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UT5 - Clonación Molecular - 2ª Parte - Contenido educativo

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Subido el 2 de febrero de 2024 por Pedro M.

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Bien, vamos a comenzar la segunda parte del tema de clonación molecular. 00:00:00
Esta parte es muy importante y es un pelín compleja. 00:00:07
Vamos a ver las fases del proceso de clonación, ¿de acuerdo? 00:00:10
Os recuerdo que el objetivo fundamental es que queremos introducir un gen en un vector, 00:00:14
en este caso está representado un plásmido, para poder amplificarlo en vivo en células bien prokaryotas o bien eucariotas. 00:00:20
Las fases del proceso de forma genérica son tres. 00:00:28
La primera de ellas es la creación de los vectores recombinantes. 00:00:34
Con todo lo que ya hemos estudiado en los apartados anteriores, sabemos que, por un lado, 00:00:38
hemos de preparar nuestro fragmento, el inserto que queremos clonar, digiriéndolo con enzimas de restricción, 00:00:43
con endonucleasas de restricción, pero al mismo tiempo también hemos de preparar el vector. 00:00:52
En este caso está representado un plásmido. 00:00:56
Y lo deberemos digerir, lo digo ya por primera vez y lo volveré a repetir después, 00:00:58
con el mismo o los mismos enzimas de restricción con los que hemos digerido el inserto. 00:01:03
Después, una vez ya los tenemos preparados, haremos una incubación juntos en un tubo con la ligasa, 00:01:10
para que se produzcan los vectores recombinantes. 00:01:17
Como vais viendo, y ya comentamos en clase y en los apartados anteriores, 00:01:20
vamos a obtener tanto vectores... 00:01:26
Vectores recombinantes, que nos gustaría que todos fueran así, 00:01:28
vectores recombinantes con nuestro fragmento de interés, con el inserto, 00:01:31
pero también habrá un porcentaje, seguramente menor, 00:01:35
pero hay un cierto porcentaje de vectores vacíos. 00:01:39
Sencillamente han recircularizado. 00:01:43
¿De acuerdo? 00:01:46
Una vez ya tenemos nuestro vector recombinante, 00:01:47
que, insisto, tendremos una mezcla de vectores recombinantes y vectores vacíos, 00:01:51
los vamos a introducir en las... 00:01:55
En las células hospedadoras, en la fase 2 del proceso. 00:01:58
En este caso, como estamos en el ejemplo con plásmidos, estos son bacterias, células prokaryotas. 00:02:03
Algunos plasmidos también se pueden introducir en células eukaryotas, 00:02:10
pero en el caso del esquema que tenéis en el libro, son bacterias. 00:02:13
Ya os introduzco que esta fase nos va a producir tres tipos de células. 00:02:19
Como veis, he modificado un poquito el esquema, 00:02:25
respecto al del libro, para representar estos tres tipos de células. 00:02:28
Las primeras, células que no han introducido ningún vector. 00:02:32
Se han quedado tal cual estaban al principio. 00:02:36
Por tanto, son células no transformadas, no transfectadas. 00:02:38
Y después de las células que sí que han introducido el vector, 00:02:44
y que sí que lo han adquirido, tenemos dos tipos. 00:02:48
Las células que han introducido el vector vacío, y por tanto no son células recombinantes, 00:02:52
y las células que han introducido el vector vacío, y por tanto no son células recombinantes, 00:02:56
y las células que han incorporado el vector recombinante, 00:02:57
y por tanto son las que nos interesan de verdad. 00:03:00
Estas de aquí, estos dos tipos de células, de alguna manera tenemos que quitarnos las de en medio. 00:03:05
Eso lo vamos a realizar en la fase 3, que es la fase de selección e identificación. 00:03:12
En esta fase veremos cuatro estrategias que se utilizan. 00:03:16
Algunas son un poquito, digamos, clásicas y están en desuso, 00:03:20
y se han ido sustituyendo. 00:03:24
Y se han ido sustituyendo por otras más efectivas, que son más fáciles de realizar en el laboratorio. 00:03:27
Las veremos. 00:03:33
¿Cuál es el objetivo? 00:03:35
De todos estos tipos de células, de estos tres tipos de células, 00:03:37
tengo que seleccionar e identificar estas, 00:03:39
para poder eliminar estas de aquí, 00:03:43
y quedarme solamente con las células transformadas con vector recombinante. 00:03:45
A partir, una vez ya las he seleccionado y las he identificado, 00:03:51
ya las puedo expandir. 00:03:55
¿De acuerdo? 00:03:57
Esto representa una placa de agar con colonias de cultivo de bacterias en medio sólido. 00:03:59
Bien, vamos a ver la primera fase. 00:04:07
La primera fase, ya hemos dicho que es la creación de un vector recombinante. 00:04:09
Para ello, hay tres subfases. 00:04:13
La primera subfase es la preparación del DNA, del inserto que vamos a clonar. 00:04:16
Y para ello, ya hemos dicho antes que vamos a digerir con endonucleasas de restricción. 00:04:21
Os recuerdo, y tiro para atrás, que este inserto lo podemos obtener de dos maneras. 00:04:27
O directamente de un DNA genómico, 00:04:34
que yo voy a cortar con enzimas de restricción y luego purifico el inserto. 00:04:37
Es decir, este inserto lo he sacado directamente del DNA genómico. 00:04:42
O, actualmente se utiliza muchísimo esta segunda técnica, 00:04:47
que es diseñar unos primers y amplificar por PCR. 00:04:52
De tal manera que yo el DNA genómico lo voy a utilizar solamente como DNA molde. 00:04:55
No lo voy a digerir. 00:05:02
Voy a obtener el amplicón, el amplicón de mi gen de interés, del inserto. 00:05:04
Entonces, después, lo voy a digerir con enzimas de restricción. 00:05:09
¿De acuerdo? 00:05:14
Por tanto, son estas dos estrategias. 00:05:16
O cojo el DNA genómico, lo digiero y obtengo entonces un montón de fragmentos 00:05:18
digeridos. 00:05:24
Y todos esos fragmentos los voy a clonar en vectores. 00:05:26
