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UT4 - Técnicas de PCR - 4ª Parte - Contenido educativo

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Subido el 1 de diciembre de 2023 por Pedro M.

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Bien, vamos a ver la última parte del tema 6 sobre las técnicas de PCR. 00:00:00
Si recordáis, el último día estuvimos viendo la PCR convencional, que es una técnica de 00:00:07
PCR la más sencilla y la de uso rutinario en los laboratorios. 00:00:12
Vamos a ver algunas modificaciones, otras técnicas de PCR. 00:00:19
La primera de ellas es la PCR que llamamos anidada o nested PCR en inglés. 00:00:22
¿En qué consiste la PCR anidada? 00:00:28
La PCR anidada consiste en realizar dos PCR simultáneas, seguidas, perdón, simultáneas 00:00:30
no, sucesivas. 00:00:36
Dos reacciones de PCR que van acopladas, que son sucesivas, de tal manera que voy a hacer 00:00:38
una primera PCR con una pareja de primers y una segunda PCR a continuación en la que 00:00:42
voy a utilizar como DNA molde los productos de amplificación de la primera. 00:00:50
¿De acuerdo? 00:00:57
Para este tipo de PCR, ¿cuándo la utilizamos, la PCR anidada? 00:00:58
Cuando tenemos problemas de sensibilidad o de especificidad, es decir, cuando hay problemas 00:01:02
de sensibilidad, es decir, tenemos poco DNA, ¿de acuerdo? 00:01:07
La muestra hemos podido extraer poquito DNA porque había poquitas células en la muestra 00:01:12
de un paciente, por ejemplo, y por tanto nos está dando una PCR con muy bajo rendimiento. 00:01:16
Esto significa que aunque ha amplificado la PCR, ha amplificado con un bajo rendimiento, 00:01:23
hay pocas copias y me cuesta mucho analizarlas, ¿de acuerdo? 00:01:29
Por tanto, si tengo baja sensibilidad, puedo utilizar la PCR anidada, que vamos a ver ahora 00:01:34
en qué consiste. 00:01:39
Pero también la puedo utilizar si tengo problemas de inespecificidad, es decir, no veo una única 00:01:40
banda en el gel de agarosa, sino que veo varias bandas y por tanto los primers se han ido 00:01:47
uniendo de forma inespecífica a muchos sitios del DNA molde, ¿de acuerdo? 00:01:51
Tanto para aumentar la sensibilidad como para aumentar la especificidad, yo puedo utilizar 00:01:58
la PCR anidada. 00:02:03
Como decía antes, para poder realizar la PCR anidada necesito dos parejas de primers, 00:02:05
unos primers que llamamos externos y unos primers internos, externos al fragmento del 00:02:13
amplicón, al fragmento que quiero amplificar, el de interés, y unos cebadores internos 00:02:19
que son los que van a amplificar el fragmento de interés. 00:02:24
Estos cebadores externos los voy a utilizar en la primera PCR que realizo, ¿de acuerdo? 00:02:30
Para esta primera PCR voy a utilizar el DNA molde que tengo poquito concentrado, el que 00:02:37
he extraído, y una vez haya acabado esa primera PCR, cogeré esos amplicones, los 00:02:44
voy a utilizar como DNA molde para una segunda PCR en la cual utilizaré una segunda pareja 00:02:50
de primers que son los cebadores internos, ¿de acuerdo? 00:02:57
Por tanto, para la primera PCR, si este es mi fragmento de interés, el que me interesa 00:03:03
amplificar, y este es el DNA molde que, por ejemplo, lo tengo a una concentración muy 00:03:09
baja, he podido extraer poco DNA, o lo he utilizado en otras PCRs pero me ha dado mucha 00:03:15
inespecificidad, utilizo este DNA molde con esta pareja de primers externos, ¿de acuerdo? 00:03:21
Externos significa que están el forward bastante por encima y el reverse bastante por debajo 00:03:29
del fragmento que quiero amplificar, por eso se le llaman externos. 00:03:36
Realizo la PCR y yo voy a obtener en mi tubo de PCR una serie de amplicones. 00:03:40
Estos amplicones, como tengo poquito DNA, seguramente en un gel de agarosa no soy capaz 00:03:48
de detectarlo porque se han amplificado poca cantidad. 00:03:54
¿Por qué? 00:03:59
Porque el DNA estaba poco concentrado. 00:04:00
Ahora parto de estos amplicones y los voy a utilizar como DNA molde para una segunda 00:04:02
reacción de PCR. 00:04:10
En esta segunda reacción de PCR voy a utilizar la segunda pareja de primers, como veis aquí, 00:04:12
es la pareja interna, que es la que me va a permitir amplificar el fragmento que a mí 00:04:18
me interesaba. 00:04:27
Si os dais cuenta, gracias a haber realizado una primera PCR, imaginaos que yo tenía de 00:04:28
DNA molde, voy a hacerlo así como si fuera una caricatura, tenía 100 copias, ¿de acuerdo? 00:04:34
Y ahora he obtenido una cantidad exponencialmente mayor de amplicones. 00:04:42
En lugar de 100, pues a lo mejor lo que tengo ahora es un millón de copias de amplicón 00:04:49
y esto lo voy a utilizar como DNA molde en la segunda amplificación, de tal manera que 00:04:54
ahora, después de la segunda PCR, la cantidad de amplicón que yo detecto de mi fragmento 00:04:59
de interés sí que la puedo detectar en un gel de agarosa, ¿se entiende? 00:05:05
Por tanto la PCR anidada la voy a utilizar cuando tengo problemas de sensibilidad y o 00:05:11
problemas de especificidad, ¿de acuerdo? 00:05:16
Muy bien. 00:05:20
¿Por qué también para problemas de especificidad? 00:05:21
Porque si os dais cuenta, gracias a esta primera PCR, el DNA molde que pongo en la segunda 00:05:24
PCR es este fragmento único y me quito de en medio todo el DNA que tengo por aquí y 00:05:28
por aquí, ¿vale? 00:05:36
Y todas las moléculas, todos los cromosomas de DNA que tengo, por ejemplo, en células 00:05:38
eucariotas me lo he quitado de en medio, de tal manera que en la segunda PCR estoy metiendo 00:05:43
un fragmento muy pequeñito de todo el genoma de las células eucariotas y por tanto, si 00:05:48
tenía problemas de especificidad, aquí los voy a perder, ya no voy a tener problemas 00:05:54
de especificidad porque estos cebadores forward y reverse, los primers internos, esta pareja 00:05:58
