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Tinción de Gram - Contenido educativo

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Subido el 24 de febrero de 2023 por Francisco J. M.

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Entonces, por unión electrostática, se va a unir a las cargas negativas que tiene el 00:00:00
pepsioblicano, que tiene mogollón de enlaces fosfáticos, y entonces esto se va a detenir 00:00:06
todas las bacterias, porque todas las bacterias tienen pepsiobliculcano, menos los micoplasmas 00:00:20
que han salido en el test que no tienen poder celular, pero a esos no los voy a decir. 00:00:24
Vamos a echar esto en una de las cubetas. Bueno, lo primero que hay que hacer es una 00:00:28
extensión en un portaobjetos, por supuesto, para hacer la extensión microbiológica. 00:00:34
Claro que al contrario que en otras técnicas de microscopía, en microbiología nunca se 00:00:38
usa cubreobjeto. Normalmente se pone una gotita de cosas entre porta y cubre. Aquí no, porque 00:00:42
vamos a intentar ver las cosas directamente por inmersión. Entonces lo primero que hay 00:00:48
que hacer es fijar las bacterias. ¿Cómo se fijan las bacterias? Javier, ¿no tendrás 00:00:52
un mechero por aquí? Vamos a hacer una demo, y así luego vosotros podéis hacerlo. Pero 00:00:56
cuidado. Atención, norma número uno de seguridad en microbiología. Para mantener la técnica 00:01:02
séptica, no contaminarnos con estas bacterias que sabemos que tenemos aquí, tenemos que 00:01:10
usar guantes. Pero en la zona estéril no se pueden usar guantes, ¿vale? Porque una 00:01:16
quemadura con un mechero pues duele, pero una quemadura con un guante es una quemadura 00:01:21
de primer grado. Entonces, ¿cómo vamos a hacer la extensión? Pues idealmente... 00:01:25
¿Cómo vamos a hacer la suspensión? Pues vamos a coger una gota súper, requete, ultra 00:01:47
chiquitina de agua. Hay ahí también lavadores a tu derecha. En primer plano, ¿qué tienes 00:01:51
a limpiar? Eres muy normal. Una gota ultra, macro, súper chiquitina de agua. Cuanto más 00:02:06
chiquitina, mejor. No te digo ya que nos copia, pero casi, casi ni se ve. Fijaos, una gota 00:02:13
súper chiquitina. Claro, me diréis, este agua está clorada y el cloro mata las bacterias. 00:02:19
Está igual, las voy a matar de todas maneras porque las voy a fijar aquí. Fijar en biología 00:02:25
celular es matar. Esto es lo que más mola, las que habéis hecho microbiología ya lo 00:02:29
habéis visto. Yo necesito una herramienta estéril, estéril de la muerte. ¿Y cómo 00:02:33
consigo la esterilidad? Pues fijaos, os aseguro que esto, ahora mismo, todas las bacterias 00:02:38
que hay ahí están muertas. Voy a hacer una atinción guay, voy a hacer una atinción 00:02:43
de este bicho, este bicho. Entonces, ¿qué hago? Me llevo un poquito de masa, un poquito 00:02:52
de chimimi de masa, por el vaso estéril. Simplemente toco un poco de masa bacteriana 00:02:59
que veis que crece, de la colonia, del chupete que ha crecido ahí, lo que sea. Tengo aquí 00:03:05
millones de células bacterias. Fijaos que he dejado enfriar un poco el asal, porque 00:03:10
si no, bueno, meto el asal rojo y las achicharro y además genero aerosoles, los snifen. 00:03:14
Lo que hago es pum pum pum, pongo aquí en la gotita de agua y lo extiendo, así. 00:03:22
Hago un frotis. Fijaos que si la gota es muy pequeña, casi solo descenderlo se me va a secar. 00:03:30
Lo primero y más importante es que tengo que esperar que se me seque. 00:03:35
