19:00
hemos obtenido un espectro, aquí vamos a tener un gráfico 00:19:04
un diagrama que se va a llamar cromatograma 00:19:08
el aspecto que tiene, parecido a cuando hacíamos el barrido 00:19:12
en espectroscopía de ultravioleta visible, es como una campana de Gauss 00:19:16
más o menos, pero no tiene el mismo significado 00:19:20
sino que cada cosa va a ser un parámetro diferente 00:19:23
En cromatografía, en el eje de X vamos a poner el tiempo 00:19:28
Y luego tenemos el eje que nos va a dar información sobre la altura del pico 00:19:35
La altura del pico va en el eje D 00:19:43
Y es la forma con la que vamos a poder trabajar 00:19:46
Con anchuras y con alturas de pico 00:19:51
Hay cosas que podamos ver 00:19:53
Pues primero, la línea de base, ¿vale? Esto va a corresponder a la fase móvil. 00:19:56
Es como una línea recta que aparece entre los picos, ¿vale? Es como la señal que da la fase móvil. 00:20:02
Luego tendríamos la altura del pico, ¿vale? La altura del pico es la distancia que hay entre la, o la altura que hay entre la cima del pico y la línea de base. 00:20:10
Y aquí pues ya va a depender un poco de la forma que tenga el cromatograma o de la forma que tenga el pico 00:20:21
¿Vale? Si tiene un vértice redondeado así como si fuera una montanita 00:20:29
Pues la altura de la cima va a quedar determinada por el punto de corte de las dos rectas tangentes 00:20:33
¿Vale? A los puntos de inflación de las laderas 00:20:40
¿Vale? Que es lo que sale aquí en esta de aquí 00:20:43
¿Vale? Es donde sería la altura del pico 00:20:46
No podemos determinar esta, porque qué punto coges este o este, pues lo que se intenta es hacer un triángulo. 00:20:48
Entonces hacemos una tangente aquí, una tangente por aquí y donde se cruce es lo que cogemos como altura del pico. 00:20:56
La anchura del pico es la distancia ahí que hay entre los dos cortes de las laderas con la línea base. 00:21:04
¿Veis? Aquí no hacemos una extrapolación a las tangentes 00:21:14
¿Vale? Para la anchura del pico nos quedamos con donde corta 00:21:18
¿Vale? Tampoco es como en el barrido 00:21:22
Que no llegaba a cortar nunca 00:21:23
Aquí sí, sí corta 00:21:25
Tenemos la línea de base 00:21:27
Luego sube, baja y vuelve a la línea de base 00:21:28
¿Vale? Unas veces mejor, otras veces con más deriva 00:21:30
O con algún hombro puede salir 00:21:34
Pero siempre va a volver abajo 00:21:36
Otro de los parámetros tendríamos la anchura del pico en la semialtura, aquí es la distancia 00:21:38
que hay entre las dos laderas a la mitad de la altura del pico, la altura recordar que 00:21:48
es hasta arriba del todo, no hasta la cima de la montaña sino hasta que se cruza y las 00:21:55
anchuras todo como hemos puesto tiempo se expresa en unidades de tiempo, tanto la anchura 00:22:02
como la anchura en semi altura son las dos unidades de tiempo 00:22:06
y luego tendríamos lo que es el área 00:22:10
calculamos el área del pico 00:22:14
entonces sería lo que hay entre el pico y la prolongación de la línea 00:22:17
de base, entonces sería la zona de color que hay aquí 00:22:22
en la figura, intentamos calcular el área esa y 00:22:25
al final el área es lo que vamos a utilizar nosotros 00:22:30
como señal. Igual que en espectroscopía nuestra señal era la absorbancia 00:22:34
o en técnicas electroquímicas nuestra señal era el potencial 00:22:38
o la conductividad, aquí nuestra señal o la señal 00:22:41
que íbamos a utilizar nosotros para trabajar con el tratamiento de datos 00:22:46
son las áreas. Las áreas nos van a determinar o nos van a dejar 00:22:50
determinar el porcentaje de cada uno de los componentes 00:22:54
en una mezcla inductable. Lo que sí es que 00:22:58
cuando tengamos varios componentes 00:23:02
en el cromatograma no nos va a salir solamente 00:23:04
un pico, sino que nos van a salir varios 00:23:06
picos y cada uno de los picos 00:23:08
va a corresponder con un componente 00:23:10