Este método, esta estrategia la utilizamos cuando queremos crear bibliotecas de DNA. 00:05:30
Lo veremos en apartados posteriores. 00:05:36
Pero la que más se utiliza actualmente es a partir de un amplicón. 00:05:39
¿De acuerdo? 00:05:44
Cogemos nuestro DNA genómico como DNA molde, 00:05:45
hacemos una PCR con primers específicos, amplificamos un gen, el inserto, 00:05:48
y por tanto vamos a clonar un solo fragmento. 00:05:53
Esta, digamos que es una estrategia más, entre comillas, quirúrgica. 00:05:56
¿Sí? 00:06:01
Vamos a mucho más dirigida, un solo fragmento. 00:06:02
Y es la que más se utiliza, sobre todo en investigación. 00:06:05
Por tanto, una vez yo ya tengo el inserto, o bien por la primera estrategia, 00:06:13
o bien por la segunda estrategia, ahora lo tengo que digerir. 00:06:17
Y lo tengo que digerir con endonucleasas de restricción. 00:06:21
Os he puesto aquí, bueno, unas diapositivas, ya lo vimos en el tema 2, 00:06:25
pero a modo de recordatorio sobre los enzimas de restricción, 00:06:32
las endonucleasas de restricción. 00:06:35
Ya hemos dicho, estos enzimas, como ya sabemos, reconocen una secuencia específica, concreta. 00:06:37
Es lo que llamamos la diana de restricción. 00:06:44
Por tanto, en nuestro inserto, en nuestro DNA, 00:06:47
irán chequeando todo el DNA y cuando encuentren su diana de restricción, cortarán. 00:06:50
Mientras que respetan toda el resto de secuencia, a derecha e izquierda, 00:06:56
porque no hay diana de restricción. 00:07:01
Para la mayoría de enzimas, esta diana de restricción es un fragmento muy chiquitín, 00:07:04
una secuencia de 4 a 8 nucleótidos. 00:07:10
Lo normal es que sean unos 5 o 6 nucleótidos, por tanto es una secuencia muy pequeña, 00:07:14
primera característica. 00:07:18
Y segunda característica. 00:07:20
Estas dianas de restricción son secuencias que tienen simetría palindrómica, 00:07:22
son secuencias palindrómicas. 00:07:27
¿Eso qué significa? 00:07:29
Aquí tenemos un ejemplo. 00:07:31
Un palíndromo, o una secuencia palindrómica, 00:07:33
es aquella que se lee igual de izquierdas a derechas que de derechas a izquierdas. 00:07:38
Como la secuencia de DNA son bicatenarias, de doble cadena, 00:07:45
si leemos la secuencia siempre en dirección 5'-3', por supuesto, 00:07:49
aquí tenemos un ejemplo, esta secuencia de izquierda a derecha es GGGCCC. 00:07:56
Leída de derecha a izquierda, como tengo que leer la 5'-3', es la misma secuencia, GGGCCC. 00:08:02
Esta es una secuencia palindrómica, de tal manera que el enzima reconoce esta secuencia específica 00:08:09
porque además es palindrómica. 00:08:16
En el ejemplo del esquema que tenemos aquí, esta secuencia también es palindrómica, GATTCC. 00:08:18
Leída de izquierda a derecha, leída de derecha a izquierda, lo mismo, GATTCC. 00:08:26
Siempre leída, repito, de 5'-3'. 00:08:33
Tercera característica de estos enzimas de restricción y sus dianas de restricción, 00:08:38
dentro de la secuencia, 00:08:44
no cortan al azar, sino que cortan siempre en un punto específico. 00:08:46
En concreto, este enzima que nos representan, 00:08:51
cortaría detrás de la guanina y la adenina, en una cadena, 00:08:54
y detrás de la guanina y la adenina, entre la guanina y la adenina, en la otra cadena también. 00:08:59
Por tanto, dentro de la secuencia de la diana de restricción, 00:09:04
no cortan al azar, sino que cortan en un punto específico. 00:09:08
Esa es la tercera característica 00:09:12
de las dianas de restricción y sus endonucleasas. 00:09:14
Aquí os pongo una tabla con algunos ejemplos. 00:09:19
Por ejemplo, todas estas enzimas de restricción se utilizan muchísimo en el laboratorio. 00:09:22
ALU-1, VAMACHE-1, ECORRE-1, ECORRE-5, GINDE-3, 00:09:27
también se utiliza mucho, PISTEL-1... 00:09:31
Ya veis, cada una tiene su secuencia. 00:09:34
Aquí han representado solo la secuencia de una de las cadenas, 00:09:36
en dirección 5'-3'. 00:09:39
Si os dais cuenta, y os dais cuenta, 00:09:42
si hacéis la complementaria, os saldrá la secuencia palindrómica. 00:09:44
Y dentro de esta secuencia, 00:09:48
de cada una de estas secuencias de restricción, 00:09:50
el enzima en concreto corta en un punto específico. 00:09:53
Esta, pues justo en medio, está entre las dos guaninas. 00:09:57
Está entre la guanina y la adenina, 00:10:02
como hemos visto en el ejemplo de antes. 00:10:04
Y así, etc., etc., cada una de las endonucleasas de restricción. 00:10:06
Cuarta característica de las endonucleasas de restricción. 00:10:14
Cuando cortan, como ya hemos visto, 00:10:20
vuelvo para atrás, 00:10:23
hay algunas enzimas que cortan justo en medio 00:10:24
de la secuencia de la diana de restricción. 00:10:27
Y otras, más hacia el extremo. 00:10:31
Por ejemplo, JAE-3 y ALU-1 cortan justo en medio. 00:10:33
Mientras que BAMACHE-1, ECORRE-1 y GINDE-3 00:10:38
cortan al principio de la secuencia. 00:10:42
¿Esto qué implicación tiene? 00:10:46
Pues que pueden generar dos tipos de extremos después de cortar. 00:10:48
Los tenemos aquí representados. 00:10:52
Pueden generar extremo romo, 00:10:55
cuando el enzima de restricción corta justo en medio de la secuencia 00:10:57
de la diana de restricción, genera extremo romo. 00:11:01
¿Qué es un extremo romo? 00:11:04
Un extremo justo que parece como un tabique. 00:11:05
Dos muros. 00:11:10
No tiene nada, ninguna secuencia colgando. 00:11:11
Mientras que ECORRE-1, por ejemplo, corta dejando extremos cohesivos. 00:11:13
Como corta al principio de la secuencia de restricción 00:11:18
en cada una de las dos hebras, entre guanina y adenina, 00:11:21
cuando corta aquí, corta aquí y se rompen todos los puentes de hidrógeno, 00:11:25
los extremos que deja son cohesivos. 00:11:32
Eso significa que queda una cola en una de las cadenas, 00:11:35