Si no se seca, no lo puedo fijar. ¿Cómo se hace una fijación en microbiología? 00:03:41
¿Una fijación en una atinción microbiológica? Pues se hace fijando al calor, pero primero 00:03:45
tiene que estar seco. Seca, seca, seca. Bueno, ya se está secando. ¿Veis que cuando se seca 00:03:49
se queda como, al irse el agua, se queda como así, opaco, ¿no? Se queda como una marca 00:03:54
así, pero es más que se queda en el centro, pero rápido se baja. Hay una zona caliente 00:03:59
que ayuda siempre a secar. Bueno, pues una vez que esto está seco de la muerte, que es 00:04:03
ya, ya, ya, ya. Seco, seco, como el desierto. Ahí, ya. Hay que fijarlo, y se fija por calor. 00:04:09
¿Cómo se fija por calor? A la llama. Aprovechamos que tenemos un bichero, ¿vale? 00:04:16
Claro, entonces, cuidado, atención al truco. Y esto es el truco para no quemarse. 00:04:20
Primero, ¿veis que no tengo guantes para no morir quemado, vale? Y, ¿veis que yo, 00:04:26
esto puedo pasarlo por la llama así, así o así? ¿Qué pasa? Que si lo paso así, 00:04:32
la llama viene a mí, me quemo la bata y me convierto en el hombre antorcha. Si lo paso 00:04:37
así, la mitad viene a mí y me convierto en antorcha, la mitad se pasa así, así. 00:04:41
De tal manera que la llama sigue su curso para arriba y yo no me quemo, ¿ok? 00:04:46
¿Cuánto lo tengo que calentar? Muy poquito, muy poquito. Muy poquito. A ver, muerto, muerto, 00:04:52
lo vamos a matar bien muerto. Porque esto ya, solo al secarse ya, el pobre se queda muerto. 00:04:58
Entonces, lo que queremos es que además de un poco muerto, queremos que se muera, 00:05:03
pero que no se destruya y se desintegre. O sea, que mantenga la estructura por lo menos 00:05:06
de la pared celular, que es lo que vamos a tener, ¿no? Entonces, si tocáis por abajo, 00:05:10
por abajo no hay bacterias. Cuidado que no tenemos guantes en este momento, ¿vale? 00:05:15
Si tocáis por abajo, los guantes son para manipular las plantas, no sea que os contaminéis, 00:05:19
pero en este momento, cuando manejáis el mechero, no. Si tocáis por abajo, por donde 00:05:23
no hay bacterias, claro, y os quemáis, creo que os habéis pasado, porque igual que os 00:05:27
estáis quemando vosotros, pues las bacterias las habéis desfigurado ya, la pobre, ¿no? 00:05:31
Las habéis cocido y no se trata ni de cocerlas ni de asarlas, se trata de que se queden pegadas 00:05:35
al... Entonces, ya está. Y ahora lo vamos a ir sumergiendo un minuto en cada una de 00:05:39
las suspensiones, de las soluciones, perdón, siguiendo el siguiente protocolo. Vamos a 00:05:46
apagar esto ya, que no lo necesitamos. Siguiendo el siguiente protocolo. Tijas. 00:05:51
He borrado la úrula que tenía aquí. Un minuto. Por tanto, repito, primero, extender 00:05:56
en una botinrina diminuta de agua, ¿vale? Segundo, secar. Tercero, fijar a la llama. 00:06:07
Cuarto, teñir. Y esto es teñir. Un minuto, cristal violeta. ¿Cuál es el cristal violeta? 00:06:14
Pues de los tres contenedores que va a haber aquí, pues el que es evidentemente de color 00:06:20
violeta. Quedaros con el color, porque este va a ser el color del gram positivo cuando 00:06:24
lo veamos al microscopio. Si es violeta, va a ser gram positivo, coge el primer color. 00:06:28
Todas las tensiones diferenciales tienen una tensión inicial con un colorante inicial, 00:06:32
una decoloración, que quita ese colorante inicial de las que vamos a llamar negativas 00:06:37