ahí sí es donde veríamos la separación 00:23:12
¿vale? que es lo que pasaba 00:23:14
en esta de aquí 00:23:16
a ver si sale otra vez 00:23:18
¿vale? en esta 00:23:20
de aquí, yo antes os he dicho 00:23:22
que se iban separando 00:23:24
y me aburrían los colores 00:23:26
y que cada vez que salía un color 00:23:27
por un extremo de aquí, pues se iba a ver un pico diferente, se iba a ver el cromatograma. 00:23:30
Como aquí teníamos tres colores, que eran el rojo, el verde y el azul, pues tendríamos 00:23:38
tres picos. 00:23:43
Lo que sí que decía que los picos no salen siempre bonitos y perfectos, sino que puede 00:23:44
que salgan con algún hombro, que salgan con deriva, que salgan más anchos por un lado 00:23:53
que por otro, son irregulares normalmente. Hasta el momento, pues si hemos estado hablando 00:23:58
de que los analitos quedan retenidos o no en la fase estacionaria, pero imaginad que 00:24:05
estamos en una cromatografía de columna, como la que he puesto yo ahí. Cuando nos 00:24:13
referimos al tiempo, estamos hablando del tiempo que tarda el analito en recorrer una 00:24:18
desde que entra por la columna desde que entra por aquí lo que tarda en recorrer todo esto de 00:24:22
aquí hasta que sale aquí ya saldría y se mediría el tiempo que ha tardado y es la anchura de la que 00:24:32
estamos hablando de los parámetros de antes desde la entrada a la salida si es un analito que por 00:24:40
ejemplo no queda retenido nada, pues tardará poco tiempo. Si es un analito que sí tarda, 00:24:46
y es un analito que queda retenido, pues tardará más. Y entonces ese es el tiempo al que nos 00:24:53
referimos, es el que nos va a dar la información tanto cualitativa, porque el tiempo sí es propio 00:25:00
de cada sustancia, en unas condiciones determinadas, eso sí. Pero bueno, luego nosotros podemos comparar 00:25:06
En base a los tiempos que han tardado en salir 00:25:12
¿Vale? 00:25:14
La fase móvil, por ejemplo 00:25:16
Hemos dicho que la fase móvil va a desplazar 00:25:17
Va a llevar los componentes de la muestra 00:25:19
Los anonitos 00:25:22
Y también va a atravesar la columna 00:25:22
La fase móvil no debería quedar retenida 00:25:24
La cual entra, va a salir 00:25:27
¿Vale? 00:25:29
Pero bueno, sí 00:25:29
Tarda un tiempo en recorrer la columna 00:25:30
¿Vale? 00:25:34
Tiene que pasar por aquí 00:25:34
Se tiene que atravesar todo esto 00:25:35
Entonces, bueno 00:25:37
Aunque sea un segundo, dos segundos 00:25:37
O lo que queráis 00:25:39
Tarda en hacerlo 00:25:39
¿Vale? 00:25:42
Y eso se la va a llamar tiempo muerto. 00:25:42
El tiempo muerto o el volumen muerto. 00:25:45
Bueno, como generalmente hablamos de tiempos o nos vamos a manejar con tiempos, 00:25:48
pues tiempo muerto. 00:25:52
Ahora, ¿qué pasa? 00:25:54
Si un analito queda retenido, ¿vale? 00:25:55
Pues va a salir más tarde. 00:25:58
Si no queda retenido, pues saldrá a la fase móvil, ¿no? 00:26:00
Entonces, llamamos tiempo de retención o volumen de retención 00:26:04
al tiempo-volumen necesario para que salga cada analito. 00:26:08
Ahora, ¿qué pasa si en este tiempo-volumen, 00:26:14
pero qué pasa? 00:26:21
Pues que en este tiempo-volumen también está metida la fase móvil. 00:26:25
Por tanto, no es un tiempo de verdad, por así decirlo. 00:26:30
Es para averiguar cuánto tiempo realmente está retenido el elemento, 00:26:33
debemos restar 00:26:36
al tiempo que ha tardado en salir 00:26:38
el tiempo muerto 00:26:41
que será 00:26:42
el tiempo muerto de la fase móvil 00:26:43
entonces el tiempo de retención 00:26:47
verdadero, por así decirlo 00:26:49
sería el tiempo muerto menos el tiempo de retención 00:26:51
y así sabemos justo cuánto tiempo 00:26:53
ha estado dentro de la columna 00:26:55
es como si quitáramos el recorrido 00:26:56
y luego hay veces 00:26:59
que lo que nos interesa 00:27:03
comparar el tiempo de retención de un analito 00:27:06