de primers internos, solamente pueden unirse a este DNA molde, ¿de acuerdo? 00:06:06
Y por tanto disminuye mucho la inespecificidad. 00:06:12
Una segunda técnica de PCR es lo que llamamos la PCR múltiple o en inglés multiplex PCR, 00:06:17
¿de acuerdo? 00:06:24
Que consiste ni más ni menos que hacer una PCR pero en lugar de poner una pareja de primers, 00:06:25
voy a poner dos parejas de primers o tres, ¿de acuerdo? 00:06:32
¿Para qué? 00:06:36
Para amplificar más de una secuencia de DNA y en la misma PCR obtener dos, tres o cuatro 00:06:37
fragmentos amplificados a la vez, ¿de acuerdo? 00:06:45
Para que esto lo pueda realizar, la pareja de primers debe cumplir varios requisitos, 00:06:49
el primero es que deben tener la misma temperatura de anilin, claro, si una pareja de primers 00:06:55
su temperatura de anilin es 55 y la otra es 58, ¿cuál de las dos temperaturas pongo 00:07:01
en el termociclador, en la programación del termociclador? 00:07:08
Sería un lío. 00:07:13
Por lo tanto, las dos o tres parejas de primers que utilice deben tener la misma temperatura 00:07:14
de anilin. 00:07:20
En segundo lugar, los amplicones deben ser muy diferentes de tamaños, de tal manera 00:07:21
que cuando yo corra las PCRs en el gel de agarosa, vea de forma clara y nítida dos 00:07:26
o tres bandas completamente diferentes, de tamaño muy diferentes, claro, si los tamaños 00:07:35
son muy parecidos, las bandas van a sola par en el gel de agarosa y no voy a ser capaz 00:07:41
de diferenciarlas. 00:07:46
Y por último, que entre los cuatro primers, imaginaos que pongo dos parejas de primers, 00:07:47
tendré dos forward y dos reverse, que entre ellos no haya hibridación cruzada y no se 00:07:53
formen primer dimers, dimeros de primers que me puedan secuestrar los primers y por tanto 00:07:58
me den problemas de bajo rendimiento, ¿de acuerdo? 00:08:06
Por tanto, estas parejas de primers hay que diseñarlas muy bien para que no haya hibridación, 00:08:12
para que amplifiquen amplicones muy diferentes de tamaño y la temperatura de anilin sea 00:08:17
la misma, ¿de acuerdo? 00:08:24
La aplicación más sencilla de PCR múltiple es aquella en la que en el mismo tubo de la 00:08:27
PCR con la muestra del paciente voy a incorporar el control positivo, que es lo que llamamos 00:08:35
un control positivo interno, ¿de acuerdo? 00:08:41
Control positivo interno no es ni más ni menos que poner en la mezcla de reacción donde 00:08:45
está el DNA molde del paciente una pareja de primers que yo sé que amplifican una secuencia 00:08:50
control que van a amplificar sí o sí. 00:08:58
De tal manera que ya no necesito poner, si os acordáis de lo que veíamos en la clase 00:09:02
anterior, un tubo de PCR con el DNA de cada paciente y añadir un control positivo y un 00:09:08
control negativo, sino que solamente añado a cada uno de los tubos que llevan el DNA 00:09:14
del paciente añado los primers del control positivo y ya no tengo que poner un tubo de 00:09:23
control positivo y un tubo de control negativo, ¿de acuerdo? 00:09:27
De esta manera, con esta PCR múltiple, por un lado, me evito de tener que preparar un 00:09:32
control positivo y un control negativo porque lo veo todo en el mismo gel y al correr cada 00:09:39
una de las muestras de los pacientes, como vemos aquí. 00:09:49
De tal manera que, en segundo lugar, yo podría obtener en una PCR múltiple de este estilo 00:09:52
tres posibles resultados, un resultado positivo, un resultado negativo o un resultado no válido. 00:09:58
¿De acuerdo? 00:10:04
Fijaos, en este gel hicieron un experimento con la muestra de ocho pacientes y en cada 00:10:07
uno de los tubos de PCR metieron dos parejas de primers. 00:10:16
La pareja de primers que amplifica un fragmento más pequeño, este de aquí, es la pareja 00:10:20
de primers que corresponde al control positivo. 00:10:26
Si os dais cuenta, todos los pacientes, en todos los pacientes, en todos los DNAs, esta 00:10:29
banda tiene que amplificar sí o sí, pero además añadieron la pareja de primers específica 00:10:35
para el gen que querían detectar. 00:10:42
Si os dais cuenta, en el paciente 1, 2, 3 y 8, el resultado es positivo, es decir, los 00:10:45
pacientes tienen el gen, tened cuenta, tienen el gen, pero además es el resultado positivo 00:10:53
y me lo puedo creer porque también ha amplificado el control positivo. 00:11:01
Los pacientes 4, 5 y 6 y 7 me dan un resultado negativo, si os dais cuenta, no ha amplificado 00:11:07
la banda específica, yo diría, estos pacientes son negativos para ese gen. 00:11:14
Imaginaos que estoy haciendo un análisis del coronavirus, me lo invento, yo diría, 00:11:19
el paciente 1, 2, 3 y 8 son positivos, los pacientes 4, 5, 6 y 7 son negativos porque 00:11:25
no detecto el DNA del virus, del coronavirus, ¿de acuerdo? 00:11:33
¿Cuándo diré que el resultado no es válido? 00:11:42
Cuando no se amplifique la banda del control. 00:11:45
Imaginaos que en el paciente 1 observo la banda específica, pero no observo esta. 00:11:49
Este resultado no me lo puedo creer, ¿por qué? 00:11:58
Porque esta banda de aquí, la del control, tendría que haber amplificado sí o sí. 00:12:01
Si no ha amplificado es que ha habido algún problema, algún problema en este tubo o con 00:12:06
esta muestra. 00:12:12
Por tanto, esta muestra la tendría que repetir. 00:12:13
Por tanto, con esta PCR múltiple en la cual incorporo una segunda pareja de primers, además 00:12:17
del primer específico correspondiente a esta segunda pareja a un control positivo interno, 00:12:24
hace que en la misma muestra con el mismo DNA del paciente y en el mismo tubo con la 00:12:30
misma PCR yo pueda decir si el resultado es positivo, si es negativo o incluso si no fuera 00:12:36
válido y hubiera que repetir, ¿de acuerdo? 00:12:41
Y después tenemos la PCR con transcripción inversa. 00:12:47
Se utiliza muchísimo. 00:12:51
Ya sabemos que la DNA polimerasa estermoestable utiliza como molde DNA. 00:12:54