para la tensión, de lo de gram negativas, que son las que se lava el colorante cuando 00:06:41
haces la operación de lavado. Y luego, lo que se llama un colorante de contraste, que 00:06:48
en este caso va a ser la safranina, que es de color rosa. ¿Por qué se utiliza? Porque 00:06:54
yo puedo tener bacterias gram positivas y gram negativas, ¿vale? Las gram positivas 00:06:59
van a retener el colorante inicial durante toda la tensión, por eso son positivas. 00:07:03
Pero las gram negativas, cuando yo lave ese colorante en el segundo paso, realmente en 00:07:07
el tercero ya veréis, entonces se van a quedar otra vez transparentes. Y un microscopio realmente 00:07:12
funciona con luz transmitida, y si es una cosa transparente sobre un fondo luminoso, 00:07:19
pues no lo veo. Entonces tengo que utilizar un colorante de contraste para poder verlo. 00:07:23
Y claro que eso es otro color, pues si no, vaya faena. Entonces, esas que se me han decolorado 00:07:27
y no se van a ver de este color violeta opaco, se van a ver de un color rosita más clarito, 00:07:31
que parece que no, pero es más clarito. Entonces, primer paso, cristal, violeta, un minuto. 00:07:37
¿Qué se hace después? Pues habrá un frasco lavador por aquí a mano, iremos a un sitio 00:07:43
donde el agua reemos mucho, un regadero o lo que sea, o un contenedor o tal. 00:07:47
Puedo llevar esto si queréis, la lavamos aquí. 00:07:54
Eso. Y se lava ese primer colorante hasta que se baje, la mayoría. No hace falta secar 00:07:56
entre paso y paso, con escurrir un poco ya basta para que no se diluya el siguiente colorante. 00:08:03
Y lo siguiente que vamos a echar es un minuto de Lugol. ¿Alguien sabe lo que es el Lugol? 00:08:07
Una quesadita para... 00:08:13
Exacto, sí, sí. Exacto, es yodo potásico. Realmente es yoduro, yodo. 00:08:16
Se utiliza para detectar el albinón. Es guay porque el albinón se pone azul en presencia de yodo. 00:08:24
El yodo es esto, que es este color así marroncillo. De hecho, ¿sabéis lo que es el betadine? 00:08:31
Pues es Lugol, es una quesadita, es casi lo mismo. Es un desinfectante. 00:08:37
Entonces, es yodo. Entonces, esto lo que hace, lo sabemos empíricamente, lo descubrió un señor 00:08:41
Juan de Cristian Ramos, lo que hace es fijar muy bien en el perfil glucano de las gran positivas 00:08:49
que tienen mogo yodo, no tienen otra cosa en la parámetro rural casi, fijar muy bien el cristal libre 00:08:56
de tal manera que ya no se va a ir. 00:09:01
Luego eso que llamamos un mordiente, es decir, fija la molécula del primer colorante 00:09:03
de manera indebida en la pared celular de los gran positivos. 00:09:08
Luego es un segundo paso, digamos, de tinción en los gran positivos. 00:09:11
Y ahora sí, ahora viene el lavado. El lavado va a ser con alcohol acetona. 00:09:16
Hay varios protocolos del gram, nosotros hemos traído alcohol acetona. 00:09:21
Como sabéis son disolventes, disolventes orgánicos, lo que van a hacer es deshidratar, 00:09:25
el alcohol es un disolvente distinto al agua, deshidratar la pared celular de las gram negativas 00:09:30
que tiene una bicapa lipídica externa, recordad, donde está el lipo polisacarico famoso, 00:09:35
y eso va a expulsar el colorante y entonces las gram negativas no van a decolorarse. 00:09:40
Las gram positivas no, porque se ha quedado ahí pegado, tienen mucho pérdido glucano 00:09:44
y esas, aunque las deshidrates y tal, esas ya se quedan tenidas de morado. 00:09:48