una cola colgando. 00:11:39
¿De acuerdo? 00:11:40
Esto es muy importante. 00:11:41
¿Por qué? 00:11:43
Porque si después la liga se tiene que actuar, 00:11:45
estos dos extremos solamente se pueden ligar nuevamente 00:11:48
de la misma manera en la que estaban ligados. 00:11:53
Mientras que este, si yo corto y dejo un extremo romo, 00:11:57
lo veremos en algún ejemplo, 00:12:01
puede ligar así o podría ligar al revés. 00:12:04
Entonces el inserto puede entrar, 00:12:08
de derecha a izquierda o de izquierda a derecha. 00:12:10
Esto lo veremos un poquito mejor más adelante. 00:12:13
¿De acuerdo? 00:12:18
Muy bien. 00:12:19
Hemos cortado el DNA, el inserto que queremos clonar. 00:12:20
Y lo normal es cortar con dos enzimas de restricción, 00:12:24
es decir, y tiro para atrás. 00:12:28
Aquí lo tenemos, el inserto. 00:12:32
Lo normal es cortar con dos enzimas de restricción, 00:12:34
una encima al principio y otra encima al final. 00:12:37
¿Para qué? 00:12:40
Para que este fragmento entre sí o sí en esa dirección, 00:12:42
en el plásmido. 00:12:46
Si no, se podría... 00:12:48
Imaginaos que este es el principio y este es el final, ¿sí? 00:12:50
Si yo corto aquí con ecoR1, ecoR1, 00:12:53
este fragmento puede entrar así, 00:12:56
aquí principio y final, 00:12:58
o podría entrar final-principio. 00:13:01
Se puede dar la vuelta. 00:13:03
Entonces, claro, cambio la pauta de lectura. 00:13:05
Si yo corto con una encima de restricción, 00:13:08
este fragmento puede entrar principio-final 00:13:11
o puede entrar al revés, final-principio. 00:13:14
Pero si yo corto con dos enzimas de restricción, 00:13:17
ecoR1, bamH1, 00:13:19
y aquí igual, ecoR1, bamH1, 00:13:22
este fragmento sólo puede entrar en dirección eco-bam. 00:13:25
Nunca podrá entrar bam-eco. 00:13:29
¿De acuerdo? 00:13:32
Bueno, espero que se entiende. 00:13:33
Si no, en clase lo... lo... lo... 00:13:35
lo vemos. 00:13:38
¿De acuerdo? 00:13:39
Muy bien. 00:13:40
He preparado mi DNA, 00:13:41
lo he cortado con enzimas de restricción 00:13:42
y tengo que hacer lo mismo con el vector de clonación. 00:13:44
Y debo digerirlo con el mismo enzima, 00:13:47
con las mismas enzimas endonucleases de restricción. 00:13:50
Las mismas, porque si no, es imposible que entre el inserto. 00:13:53
Y el libro nos pone que hay varios casos. 00:13:56
Dependiendo de cómo es el vector, 00:13:59
si corto con una enzima de restricción, 00:14:02
obtengo un fragmento, 00:14:04
es decir, lo linearizo el plásmido. 00:14:06
Si corto con dos, linearizo el plásmido, 00:14:09
pero obtengo también un pequeño fragmento. 00:14:12
Pero si es lineal, 00:14:14
pues cortando con... con una enzima de restricción, 00:14:16
obtengo dos fragmentos, 00:14:20
cortando con dos enzimas de restricción, 00:14:21
obtengo tres fragmentos. 00:14:23
Esto es muy sencillo. 00:14:24
¿De acuerdo? 00:14:26
Por tanto, ya he digerido con enzimas de restricción el inserto, 00:14:29
he digerido el vector, 00:14:34
y ahora los voy a incubar con la ligasa. 00:14:35
¿De acuerdo? 00:14:38
Yo tenía mi inserto, 00:14:41
imaginaos que este inserto viene de un producto de PCR, 00:14:43
he amplificado el gen de la insulina por PCR, 00:14:48
lo he digerido con enzimas de restricción, 00:14:53
ECOBAM, por ejemplo, 00:14:56
he cogido mi plásmido, 00:14:59
lo he digerido con los mismos enzimas de restricción, 00:15:01
por tanto, aquí tenemos un extremo ECO y un extremo BAM, 00:15:03
y ahora lo que hago es, 00:15:07
los voy a incubar con la ligasa. 00:15:09
Y pueden ocurrir dos cosas. 00:15:11
Si yo he cortado con una enzima de restricción, 00:15:14
este plásmido puede recircularizar. 00:15:17
Si yo he cortado con dos enzimas de restricción, 00:15:20
y esto es muy importante, 00:15:23
este inserto, consigo dos cosas. 00:15:25
Una, este inserto solo puede entrar ECO, ECO, BAM, BAM. 00:15:27
Nunca puede entrar este extremo BAM con el de ECO. 00:15:33
Imposible, ¿de acuerdo? 00:15:36
No se puede dar la vuelta. 00:15:38
Y segundo, que consigo, es que 00:15:40
solamente después de la ligación voy a obtener 00:15:43
vectores recombinantes. 00:15:46
Y muy pocos van a recircularizar. 00:15:48
¿Por qué? 00:15:50
Porque este extremo es ECO y este extremo es BAM. 00:15:51
Dejan extremos cohesivos diferentes, 00:15:54
es decir, tiro para atrás. 00:15:57
Acordaos, estos extremos cohesivos son diferentes, 00:15:59
no son complementarios, 00:16:02
y por tanto el plásmido no puede recircularizar. 00:16:04
¿De acuerdo? 00:16:07
Bien, una vez acaba la fase 1, 00:16:14
y yo ya tengo, he acabado la fase de ligación, 00:16:17
ya he hecho el tratamiento con la ligasa, 00:16:21
la segunda fase es, voy a introducir el vector recombinante 00:16:24
en células hospedadoras. 00:16:30
Y aquí tenemos varios casos. 00:16:32
Podemos introducirlo en células prokaryotas 00:16:36
o en células eukaryotas. 00:16:39
Si lo introducimos en células bacterianas, 00:16:41
en células prokaryotas, 00:16:43
hemos de utilizar como vector siempre plásmidos. 00:16:45
Primero, y eso es muy importante. 00:16:48
Segundo, la introducción de un vector en bacterias 00:16:51
se denomina transformación. 00:16:55
Por tanto, cuando hablamos de transformación, 00:16:58
es transformación bacteriana. 00:17:00
La introducción de un vector en otra, 00:17:02
en células eukaryotas, recibe otro nombre. 00:17:05
¿De acuerdo? 00:17:08
Importante, para poder transformar, 00:17:09
tercera idea fundamental de células prokaryotas, 00:17:11
para poder transformar bacterias, 00:17:14
debo realizarlo en bacterias competentes. 00:17:17
¿Esto qué significa? 00:17:20
Son bacterias que están preparadas 00:17:22
para poder admitir el plásmido. 00:17:25
Y van a estar preparadas 00:17:28
siguiendo un tratamiento específico 00:17:30