¿Qué es lo que ocurre si lo que yo quiero hacer es una PCR no de un DNA molde, sino 00:12:59
de un RNA, por ejemplo, de un RNA mensajero de la célula? 00:13:05
Como la DNA polimerasa solamente, estas DNA polimerasas termoestables solamente utilizan 00:13:10
como molde DNA, este RNA mensajero que quiero detectar y amplificar por PCR tengo que pasarlo 00:13:17
y transformarlo primero en DNA. 00:13:27
Para ello utilizo la retrotranscriptasa, ¿de acuerdo?, o transcriptasa inversa, que si 00:13:32
os acordáis, si os acordáis que ya lo vimos en temas anteriores, la transcriptasa inversa 00:13:39
es una DNA polimerasa RNA dependiente que tienen los retrovirus, por ejemplo, el virus 00:13:45
del SIDA es un retrovirus, tiene su genoma es RNA, cuando infecta una célula, inyecta 00:13:54
también la infecta con el RNA, inyecta la retrotranscriptasa dentro de la célula, transforma 00:14:03
su RNA en un DNA que llamamos cDNA, que es DNA copia o complementario y es este DNA complementario 00:14:10
el que el virus integra para que pase desapercibido dentro de la célula eucariota, ¿de acuerdo? 00:14:22
Por encima la retrotranscriptasa la podemos utilizar en el laboratorio, de tal manera 00:14:29
que yo para poder realizar una RT-PCR voy a hacer dos pasos, un primer paso previo en 00:14:33
el cual voy a coger el RNA que he extraído, ¡ojo!, y esto es importante, yo no voy a 00:14:41
extraer DNA, sino que yo de las células del tejido que tengo que analizar voy a extraer 00:14:47
el RNA, no lo hemos visto como se hace, pero extraigo el RNA y a partir de este RNA extraído 00:14:53
hago un primer paso de retrotranscripción o transcripción inversa con la RT, de tal 00:15:01
manera que ese RNA lo transformo en su DNA copia o DNA complementario y este DNA complementario 00:15:08
es el que voy a utilizar ahora sí como DNA molde para el segundo paso que es la PCR convencional 00:15:15
normal, ¿de acuerdo? Bueno, no es una PCR convencional normal, sino que ahora veremos 00:15:22
en qué se diferencia, ¿de acuerdo? Entonces estos dos pasos puedo realizarlos en tubos 00:15:31
diferentes, por tanto primero hago en un tubito el cDNA y una vez ya tengo el cDNA en otro 00:15:39
tubito hago la PCR o hay sistemas actualmente donde puedo hacerlo todo en el mismo tubo 00:15:45
y a la vez, ¿de acuerdo? De tal manera que en el mismo tubo lo meto en el termociclador 00:15:52
con un programa para sintetizar cDNA y después cambio el programa del termociclador sin ni 00:15:58
siquiera abrir el termociclador, pongo el programa de la PCR y me hace la PCR en el 00:16:04
mismo tubo, ¿de acuerdo? Muy importante, la transcriptase inversa como es una DNA polimerasa 00:16:09
RNA dependiente requiere un cebador, si no hay cebador no puede sintetizar, de tal manera 00:16:18
que para la transcripción inversa además de la encima de la transcriptase inversa o 00:16:25
RT tengo que añadir un único cebador. Este cebador se unirá al RNA de tal manera que 00:16:32
ahora sí que tengo ya una zona, una región de bicatenaria y la transcriptase inversa 00:16:41
que es una DNA polimerasa RNA dependiente se unirá y se sintetizará un DNA complementario. 00:16:47
Con este DNA complementario después de naturalizarlo es el que yo voy a utilizar para hacer mi 00:16:56
PCR, ¿de acuerdo? Para hacer la PCR. Muy bien. Este cebador lo puedo diseñar de tal 00:17:05
manera que gracias a este cebador yo pueda amplificar todos los RNAs de la célula, transformarlos 00:17:19
a cDNAs o incluso un único RNA mensaje. ¿Por qué? Porque para la transcripción 00:17:27
inversa del RNA molde yo puedo utilizar tres estrategias, tres primers diferentes. El primer 00:17:37
tipo de primers que puedo utilizar son lo que llamamos los random priming. Los random 00:17:43
priming son hexanucleótidos degenerados, son primers de seis nucleótidos, por tanto 00:17:48
son primers tremendamente pequeños. ¿Y por qué le llamamos degenerados? Porque están 00:17:55
hechos al azar. La secuencia de primers es al azar. Son seis nucleótidos que los genera 00:18:00
una máquina, los generamos artificialmente en el laboratorio. De tal manera que tengo 00:18:07
una mezcla, cuando hablo de un primer random no es ni más ni menos que una mezcla de primers 00:18:13
pequeñitos de seis nucleótidos de secuencia random, aleatoria. Claro, cuando yo ponga 00:18:20
estos primers se van a pegar a cualquier tipo del RNA que yo he extraído. RNA ribosómico, 00:18:28
mensajero, RNA de transferencia, por tanto, utilizando la estrategia de primers random 00:18:36
aleatorios voy a transformar en cDNA todos los RNAs de la célula. ¿Qué ocurre si lo 00:18:43
que yo quiero es amplificar solo los mensajeros? Acordaos que el RNA ribosómico es el 80% 00:18:52
del RNA de las células y yo lo que quiero amplificar es un mensajero. Utilizo una segunda 00:18:58
estrategia que es utilizar lo que llamamos un primer oligo de T, que no es ni más ni 00:19:04
menos que un primer en el que tengo oligo unas cuantos timinas. Son timinas. Es un primer todo 00:19:09
de timinas. Puede tener 14, 16, 18 hasta 22 timinas. ¿Cómo este primer oligo de T solamente 00:19:17
me amplifica el mensajero? Muy sencillo. Solo amplifica a los mensajeros porque de toda la 00:19:28
secuencia de los RNAs un oligo de T es complementario a la cola polia, si os dais cuenta. 00:19:34
Los oligo de T, ese cebador oligo de T se va a unir a la cola polia. ¿Qué RNAs de la célula tienen 00:19:41
polia? La cola polia solamente los RNA mensajeros. De tal manera que los oligo de T se van a unir a 00:19:48
la cola polia de todos los RNA mensajeros y la retotranscriptasa va a sintetizar el DNA copia 00:19:58
de todos los RNA mensajeros. ¿De acuerdo? Por tanto, con oligo de T amplificaré todos los mensajeros. 00:20:05
Pero si yo lo que quiero es amplificar de todos los mensajeros solamente uno, el RNA mensajero 00:20:13