¿Cuánto tiempo? Bueno, esto no necesitamos un cacharro, simplemente este es el alcohol acetona, 00:09:53
lo que vamos a hacer es escurrir un poquito sobre un cacharro que tengamos aquí, 00:09:59
o en el fregadero, escurrimos unas gotitas de esto por encima de la preparación, chiquichí, 00:10:04
y con eso ya se lava el colorante, pues 10 segundos así, que escurra, 00:10:09
y veréis que de hecho se va el grueso del primer colorante, ¿vale? 00:10:14
Laváis con agua, otra vez, entre paso y paso siempre hay que lavar un poquito con agua, 00:10:19
no hace falta secar, escurrís un poquillo así y el cuarto paso en este caso es añadir la safranina, 00:10:26
que es el colorante de contraste para teñir a las gram negativas, 00:10:35
que se les ha ido la safranina durante un minuto. 00:10:38
La safranina será esta, entonces lo que vamos a hacer es preparar... 00:10:44
No se ve... 00:10:49
Y esto, que parece granadina, parece sangre de vampiro, esto es la safranina. 00:11:20
Muy bien, entonces nada, pues simplemente, fijaos, para hacer la adicción de gram, 00:11:28
ya lo tenemos seco, lo tengo fijado a la llama, ya la llama no la necesito, 00:11:34
pues nada, lo pongo aquí y cuento un minuto. 00:11:38
No valen 50 segundos ni 70, tiene que ser 60, porque si no nos pasamos y el protocolo... 00:11:41
¿Pero no tenemos reloj? 00:11:47
No tenemos reloj, dios mío, entonces... 00:11:49
Mi móvil tiene una especie de reloj. 00:11:54
Vale, entonces lo tenemos así, fijaos, no voy a hacer todo el proceso, 00:11:58
tenemos un cacharro para no salvaguardar aquí muchos hijos, me vale una palancana o así. 00:12:02
Pero esto es muy pequeño, necesito más. 00:12:08
¿Me pongo más grande? 00:12:11
¿Un cristalizador? 00:12:14
Vale, entonces imaginaos que ha pasado un minuto, esto es ciencia ficción, 00:12:23
pero imaginaos que ha pasado un minuto, pues ya está, es el primer paso. 00:12:27
Ha pasado un minuto... 00:12:35
Tiene que acordarse siempre el lado por el que está la bacteria, porque si no... 00:12:37
Entonces, echamos, lavamos con agua... 00:12:42
Fijaos, no está moviendo célula, pero está moviendo que toda esta guarrería se me ha teñido, ¿eh? 00:12:51
¿Lo veis, no? 00:12:56
Vale, un minuto luego... 00:12:58
Aquí caben como 6 o 7, podéis trabajar unos cuantos a la vez si queréis. 00:13:01
Un minuto aquí... 00:13:06
Vamos a imaginar que ya ha pasado un minuto... 00:13:11
Bueno, esto no va a haber quien lo vea porque no estoy respetando los tiempos. 00:13:13
Es que se lo estoy enseñando solo. 00:13:19
Creo que Claudia ha puesto el cronómetro. 00:13:23
¿Claudia ha puesto el cronómetro? 00:13:25
Menos mal que tenemos a alguien serio en este... 00:13:27
Pero ella va a pitar primero. 00:13:31
El segundo, el segundo. 00:13:35
¿Alguna pregunta hasta aquí? 00:13:38
Cinco, cuatro, tres... 00:13:44
¿Qué está ocurriendo? 00:13:49
Pues el dióxido de potásico está facilitando la unión... 00:13:51
¿Y por qué? 00:13:55
Eso es química pura. 00:13:57
Os aviso que esto ni Graham lo sabía. 00:14:00
Esto es absolutamente empírico. 00:14:03
Era un tío loco que había en el laboratorio de Robert Koch 00:14:05
que se dedicó a hacer muchas cosas de colores 00:14:07
y se dedicaba a hacer cinciones de tipo histológico. 00:14:10
Entonces tenía todos los colorantes que se utilizaban en histología 00:14:15
y decía a ver cuáles me valen para los microorganismos pequeñitos, para las bacterias. 00:14:18
Entonces empezaba a hacer combinaciones y vio con esto 00:14:22