que va a abrir pequeños poros 00:17:33
en su pared y membrana. 00:17:35
De tal manera que va a ser mucho más fácil 00:17:37
que admitan el vector recombinante, 00:17:39
el plásmido recombinante. 00:17:41
Ya vimos dos cepas que se utilizan mucho 00:17:43
de bacterias competentes. 00:17:46
Las DH5-alfa y las CK14, creo. 00:17:48
Me parece las K14. 00:17:52
Bueno, las tenéis en las diapositivas anteriores. 00:17:57
¿De acuerdo? 00:18:00
Este proceso de competencia 00:18:01
lo tenemos que realizar en nuestras bacterias. 00:18:03
Se suele utilizar muchísimo Escherichia coli. 00:18:05
Y el proceso de transformación 00:18:09
debe estar precedido siempre 00:18:12
de un proceso de competencia. 00:18:14
Hemos de hacer nuestras bacterias competentes. 00:18:18
Y este proceso lo podemos hacer de dos maneras. 00:18:20
Uno, utilizando un tratamiento físico, 00:18:23
es decir, un choque térmico, 00:18:28
un choque térmico. 00:18:29
¿Cómo lo realizamos? 00:18:31
Ponemos nuestras bacterias 00:18:33
a cuatro grados, 00:18:35
en hielo, a cuatro grados. 00:18:37
Por tanto, ocurre lo mismo 00:18:39
que cuando hace hielo por la mañana. 00:18:43
Su pared, digamos que se retrae, 00:18:46
el péptido glicano de su pared se retrae 00:18:50
y rápidamente lo pongo a 42 grados. 00:18:52
Eso es lo que hace, es que se dilate 00:18:56
el péptido glicano de forma muy brusca 00:18:58
y que la pared bacteriana se resquebraje 00:19:00
y aparezcan pequeñas fisuras, pequeños poros. 00:19:03
Tratamiento físico. 00:19:07
Puedo hacerlo también con un tratamiento químico. 00:19:09
El tratamiento químico clásico 00:19:11
que se utiliza muchísimo es el cloruro cálcico. 00:19:13
Un tratamiento con cloruro cálcico muy concentrado 00:19:16
que produce lo mismo que el tratamiento físico. 00:19:19
Es decir, produce fisuras en la pared de la bacteria. 00:19:22
Son pequeñas fisuras, es decir, 00:19:26
si fueran muy grandes la bacteria lixaría 00:19:28
y eso no nos interesa. 00:19:30
Muy bien. 00:19:32
Por tanto, con mis bacterias ya competentes 00:19:34
o bien por un método físico o por un método químico 00:19:36
la voy a transformar. 00:19:39
¿De acuerdo? 00:19:41
Si en lugar de células prokaryotas 00:19:51
yo quiero introducir el vector en células eukaryotas 00:19:53
tenemos dos tipos. 00:19:56
Si utilizamos virus, 00:19:58
es decir, voy a meter mi inserto dentro de un virus 00:20:00
y el virus va a infectar las células eukaryotas. 00:20:04
Esto a veces se utiliza mucho sobre todo si son células en cultivo 00:20:07
porque los virus tienen una tasa de infección, 00:20:11
infectividad muy elevada 00:20:14
y en un periodo corto de tiempo 00:20:16
puedo tener muchas células en cultivo infectadas 00:20:19
y con mi inserto. 00:20:22
Este proceso lo llamamos transducción. 00:20:24
O puedo utilizar células eukaryotas 00:20:26
pero que no están mediadas por virus. 00:20:30
Por ejemplo, puedo introducir plásmidos o cósmidos. 00:20:32
Y hablamos entonces de transfección. 00:20:35
Podemos transfectar de dos maneras diferentes. 00:20:37
Bien. 00:20:40
Utilizando un tratamiento químico con fosfato cálcico 00:20:42
el fosfato cálcico va a obligar a las células 00:20:46
a introducir los plásmidos por un proceso de endocitosis 00:20:50
los que... 00:20:54
Esto os debe sonar de la biología celular 00:20:55
que visteis en segundo de bachillerato 00:20:59
por endocitosis. 00:21:01
Los que no lo podéis buscar en Youtube 00:21:02
pero es un proceso por el cual las células 00:21:05
internalizan componentes de gran tamaño 00:21:07
al interior de la célula. 00:21:10
O podemos utilizar liposomas. 00:21:12
Entonces, los liposomas son vesículas lipídicas 00:21:14
en las que dentro van a incluir nuestro vector 00:21:19
y van a introducirlo dentro de la célula eucariota 00:21:23
por fusión con la membrana. 00:21:27
Son dos procesos diferentes. 00:21:29
¿De acuerdo? 00:21:31
Podemos transformar las bacterias 00:21:32
por un método físico o por un método químico. 00:21:34
Ya hemos visto. 00:21:37
Y la transfección también la llevamos a cabo 00:21:38
normalmente por métodos químicos 00:21:40
utilizando liposomas o con fosfato cálcico 00:21:42
que es muy barato y funciona muy bien. 00:21:45
Por tanto, transformación. 00:21:51
Células prokaryotas. 00:21:52
Transfección y transducción en células eucariotas. 00:21:54
Pero hay un cuarto método 00:21:59
que es la electroporación. 00:22:01
¿A qué os suena esto de electroporación? 00:22:03
Pues sí, vamos a someter las células 00:22:05
a un choque eléctrico. 00:22:08
¿De acuerdo? 00:22:10
Las vamos a electroporar, electrocutar entre comillas. 00:22:11
¿De acuerdo? 00:22:14
Con una corriente eléctrica de bajo voltaje 00:22:15
de tal manera que esta electroporación 00:22:19
va a hacer que vibren las membranas, 00:22:22
las paredes bacterianas 00:22:24
y también va a producir fisuras. 00:22:26
¿De acuerdo? 00:22:28
¿Cuál es la gran ventaja de la electroporación? 00:22:29
Bueno, porque lo podemos utilizar 00:22:31
en cualquier tipo de célula, 00:22:33
tanto prokaryotas como eucariotas. 00:22:34
La electroporación. 00:22:36
¿De acuerdo? 00:22:37
Y la segunda característica 00:22:38
es que es un método de gran eficiencia. 00:22:40
Por tanto, por electroporación 00:22:43
se va a introducir muchísima mayor cantidad 00:22:45
de vector en la célula. 00:22:47
El inconveniente que tiene la electroporación 00:22:49
es que tengo que controlar muy bien 00:22:51
el tiempo de electroporación, 00:22:53
la intensidad de la corriente 00:22:55
y el voltaje. 00:22:58
Porque si no, 00:22:59
bueno, puedo romper las células y les salvas. 00:23:00
¿De acuerdo? 00:23:04
Muy bien. 00:23:07
Una vez ya hemos introducido, 00:23:09
os recuerdo, 00:23:11
una vez ya obtuvimos los clones recombinantes 00:23:13