de un gen en concreto que quiero estudiar, entonces lo que tengo que hacer es diseñar un primer, 00:20:20
que es lo que han hecho aquí, diseñar un primer que sea específico, único, exclusivo de la 00:20:26
secuencia de ese RNA mensajero. De tal manera que ese cebador no solamente voy a cribar los 00:20:34
RNA ribosómicos, sino que también voy a cribar dentro de los RNA mensajeros para que se una 00:20:41
específicamente a un solo mensajero. De tal manera que el cDNA que obtengo, este cDNA que lo voy a 00:20:46
utilizar como molde para mi PCR, es un único cDNA que procede de un único RNA mensajero. De tal manera 00:20:56
que estos amplicones son tremendamente específicos para un único mensaje. ¿De acuerdo? Muy bien. 00:21:03
Estas otras técnicas, si os dais cuenta, están basadas en la PCR convencional. Cuando hablamos 00:21:12
de yo realizo un ciclo de PCR, estamos hablando de realizo una PCR convencional, pero parto de 00:21:18
material diferente en cada uno de estos tres tipos de PCR. Vamos a ver ahora, en la última parte del 00:21:26
tema, un tipo de PCR completamente diferente. ¿De acuerdo? Es la PCR a tiempo real. ¿Por qué 00:21:32
se llama PCR a tiempo real? Porque todas las PCR que hemos visto en el tema hasta ahora son 00:21:42
reacciones de PCR a punto final o a tiempo final. Es decir, hago la mezcla de reacción, pongo el 00:21:48
MasterMix en los tubos, añado el DNA molde, la pongo en el termociclador, hace toda la PCR y 00:21:57
analizo a tiempo final, después de acabar la PCR, analizo los resultados. ¿La PCR a tiempo real? No. 00:22:06
Voy a monitorizar el proceso de amplificación. ¿Cómo? Voy a utilizar productos fluorescentes y 00:22:14
un termociclador que tiene un lector de fluorescencia. De tal manera que voy a ir 00:22:21
detectando ciclo a ciclo el número de amplicones que se van generando. Y esto es muy importante, 00:22:28
por eso se llama a tiempo real. De tal manera que ciclo a ciclo yo voy a saber, voy a tener un dato 00:22:37
exacto, exacto, de cuántos amplicones se van generando ciclo a ciclo. ¿Cómo lo hago? Utilizando 00:22:43
fluorocromos. ¿De acuerdo? Fluorocromos ya sabéis que son moléculas fluorescentes y por tanto necesito 00:22:52
un termociclador un poquito especial que tenga un lector de fluorescencia. ¿Ventajas? Y esto es 00:22:59
muy importante. Tremendamente rápida. Ya os dije que la PCR convencional aproximadamente 30 ciclos, 00:23:06
son dos horas y media de PCR. Para una PCR a tiempo real, que se suele hacer 35, normalmente 00:23:15
suele hacer 40 ciclos, lo realiza en tres cuartos de hora. Si yo quiero realizar después un análisis 00:23:23
para ver las bandas de fusión, que lo veremos al final, ¿de acuerdo? Se alarga un poquito más y 00:23:32
puede llegar a una hora y media, a una hora tres cuartos. Por tanto es muchísimo más rápido la 00:23:40
detección cualitativa. Segunda ventaja. Los resultados son muchísimo más fidedignos. Es 00:23:46
decir, no voy a ver los resultados en un gel de agarosa que hasta cierto punto puede ser subjetivo 00:23:52
porque yo veo la banda más intensa o menos intensa según mi ojo. Por tanto aquí el resultado es muy 00:24:02
objetivo porque los datos los va a leer un lector de fluorescencia y van a ser datos matemáticos, 00:24:08
¿de acuerdo? Son datos concretos de cantidad de amplicones, ¿de acuerdo? Y además es tremendamente 00:24:15
más sensible, muchísimo más sensible. Es decir, si os acordáis, si yo el DNA lo tenía muy poquito 00:24:23
concentrado, ya hemos visto antes que tengo que hacer una PCR anidada. Aquí no hace falta. Aquí 00:24:31
la PCR a tiempo real va a detectar el DNA aunque esté muy poquito concentrado. Tercera ventaja. Menor 00:24:37
probabilidad de contaminación, ¿de acuerdo? Yo pongo la mezcla de reacción, pongo el DNA, lo meto en el 00:24:44
termociclador y no vuelvo a tocar. Cuando acaba la PCR tengo todos los datos en el ordenador y los 00:24:50
analizo en el ordenador. No tengo que abrir el tubo, hacer la mezcla, meterlo en el gel de agarosa. 00:24:57
En todo este proceso se puede contaminar el producto de PCR. Y por último, y quizás la más 00:25:03
importante como ventaja, es que puedo obtener datos cuantitativos de dos parámetros. Sé 00:25:10
cuantitativamente, ciclo a ciclo, cuántos amplicones están generando y también puedo 00:25:17
cuantificar la cantidad de DNA inicial que tenía de una forma muy exacta, ¿de acuerdo? Tantos 00:25:23
microgramos de DNA tenía mi muestra, tantos picogramos, etcétera, etcétera. ¿De acuerdo? 00:25:32
Muy bien, ya hemos dicho que utilizamos sistemas fluorescentes para detectar los amplicones. 00:25:38
Primero vamos a hacer una pequeña introducción, que no viene en el libro, sobre qué es la 00:25:44
fluorescencia por si alguno no lo habéis visto. Los sistemas fluorescentes utilizan fluorocromos, 00:25:48
son moléculas de este estilo que tienen muchos anillos aromáticos, ¿vale? Esta me parece, 00:25:53
si no recuerdo mal, es la fluorescina. ¿Qué ventaja o qué característica tienen estas 00:26:00
moléculas de fluorocromos? Que si yo a esta molécula le hago incidir una luz de una longitud 00:26:06
de onda determinada, un láser, ¡bum!, y la irradio con un láser, parte de los electrones 00:26:13
que tienen en estos anillos aromáticos saltan a un orbital de mayor energía. Ya sabéis 00:26:19
que los electrones en los átomos están en los orbitales. Este electrón está tan pancho, 00:26:27
está en su orbital, tranquilo. Si yo lo excito, ¿vale?, porque le hago incidir un rayo láser de 00:26:32
una longitud de onda determinada, capta esa energía y se va a un estado energético superior. 00:26:40
Claro, aquí no puede estar eternamente, sino que este electrón llega un momento que va dando 00:26:49
saltos hasta que vuelve nuevamente a su estado energético donde tendría que estar. ¿Cuál es la 00:26:57
peculiaridad de estos fluorocromos? Que estos electrones, cuando vuelven a su estado inicial, 00:27:05