con el de la fase inmóvil 00:27:09
¿vale? esto se le va ya 00:27:10
como un tiempo relativo 00:27:11
se le llama factor de capacidad 00:27:13
¿vale? y la relación entre el tiempo 00:27:16
de retención verdadero 00:27:18
¿vale? el rosa, el que hemos hecho ya 00:27:20
la resta y el de la fase 00:27:22
inmóvil 00:27:24
cuanto mayor sea el factor de capacidad 00:27:25
pues mayor será el tiempo de retención del componente 00:27:28
¿vale? tenemos más numerador 00:27:30
porque tenemos más tiempo de retención 00:27:32
pues más alto será 00:27:34
y más medio será el factor de capacidad 00:27:35
también 00:27:38
hemos dicho que el tiempo de retención 00:27:40
de un alito 00:27:43
en unas condiciones 00:27:44
era fijo 00:27:46
en las mismas condiciones 00:27:47
si variamos las condiciones 00:27:49
pues varía el tiempo 00:27:51
entonces el factor de capacidad 00:27:53
si el tiempo de retención 00:27:56
es fijo 00:27:58
es el factor de capacidad 00:28:00
también debería serlo 00:28:01
y ahora 00:28:04
¿qué pasa si esto cambia? 00:28:06
pues eso quiere decir 00:28:08
que están cambiando las condiciones 00:28:10
por lo tanto el factor de capacidad 00:28:11
pues también nos va a orientar un poco sobre el mantenimiento 00:28:14
de la columna por ejemplo 00:28:16
si en lugar de 00:28:17
comparar el tiempo de retención del componente 00:28:20
con la fase móvil 00:28:22
lo comparamos con 00:28:23
un componente 00:28:25
con otro, lo que os decía que en vez del factor 00:28:28
de capacidad se llama el tiempo de retención 00:28:29
relativo, ¿vale? 00:28:31
y sería, lo que sí tiene que ser 00:28:33
mayor a la unidad, ¿vale? entonces el que 00:28:35
tenga mayor tiempo de retención va arriba en el numerador 00:28:37
y el otro va abajo 00:28:40
entonces de momento estamos hablando 00:28:41
de tiempos de retención, ¿vale? 00:28:43
de condiciones de la columna, de condiciones 00:28:45
de la ilusión, pero bueno 00:28:47
también hemos dicho que puede que el 00:28:49
anadito no quede retenido, ¿vale? 00:28:51
y salga por la columna, ¿no? 00:28:53
estábamos diciendo de los primeros que si va por ahí pues no sale 00:28:55
es por lo que 00:28:57
su tiempo de retención sería el tiempo 00:28:59
muerto no tal cual hemos dicho que sale pues tiempo de retención igual a tiempo 00:29:01
muerto y entonces el tiempo de retención en el verdadero verdadero de la resta 00:29:07
sería cero por lo tanto el factor de capacidad también sería cero pero esto 00:29:13
esto porque pasa esto porque puede pasar si hay un hábito que sale a la vez que 00:29:18
la fase móvil quiere decir que no está retenido no hay competencia se va siempre 00:29:23
con la fase móvil no tiene atracción por la fase estacional entonces acompaña 00:29:27
siempre a la fase móvil, por lo que está totalmente disuelta la fase móvil y la fase 00:29:31
estacionaria no quiere saber nada. Si vemos un coeficiente de reparto, no tendríamos 00:29:35
nada en la fase estacionaria. Acordaros que el coeficiente de reparto es la concentración 00:29:44
en una fase y la concentración en la otra. Si en la fase estacionaria no hay nada, concentración 00:29:48
Entonces aquí, pues sí podemos establecer una relación entre el tiempo muerto, el tiempo de retención y el coeficiente de reparto. 00:29:54
Aquí igual, pues en función de cuánto sea el tiempo de retención respecto al tiempo muerto, podemos ir jugando un poco con los diferentes factores de capacidad. 00:30:05
Además del factor de capacidad, ¿vale? del tiempo de retención, pues tenemos otros parámetros, otras propiedades que nos vayan a permitir, pues, ver cómo va la separación. 00:30:14
Si estamos trabajando bien, si no, si hay que cambiar alguna cosa, si podemos mejorarla, ¿vale? 00:30:23
En qué condiciones vamos a trabajar. 00:30:27
El parámetro que vamos a ver ahora en el plato teórico es algo imaginario, ¿vale? 00:30:31
En la vida real de la columna no existe físico, no podemos verlo, ¿vale? 00:30:37