y ahora hemos introducido en células hospedadoras, 00:23:17
tenemos tres casos. 00:23:20
De todas esas células, 00:23:22
unas no habrán incorporado nada 00:23:24
y serán células que están tal cual 00:23:27
como antes, como al principio. 00:23:30
Células que han incorporado el vector, 00:23:32
pero el vector vacío 00:23:34
y células que han incorporado 00:23:36
el vector recombinante. 00:23:38
De tal manera que ahora en la tercera fase, 00:23:40
que es quizá un poquito conceptualmente 00:23:43
la más compleja, 00:23:45
vamos a llevar a cabo el proceso 00:23:47
de selección y el proceso 00:23:49
de identificación de todos estos clones 00:23:51
para poder quedarnos solamente 00:23:54
con los clones recombinantes 00:23:56
y estos expandirlos in vitro. 00:23:58
Hemos dicho, podemos obtener células 00:24:03
no transformadas, 00:24:05
tal y como está aquí en el ejemplo, 00:24:07
como estamos utilizando plásmidos 00:24:09
en el ejemplo y bacterias, 00:24:11
vamos a hablar de transformación 00:24:12
como si fueran bacterias. 00:24:14
¿De acuerdo? 00:24:15
Células no transformadas 00:24:16
y luego células transformadas. 00:24:17
O con vector recombinante 00:24:19
o con vector vacío, 00:24:20
no recombinante. 00:24:21
La selección, ya decíamos, 00:24:23
el proceso de selección 00:24:25
me va a permitir eliminar 00:24:26
las células no transformadas 00:24:27
y quedarme sólo con las transformadas. 00:24:29
Importante. 00:24:32
Y el proceso de identificación 00:24:33
me va a permitir quedarme 00:24:36
con las células transformadas recombinantes 00:24:38
y eliminar las transformadas 00:24:41
no recombinantes. 00:24:43
¿De acuerdo? 00:24:45
Para ello vamos a utilizar, 00:24:46
si recordáis, 00:24:48
dos elementos que tienen 00:24:50
los vectores de clonación. 00:24:51
El marcador de selección 00:24:53
y el marcador de identificación. 00:24:55
Hay cuatro estrategias fundamentales 00:24:58
para poder llevar a cabo 00:25:02
la selección e identificación. 00:25:04
Vamos a empezar por la técnica más clásica 00:25:06
y prácticamente está en desuso. 00:25:08
¿De acuerdo? 00:25:10
Y pasaremos después 00:25:11
a la segunda y la tercera 00:25:12
para la última, 00:25:13
que es la más novedosa 00:25:14
y más rápida. 00:25:16
La primera estrategia 00:25:18
vamos a utilizar 00:25:20
genes de resistencia antibióticos. 00:25:21
Es decir, 00:25:23
el gen de selección 00:25:24
y el gen de... 00:25:26
tanto el gen de selección 00:25:29
como el gen de identificación 00:25:31
son genes de resistencia antibióticos. 00:25:33
¿Vale? 00:25:36
Aquí nos han representado, 00:25:37
este es el esquema del vector, 00:25:39
para que lo podamos entender mejor, 00:25:41
del vector que vamos a utilizar 00:25:43
en nuestra clonación, 00:25:46
el que pone en el libro. 00:25:47
Tenemos un gen de resistencia ampicilina, 00:25:49
que es un antibiótico, 00:25:51
y un gen, aquí morado, 00:25:52
de resistencia tetraciclina. 00:25:54
¿De acuerdo? 00:25:56
La ampicilina y la tetraciclina 00:25:57
son dos antibióticos, 00:25:58
de tal manera que, 00:25:59
si yo en el medio de cultivo 00:26:00
de mis bacterias pongo ampicilina, 00:26:02
o tienen este gen 00:26:05
que hace que la bacteria resista la ampicilina, 00:26:07
o la bacteria se muere. 00:26:09
De la misma manera, 00:26:13
si yo en el medio de cultivo pongo tetraciclina, 00:26:14
o mis bacterias tienen este gen, 00:26:16
o las bacterias se mueren. 00:26:19
¿De acuerdo? 00:26:21
Como estáis viendo, 00:26:22
igual que en todos los vectores, 00:26:23
además del gen de selección 00:26:25
y el marcador de identificación, 00:26:28
tenemos un origen de replicación, 00:26:30
pero ahora, 00:26:32
en esta estrategia, 00:26:33
vamos a utilizar un vector 00:26:35
en el que el polilínquer, 00:26:37
y esto es muy importante, 00:26:39
el polilínquer, 00:26:40
el multiclone inside, 00:26:41
no está fuera. 00:26:42
En cualquier caso, 00:26:44
en cualquier sitio del plásmido, 00:26:45
sino que lo tenemos dentro, 00:26:47
dentro del gen de identificación. 00:26:49
Y esto es muy importante. 00:26:52
¿Por qué? 00:26:53
Fijaos, 00:26:54
una bacteria que haya introducido 00:26:56
el vector vacío, 00:26:58
bueno, 00:26:59
lo primero que tenemos que tener claro es que, 00:27:00
cuando nosotros, 00:27:02
en la primera fase, 00:27:04
hemos introducido el inserto 00:27:05
dentro del vector, 00:27:08
ese inserto, 00:27:10
en este vector en concreto, 00:27:11
se va a insertar aquí, 00:27:14
block, 00:27:15
¿sí? 00:27:16
Por ejemplo, 00:27:17
hemos cortado HINT-ECO-R1, 00:27:18
cortará aquí, 00:27:22
y el inserto entrará aquí dentro. 00:27:23
¿Qué es lo que ocurre 00:27:26
si el vector no es recombinante 00:27:27
y está vacío? 00:27:31
La bacteria que lo introduzca 00:27:32
podrá expresar el gen de ampicilina, 00:27:34
y será resistente a ampicilina, 00:27:37
y expresará el gen de tetraciclina, 00:27:39
de resistencia tetraciclina, 00:27:42
porque lo tiene completo. 00:27:44
Pero si os dais cuenta, 00:27:46
si la bacteria ha introducido 00:27:48
el vector recombinante, 00:27:51
este gen de tetraciclina está roto. 00:27:53
En una primera parte, 00:27:57
tendremos una primera parte 00:27:58
del gen de tetraciclina, 00:28:01
tendremos nuestro inserto, 00:28:02
y a continuación la segunda parte 00:28:04
del gen de resistencia tetraciclina. 00:28:07
Por tanto, 00:28:09
cuando esta bacteria quiera, 00:28:10
expresar el gen de la tetraciclina, 00:28:13
empezará a expresar 00:28:17
la proteína de resistencia tetraciclina, 00:28:18
pero llega un momento que se para, 00:28:20
y se corta. 00:28:22
¿Por qué? 00:28:23
Porque tenemos el inserto, 00:28:24
que es gigante. 00:28:25
Y por tanto, 00:28:26
la bacteria que tiene 00:28:27
el vector recombinante, 00:28:29