emiten una luz también. Pero esta luz es de una longitud de onda diferente. Esto de las 00:27:10
longitudes de onda, para los que no habéis visto nunca esto de las longitudes de onda, 00:27:19
no es ni más ni menos que yo voy a excitar con una luz de un color y cuando este electrón vuelva 00:27:23
a su estado va a emitir luz de un color diferente, longitud de onda diferente. ¿De acuerdo? De tal 00:27:30
manera que si yo este tipo de fluorocromos los ilumino con luz de una longitud de onda, 00:27:38
emiten luz de otro color. ¿De acuerdo? Ya sabemos este es el espectro del visible. ¿De acuerdo? 00:27:44
Tendríamos aquí el ultravioleta, el infrarrojo. ¿Por qué le decimos el espectro del visible? 00:27:52
Porque todos estos colores, que son los del arco iris, son los que podemos, son las 00:27:57
longitudes de onda que nuestro ojo humano puede detectar. De tal manera que, en concreto, 00:28:01
la fluoresceína tiene un espectro de absorción, absorbe luz azul y emite luz verde. ¿De acuerdo? 00:28:06
Por tanto, todos los fluorocromos tienen un espectro de absorción, que hay que conocerlo, 00:28:16
para saber con qué luz tengo que irradiarlos y tienen un espectro de emisión, que también tengo 00:28:22
que conocerlo para saber qué color de, qué luz de qué color emiten. Tengo fluorocromos que emiten 00:28:29
en verde, en amarillo, en rojo, etcétera. En concreto, para las PCR se van a utilizar este 00:28:35
tipo de moléculas que son irradiadas, absorben el azul y emiten el verde. ¿De acuerdo? 00:28:42
Muy bien. Para la PCR podemos utilizar sistemas fluorescentes independientes de secuencia o 00:28:53
específicos de secuencia. Los sistemas independientes de secuencia se basan en 00:28:59
emplear fluorocromos, agentes fluorescentes intercalantes. Es decir, que se van a meter 00:29:04
dentro de la doble hélice, entre las puentes de hidrógeno de las bases nitrogenadas del DNA 00:29:11
y ahí se queda. Por tanto, si tengo un DNA monocatenario, porque acabo de desnaturalizar, 00:29:18
estos agentes fluorescentes no pueden intercalarse y, por tanto, no vería fluorescencia. 00:29:25
Pero lo único que necesitan estos agentes fluorescentes es un DNA de doble cadena, 00:29:33
independientemente de la secuencia. Sin embargo, hay otros sistemas que son más específicos de 00:29:40
secuencia y se basan en sondas. Ya conocemos las sondas de hibridación. ¿De acuerdo? Son 00:29:45
sondas que están marcadas con fluorocromos. Las vamos a ver ahora y hibridan específicamente en 00:29:51
un gen. ¿De acuerdo? En la región central del amplicón que yo quiero detectar. Vamos a ver 00:29:57
primero los sistemas de detección independientes y después los específicos de secuencia. ¿De acuerdo? 00:30:04
Los sistemas independientes de secuencia, ya hemos dicho que utilizan agentes intercalantes. Por 00:30:10
tanto, solamente veré fluorescencia cuando tenga el DNA y tenga moléculas bicatenarias. ¿De acuerdo? 00:30:15
De tal manera que, a medida que va avanzando la PCR y aumenta el número de amplicones, acordaos 00:30:22
que tengo fase de desnaturalización, fase de hibridación, fase de extensión. Cuando acaba la 00:30:29
fase de extensión, todos estos agentes intercalantes que yo ya he puesto en la Master 00:30:37
Mix, en la mezcla de reacción, se van a unir a los amplicones. De tal manera que voy a poder 00:30:44
medir la fluorescencia. Por tanto, la fluorescencia la vamos a medir al finalizar la fase de extensión 00:30:51
de cada ciclo. De cada ciclo. Y esto es muy importante. De tal manera que, a medida que 00:30:58
van avanzando los ciclos, 10, 12, 15 ciclos, tengo más amplicones, tengo mayor cantidad de 00:31:03
fluorocromos que se unen a los amplicones y, por tanto, a mayor número de amplicones, mayor 00:31:12
fluorescencia voy detectando. Creo que esto es sencillo de entender. ¿De acuerdo? La gran desventaja 00:31:17
de estos sistemas independientes es que, pues tengo una baja en especificidad. ¿Es así? ¿Por qué? 00:31:24
Porque no son sistemas específicos de un gen, de un amplicón determinado. Igual que si lo son los 00:31:30
primers. De tal manera que se van a unir donde hagan una doble cadena. ¿De acuerdo? El agente 00:31:39
intercalante más utilizado es el CyberGreen. El CyberGreen hay que conocerlo. Es el sistema 00:31:46
de detección independiente más utilizado. Tiene esta fórmula química, esta estructura química, 00:31:50
con anillos aromáticos. Es decir, voy a comenzar la PCR. He puesto en la mezcla de reacción de mi 00:31:56
tubo todos los reactivos. He puesto el CyberGreen y he puesto el DNA. El CyberGreen, como el DNA no 00:32:03
ha empezado la PCR, lo tengo en forma bicatenaria. Se va a unir el CyberGreen. ¿De acuerdo? Se va a 00:32:11
intercalar y el termociclador a ciclo cero, todavía no ha empezado, hace la primera medición de 00:32:18
fluorescencia. Esa medición de fluorescencia es lo que llamamos la fluorescencia basal. ¿De acuerdo? 00:32:25
Correspondiente al DNA molde. Comienza el primer ciclo, desnaturalizo, tengo hebras sencillas y 00:32:31
por tanto el CyberGreen se libera. ¿Tendría en la desnaturalización fluorescencia? No. Segunda 00:32:41
fase, la segunda fase del primer ciclo, hibridan. ¿De acuerdo? Y en la extensión, las polimerasas 00:32:50
extienden. Ahora sí, al final de la extensión, el CyberGreen ve un amplicón, una región larga, 00:32:58
grande, de doble cadena, por tanto se puede intercalar y aquí sí que detectaría fluorescencia. 00:33:08
Podemos decir, a modo para que nos entendamos, que ahora, ahora el termociclador detectaría el 00:33:15
doble de fluorescencia que al principio, puesto que tengo el doble de cadenas bicatenarias. 00:33:24
Comienza el segundo ciclo, desnaturalización, se libera el CyberGreen. Hibridación, extensión. 00:33:33
Ahora, al final de la extensión, nuevamente el CyberGreen encuentra regiones largas de estructuras 00:33:42