y digo, Polina, hay dos tipos de bacterias, 00:14:24
las que se me decoloran y las que no. 00:14:26
Y ahora viene el paso esencial de todas las cinciones diferenciales, 00:14:29
que es la decoloración. 00:14:34
Siempre la hago entre paso y paso. 00:14:36
Fijaos que se me ha quedado ya un poco raro, 00:14:38
porque he mezclado el morado con el este, pero bueno. 00:14:40
Que es el lavar con alcohol acetona. 00:14:43
Y esto es lo que os digo. 00:14:46
Churruflú, churruflú, churruflú. 00:14:48
Churruflú. 00:14:50
Dejáis circular esto así. 00:14:51
¿Vale? 00:14:54
Y ya está. 00:14:55
Ya está. 00:14:57
Si había aquí algún Graham negativo, 00:14:58
solo con ver el alcohol acetona ya se ha decolorado. 00:15:00
Vuelvo a lavar. 00:15:03
Tampoco echéis los chorros a lo bestia ahí, 00:15:06
porque si no está muy encijado, pues se os va de todo. 00:15:08
Algunas bacterias se tienen que quedar pegadas, ¿no? 00:15:10
Y ahora, ¿qué nos queda? 00:15:12
¿Qué ha pasado? 00:15:15
Las Graham negativas han perdido la risa y han perdido el color. 00:15:16
Hay que teñirlas con safranina. 00:15:19
La safranina tiene la misma raza que el azafrán. 00:15:22
La hebra del azafrán. 00:15:26
¿No? 00:15:28
¿Cómo se dice azafrán en inglés? 00:15:29
Saffron. 00:15:31
¿No? 00:15:32
Safranina. 00:15:33
Pues más o menos se tiene en ese color. 00:15:34
Aquí parece que está muy concentrado, 00:15:37
pero luego las bacterias se vienen de un color rosa muy clarito. 00:15:39
Tan clarito que a veces es difícil enfocarlos. 00:15:42
Es un color luminoso. 00:15:45
Los Graham positivos se enfocan muy bien, 00:15:47
porque es un color oscuro, 00:15:49
pero los Graham negativos se enfocan regulio, ¿verdad? 00:15:50
Los que habéis oído aquí, 00:15:53
que han tenido prácticas en tercero de farmacia, 00:15:54
saben que son difíciles. 00:15:57
¿Ya está? 00:16:01
Sí. 00:16:02
¿Ya está la safranina? 00:16:03
Pues ya está. 00:16:05
Ya hemos sacado. 00:16:06
Entonces ya solo nos quedaría ir al microscopio, 00:16:07
que se seque del todo, 00:16:13
ir al microscopio y mirar. 00:16:15
Digo que se seque del todo, 00:16:17
porque normalmente las bacterias se miran directamente a mil aumentos. 00:16:18
Es decir, con el objetivo de cien por, 00:16:23
que son tan chiquitinas, 00:16:25
y aún así a mil aumentos... 00:16:26
Sí, es eso. 00:16:29
Entonces, se necesita un objetivo de inmersión. 00:16:31
No sé si sabéis de qué va esto. 00:16:34
Básicamente, si aumentamos el índice de refracción del medio 00:16:37
que hay entre la lente objetivo y la muestra, 00:16:41
aumentamos el límite de detección, 00:16:44
la capacidad de resolución del microscopio, 00:16:48
del sistema óptico. 00:16:51
Entonces, el aceite de cedro, 00:16:52
se pone una gota de aceite de cedro entre la muestra y el objetivo. 00:16:54
La distancia focal es muy corta. 00:16:59
Es tan corta que no se puede poner un cubre, 00:17:01
porque es más corta que el tamaño de un cubre, 00:17:03
que son 0,16 milímetros. 00:17:08
O sea, que está casi pegando a la lente y está sumergido en aceite. 00:17:11
Y de esa manera se consigue una resolución que es la máxima 00:17:14
que te da un sistema de microscopía óptica. 00:17:17
La máxima. 00:17:20
O sea, no se han inventado lentes, 00:17:21
no se puede físicamente conseguir una detección. 00:17:23
Autor/es:
Departamento de Ciencias Naturales - IES Alpajés
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24 de febrero de 2023 - 11:55
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