será resistente a ampicilina, 00:28:31
pero no será resistente a tetraciclina. 00:28:33
No sé si me explico. 00:28:36
¿De acuerdo? 00:28:39
Espero que se entienda bien. 00:28:40
Ya hemos dicho, 00:28:44
vamos a utilizar vectores 00:28:45
que tienen dos genes de resistencia. 00:28:46
En este caso, 00:28:48
os he puesto como ejemplo 00:28:49
a ampicilina y tetraciclina, 00:28:50
pero podría ser también la canamicina, 00:28:51
la neomicina... 00:28:53
Hay muchos genes de resistencia a antibióticos 00:28:54
que se utilizan en investigación. 00:28:57
De tal manera que, 00:29:01
cuando introducimos el vector en las bacterias, 00:29:02
tenemos que utilizar bacterias competentes 00:29:05
y sensibles tanto a ampicilina 00:29:08
como a tetraciclina. 00:29:10
Es decir, 00:29:12
estas bacterias por sí mismas 00:29:13
no resisten a los antibióticos. 00:29:15
Pongo ampicilina y pongo tetraciclina 00:29:17
y se mueren. 00:29:19
Son sensibles. 00:29:20
¿De acuerdo? 00:29:22
Ya hemos dicho que vamos a obtener células no transformadas. 00:29:23
Si las células no son transformadas, 00:29:26
en el medio de cultivo yo voy a poner ampicilina 00:29:29
y voy a poner tetraciclina, 00:29:32
junto con todos los nutrientes. 00:29:34
Por tanto, 00:29:36
las células no transformadas se mueren, 00:29:37
porque van a ser sensibles a ampicilina 00:29:39
y a tetraciclina. 00:29:41
Las células transformadas 00:29:43
con el vector no recombinante 00:29:45
serán resistentes 00:29:49
tanto a ampicilina como a tetraciclina, 00:29:51
porque, 00:29:53
vuelvo para atrás, 00:29:54
han incorporado este vector 00:29:58
tal cual lo tenemos aquí dibujado 00:30:00
y tienen el gen de resistencia a ampicilina 00:30:02
y el gen de tetraciclina 00:30:04
lo tienen completo, 00:30:06
no está roto. 00:30:07
Sin embargo, 00:30:08
las células, 00:30:09
las células transformadas con el vector recombinante 00:30:10
serán resistentes a ampicilina 00:30:13
pero serán sensibles a tetraciclina 00:30:15
y esto es muy importante, 00:30:17
que lo tengamos claro. 00:30:18
Sabiendo esto, 00:30:20
nosotros ponemos, 00:30:22
vamos a llevar a cabo una estrategia 00:30:24
en dos pasos. 00:30:26
Cogemos nuestras bacterias, 00:30:28
hemos hecho la transformación 00:30:32
y las vamos a poner en una plaquita con agar, 00:30:34
esto lo haréis el año que viene en microbiología, 00:30:36
en medio de cultivo con ampicilina, 00:30:39
sólo ampicilina, 00:30:41
de tal manera que 00:30:42
van a producirse colonias de bacterias, 00:30:44
estas de aquí, 00:30:47
al cabo de 24 horas de incubación, 00:30:48
las células que crezcan 00:30:50
son células transformadas. 00:30:52
Tiro para atrás. 00:30:54
Hemos dicho que las no transformadas 00:30:55
son sensibles a ampicilina, 00:30:57
por tanto estas se mueren, 00:30:59
directamente no crecen, 00:31:01
pero las transformadas, 00:31:03
tanto estas como estas, 00:31:04
son resistentes a ampicilina. 00:31:05
¿Por qué? 00:31:07
Porque tienen el vector. 00:31:08
Muy bien. 00:31:10
¿Qué es lo que hago ahora? 00:31:11
Cojo un fragmento de terciopelo estéril, 00:31:13
y lo que hago es una imprimación. 00:31:18
Imprimo, 00:31:21
lo dejo caer sobre la plaquita, 00:31:23
de tal manera que en el terciopelo 00:31:26
me voy a llevar unas cuantas bacterias 00:31:28
pegadas en la misma posición 00:31:30
en la que estaban en la placa, 00:31:32
me las voy a llevar pegadas en el terciopelo, 00:31:34
unas cuantas bacterias de cada una de las colonias. 00:31:38
¿Y qué es lo que hago ahora? 00:31:41
Esta es la placa original, 00:31:43
esta de aquí con ampicilina. 00:31:45
Lo que hago ahora es cojo una placa nueva, 00:31:47
y en este caso esta placa 00:31:51
va a tener el medio de cultivo 00:31:53
y voy a incluir la tetraciclina, 00:31:55
el segundo antibiótico. 00:31:58
Y cojo mi terciopelo y vuelvo a imprimir. 00:32:00
¿De acuerdo? De la misma manera que he hecho aquí, 00:32:03
lo bajo y me llevo bacterias, 00:32:05
lo que hago ahora es lo bajo 00:32:07
que contacte con el medio de cultivo 00:32:09
y deposito las bacterias 00:32:11
en la misma posición en la que estaban 00:32:13
en la placa anterior. 00:32:15
¿De acuerdo? Incubo 24 horas 00:32:18
y veis, si os dais cuenta, 00:32:20
hay alguna colonia que desaparece, 00:32:24
es decir, era resistente a ampicilina 00:32:27
pero ahora ya no es resistente a tetraciclina. 00:32:29
Vuelvo para atrás. 00:32:32
Las que son resistentes a ampicilina, 00:32:34
pero son sensibles a tetraciclina, 00:32:36
llevan el vector recombinante. 00:32:38
Estas son las que me interesan. 00:32:40
Por tanto, estas de aquí, 00:32:43
que son resistentes a ampicilina 00:32:45
y a tetraciclina, no me interesan. 00:32:48
Como yo he mantenido la disposición topográfica, 00:32:51
es decir, la localización de las colonias, 00:32:55
yo sé que esta colonia que tendría que estar aquí 00:32:58
es la que me interesa. 00:33:00
Entonces, vuelvo a la primera plaquita, 00:33:02
a esta de aquí, cojo, 00:33:04
esta colonia, cojo sus bacterias 00:33:06
y las crezco aparte sabiendo que esas 00:33:09
son las bacterias con el clon recombinante. 00:33:12
¿De acuerdo? 00:33:15
Esta estrategia es una estrategia clásica. 00:33:17
En dos pasos tengo que hacer dos incubaciones 00:33:20
en dos placas, una con ampicilina, 00:33:23
otra con tetraciclina. 00:33:25
Es larga y laboriosa. 00:33:27
Por eso, realmente está en desuso. 00:33:29
La segunda estrategia intenta mejorar 00:33:32
esta estrategia para intentar hacerlo todo en un paso. 00:33:35
¿De acuerdo? 00:33:38
¿Cómo lo conseguimos? 00:33:40
Lo vamos a conseguir, en primer lugar, 00:33:42
porque vamos a utilizar bacterias 00:33:45
que son defectivas en lactosa. 00:33:49
Son lo que llamamos LAC negativas. 00:33:52
¿LAC negativas qué significa? 00:33:55