bicatenarias, se intercala y nuevamente el CyberGreen emite fluorescencia. ¿De acuerdo? 00:33:51
Esta fluorescencia al final de la extensión la puedo detectar. Si os dais cuenta, teóricamente 00:33:59
la fluorescencia sería el doble que en el ciclo anterior y, si os dais cuenta, 00:34:05
cuatro veces más que al principio y así sucesivamente. ¿De acuerdo? Por tanto, 00:34:11
el CyberGreen es un agente intercalante pero que es inespecífico. Solamente va a detectar 00:34:16
estructuras bicatenarias, se une a ellas. Los sistemas específicos de secuencia tenemos dos 00:34:25
tipos. Las balizas y tenemos las sondas de hidrólisis, que también se le llaman sondas 00:34:33
TACMAN. Ojo, nadie habla de sondas de hidrólisis, todo el mundo habla de sondas TACMAN. TACMAN es 00:34:38
la empresa que las comercializó. Las sondas TACMAN son sondas de hibridación, que las conocemos. 00:34:46
Sondas de hibridación, que ya conocemos lo que son, especificas de un amplicón, del gen de interés 00:34:53
que yo quiero amplificar. Y esta sonda de hibridación se va a unir al amplicón en su 00:34:58
centro, entre el Forward, Primer Forward, y el Primer Reverse. Y se va a unir de forma 00:35:03
tremendamente específica, de tal manera que si esta sonda yo la pongo con el DNA genómico de 00:35:09
una célula, solamente se puede unir a un sitio, que es el centro del gen, la parte central del 00:35:15
gen que yo quiero amplificar. ¿De acuerdo? Estas sondas TACMAN detectan la fluorescencia del 00:35:23
amplicón, y única y exclusivamente del amplicón, como vamos a ver ahora. Por tanto, las sondas 00:35:32
TACMAN son tremendamente específicas, y esta es su gran ventaja. De tal manera que la fluorescencia 00:35:38
que va a medir el termociclador procede no de estructuras bicatenarias, sino que va a corresponder 00:35:45
única y exclusivamente del amplicón, ¿vale? De tal manera que ciclo tras ciclo, a medida que va 00:35:51
aumentando el número de ciclos, específicamente irá aumentando también la fluorescencia. ¿Qué 00:36:00
características tienen estas sondas TACMAN? Pues el extremo 3' de la sonda lo tienen fosforilado, 00:36:08
es decir, lo tienen bloqueado. He puesto un fosfato. ¿De acuerdo? En el carbono 3' de la 00:36:16
pentosa he puesto un grupo fosfato, de tal manera que bloqueo que se pueda unir ahí, como veremos 00:36:26
ahora en el esquema que está en la diapositiva siguiente, impido que la ADNA polimerasa se una 00:36:33
y amplifique. Cosas erróneas, de tal manera que no se pueda amplificar a partir de la sonda. 00:36:40
Y la sonda, segunda característica, está marcada con dos moléculas. Un reporter, un reporter no 00:36:48
es más ni menos que un informador, entre comillas, nadie dice informador, todo el mundo habla de 00:36:55
reporters, en el extremo 5' que es un fluorocromo. Y en el extremo 3', además de que está fosforilado, 00:36:59
se le ha añadido lo que llamamos un quencher. Ya veremos la función del quencher. Son dos 00:37:09
moléculas diferentes. Ojo, el quencher no es un fluorocromo. Veremos la diferencia entre el 00:37:17
reporter y el quencher, ahora lo explicaré en la diapositiva. Y nuevamente, aquí también la 00:37:24
fluorescencia la vamos a ir leyendo al final de la fase de extensión de cada título. ¿De acuerdo? 00:37:30
Entonces, aquí tengo mi sonda TACMAN. Ya hemos dicho que el extremo 3' está fosforilado, 00:37:38
en el extremo 3' tengo un quencher, que es una molécula, y aquí tengo, si os dais cuenta, 00:37:45
el fluorocromo. ¿Cuál es la función del quencher? Absorber la fluorescencia que emite el fluorocromo, 00:37:52
de tal manera que yo esta sonda, si yo la irradio, imaginaos que es una sonda, este 00:38:03
fluorocromo emite en verde, por tanto tiene un aspecto de absorción de azul, irradio con luz 00:38:10
azul y emite luz verde. Pero esta luz verde, en lugar de propagarse, lo que hace es que es 00:38:18
absorbida por el quencher. De tal manera que esta sonda, aunque es fluorescente, yo no lo detecto 00:38:26
porque la fluorescencia que emite el fluorocromo la absorbe el quencher. ¿De acuerdo? Hasta aquí 00:38:33
bien. ¿Cuándo detectaré fluorescencia? Detectaré fluorescencia cuando no tenga un quencher. ¿Vale? 00:38:42
Porque el quencher absorbe esa fluorescencia. Si yo no tuviera el quencher, la fluorescencia que 00:38:52
emite el fluorocromo la detectaría. Y la voy a detectar al final de la fase de extensión. Lo 00:38:58
vamos a ver ahora. Comienza la PCR. Primer ciclo. Desnaturalización. Tengo mi sonda TACMAN y tengo 00:39:06
los primers. ¿De acuerdo? Aquí en este esquema solamente han puesto el primer forward. Bueno, 00:39:14
estaría al revés también. ¿De acuerdo? Hibridación. ¿Cómo es la temperatura de 00:39:21
hibridación? Tanto la sonda de hibridación, la sonda TACMAN, como el primer hibridan. ¿Dónde? 00:39:28
Este hibridaría al principio del amplicón y este ya hemos dicho que suele caer en la región central 00:39:35
del amplicón. Y empieza la extensión. ¿Qué característica tiene la extensión? Es que 00:39:40
la ADNA polimerasa que voy a utilizar tiene actividad exonucleasa. De tal manera que comienza 00:39:47
a extender, a extender, a extender, pero llega un momento que se topa con la sonda TACMAN. ¿Y qué 00:39:54
es lo que hace? Utiliza su actividad exonucleasa 3'-5' y va hidrolizando. Por eso se le llaman 00:39:59
también sondas de hidrólisis. Va hidrolizando, va rompiendo la sonda y va liberando nucleótido a 00:40:08
nucleótido, destruyendo esta sonda. De tal manera que al final de la extensión, una vez haya acabado 00:40:14
la fase de extensión, tendré el amplicón y tendré la sonda hechatrizas. De tal manera que si yo ahora 00:40:22
irradio con luz azul, la fluorescencia sí la puedo detectar. ¿Por qué? Porque el cuencher está 00:40:31
tremendamente lejos. Me acabo de cargar este cuencher. ¿Por qué? Se me olvidó decirlo antes 00:40:40