Pero es el que se utiliza a la hora de comercializar las columnas y, bueno, se tiene ahí, ¿vale? 00:30:42
De base por si os toca comprar una columna o cuando llegue una columna, ver las condiciones y trabajarlo, ¿vale? 00:30:49
Entonces, es lo que se llama eso. 00:30:57
O el número de platos o el plato teórico, ¿vale? 00:30:58
Entonces, como es algo imaginario que no es físico, pues venga, vamos a imaginar, ¿vale? 00:31:01
Imaginaros que sacamos el relleno de una columna y vamos a dividir en diferentes secciones. 00:31:06
Vamos a hacer lonchas, ¿vale? 00:31:12
Estas secciones las dividimos en más secciones y estas en más. 00:31:14
Entonces, esto, ¿hasta cuándo? 00:31:18
O sea, ¿cuánto de fina podemos hacer la loncha? 00:31:20
¿Cuánto de fina podemos hacer la sección por la que estamos trabajando? 00:31:22
¿Cuándo paramos? 00:31:25
Entonces, a estas secciones, las más pequeñas que tengamos, es a lo que se llama platos. 00:31:26
Cuanto más platos tengamos, pues más eficaz va a ser la separación. 00:31:31
Pero bueno, también si tenemos más platos, pues necesitaríamos una columna más larga, ¿no? 00:31:36
Porque tenemos muchas secciones ahí, pues necesitaríamos una columna más larga, ¿no? 00:31:41
o va a depender de 00:31:46
como de grande y como de alto es cada plato 00:31:49
cada plato 00:31:51
ese parámetro, la altura del plato 00:31:52
es otra cosa con la que trabajamos 00:31:55
ahí he puesto 00:31:57
la fórmula 00:31:59
porque, una foto de la fórmula 00:32:01
porque creo que a lo mejor en los apuntes 00:32:02
la paréntesis de lo que vuelvo al cuadrado 00:32:04
no se ve muy allá 00:32:07
pero bueno, es la misma 00:32:08
lo que pasa es que la anchura 00:32:09
uno la ha llamado A y otro la ha llamado 00:32:12
la W, pero 00:32:14
para que veáis que el paréntesis engloba toda la fracción 00:32:15
lo que decíamos, que si nosotros queremos aumentar la eficacia de la columna 00:32:20
pues está bien que haya muchos platos, ¿no? o más o menos bien 00:32:25
y bueno, ya ideal que estos sean pequeños, ¿vale? para que cada sección 00:32:28
pues quepan muchos, muchos, muchos platos, pero creo que si nosotros queremos meter 00:32:33
muchos platos, pues al final lo que estamos haciendo es que la columna sea más larga 00:32:37
¿vale? si la columna es más larga, tenemos más tiempo 00:32:41
dar más tiempo de análisis, porque la fase móvil 00:32:44
ya va a tardar más en salir, 00:32:47
no lo mismo que una columna de un centímetro que de siete metros. 00:32:48
Entonces, tenemos más tiempo 00:32:51
de análisis. Entonces, tenemos que ir 00:32:52
valorando y ir viendo las dos cosas 00:32:54
cómo las hacemos. 00:32:56
¿Quién es bien y mejor? 00:32:59
Llegar a un punto intermedio para que 00:33:00
podamos tener una buena eficacia 00:33:02
y no estar siete horas para hacer 00:33:04
una separación. 00:33:06
Por último, tenemos la resolución. 00:33:08
La resolución es 00:33:11
otro de los parámetros que 00:33:12
va a influir en los resultados 00:33:14
que tengamos nosotros 00:33:17
algo de resolución 00:33:18
en espectroscopía 00:33:20
si la hemos visto 00:33:22
en microbiología igual yo comparo siempre 00:33:23
en microbiología el poder de resolución 00:33:26
de microscopio lo habéis visto 00:33:28
nosotros la resolución donde más la hemos visto 00:33:29
ha sido en la parte de infrarrojo 00:33:33
pero bueno así rápidamente 00:33:34
la resolución pues sería 00:33:37
cómo podemos diferenciar dos picos 00:33:39
que estén muy juntitos como si fueran 00:33:41
independientes 00:33:43
vale, ahí tenemos la foto 00:33:44
de aquí lo que decía, pues bueno, en el caso 00:33:45
de la figura de arriba, en este 00:33:48
de aquí, como medimos 00:33:50
el área, como medimos la anchura 00:33:52
si el pico no ha llegado a bajar del todo 00:33:53
no ha llegado a la línea de base, no tenemos 00:33:56
tema de corte, que es ahí, que hacemos ahí 00:33:58