Significa que no poseen el gen LACZ. 00:33:57
El gen LACZ es el gen 00:34:02
que codifica para este enzima, 00:34:04
la beta-galactosidasa. 00:34:07
Este enzima, la beta-galactosidasa, 00:34:09
es muy importante para muchas bacterias. 00:34:13
¿Por qué? Porque les permite coger la lactosa, 00:34:15
la lactosa ya sabéis que es un disacárido, 00:34:18
coge la lactosa, rompe el enlace glucosídico, 00:34:21
liberando los dos monosacáridos que la forman, 00:34:26
glucosa y galactosa. 00:34:30
De tal manera que las bacterias LAC positivas 00:34:32
producen beta-galactosidasa 00:34:36
y tienen la capacidad de coger lactosa, 00:34:39
romperla y obtienen glucosa como fuente de energía. 00:34:42
¿De acuerdo? 00:34:48
Las bacterias LAC negativas, como no lo pueden hacer, 00:34:50
o le ponemos en el medio de cultivo glucosa directamente, 00:34:53
o si solo le ponemos lactosa, se mueren. 00:34:56
¿Por qué? Porque no tienen beta-galactosidasa, 00:34:58
no pueden romper la lactosa 00:35:01
y no pueden obtener glucosa a partir de lactosa. 00:35:03
¿De acuerdo? Muy importante. 00:35:07
Por tanto, primer punto. 00:35:09
Necesitamos como células hospedadoras bacterias LAC negativas, 00:35:11
bacterias competentes LAC negativas, 00:35:16
que no produzcan beta-galactosidasa. 00:35:19
¿Sí? Muy bien. 00:35:22
Segunda idea importante de esta estrategia. 00:35:27
Nosotros, en el medio de cultivo, 00:35:29
no vamos a poner lactosa. 00:35:31
Pondremos glucosa directamente. 00:35:33
Porque en esta estrategia queremos que crezcan las bacterias. 00:35:35
Las bacterias LAC negativas queremos que crezcan. 00:35:38
Pero, en el medio de cultivo vamos a poner una análogo. 00:35:41
No es la lactosa, pero estructuralmente se le parece. 00:35:45
¿Y qué gracia tiene? Fijaros. 00:35:48
Vamos a poner X-gal. 00:35:50
¿Qué gracia tiene el X-gal? 00:35:52
Si os dais cuenta, contiene una galactosa. 00:35:54
¿De acuerdo? 00:35:58
Pero, en lugar de estar unida esa galactosa a una glucosa, 00:35:59
está unida a un compuesto químico muy raro, 00:36:03
cuya estructura y nombre no nos interesa. 00:36:07
¿Qué gracia tiene? 00:36:10
Que si este X-gal... 00:36:12
La gracia que tiene el X-gal es que, 00:36:15
estructuralmente, es muy parecido a la lactosa. 00:36:19
De tal manera que podemos engañar a la beta-galactosidasa. 00:36:22
Si la beta-galactosidasa 00:36:25
coge el X-gal, es capaz de romper este enlace, 00:36:27
liberar la galactosa 00:36:32
y liberar este compuesto raro. 00:36:35
¿Qué gracia tiene este compuesto? 00:36:38
Que si yo, además, le añado un catalizador, 00:36:40
que se suele utilizar mucho el IPTG, 00:36:45
se une al IPTG, se oxida 00:36:49
y produce una molécula 00:36:52
que precipita y que está coloreada, 00:36:55
de un color así oscuro, ¿de acuerdo? 00:36:59
Azul oscuro, muy oscuro. 00:37:02
Ahora diréis, bueno, ¿y qué gracia tiene todo esto? 00:37:04
Pues fijaos, las bacterias lactonegativas 00:37:07
no van a poder hacer este proceso, 00:37:11
porque no tienen beta-galactosidasa. 00:37:13
Las colonias que van a dar van a ser de color blanco. 00:37:16
Las bacterias que son lactonegativas 00:37:20
y que incorporan la beta-galactosidasa 00:37:24
entonces van a dar colonias de color azul. 00:37:27
Fijaos, aquí han hecho ese experimento. 00:37:30
Aquellas colonias, 00:37:33
esto para lo general ya lo habéis visto nunca, 00:37:36
es una placa petri, esto amarillento es el medio de cultivo, 00:37:38
el agar debe ser un agar nutritivo, ¿de acuerdo? 00:37:41
Lo veréis el año que viene en microbiología 00:37:43
y os dais cuenta, hay dos tipos de colonias. 00:37:45
Unas colonias blancas, 00:37:47
las blancas corresponden a las células lactonegativas, 00:37:49
que no tienen beta-galactosidasa, 00:37:52
y las azules son las que tienen beta-galactosidasa, 00:37:53
¿de acuerdo? 00:37:58
De tal manera que cultivando en una única placa 00:37:59
soy capaz de diferenciar las bacterias 00:38:03
lac menos de las lac más, lac positivas, 00:38:05
¿de acuerdo? 00:38:08
Espero que se haya entendido esta introducción 00:38:10
de esta estrategia que llamamos cromogénica. 00:38:13
¿Qué gracia tiene esta estrategia? 00:38:16
Entendiendo esto, ahora podemos, 00:38:20
podemos entender que vamos a utilizar vectores de clonación 00:38:22
en los cuales, si os dais cuenta, 00:38:26
es idéntico al de la estrategia anterior, 00:38:30
vamos a tener el gen de selección, 00:38:32
que es un gen de resistencia a ampicilina, 00:38:34
pero en este caso hemos sustituido 00:38:36
el gen de la tetraciclina por el gen lacZ, 00:38:38
ya hemos dicho que el lacZ es el gen 00:38:41
que produce beta-galactosidasa, 00:38:44
que codifica para la beta-galactosidasa, 00:38:46
¿de acuerdo? 00:38:48
Muy bien, ¿qué es lo que hacemos ahora? 00:38:50
Ojo, si os dais cuenta, 00:38:52
nuevamente el poli-linker está dentro del gen lacZ, 00:38:54
de tal manera que el vector vacío, 00:38:58
aquella bacteria que tenga el vector vacío 00:39:01
va a ser capaz de producir beta-galactosidasa, 00:39:03
pero la que incorpore el gen, 00:39:06
el inserto, 00:39:09
va a tener el gen lacZ interrumpido, 00:39:12
roto, y no va a poder producir beta-galactosidasa 00:39:15
aunque tenga el gen, porque está roto. 00:39:18
De tal manera que ahora 00:39:22
lo que hacemos es, 00:39:24
después de la transformación, 00:39:26
incubamos nuestras células, 00:39:29
tiro para atrás, 00:39:31
en un medio de cultivo que tiene 00:39:32
1. ampicilina 00:39:34
y 2. x-gal, 00:39:36
de tal manera que ahora voy a ser capaz 00:39:39
de diferenciar en un único paso 00:39:42
qué bacterias dan colonias blancas 00:39:45
y qué bacterias dan colonias azules. 00:39:48
Las colonias azules son de base, 00:39:50
son de bacterias que han incorporado 00:39:51