que porque este cuencher absorbe la fluorescencia, pero la que está en un radio en una distancia muy 00:40:47
cortita. De tal manera que la hidrólisis de la sonda hace que se separen espacialmente, se distancien 00:40:55
fluoro cromo de sonda de cuencher y ahora cuando yo irradie con luz azul sí que podré detectar la 00:41:03
fluorescencia verde porque no está el cuencher que la absorbe. ¿Se entiende? De tal manera que al final 00:41:13
de cada ciclo, al final de la fase de extensión, yo voy a ir detectando la fluorescencia verde. 00:41:20
¿De acuerdo? Muy bien. ¿Cómo es la cinética de amplificación? Es decir, 00:41:28
la cinética de amplificación se suele estudiar en una curva de amplificación. ¿Cómo es esta curva 00:41:35
de amplificación? Pues no es ni más ni menos que una gráfica. Esto es lo que me saca después de la 00:41:40
pcr de tiempo real, lo que me saca el ordenador, ¿de acuerdo? El programa, en la cual se representa 00:41:45
el número de ciclos, 0, 1 ciclo, el segundo ciclo, hasta ya os he dicho que se suele hacer hasta 35, 00:41:53
más bien 40 ciclos y aquí voy a graficar la fluorescencia que voy detectando. Entonces, 00:41:59
en esta curva de amplificación se distinguen tres regiones. Lo voy a poner aquí porque se 00:42:06
ve un poquito más grande. Una primera región, que es lo que llamamos fase de ruido, en la cual 00:42:15
pues van pasando los ciclos, primero, segundo, tercero, diez ciclos y la cantidad de fluorescencia 00:42:21
que se va generando todavía no es representativa. De tal manera que la llamamos fase de ruido 00:42:28
porque la fluorescencia todavía no es suficiente como para considerarla apreciable. ¿De acuerdo? 00:42:36
Hasta que llega un momento, hay un punto de inflexión en el cual, a medida que van sucediendo 00:42:45
ya los ciclos, la fluorescencia va aumentando. Es lo que llamamos la fase exponencial lineal. 00:42:52
De tal manera que, a cada ciclo, la cantidad de fluorescencia que voy detectando es mucho 00:42:59
mayor, mucho mayor, mucho mayor. Aquí, en esta fase exponencial, es donde se está llevando a 00:43:05
cabo la amplificación exponencial de la PCR. ¿De acuerdo? Y esto acaba, llega a un número de ciclos, 00:43:10
en el cual llegamos a la fase que llamamos de saturación, en la cual, aunque yo vaya aumentando 00:43:20
el número de ciclos, llega un momento que, por mucho que yo vaya amplificando y vaya poniendo 00:43:27
más ciclos, 35, 38, 40 ciclos, la fluorescencia ya no crece más. O sea, ya no puede amplificar más, 00:43:31
ya no se puede amplificar mucho más. Se ha llegado a una saturación. La polimerasa ya no puede 00:43:40
amplificar más. O bien porque se están acabando los reactivos, o bien porque la polimerasa se 00:43:46
está ya inactivando. ¿De acuerdo? Por tanto, la curva y la cinética de la amplificación en una PCR 00:43:52
a tiempo real tiene esta forma de curva sigmoidea. Curva sigmoidea porque tiene forma de S. Una fase 00:43:58
de ruido, una fase exponencial, que es la importante, y una fase de saturación. ¿De acuerdo? 00:44:05
En esta curva yo puedo marcar aquí un umbral. ¿Cuál es este umbral? Es justo, este umbral lo 00:44:12
marco justo en el punto de inflexión que diferencia, ¿vale? Que separa la fase de 00:44:23
ruido de la fase exponencial. ¿De acuerdo? Pues aquí, en este punto de inflexión, yo voy a 00:44:31
determinar lo que llamamos el CT. El CT es el ciclo threshold en inglés. Es decir, es el ciclo 00:44:37
umbral. Es decir, es el ciclo a partir del cual la PCR y la fluorescencia van aumentando de forma 00:44:47
exponencial. ¿De acuerdo? ¿Por qué es importante este ciclo umbral? Es importante este ciclo umbral, 00:44:57
este punto de inflexión, porque me va a permitir la principal aplicación, que es la cuantificación, 00:45:07
que es lo que me permite la PCR a tiempo real. De hecho, la PCR a tiempo real la veréis en muchos 00:45:15
sitios que se le habla de QPCR, PCRQ, PCR cuantitativa. ¿De acuerdo? Y puedo realizar dos 00:45:21
tipos de cuantificaciones, cuantificación absoluta o cuantificación relativa. ¿Cuantificación de qué? 00:45:29
Cuantificación de la cantidad de DNA de partida que tenía. Por ejemplo, en esta gráfica, en esta 00:45:35
gráfica se muestran las curvas de amplificación de PCR cuantitativa, de PCR a tiempo real, de seis 00:45:44
muestras diferentes. ¿Cuál es la diferencia entre estas muestras? La diferencia es que aquí tengo 00:45:53
100 nanogramos de DNA de partida, 10 nanogramos, 1 nanogramo, 0,1 nanogramos, 0,01 nanogramos y 00:45:59
un picogramo. O sea, en cada curva, en cada una de estas PCRs, en cada uno de estos tubos he 00:46:08
utilizado 10 veces menos de DNA. Si os dais cuenta, el threshold cycle, el ciclo umbral, aparece antes 00:46:14
cuanto más concentrado tengo el DNA. Cuanto más DNA tengo en mi tubo, antes, hay un ciclo antes, 00:46:26
antes aparece la fase exponencial. ¿De acuerdo? Necesito menos ciclos para empezar a detectar la 00:46:36
fluorescencia de verdad. ¿Se entiende? De tal manera que si yo tengo muy poquito DNA, prácticamente 00:46:45
me tengo que ir a los 36, 37 ciclos para empezar a detectar la fluorescencia. ¿De acuerdo? De tal 00:46:51
manera que, gracias al ciclo umbral, a la determinación cuantitativa del ciclo umbral, 00:47:00
si os dais cuenta, yo puedo determinar de forma cuantitativa y muy exacta cuánto DNA de partida 00:47:09
tenía. ¿De acuerdo? Esto es una aplicación, la PCR cuantitativa, el poder cuantificar cuánto DNA 00:47:16
tengo en una muestra de forma cuantitativa, tiene muchísimas aplicaciones, muchísimas, 00:47:22
muchísimas. ¿De acuerdo? De tal manera que, si os dais cuenta, yo puedo hacer, gracias a esta PCR 00:47:28
cuantitativa, saber exactamente en una muestra determinada cuánto DNA tengo. ¿De acuerdo? 00:47:37
Entonces, eso puedo hacerlo con una cuantificación absoluta. ¿De acuerdo? La cuantificación absoluta 00:47:43
es que yo voy a poner un DNA que conozco su concentración y voy a poner de ese DNA que 00:47:49