vale, o es el mismo pico y tenemos que 00:34:00
medir de base a base, vale 00:34:02
y aquí que hacemos 00:34:04
en este caso de aquí, tenemos 00:34:05
dos picos, son las fotos que a lo mejor 00:34:08
aquí se ven un poco borrosas, pero son las fotos de 00:34:10
de los apuntes de la plataforma 00:34:12
aquí por ejemplo si tenemos dos picos que están perfectamente separados y de base a base y de 00:34:13
base a base y no tendríamos ningún tipo de problema entonces creo que estáis todos de 00:34:21
acuerdo que cuanto más resolución tengamos pues mejor más separados están los picos 00:34:28
muy nudos tenemos vale y esto entre otras cosas va a depender de la longitud de la 00:34:32
columna entonces cuanto mayor sea la columna vale cuanto más larga sea la columna es mejor 00:34:38
vale más separación y más resolución entonces se ha separado mejor por eso que al final que 00:34:44
sacrificamos vale la resolución y la eficacia o la altura de la columna y el tiempo de análisis 00:34:51
entonces llegar ahí un poco a un punto intermedio vale que podamos separar que veamos bien y que 00:34:59
no tenga que ser mucho tiempo de análisis 00:35:05
más que nada no solamente por el tiempo 00:35:08
el tiempo de análisis 00:35:10
porque ya 00:35:12
los que habéis hecho venir a las prácticas 00:35:13
de HPC 00:35:16
ya os lo he contado que está todo muy automatizado 00:35:17
entonces a veces que el tiempo 00:35:20
de análisis no perdemos 00:35:22
tiempo de analista porque podemos hacer otras cosas 00:35:24
entre medias pero bueno si es un 00:35:26
gasto de fase móvil 00:35:28
si tenemos una columna que sea 00:35:29
7 metros el volumen que tiene 00:35:32
que pasar por ahí, desde que empieza la columna hasta que sale, no es el mismo que si tenemos 00:35:34
una columna de 5 centímetros. Entonces, es gasto de fase móvil, el gasto de disolventes 00:35:37
y los de cromatografía, pues son un pelín más caros, que lo normal no es agua del grifo. 00:35:43
Y ahora vamos a ver un poquito, ¿vale? Porque como esta es la que creo que más habéis 00:35:51
visto en mi tecnología, no me voy a entretener mucho, ¿vale? Los apuntes ya habéis visto 00:35:55
que viene muy poquito y yo la voy a 00:36:00
resolver un poco, ¿vale? Entonces 00:36:02
la cromatografía de capa fina 00:36:04
si vamos a ver cada tipo de cromatografía 00:36:06
yo lo que digo es que me voy a centrar sobre todo 00:36:08
en HPLC, ¿vale? Que es la 00:36:10
parte de cromatografía de líquidos y 00:36:12
columnos y cromatografía 00:36:14
de gases, ¿vale? Cromatografía 00:36:16
de fluidos 00:36:18
supercríticos y de capa fina un poquito 00:36:20
¿vale? Pero poco, ¿vale? 00:36:22
Porque esta la veis en 00:36:24
biotecnología y la de fluidos supercríticos 00:36:25
es un poco mezclada las dos, entonces 00:36:28
Vamos a ver las diferencias que tiene con las otras dos. 00:36:30
En la cromatografía de capa fina. 00:36:33
Capa fina, en capa fina o en papel. 00:36:35
Cualquiera de las dos. 00:36:37
Esta es muy cívica. 00:36:39
Hasta igual la habéis hecho en el instituto. 00:36:41
Esta que se pone el papel en un rotulador y se ve cómo se separa la tinta en diferentes colores. 00:36:44
En este tipo de cromatografía, la fase móvil es un líquido que va a ascender por capilaridad. 00:36:52
desplazándose por una fase estacional 00:36:58
que es sólida y polar 00:37:01
entonces las placas 00:37:03
que serían estas de aquí 00:37:05
pues si podéis prepararlas vosotros 00:37:07
con la mezcla 00:37:10
y los ingredientes que sean 00:37:11
pero bueno, generalmente 00:37:13
ya se compran bien hechas 00:37:14
entonces tampoco vamos a entrar mucho en detalle 00:37:16
en cómo se prepara la placa 00:37:18
lo que sí, lo que tenemos que hacer nosotros 00:37:20
la parte nuestra, una vez que tenemos la placa 00:37:22
pues la recortamos en base a 00:37:24
el trabajo que vayamos a realizar 00:37:26
las condiciones, cuántos componentes 00:37:28