el vector no recombinante 00:39:53
y que por tanto tienen el gen completo, 00:39:56
tal cual las colonias blancas 00:39:58
proceden de bacterias que tienen 00:40:03
el vector recombinante. 00:40:05
No producen beta-galactosidasa. 00:40:07
¿Por qué? 00:40:09
Porque aquí tienen metido el inserto 00:40:10
y el gen de la lacZ lo tienen roto. 00:40:12
¿De acuerdo? 00:40:15
Por tanto, 00:40:16
podemos hacer la selección 00:40:19
y la identificación simultáneamente 00:40:22
en un paso. 00:40:24
Las células no transformadas serán sensibles 00:40:26
al antibiótico, 00:40:28
a la ampicilina 00:40:29
y lacZ. 00:40:30
Por tanto, estas no crecen, 00:40:31
se mueren, 00:40:32
porque yo he puesto ampicilina. 00:40:33
Las células transformadas 00:40:35
con el vector no recombinante 00:40:36
son resistentes a ampicilina 00:40:38
y como son lacZ, 00:40:40
son lac positivas, 00:40:41
producen colonias azules. 00:40:43
Y las que me interesan a mí 00:40:45
son las que producen 00:40:47
colonias blancas 00:40:48
porque son lac negativas. 00:40:49
¿De acuerdo? 00:40:51
De tal manera que 00:40:52
lo único que tengo que hacer ahora 00:40:54
es seleccionar aquellas colonias 00:40:56
blancas 00:40:58
y ponerlas en cultivo 00:41:00
y amplificarlas. 00:41:01
¿De acuerdo? 00:41:02
Todo en un paso. 00:41:03
Selección e identificación 00:41:04
en un único paso. 00:41:06
La tercera estrategia, 00:41:09
todavía más sencilla, 00:41:11
pero es muy parecida a esta. 00:41:12
Y es que en lugar de ser 00:41:13
una estrategia cromogénica, 00:41:15
bueno, esto es una imagen 00:41:17
de un artículo científico 00:41:19
donde también veis 00:41:21
un montón de colonias blancas, 00:41:22
pero también hay colonias azules. 00:41:23
Seleccionamos las blancas, 00:41:25
que son las que nos interesan. 00:41:26
Es la utilización, 00:41:28
en la tercera estrategia, 00:41:30
utilización de proteínas fluorescentes. 00:41:31
De tal manera que es muy sencilla 00:41:33
y muy parecida a la anterior 00:41:35
si es que la hemos entendido bien. 00:41:36
En lugar de tener 00:41:38
como gen de identificación el lacZ, 00:41:40
que va a producir colonias de color azul, 00:41:43
pongo el gen de la GFP, 00:41:46
que es la proteína verde fluorescente. 00:41:49
Green Fluorescent Protein. 00:41:51
¿De acuerdo? Es una proteína fluorescente. 00:41:53
Pero, por lo demás, es idéntico. 00:41:55
Aquellos vectores vacíos 00:41:58
producirán el gen de resistencia a ampicilina 00:42:00
y el gen de GFP. 00:42:03
¿Qué gracia tiene? 00:42:05
Que esas bacterias van a ser fluorescentes. 00:42:06
Porque producen una proteína 00:42:09
que produce fluorescencia por sí misma. 00:42:11
Que es fluorescente. 00:42:13
Y las que hayan introducido 00:42:16
el vector recombinante, 00:42:18
por tanto, tendrán aquí el inserto, 00:42:19
no serán verdes fluorescentes 00:42:21
porque tendrán este gen roto nuevamente. 00:42:23
Por tanto, la selección 00:42:26
se realiza sobre un medio de cultivo 00:42:28
con ampicilina 00:42:31
y la identificación vamos a utilizar 00:42:34
un microscopio de fluorescencia. 00:42:37
Lo pondremos en el microscopio de fluorescencia 00:42:40
en una lupa fluorescente 00:42:43
y aquellas colonias que sean fluorescentes 00:42:45
no nos interesan. 00:42:47
Igual que antes las negras tampoco nos interesaban. 00:42:48
¿De acuerdo? 00:42:51
Así de sencillo. 00:42:52
¿Qué ventaja tiene? 00:42:54
¿O qué diferencia tiene con la estrategia anterior? 00:42:56
Aquí voy a utilizar placas con medio de cultivo 00:42:59
a las que voy a incorporar solamente ampicilina. 00:43:02
En este caso, si os acordáis, 00:43:05
utilizamos, además de poner ampicilina, 00:43:07
tengo que poner X-gal 00:43:11
y tengo que poner el catalizador IPTG. 00:43:13
Por tanto, tres cosas. 00:43:16
Por tanto, es un poquito más cara 00:43:18
porque todos estos compuestos son caros. 00:43:20
Estos reactivos son caros. 00:43:22
En este caso, sencillamente pongo 00:43:24
un medio de cultivo con ampicilina y ya está. 00:43:26
Y luego miro al microscopio. 00:43:29
Y la última estrategia es todavía más sencilla 00:43:32
y es que vamos a sustituir este gen de la GFP, 00:43:36
es lo que llamamos el uso de genes letales, 00:43:39
por un gen letal, 00:43:42
que codifica para una proteína que es letal. 00:43:44
Por ejemplo, una toxina. 00:43:47
De tal manera que aquella bacteria 00:43:49
que exprese la toxina 00:43:52
directamente se muere 00:43:54
y no crece. 00:43:56
Por tanto, 00:43:58
si os dais cuenta, 00:44:00
esta es muy rápida. 00:44:02
¿Por qué? Tiro para atrás. 00:44:04
Muy sencillo. 00:44:06
Voy a poner las bacterias 00:44:08
en un medio de cultivo con ampicilina. 00:44:10
Solo ampicilina. 00:44:13
Igual que en la estrategia 3. 00:44:14
¿De acuerdo? 00:44:16
De tal manera que las células no transformadas 00:44:18
no crecen. 00:44:20
Pero, 00:44:22
¿qué gracia tiene? 00:44:24
Que aquellas células que hayan incorporado 00:44:26
el vector no recombinante 00:44:28
tienen el gen letal intacto 00:44:30
y por tanto tampoco crecen 00:44:32
porque van a producir la toxina. 00:44:34
De tal manera que, 00:44:36
ahora en la placa de cultivo 00:44:38
solamente van a crecer 00:44:40
las células transformadas 00:44:42
con vector recombinante. 00:44:44
¿De acuerdo? 00:44:46
Bueno, pues con esto 00:44:48
damos por finalizada 00:44:50
la segunda parte del tema 00:44:52
de clonación molecular. 00:44:54
Idioma/s:
es
Autor/es:
Pedro Melgar-Rojas
Subido por:
Pedro M.
Licencia:
Reconocimiento - No comercial - Sin obra derivada
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Fecha:
2 de febrero de 2024 - 19:19
Visibilidad:
Clave
Centro:
IES BENJAMIN RUA
Duración:
45′ 02″
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1.78:1
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