conozco su concentración, porque lo tengo a 100 nanogramos, voy a hacer diluciones seriadas, 00:47:57
si os dais cuenta, que es lo que han hecho aquí, y entre medias, además de estos seis tubos, 00:48:02
que son los seis tubos control de las seis diluciones, voy a meter el séptimo tubo, 00:48:09
que va a ser el tubo con la muestra de mi paciente, del cual yo quiero saber cuánto 00:48:14
DNA tiene. ¿Se entiende? Y pongo en marcha la PCR. Entonces, obtendría estas curvas de amplificación 00:48:18
y obtendría, además, una séptima. Imaginaos que viene por aquí, por donde voy señalando con el 00:48:28
puntero, plum, plum, plum, plum, plum. ¿De acuerdo? Y esa va a ser la curva de mi paciente, del DNA de 00:48:34
mi paciente. De tal manera que, con el threshold, ¿de acuerdo?, con este ciclo umbral y con estos 00:48:42
seis ciclos umbrales, yo hago una gráfica. Y en esta gráfica, ahora yo también voy a graficar el 00:48:49
ciclo umbral de mi paciente, que estaría por aquí, de tal manera que estaría por aquí, aproximadamente. 00:48:56
Entonces, en esta gráfica, yo pongo el ciclo umbral versus la cantidad de DNA. Y sobre esta 00:49:02
gráfica, voy a extrapolar, voy a extrapolar el ciclo de mi paciente. Si mi paciente, el ciclo 00:49:14
umbral estaba aquí, ya sé de forma cuantitativa y exacta, una cuantificación absoluta, de la 00:49:20
cantidad de DNA que tenía en su muestra. ¿De acuerdo? Esto, si queréis, luego lo vemos también 00:49:26
en clase, ¿vale?, con ejercicios. Hablamos de una cuantificación relativa, no cuando quiero saber de 00:49:33
forma cuantitativa exacta los nanogramos, microgramos que tengo en el DNA de un paciente, sino que yo la 00:49:39
quiero comparar, por eso es relativa, con una muestra control. De tal manera que yo meto una 00:49:45
muestra control y voy a meter las muestras de los pacientes. Y quiero saber si el paciente tiene el 00:49:50
gen X en la misma cantidad que la muestra control, o está dos veces, está el doble de concentrado, 00:49:56
o está dos veces menos, ¿de acuerdo?, ¿se entiende? Esa es una cuantificación relativa, cuando yo los 00:50:07
resultados de mi paciente los quiero comparar con una muestra control, ¿de acuerdo? Os pongo un 00:50:13
ejemplo. Normalmente cuando se extrae una biopsia de un tumor, un paciente le están operando de un 00:50:19
tumor, se cogen varias muestras, varias muestras del tumor, varios trocitos de tumor y también un 00:50:25
fragmento, una pequeña biopsia de tejido sano del paciente. Si yo quiero saber si un gen está 00:50:33
expresado en el tumor, puedo hacer una cuantificación relativa, es decir, cojo el DNA del 00:50:39
fragmento de la biopsia de tejido sano y ese va a ser mi control. Imaginaos que la expresión del 00:50:50
gen que yo quiero estudiar es 10, se expresa 10 veces. Yo lo que voy a comparar contra ese dato, 00:50:58
voy a ir comparando la expresión de las biopsias de los tejidos tumorales de ese mismo paciente, 00:51:07
¿se entiende? Y voy a hacer una cuantificación relativa que la voy a comparar con el tejido 00:51:15
sano de ese propio paciente, ¿de acuerdo? Esto darle unas vueltas si queréis. Os voy a dejar 00:51:20
unos vídeos también complementarios, si os ayudan a la hora de entenderlo y de estudiarlo, ¿de 00:51:25
acuerdo? Y si no, pues me vais preguntando. Muy importante, después de la PCR a tiempo real 00:51:31
tenemos que hacer una curva de fusión, que no es ni más ni menos que cuando ha acabado la PCR, 00:51:38
yo al termociclador le digo, ahora que ya se ha acabado la PCR, vas a coger y vas a ir 00:51:44
aumentando la temperatura poco a poco a razón de 0,1 grados por segundo y me vas a ir midiendo 00:51:50
la fluorescencia. Entonces el termociclador lo va realizando y va midiendo la fluorescencia 00:52:01
de forma continua. Y si os dais cuenta, lo que se obtiene es una curva de fusión, en la cual, 00:52:08
en la muestra, si os dais cuenta, obtengo que la fluorescencia va disminuyendo porque se va 00:52:14
desnaturalizando todo el DNA hasta que llega un momento cuando llego a su temperatura de 00:52:22
melting, la temperatura de melting del amplicón, que la fluorescencia cae de golpe. ¿Por qué? 00:52:28
Porque todos los amplicones se han desnaturalizado a la vez. Entonces aquí tenemos, nos muestran una 00:52:34
muestra A y una muestra B. Esta curva de fusión, el programa de análisis, me lo transforma en 00:52:43
picos de fusión. De tal manera que si os dais cuenta, este punto de inflexión me lo traduce 00:52:50
en un pico. Este pico significa que se ha amplificado una banda. Solo tengo un amplicón. 00:52:59
¿Qué es lo que ocurre en la muestra B? En la muestra B va disminuyendo la fluorescencia a medida 00:53:06
que disminuye la temperatura, pero veo un punto de inflexión y después un megapunto de inflexión 00:53:11
más grande. Esto, cuando lo traduzco a picos de fusión, veo un doble pico. Esto lo que significa 00:53:17
es que la PCR no ha sido específica. Ha amplificado mayoritariamente el amplicón que yo quería, 00:53:23
pero también ha amplificado de forma inespecífica un segundo pico. Por tanto, 00:53:29
la PCR de la muestra 2, algo le ha pasado, la tendría que repetir. ¿De acuerdo? Por tanto, 00:53:35
esta curva de fusión y la obtención de los picos de fusión es un control que me habla sobre si la 00:53:42
PCR a tiempo real ha sido más o menos específica y, por tanto, si tendría o no que repetir la PCR 00:53:50
de alguna muestra en concreto. ¿De acuerdo? Y con esto acabamos el tema 6 de técnicas de PCR. 00:53:58
Idioma/s:
es
Autor/es:
Pedro Melgar-Rojas
Subido por:
Pedro M.
Licencia:
Reconocimiento - No comercial - Sin obra derivada
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Fecha:
1 de diciembre de 2023 - 10:19
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Clave
Centro:
IES BENJAMIN RUA
Duración:
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