tengamos, cuánto tiempo necesitamos 00:37:31
si sube muy rápido o no 00:37:32
la por capilaridad 00:37:34
entonces, respetando las condiciones 00:37:37
pues recortamos la placa 00:37:39
¿vale? y estas pues también 00:37:40
cuanto más aprovechamiento podamos hacer de la placa, mejor 00:37:41
porque también tienen 00:37:44
un precio elevado 00:37:46
lo siguiente que tendríamos que hacer sería 00:37:48
marcar una línea, ¿vale? para tener una referencia 00:37:50
a la hora de aplicar 00:37:53
las muestras al final esto va a ser como una carrera a ver quién llega antes al final para 00:37:54
que sea justo que no haya trampa pues tiene que empezar todos los componentes y todos los 00:38:01
componentes desde el mismo sitio una vez marcada la línea vamos a aplicar con un capilar la muestra 00:38:06
además de la muestra vamos a poner una serie de patrones de los que suponemos que va a tener 00:38:13
muestra para que podamos ver la muestra qué componentes tiene si no comparamos con un patrón 00:38:19
vamos a ver solamente manchas de colores y no vamos a saber qué es entonces tendríamos en este 00:38:25
caso por ejemplo por ejemplo por ejemplo tendríamos el patrón 1 el patrón 2 el patrón 3 y luego pues 00:38:32
1 2 3 y 4 muestras diferentes y luego veremos la separación ponemos la placa en una cubeta donde 00:38:40
se encuentra la fase móvil 00:38:49
y como he dicho 00:38:50
que por capitalidad va ascendiendo 00:38:52
junto con los componentes 00:38:55
aquellos que sean más polares 00:38:56
quedarán retenidos en la fase estacionaria 00:38:58
y no ascenderán 00:39:01
lo que tenemos que tener cuidado 00:39:02
también es 00:39:05
en terminar la elusión antes de que se termine 00:39:06
la placa 00:39:09
que hay muchas veces que nosotros dejamos 00:39:10
que el eluyente vaya subiendo 00:39:12
el eluyente va subiendo por aquí y por aquí 00:39:14
y va arrastrando los componentes 00:39:16
y se nos sale, se va por aquí 00:39:18
y si hay algún componente 00:39:20
que vaya con la fase móvil 00:39:21
ahí se va 00:39:24
y no lo vemos 00:39:26
entonces se nos escapa 00:39:27
y lo que digo es que se escapa un componente 00:39:29
y no lo determinamos 00:39:32
esa sería la separación, a nivel 00:39:33
cualitativo, pues veríamos 00:39:35
la altura de las manchas 00:39:38
lo que antes hablábamos de tiempos de retención 00:39:40
aquí vemos altura de manchas 00:39:42
no vemos un gráfico ni nada 00:39:44
la cromatografía en placa, sino que veríamos una serie de manchas, una serie de círculos 00:39:46
que son de diferentes colores y nosotros lo que hacemos es 00:39:50
calcular la distancia desde la línea de salida 00:39:54
que hemos marcado antes hasta el punto donde se ha quedado. 00:39:58
Si podemos ir de centro a centro, mejor. A nivel cualitativo 00:40:02
vemos la altura de las manchas de la muestra y luego si comparamos 00:40:06
con los patrones, tendríamos una serie de manchas que están en la muestra 00:40:10
y una serie de manchas que salen del patrón. 00:40:14
El patrón sí es puro, ¿vale? 00:40:17
El patrón no tiene mezcla, sale una mancha única. 00:40:18
Entonces, por comparación de alturas del patrón 00:40:21
con las cosas que hayan salido de la muestra, 00:40:23
pues podemos decir, tiene este componente. 00:40:26
Entonces, como han salido del mismo, 00:40:29
tienen la misma altura, pues lo veríamos. 00:40:31
Para el análisis cuantitativo, 00:40:33
pues no aporta mucha información, 00:40:36
pero bueno, se puede medir el área de la mancha 00:40:38
que no suele ser tan redonda. 00:40:40
Es un poquito más irregular. 00:40:42
Autor/es:
Mª José de Luna
Subido por:
María Jose De L.
Licencia:
Todos los derechos reservados
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Fecha:
24 de abril de 2024 - 16:38
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Clave
Centro:
IES LOPE DE VEGA
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